DE3005605C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren
gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und
eine Vorrichtung zur Durchführung des beanspruchten Verfahrens nach Anspruch 1 und 2.
Pathogene Clostridia sind die Ursache für den
Gasoedem- und Enterotoxaemiekomplex bei Rindern,
Schafen und Ziegen, insbesondere in den Tropen
und Subtropen. Die Seuchen, verursacht von einer
Gruppe pathogener Erreger, sind der Grund für
erhebliche Verluste hauptsächlich unter abge
setzten Jungtieren, aber auch bei Tieren, die
zur Mast intensiv gehalten werden.
Das Seuchengeschehen wird bestimmt durch ein
komplexes System von Endo- und Exotoxinen, die
die Erreger entweder im Darmkanal oder in der
Muskulatur der erkrankten Tiere produzieren. Das
Molekulargewicht dieser Toxine kann grob zwischen
20 und 100 000 eingruppiert werden.
Die Bekämpfung der von Clostridia hervorgerufenen
Bodenseuchen ist im Prinzip seit langer Zeit tech
nisch gelöst. Als Antigen für Schutzimpfungen fand
bisher ein Gemisch aus Formalin abgetöteten
Erregern und ausgefällten Anatoxinen der Erreger
Verwendung. Die gebräuchlichen Impfstoffe hatten
bzw. haben nur eine relativ beschränkte Wirksam
keit, deshalb müssen Impfungen der gefährdeten
Tiere in jährlichen Intervallen erfolgen, da sonst
der von dem offenbar schwachen Antigen produzierte
aktive Immunschutz keine ausreichende Protektion
gewährt. Insbesondere auf dem Höhepunkt der Trocken
zeit, wenn die Infektion für die Tiere in den Tropen
besonders groß und ihr Abwehrsystem aufgrund des
Futtermangels geschwächt ist, läßt die Schutz
wirkung gebräuchlicher Vakzinen zu wünschen übrig.
Die Ursache dafür kann gesucht werden in
- - ungenügender Spezifität
- - ungenügender Antigenität.
Da die Erreger über ihre Toxine pathogen wirken
und erst - so beim C.perfringens-Komplex - unter
besonderen Lebensbedingungen im Organismus Toxine
produzieren, ist es nicht die Infektion, sondern
die Toxinwirkung, gegen die der Organismus ge
schützt werden muß. Das heißt über ein Anatoxin mög
lichst hoher Wirksamkeit muß versucht werden, den
Organismus zur Bildung eines möglichst lang persi
stierenden Titers von Antitoxinen anzuregen.
Über die Natur der von der Gruppe pathogener
Clostridia gebildeten Toxine und ihre das Immun
system stimulierenden Anatoxine ist relativ wenig
bekannt. Man weiß, welches Toxin welche pathogene
Wirkung auslöst, so z. B. Histolyse oder Haemolyse,
welche Toxine bzw. Toxiinfraktionen am besten
immunisieren ist Spekulation. Es konnte jedoch
festgestellt werden, daß bei der üblichen Toxin
produktion es rasch zu einem Abbau, zumindestens
der im Tierversuch nachweisbaren Letal-Toxine
kommt, wenn der Nährboden länger als bis zum Zeit
punkt der maximalen Toxinproduktion bebrütet wird.
Unter den relativ bescheidenen Arbeitsbedingungen
von Vakzine-Labors in Entwicklungsländern ist das
der Regelfall. Sowohl Temperatur als auch pH scheinen
die Toxinaktivität zu beeinträchtigen.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde,
mit einfachen Mitteln ein Verfahren und eine
dazugehörige Vorrichtung zur Durchführung des
Verfahrens zu schaffen , welches bzw. die es
ermöglicht, aus einer Zellsuspension, z. B. aus
einer Bakteriensuspension, eines für einen im
gefährdeten Seuchengebiet speziellen Krankheits
erreger einen sofort verwendbares Antigen zur
Vakzineherstellung abzutrennen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst,
daß die Wirkstoffe aus der Zellsuspension konti
nuierlich unmittelbar durch Membranfiltration
abgetrennt und die als Filtrat gewonnene Wirk
stoffsuspension in einer Ultrafiltrations-Stufe
kontinuierlich durch Abtrennen der Trägerflüssig
keit bis zum gewünschten Konzentrationsgrad auf
konzentriert und die wirkstofffreie Träger
flüssigkeit wieder der Zellsuspension zurück
geführt wird.
Vorteilhafterweise wird das in der Membranfiltrations-
Stufe kontinuierlich anfallende Zellkonzentrat zur
weiteren Vermehrung in die Zellsuspension zurück
geführt.
Durch Weiterbehandlung des Wirkstoffkonzentrates
in weiteren Filtrationsstufen können die verschie
denen Wirkstoffe des Wirkstoffkonzentrats entsprechend
ihrem Molekulargewicht fraktioniert und damit isoliert
werden.
Die Vorrichtung zur Herstellung von Vakzinen
durch Abtrennen der Wirkstoffe aus einer Zell
suspension ist gebildet durch einen die Zell
suspension aufnehmenden Fermenter, dessen Aus
laßseite mittels eines Zwangsumlaufes an ein
Membranfiltrationsgerät angeschlossen ist,
dessen Membranfilter eine die Wirkstoff un
mittelbar durchlassende und abtrennende Poren
größe aufweist, wobei die Auslaßseite für das
Zellkonzentrat zu dessen Rückführung an den
Einlaß des Fermenters angeschlossen ist. Die
Filtratauslaßseite des Membranfiltrationsge
rätes ist an die Einlaßseite mindestens eines,
die Trägerflüssigkeit des Wirkstofffiltrats
der ersten Filtrationsstufe durchlassenden
Ultrafilters angeschlossen, wobei die Auslaß
seite des Ultrafilters zur Abgabe des aufkon
zentrierten Wirkstoffes an ein Auffang- und
Sammelgerät und die Filtratseite des Ultrafilters
an den Fermentereinlaß angeschlossen ist (vgl. in diesem Zusammenhang die Ansprüche 3 bis 9).
Für den kontinuierlichen Betrieb über einen
längeren Zeitraum sind das Membranfiltrations
gerät und der Ultrafilter in einem geschlossenen
Kreislauf an den Fermenter angeschlossen. Zur
Steuerung des Konzentrationsgrades ist in die
von der Konzentratauslaßseite des Ultrafilters
zum Auffang- und Sammelgefäß führende Leitung
ein Drossel- und Absperrventil eingeschaltet und
um im kontinuierlichen Betrieb den Aufbau eines
Filterkuchens im Membranfiltrationsgerät und auch
im Ultrafilter zu beseitigen, ist vorzugsweise
die Konzentratauslaßseite des jeweiligen Filters
durch eine absperrbare Bypassleitung oder direkt
an die Rücklaufleitung zum Fermenter angeschlossen,
so daß auf diese Weise die Filtermembranen
des Membranfiltrationsgerätes und des Ultrafilters
im freien Durchlauf freispülen lassen.
Die Vorteile dieses Verfahrens und der Vorrichtung
sind darin zu sehen, daß
- - kontinuierlich tage- oder sogar wochenlang kontaminationsfrei im geschlossenen System Vakzine produziert wird,
- - alle Toxinfraktionen in statu nascendi als mittlere Fraktion der Ultrafiltrationskaskade sofort abgezogen, kühl gelagert und dann ver arbeitet werden können,
- - eine Aufkonzentration der relevanten Toxinfraktion um mindestens das Hundertfache erreicht wird,
- - der Gesamttoxinkomplex ggf. durch Zwischenschaltung einer weiteren Ultrafiltrationskaskade in Fraktionen unterschiedlichen Molekulargewichts weiter getrennt werden kann.
Damit gelingt es, mit einem minimalen Aufwand an
Nährboden eine maximale Menge der als Antigen
relevanten Toxine zu gewinnen und diese sofort
zu stabilisieren. Der daraus gewonnene Impfstoff
würde im Volumen in jedem Falle unter 1 ccm Dosis/
Tier liegen, dabei an Wirksamkeit die bisherigen
Vakzine weit übertreffen und den Vorteil besitzen, fast
frei von Abbauprodukten des Nährbodens zu sein, die,
wie die Erfahrung zeigt, nicht nur zu Allergien,
sondern zu seuchenhaften anaphylaktischem Schock
mit tödlichem Ausgang führen können.
Die Herstellung einer solchen Vakzine verursacht
für das Land, in dem sie produziert wird, geringe
Kosten, braucht geringe Lager- und Transportkapa
zität und gibt die Möglichkeit, die Impffrequenz
bei den Tieren von einmal jährlich auf eine
doppelte Boosterimpfung bei Absatzkälbern zu
reduzieren, die den Tieren einen lebenslangen
Schutz verleiht.
Der Erfindungsgedanke, der verschiedene Aus
führungsmöglichkeiten zuläßt, ist schematisch in
einer Schaltungszeichnung für die Vorrichtung
erläutert.
Die Vorrichtung weist einen einfachen Fermenter
1 bestehend aus einem Behälter 2 mit einem auf
Bebrütungstemperatur aufheizbaren Wasserbad 3
auf, in welches das Reaktionsgefäß 4 zur Aufnahme
der Zellsuspension 5 eintaucht. Der Einlaß 7 des
Reaktionsgefäßes 4 ist durch einen Deckel steril
verschlossen, der von den verschiedenen Leitungen
durchstoßen wird. Zur Vermeidung einer kritischen
Abdichtung im Bereich der Welle des Rührers 6 ist vorzugs
weise ein Magnetrührer vorgesehen, dessen Antrieb
außerhalb und dessen angetriebenes Rührwerk inner
halb des Reaktionsgefäßes 4 angeordnet ist. Außer
dem ist das Reaktionsgefäß 4 mit einer sterilen
Entlüftung 8 über ein Sicherheitsgefäß 41 versehen,
die den Druckausgleich zwischen innen und außen
ermöglicht. Über eine Nährlösungsleitung 9 ist
das Reaktionsgefäß 4 unter Zwischenschaltung
eines Dosierventiles V 4 mit einem Vorratsbehälter
10 für die Nährlösung 12 verbunden. Dieser ist
ebenfalls verschlossen und mit einer sterilen Be
lüftung 11 versehen.
Der im Bodenbereich des Reaktionsgefäßes 4
endende Auslaß 13 des Fermenters 1 führt über
einen Zwangsumlauf 14 mit der Leitung 15 in die Filter
einlaßkammer 19 des Membranfiltrationsgerätes
16, dessen Membranfilter 17 eine die Wirkstoffe mit
Trägerflüssigkeit unmittelbar durchlassende
und abtrennende Porengröße aufweist. Die Wirk
stoffe und Trägerflüssigkeit passieren also die
Membranfilter 17 in Richtung der Filtratkammer 20.
Das in der Filtereinlaßkammer 19 aufkonzen
trierte Zellkonzentrat verläßt diese durch den
Auslaß 18 über die Leitung 21 unter Zwischen
schaltung eines Druckregulierventils V 1 in Rich
tung auf den Einlaß 7 des Reaktionsgefäßes 4 und
wird in die Zellsuspension 5 wieder einbezogen.
Die Filtratkammer 20 ist über den Filtratauslaß
27 an den Einlaß 24 des Ultrafilters
23 angeschlossen. Die Ultrafiltrationsmembrane
25 des Ultrafilters 23 hat eine die Wirkstoffe
zurückhaltende Porengröße, so daß lediglich die
Trägerflüssigkeit die Ultrafiltrationsmembrane
25 passiert und das Wirkstoffiltrat des Membran
filtrationsgerätes 16 im Einlaß 24
des Ultrafilters 23 bis zum gewünschten Konzen
trationsgrad aufkonzentriert wird, so daß der
Wirkstoff durch den Auslaß 26, über die Leitung
27 und das Drosselventil V 2 und die Leitung 28
direkt in ein gekühltes Auffang- und Sammelge
fäß 29 geführt wird, in welchem es als Wirkstoff
konzentrat 30 zur weiteren Verwendung zur Ver
fügung steht. Das Auffang- und Sammelgefäß 29
ist ebenfalls steril verschlossen und mit einer
Sterilbelüftung versehen. Mit dem Drosselventil
V 2 läßt sich der für die gewünschte Konzentration
notwendige Druck im Einlaß 24 aufbauen.
Die die Ultrafiltrationsmembrane 25 passierende
Trägerflüssigkeit des Wirkstoffiltrats wird
aus der Filtratseite 32 über die Leitung 33 und 34
in den Einlaß 7 des Reaktionsgefäßes 4 zurück
geführt und steht ebenfalls der Zellsuspension
5 erneut zur Verfügung.
Während der kontinuierlichen Filtration baut sich
in der Filtrateinlaßkammer 19 und im Einlaß 24 auf dem Membranfilter
17 und der Ultrafiltrationsmembran 25 eine Art Filterkuchen auf, der die
Wirksamkeit der Filter beeinträchtigt. Durch
eine Leitung 27, 35 läßt sich jedoch, wie
für den Ultrafilter 23 beispielhaft gezeigt, die
Ultrafiltrationsmembrane 25 durch das Wirkstoff
filtrat aus der Filtratkammer 20 freispülen.
Zu diesem Zweck wird das Drosselventil V 2 ge
sperrt und die Leitung 35 über das Ventil V 3 mit
der Leitung 34 verbunden, so daß der Filterkuchen
auf einfache Weise von der Ultrafiltrationsmembrane
25 entfernt und deren Poren dadurch wieder frei
gespült werden. Eine entsprechend wirksame Leitung
ist für das Membranfiltrationsgerät 16 durch die
Leitung 21 und das einstellbare Druckre
gulierventil V 1 vorhanden. Das vereinfacht darge
stellte Membranfiltergerät 16 und Ultrafilter 23 sind mehr
schichtig aufgebaut bzw. mehrere Filter können in
Reihe geschaltet sein.
Weiterhin ist es möglich, daß das im Auffang- und
Sammelgefäß 29 enthaltene Wirkstoffkonzentrat in
weiteren Stufen aufgetrennt und zwar nach bestimmten
Wirkstoffkomponenten fraktioniert wird. Dies ist
durch die Wahl entsprechender Filter mit entsprechend
abgestufter Porengröße möglich.
Des weiteren ist das Reaktionsgefäß 4 zur
Erzeugung geeigneter atmosphärischer Bedin
gungen bei Bedarf mit einer regulierbaren
Gasquelle 36 mit Sterilfilter 39 verbindbar.
Das Reaktionsgefäß 4 ist mittels in die Zell
suspension 5 eintauchender Meßsonden 40 über
ein pH-Meter 37 und eine automatische Niveau
regelung 42 mit Grenzwertschaltern elektro
nisch verbunden und strömungsmäßig an Be
hälter 38 und Vorratsbehälter 10 mit Puffer- und Nährlösung
über elektronisch gesteuerte (Drossel-)Ventile
V 4, V 5 angeschlossen, wobei der Reaktions
raum eine Gaszuführung aus der Gasquelle 36
und eine Gasabführung in das Sicherheitsgefäß
41 mit Entlüftung 8 aufweist.
Für C.chauvoei und ihm nahestehende, von der
Abteilung für Tierhygiene in den Tropen und
Subtropen der Universität Göttingen in Mada
gaskar und Peru isolierte Clostridien der
Gasoedemgruppe, die bisher taxonomisch nicht
erfaßt sind, wird folgende Filterkombination
gewählt:
Für das Membranfiltrationsgerät 16 ein Membran
filter mit einer Porengröße von etwa 0,2 µm
und für den Ultrafilter 23 eine asymmetrische
Ultrafiltrationsmembrane, die eine nominelle
Trenngrenze, angegeben in Molekulargewicht,
von etwa 20 000 hat.
Die im Fermenter 1 angesetzte Bakteriensuspension
wird über ca. 4 Stunden bei 37°C vorbebrütet.
Im darauffolgenden Filtrationsverfahren erfolgt
im Membranfiltrationsgerät 16 die Abtrennung
der Mikroorganismen und deren Rückführung als
Konzentrat über die Leitung 21 in das Reaktions
gefäß 4. Das sterile und bakterienfreie Filtrat
gelangt in den Ultrafilter, in welchem es eine
Aufkonzentrierung von 50-80 : 1 erhält
und im gekühlten Auffang- und Sammelgefäß
29 als Toxinkonzentrat zur Verfügung steht.
Der Gegenstand der Erfindung kann durch Wahl
entsprechender Filter selbstverständlich auch zur Produktion von
Toxinen (Anatoxinen) zur Impfstoffherstellung
gegen andere anaerobe Infektionen der Haustiere
sowie gegen Tetanus, Gasbrand und gegebenenfalls
gegen die Botulismus-Vergiftungen des Menschen
Verwendung finden.
Claims (9)
1. Verfahren zum Abtrennen eines sofort verwendbaren
Wirkstoffes aus einer Zellsuspension eines in einem
gefährdeten Seuchengebiet speziellen Krankheitserregers,
dadurch gekennzeichnet, daß
- - die Wirkstoffe aus der Zellsuspension kontinuierlich unmittelbar durch Membranfiltration abgetrennt, und
- - die als Filtrat gewonnene Wirkstoffsuspension in einer Ultrafiltrationsstufe kontinuierlich durch Abtrennen der Trägerflüssigkeit bis zum gewünschten Konzen trationsgrad aufkonzentriert und
- - die wirkstofffreie Trägerflüssigkeit wieder der Zell suspension zugeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das in der Membranfiltrationsstufe kontinuierlich
anfallende Zellkonzentrat in die Zellsuspension
zurückgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Wirkstoffkonzentrat in einer weiteren
Behandlungsstufe nach Molekulargewicht fraktioniert
wird.
4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach
Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß
- - ein die Zellsuspension (5) aufnehmendes Reaktionsgefäß (4) vorgesehen ist, dessen Auslaß (13) mittels eines Zwangsumlaufes (14) an ein Membranfiltrationsge rät (16) angeschlossen ist, dessen Membranfilter (17) eine die Wirkstoffe mit Trägerflüssigkeit unmittelbar durchlassende und abtrennende Porengröße aufweist,
- - der Auslaß (18) für das Zellkonzentrat zu dessen Rückführung an den Einlaß (7) des Reaktionsgefäßes (4) mittels einer absperrbaren Leitung (21) ange schlossen ist,
- - der Filtratauslaß (22) des Membranfiltrations gerätes (16) an den Einlaß (24) mindestens eines, die Trägerflüssigkeit des Wirkstoffiltrats der ersten Filtrationsstufe durchlassenden Ultrafilters (23) angeschlossen ist,
- - der Auslaß (26) des Ultrafilters (23) zur Abgabe des aufkonzentrierten Wirkstoffes an ein Auffang- und Sammelgefäß (29) angeschlossen, und die Filtrat seite (32) des Ultrafilters (23) an den Einlaß (7) des Reaktionsgefäßes (4) angeschlossen ist.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
das Membranfiltrationsgerät und der Ultrafilter
(16 und 23) in einem geschlossenen Kreislauf an das Reaktionsgefäß (4)
angeschlossen sind.
6. Vorrichtung nach Anspruch 4 und 5, dadurch
gekennzeichnet, daß in die vom (Konzentrat-)
Auslaß (26) des Ultrafilters (23) zum
Auffang- und Sammelgefäß (29) führende Leitung
(27) ein Drosselventil (V 2) ein
geschaltet ist.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß der (Konzentrat-)
Auslaß (26) des Ultrafilters (23) durch eine
absperrbare Leitung (27, 35) zwecks einer
Reinigungsspülung an die Leitung (34)
zum Reaktionsgefäß (4) angeschlossen ist.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsge
fäß (4) mit einer regulierbaren Gasquelle (36)
zur Erzeugung geeigneter atmosphärischer Be
dingungen verbunden ist.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß
(4) mittels in die Zellsuspension (5) eintauchen
der Meßsonden (40) über ein pH-Meter (37) und
eine automatische Niveauregelung (42) mit Grenz
wertschaltern elektronisch verbunden und strömungs
mäßig an den Behälter (38) und den Vorratsbehälter (10) mit Puffer- und
Nährlösung über elektronisch gesteuerte (Drossel-)
Ventile (V 4, V 5) angeschlossen ist, wobei der
Reaktionsraum eine Gasquelle (36) und (39) und einen Zwangsumlauf
(14) und eine Entlüftung (8) aufweist.
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