DE3005605C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und eine Vorrichtung zur Durchführung des beanspruchten Verfahrens nach Anspruch 1 und 2.

Pathogene Clostridia sind die Ursache für den Gasoedem- und Enterotoxaemiekomplex bei Rindern, Schafen und Ziegen, insbesondere in den Tropen und Subtropen. Die Seuchen, verursacht von einer Gruppe pathogener Erreger, sind der Grund für erhebliche Verluste hauptsächlich unter abge­ setzten Jungtieren, aber auch bei Tieren, die zur Mast intensiv gehalten werden.

Das Seuchengeschehen wird bestimmt durch ein komplexes System von Endo- und Exotoxinen, die die Erreger entweder im Darmkanal oder in der Muskulatur der erkrankten Tiere produzieren. Das Molekulargewicht dieser Toxine kann grob zwischen 20 und 100 000 eingruppiert werden.

Die Bekämpfung der von Clostridia hervorgerufenen Bodenseuchen ist im Prinzip seit langer Zeit tech­ nisch gelöst. Als Antigen für Schutzimpfungen fand bisher ein Gemisch aus Formalin abgetöteten Erregern und ausgefällten Anatoxinen der Erreger Verwendung. Die gebräuchlichen Impfstoffe hatten bzw. haben nur eine relativ beschränkte Wirksam­ keit, deshalb müssen Impfungen der gefährdeten Tiere in jährlichen Intervallen erfolgen, da sonst der von dem offenbar schwachen Antigen produzierte aktive Immunschutz keine ausreichende Protektion gewährt. Insbesondere auf dem Höhepunkt der Trocken­ zeit, wenn die Infektion für die Tiere in den Tropen besonders groß und ihr Abwehrsystem aufgrund des Futtermangels geschwächt ist, läßt die Schutz­ wirkung gebräuchlicher Vakzinen zu wünschen übrig. Die Ursache dafür kann gesucht werden in

• - ungenügender Spezifität
• - ungenügender Antigenität.

Da die Erreger über ihre Toxine pathogen wirken und erst - so beim C.perfringens-Komplex - unter besonderen Lebensbedingungen im Organismus Toxine produzieren, ist es nicht die Infektion, sondern die Toxinwirkung, gegen die der Organismus ge­ schützt werden muß. Das heißt über ein Anatoxin mög­ lichst hoher Wirksamkeit muß versucht werden, den Organismus zur Bildung eines möglichst lang persi­ stierenden Titers von Antitoxinen anzuregen.

Über die Natur der von der Gruppe pathogener Clostridia gebildeten Toxine und ihre das Immun­ system stimulierenden Anatoxine ist relativ wenig bekannt. Man weiß, welches Toxin welche pathogene Wirkung auslöst, so z. B. Histolyse oder Haemolyse, welche Toxine bzw. Toxiinfraktionen am besten immunisieren ist Spekulation. Es konnte jedoch festgestellt werden, daß bei der üblichen Toxin­ produktion es rasch zu einem Abbau, zumindestens der im Tierversuch nachweisbaren Letal-Toxine kommt, wenn der Nährboden länger als bis zum Zeit­ punkt der maximalen Toxinproduktion bebrütet wird. Unter den relativ bescheidenen Arbeitsbedingungen von Vakzine-Labors in Entwicklungsländern ist das der Regelfall. Sowohl Temperatur als auch pH scheinen die Toxinaktivität zu beeinträchtigen.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, mit einfachen Mitteln ein Verfahren und eine dazugehörige Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zu schaffen , welches bzw. die es ermöglicht, aus einer Zellsuspension, z. B. aus einer Bakteriensuspension, eines für einen im gefährdeten Seuchengebiet speziellen Krankheits­ erreger einen sofort verwendbares Antigen zur Vakzineherstellung abzutrennen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Wirkstoffe aus der Zellsuspension konti­ nuierlich unmittelbar durch Membranfiltration abgetrennt und die als Filtrat gewonnene Wirk­ stoffsuspension in einer Ultrafiltrations-Stufe kontinuierlich durch Abtrennen der Trägerflüssig­ keit bis zum gewünschten Konzentrationsgrad auf­ konzentriert und die wirkstofffreie Träger­ flüssigkeit wieder der Zellsuspension zurück­ geführt wird.

Vorteilhafterweise wird das in der Membranfiltrations- Stufe kontinuierlich anfallende Zellkonzentrat zur weiteren Vermehrung in die Zellsuspension zurück­ geführt.

Durch Weiterbehandlung des Wirkstoffkonzentrates in weiteren Filtrationsstufen können die verschie­ denen Wirkstoffe des Wirkstoffkonzentrats entsprechend ihrem Molekulargewicht fraktioniert und damit isoliert werden.

Die Vorrichtung zur Herstellung von Vakzinen durch Abtrennen der Wirkstoffe aus einer Zell­ suspension ist gebildet durch einen die Zell­ suspension aufnehmenden Fermenter, dessen Aus­ laßseite mittels eines Zwangsumlaufes an ein Membranfiltrationsgerät angeschlossen ist, dessen Membranfilter eine die Wirkstoff un­ mittelbar durchlassende und abtrennende Poren­ größe aufweist, wobei die Auslaßseite für das Zellkonzentrat zu dessen Rückführung an den Einlaß des Fermenters angeschlossen ist. Die Filtratauslaßseite des Membranfiltrationsge­ rätes ist an die Einlaßseite mindestens eines, die Trägerflüssigkeit des Wirkstofffiltrats der ersten Filtrationsstufe durchlassenden Ultrafilters angeschlossen, wobei die Auslaß­ seite des Ultrafilters zur Abgabe des aufkon­ zentrierten Wirkstoffes an ein Auffang- und Sammelgerät und die Filtratseite des Ultrafilters an den Fermentereinlaß angeschlossen ist (vgl. in diesem Zusammenhang die Ansprüche 3 bis 9).

Für den kontinuierlichen Betrieb über einen längeren Zeitraum sind das Membranfiltrations­ gerät und der Ultrafilter in einem geschlossenen Kreislauf an den Fermenter angeschlossen. Zur Steuerung des Konzentrationsgrades ist in die von der Konzentratauslaßseite des Ultrafilters zum Auffang- und Sammelgefäß führende Leitung ein Drossel- und Absperrventil eingeschaltet und um im kontinuierlichen Betrieb den Aufbau eines Filterkuchens im Membranfiltrationsgerät und auch im Ultrafilter zu beseitigen, ist vorzugsweise die Konzentratauslaßseite des jeweiligen Filters durch eine absperrbare Bypassleitung oder direkt an die Rücklaufleitung zum Fermenter angeschlossen, so daß auf diese Weise die Filtermembranen des Membranfiltrationsgerätes und des Ultrafilters im freien Durchlauf freispülen lassen.

Die Vorteile dieses Verfahrens und der Vorrichtung sind darin zu sehen, daß

• - kontinuierlich tage- oder sogar wochenlang kontaminationsfrei im geschlossenen System Vakzine produziert wird,
• - alle Toxinfraktionen in statu nascendi als mittlere Fraktion der Ultrafiltrationskaskade sofort abgezogen, kühl gelagert und dann ver­ arbeitet werden können,
• - eine Aufkonzentration der relevanten Toxinfraktion um mindestens das Hundertfache erreicht wird,
• - der Gesamttoxinkomplex ggf. durch Zwischenschaltung einer weiteren Ultrafiltrationskaskade in Fraktionen unterschiedlichen Molekulargewichts weiter getrennt werden kann.

Damit gelingt es, mit einem minimalen Aufwand an Nährboden eine maximale Menge der als Antigen relevanten Toxine zu gewinnen und diese sofort zu stabilisieren. Der daraus gewonnene Impfstoff würde im Volumen in jedem Falle unter 1 ccm Dosis/ Tier liegen, dabei an Wirksamkeit die bisherigen Vakzine weit übertreffen und den Vorteil besitzen, fast frei von Abbauprodukten des Nährbodens zu sein, die, wie die Erfahrung zeigt, nicht nur zu Allergien, sondern zu seuchenhaften anaphylaktischem Schock mit tödlichem Ausgang führen können.

Die Herstellung einer solchen Vakzine verursacht für das Land, in dem sie produziert wird, geringe Kosten, braucht geringe Lager- und Transportkapa­ zität und gibt die Möglichkeit, die Impffrequenz bei den Tieren von einmal jährlich auf eine doppelte Boosterimpfung bei Absatzkälbern zu reduzieren, die den Tieren einen lebenslangen Schutz verleiht.

Der Erfindungsgedanke, der verschiedene Aus­ führungsmöglichkeiten zuläßt, ist schematisch in einer Schaltungszeichnung für die Vorrichtung erläutert.

Die Vorrichtung weist einen einfachen Fermenter 1 bestehend aus einem Behälter 2 mit einem auf Bebrütungstemperatur aufheizbaren Wasserbad 3 auf, in welches das Reaktionsgefäß 4 zur Aufnahme der Zellsuspension 5 eintaucht. Der Einlaß 7 des Reaktionsgefäßes 4 ist durch einen Deckel steril verschlossen, der von den verschiedenen Leitungen durchstoßen wird. Zur Vermeidung einer kritischen Abdichtung im Bereich der Welle des Rührers 6 ist vorzugs­ weise ein Magnetrührer vorgesehen, dessen Antrieb außerhalb und dessen angetriebenes Rührwerk inner­ halb des Reaktionsgefäßes 4 angeordnet ist. Außer­ dem ist das Reaktionsgefäß 4 mit einer sterilen Entlüftung 8 über ein Sicherheitsgefäß 41 versehen, die den Druckausgleich zwischen innen und außen ermöglicht. Über eine Nährlösungsleitung 9 ist das Reaktionsgefäß 4 unter Zwischenschaltung eines Dosierventiles V 4 mit einem Vorratsbehälter 10 für die Nährlösung 12 verbunden. Dieser ist ebenfalls verschlossen und mit einer sterilen Be­ lüftung 11 versehen.

Der im Bodenbereich des Reaktionsgefäßes 4 endende Auslaß 13 des Fermenters 1 führt über einen Zwangsumlauf 14 mit der Leitung 15 in die Filter­ einlaßkammer 19 des Membranfiltrationsgerätes 16, dessen Membranfilter 17 eine die Wirkstoffe mit Trägerflüssigkeit unmittelbar durchlassende und abtrennende Porengröße aufweist. Die Wirk­ stoffe und Trägerflüssigkeit passieren also die Membranfilter 17 in Richtung der Filtratkammer 20. Das in der Filtereinlaßkammer 19 aufkonzen­ trierte Zellkonzentrat verläßt diese durch den Auslaß 18 über die Leitung 21 unter Zwischen­ schaltung eines Druckregulierventils V 1 in Rich­ tung auf den Einlaß 7 des Reaktionsgefäßes 4 und wird in die Zellsuspension 5 wieder einbezogen.

Die Filtratkammer 20 ist über den Filtratauslaß 27 an den Einlaß 24 des Ultrafilters 23 angeschlossen. Die Ultrafiltrationsmembrane 25 des Ultrafilters 23 hat eine die Wirkstoffe zurückhaltende Porengröße, so daß lediglich die Trägerflüssigkeit die Ultrafiltrationsmembrane 25 passiert und das Wirkstoffiltrat des Membran­ filtrationsgerätes 16 im Einlaß 24 des Ultrafilters 23 bis zum gewünschten Konzen­ trationsgrad aufkonzentriert wird, so daß der Wirkstoff durch den Auslaß 26, über die Leitung 27 und das Drosselventil V 2 und die Leitung 28 direkt in ein gekühltes Auffang- und Sammelge­ fäß 29 geführt wird, in welchem es als Wirkstoff­ konzentrat 30 zur weiteren Verwendung zur Ver­ fügung steht. Das Auffang- und Sammelgefäß 29 ist ebenfalls steril verschlossen und mit einer Sterilbelüftung versehen. Mit dem Drosselventil V 2 läßt sich der für die gewünschte Konzentration notwendige Druck im Einlaß 24 aufbauen.

Die die Ultrafiltrationsmembrane 25 passierende Trägerflüssigkeit des Wirkstoffiltrats wird aus der Filtratseite 32 über die Leitung 33 und 34 in den Einlaß 7 des Reaktionsgefäßes 4 zurück­ geführt und steht ebenfalls der Zellsuspension 5 erneut zur Verfügung.

Während der kontinuierlichen Filtration baut sich in der Filtrateinlaßkammer 19 und im Einlaß 24 auf dem Membranfilter 17 und der Ultrafiltrationsmembran 25 eine Art Filterkuchen auf, der die Wirksamkeit der Filter beeinträchtigt. Durch eine Leitung 27, 35 läßt sich jedoch, wie für den Ultrafilter 23 beispielhaft gezeigt, die Ultrafiltrationsmembrane 25 durch das Wirkstoff­ filtrat aus der Filtratkammer 20 freispülen. Zu diesem Zweck wird das Drosselventil V 2 ge­ sperrt und die Leitung 35 über das Ventil V 3 mit der Leitung 34 verbunden, so daß der Filterkuchen auf einfache Weise von der Ultrafiltrationsmembrane 25 entfernt und deren Poren dadurch wieder frei­ gespült werden. Eine entsprechend wirksame Leitung ist für das Membranfiltrationsgerät 16 durch die Leitung 21 und das einstellbare Druckre­ gulierventil V 1 vorhanden. Das vereinfacht darge­ stellte Membranfiltergerät 16 und Ultrafilter 23 sind mehr­ schichtig aufgebaut bzw. mehrere Filter können in Reihe geschaltet sein.

Weiterhin ist es möglich, daß das im Auffang- und Sammelgefäß 29 enthaltene Wirkstoffkonzentrat in weiteren Stufen aufgetrennt und zwar nach bestimmten Wirkstoffkomponenten fraktioniert wird. Dies ist durch die Wahl entsprechender Filter mit entsprechend abgestufter Porengröße möglich.

Des weiteren ist das Reaktionsgefäß 4 zur Erzeugung geeigneter atmosphärischer Bedin­ gungen bei Bedarf mit einer regulierbaren Gasquelle 36 mit Sterilfilter 39 verbindbar. Das Reaktionsgefäß 4 ist mittels in die Zell­ suspension 5 eintauchender Meßsonden 40 über ein pH-Meter 37 und eine automatische Niveau­ regelung 42 mit Grenzwertschaltern elektro­ nisch verbunden und strömungsmäßig an Be­ hälter 38 und Vorratsbehälter 10 mit Puffer- und Nährlösung über elektronisch gesteuerte (Drossel-)Ventile V 4, V 5 angeschlossen, wobei der Reaktions­ raum eine Gaszuführung aus der Gasquelle 36 und eine Gasabführung in das Sicherheitsgefäß 41 mit Entlüftung 8 aufweist. Für C.chauvoei und ihm nahestehende, von der Abteilung für Tierhygiene in den Tropen und Subtropen der Universität Göttingen in Mada­ gaskar und Peru isolierte Clostridien der Gasoedemgruppe, die bisher taxonomisch nicht erfaßt sind, wird folgende Filterkombination gewählt:

Für das Membranfiltrationsgerät 16 ein Membran­ filter mit einer Porengröße von etwa 0,2 µm und für den Ultrafilter 23 eine asymmetrische Ultrafiltrationsmembrane, die eine nominelle Trenngrenze, angegeben in Molekulargewicht, von etwa 20 000 hat.

Die im Fermenter 1 angesetzte Bakteriensuspension wird über ca. 4 Stunden bei 37°C vorbebrütet. Im darauffolgenden Filtrationsverfahren erfolgt im Membranfiltrationsgerät 16 die Abtrennung der Mikroorganismen und deren Rückführung als Konzentrat über die Leitung 21 in das Reaktions­ gefäß 4. Das sterile und bakterienfreie Filtrat gelangt in den Ultrafilter, in welchem es eine Aufkonzentrierung von 50-80 : 1 erhält und im gekühlten Auffang- und Sammelgefäß 29 als Toxinkonzentrat zur Verfügung steht.

Der Gegenstand der Erfindung kann durch Wahl entsprechender Filter selbstverständlich auch zur Produktion von Toxinen (Anatoxinen) zur Impfstoffherstellung gegen andere anaerobe Infektionen der Haustiere sowie gegen Tetanus, Gasbrand und gegebenenfalls gegen die Botulismus-Vergiftungen des Menschen Verwendung finden.

Claims (9)

1. Verfahren zum Abtrennen eines sofort verwendbaren Wirkstoffes aus einer Zellsuspension eines in einem gefährdeten Seuchengebiet speziellen Krankheitserregers, dadurch gekennzeichnet, daß

• - die Wirkstoffe aus der Zellsuspension kontinuierlich unmittelbar durch Membranfiltration abgetrennt, und
• - die als Filtrat gewonnene Wirkstoffsuspension in einer Ultrafiltrationsstufe kontinuierlich durch Abtrennen der Trägerflüssigkeit bis zum gewünschten Konzen­ trationsgrad aufkonzentriert und
• - die wirkstofffreie Trägerflüssigkeit wieder der Zell­ suspension zugeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das in der Membranfiltrationsstufe kontinuierlich anfallende Zellkonzentrat in die Zellsuspension zurückgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Wirkstoffkonzentrat in einer weiteren Behandlungsstufe nach Molekulargewicht fraktioniert wird.

4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß

• - ein die Zellsuspension (5) aufnehmendes Reaktionsgefäß (4) vorgesehen ist, dessen Auslaß (13) mittels eines Zwangsumlaufes (14) an ein Membranfiltrationsge­ rät (16) angeschlossen ist, dessen Membranfilter (17) eine die Wirkstoffe mit Trägerflüssigkeit unmittelbar durchlassende und abtrennende Porengröße aufweist,
• - der Auslaß (18) für das Zellkonzentrat zu dessen Rückführung an den Einlaß (7) des Reaktionsgefäßes (4) mittels einer absperrbaren Leitung (21) ange­ schlossen ist,
• - der Filtratauslaß (22) des Membranfiltrations­ gerätes (16) an den Einlaß (24) mindestens eines, die Trägerflüssigkeit des Wirkstoffiltrats der ersten Filtrationsstufe durchlassenden Ultrafilters (23) angeschlossen ist,
• - der Auslaß (26) des Ultrafilters (23) zur Abgabe des aufkonzentrierten Wirkstoffes an ein Auffang- und Sammelgefäß (29) angeschlossen, und die Filtrat­ seite (32) des Ultrafilters (23) an den Einlaß (7) des Reaktionsgefäßes (4) angeschlossen ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Membranfiltrationsgerät und der Ultrafilter (16 und 23) in einem geschlossenen Kreislauf an das Reaktionsgefäß (4) angeschlossen sind.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß in die vom (Konzentrat-) Auslaß (26) des Ultrafilters (23) zum Auffang- und Sammelgefäß (29) führende Leitung (27) ein Drosselventil (V 2) ein­ geschaltet ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der (Konzentrat-) Auslaß (26) des Ultrafilters (23) durch eine absperrbare Leitung (27, 35) zwecks einer Reinigungsspülung an die Leitung (34) zum Reaktionsgefäß (4) angeschlossen ist.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsge­ fäß (4) mit einer regulierbaren Gasquelle (36) zur Erzeugung geeigneter atmosphärischer Be­ dingungen verbunden ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß (4) mittels in die Zellsuspension (5) eintauchen­ der Meßsonden (40) über ein pH-Meter (37) und eine automatische Niveauregelung (42) mit Grenz­ wertschaltern elektronisch verbunden und strömungs­ mäßig an den Behälter (38) und den Vorratsbehälter (10) mit Puffer- und Nährlösung über elektronisch gesteuerte (Drossel-) Ventile (V 4, V 5) angeschlossen ist, wobei der Reaktionsraum eine Gasquelle (36) und (39) und einen Zwangsumlauf (14) und eine Entlüftung (8) aufweist.