DE69834900T2 - Verfahren zur Herstellung von Zellkulturen - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zellkulturen und insbesondere ein gemäß der Ansprüche definiertes Verfahren.
- Das Verfahren kann von einem oder mehreren Herstellungs- oder Entwicklungslaboratorien umgesetzt werden.
- Eine Luftdruckkaskade wird durch die Umwälzung turbulenter, steriler Luft erzeugt, welche mittels Durchströmen mehrerer unterschiedlicher Arten von Sterilisationsfiltern, wie HEPA-Filtern, hergestellt und über Diffusoren an der Zimmerdecke verteilt wird.
- Die Verbindung zwischen den unterschiedlichen Räumlichkeiten erfolgt mittels Einlass- oder Durchgangsschleusen. Diese werden von steriler Luft durchströmt und stellen eine zusätzliche Sicherheitsstufe zwischen den Reinräumen zur Sicherung der aus einer Gewebeentnahme hervorgehenden Ausgangskulturen und den angrenzenden Reinräumen, die mit Überdruck arbeiten.
- Gemäß der Erfindung sind die Räumlichkeiten im Sinne einer Druckluftkaskade ausgebildet, beginnend mit der Eingangsschleuse mit Überdruck über die Räumlichkeiten zur Kultivierung der Primärzellen bis zu den Räumlichkeiten um die Kulturen aus den Sekundärzellen herzustellen. Die verwendeten Drücke reichen von 5 Pascal bis 45 Pascal. Zu den angrenzenden Räumlichkeiten besteht bis auf die Durchgangsschleusen keine Verbindung. Die Räumlichkeiten sind jeweils mit einer Eingangsschleuse und einer Ausgangsschleuse unter Druck für das Material und einer Ausgangsschleuse unter Druck, die zum Abtransport von Abfällen dient, ausgestattet. Jede der Eingangsschleusen oder der Ausgangsschleusen mündet in einen Belüftungsgang.
- Für ein besonders bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die Anordnung der Räumlichkeiten in Form eines langgestreckten Rechtecks ausgestaltet, umfassend in einer sukzessiven Abfolge einen Behandlungsraum für Gewebeentnahmen und für die Ausgangskulturen, in dem ein Unterdruck vorherrscht und der eine Eingangsschleuse aufweist, an die ein Überdruck angelegt ist und eine Ausgangsschleuse für das Personal auf Unterdruck, sowie eine Eingangsschleuse für Materialien und eine Ausgangsschleuse für Abfälle, wobei in beiden ein Überdruck vorherrscht, und eine oder mehrere Verbindungsschleusen sowie – angrenzend an den besagten Raum – einen Raum, der der Vorbereitung der Nährmedien und der speziellen Reagenzien für die Kulturen dient, eine konstante Temperatur aufweist und der eine Eingangsschleuse für das Personal mit Überdruck und eine Eingangsschleuse für das Material, ebenfalls mit Überdruck, und eine Schleuse für das Material und eine Schleuse zur Entfernung der Abfälle umfasst, wobei der besagte Raum zur Vorbereitung einen höheren Druck aufweist; einen Kontrollraum, der der Überprüfung der Verfahren und der Qualität der Produkte dient, wobei dieser Raum auf einem mittleren Überdruck gelegt ist, und die Eingangsschleusen, welche selbst auf einem geringeren Überdruck gehalten werden.
- Jedes Labor umfasst folglich ein oder einige Eingangsschleusen für das Personal und die Neumaterialien sowie ein oder mehrere Ausgangsschleusen, welche der Abfuhr der benutzten Materialien dient.
- An diesen Raum schließt sich ein Raum an, welcher der Herstellung der Zellen dient, für welche die Kultivierung aufgenommen werden kann. Dieser Raum ist der einzige, für den aus dem Innenbereich eine Verbindung an einen dahinter liegenden Raum besteht, in welchem eine Bestrahlung der Zellen, falls dies notwendig ist, durchgeführt werden kann. Er kann Verbindungseinrichtungen mit jedem der angrenzenden Räume umfassen, die als Durchgangsschleusen ausgestaltet sind.
- Die Ausgestaltung umfasst ferner einen mit einer Seite angrenzenden Raum mit Kältetechnik, welcher das Einfrieren und die Gefrierlagerung der bestrahlten Zellproben bei einer ausreichend tiefen Temperatur etwa jener von Flüssigstickstoff, erlaubt, in dem ein Flüssigstickstoffstrom ausgebildet wird.
- Die Ausgestaltung umfasst ferner einen Raum mit Sekundärkulturen, welche dem Fertigprodukt entsprechen, wobei dieser auf einen starken Überdruck gesetzt ist und dessen Innenbereich über eine belüftete Durchgangsschleuse mit einem Labor oder den Laboratorien für die Ausgangskulturen verbunden ist.
- Das Arrangement der Räume ist so gestaltet, dass diese in einen Vorraum münden, welcher auf den Flur mit der äußeren Belüftung führt.
- Genauer gesagt betrifft die Erfindung eine technische Einrichtung, die der Kultur von Hautfragmenten dient und die ein Labor umfasst, in welchem entnommenes Hautgewebe mit Hautzellen und insbesondere mit Keratinozyten (A) behandelt wird, ein angrenzendes Labor, in welchem die Vorbereitungsmaßnahmen und die Inkubation der Nährmedien und der Reagenzien für die Kulturen, die für diese Hautfragmente und Zellen (B) geeignet sind, vorbereitet werden, und zwar während einer hierfür geeigneten Verfahrensphase, um eine bestmögliche Produktion zu realisieren, ein angrenzendes Labor in dem die Validierung der Produkte und die interne Qualitätskontrolle der Produkte (C) durchgeführt wird und in dem eine Bestrahlung (D) der Fibroblasten mit Gammastrahlen durchgeführt werden kann, um diese postmiotisch zu machen, sowie ein Raum zur Herstellung von Kulturen für Fibroblasten 3T3 (E), um die Anzucht von Keratinozyten sicherzustellen, ein Kälteraum (F), umfassend eine Gefriereinheit bis –80°C und ein Gefäß mit flüssigem Stickstoff zur Gefrierkonservierung der Keratinozyten und der Träger aus Fibroblasten, derart, dass im Wesentlichen die menschlichen Keratinozyten eingefroren werden und ferner die Rückverfolgbarkeit der Keratinozyten sichergestellt wird, indem eine Datenbank für die Fibroblasten realisiert ist, um in der Folge eine Rückführung zum ursprünglichen Patienten zu ermöglichen. Auf diese Weise lässt sich die Möglichkeit der Transplantation eigener Epidermis verwirklichen.
- Die gefrorene Produkte werden in der Folge in einen Raum für Zweitkulturen (G) verbracht, welcher sich an den Raum für die Ausgangskulturen (A) anschließt, und zwar über einen Bereich, in welchem die Anzucht von Keratinozyten ausgeführt wird, um Sekundärkulturen zu erzielen, die man dann in die Behälter oder Schälchen mit doppelter, steriler Umhüllung und einer Polyethylen (PETG)-Abdeckung zurückführt.
- Schließlich wird gemäß der Ausgestaltung die Endbehandlung in einem Labor zur Entwicklung (I) ausgeführt, welches sich an den Behandlungsraum für die Gewebeentnahmen (A) und die Ausgangskulturen anschließt, und in welchem die endgültige Verpackung ausgeführt wird, mit diesem steht ein Raum zur Desinfektion mittels eines Autoklaven (J) in Verbindung, in welchem die Produktion von sterilem Wasser sowie die Sterilisation der Werkzeuge und Materialien zur Gewebeentnahme sichergestellt wird. Der Raum mit dem Autoklaven steht mit dem Entwicklungslabor (I) mittels eines internen Durchgangs in Verbindung. Dieser Raum umfasst darüber hinaus eine Eingangs- und eine Ausgangsschleuse für Material (K) und eine Ausgangsschleuse für Abfälle.
- Das Entwicklungslabor und der Raum mit dem Autoklaven werden bei Umgebungsdruck betrieben. Gemäß einer besonderen Ausgestaltung umfasst die Erfindung folgendes:
- – die Räumlichkeiten werden mittels einer kontinuierlich betriebenen Belüftung belüftet, wobei mit der Hilfe von zwei Luftzentralen, jeweils umfassend drei Filtrationsebenen und welche mit jedem Belüftungsstoß 20 % Frischluft passieren lassen, eine Austauschrate zwischen 30 und 50 pro Stunde erzielt wird,
- – der für die Gewebeentnahmen und die Ausgangskulturen benutzte Reinraum (A) wird mit Unterdruck betrieben und der Rest der technischen Plattform funktioniert mit Überdruck,
- – die turbulente Belüftung mit steriler Luft erfolgt über HEPA-Filter mittels Diffusoren, die an den Decken der Räume angebracht sind,
- – eine Vorrichtung für den Abzug der Luft, welche an einem unteren Bereich der Trennwände angebracht sind,
- – es wird zum einen eine Druckkaskade zwischen den sterilen Reinräumen und zum anderen zwischen dem Belüftungsgang und den Reinräumen angelegt, wobei sich die Druckabstufung zwischen 5 Pascal (schwacher Druck) und 45 Pascal (starker Druck) erstreckt,
- – die Durchgangsschleusen zur Verbindung des Reinraums für die Gewebeentnahme und den angrenzenden Reinräumen sind unbelüftet oder belüftet ausgeführt,
- – für jeden Reinraum ist eine belüftete Eingangsschleuse für das Personal vorgesehen,
- – für jeden Reinraum sind die Eingangsschleusen für das Material und die Ausgangsschleusen, die insbesondere der Abfuhr von Abfällen dienen, belüftet,
- – die Türen der Durchgangsschleuse für den Reinraum zur Gewebeentnahme (A) umfassen elektromagnetische Sicherheitsschlösser,
- – die Türen der Schleusen für die anderen Reinräume sind mit einem Kontakt im Türfalz ausgestattet, welcher mit einer internen oder externen Leuchtanzeige verbunden ist, beispielsweise in Form eines roten oder eines grünen Lichts.
- Die unterschiedlichen Reinräume umfassen Arbeitsplatten aus einem nicht porösen leicht abwaschbaren Material, etwa aus CORIANO, die so ausgestaltet sind, dass sich deren Form an die Hindernisse anpasst, die sie umgeben.
- Die dargestellte technische Einrichtung dient nicht nur dem Ziel, Kulturen von Hautzellen und insbesondere von Keratinozyten, die Patienten entnommen wurden, um geschädigte, gequetschte oder verbrannte Hautflächen wiederherzustellen, zu züchten, sondern auch dem Studium und der Entwicklung weiterer Verfahren für die zelluläre Therapie bei Menschen, wobei hierfür jeder menschliche Zelltyp in Frage kommt.
- Die vorgestellte technische Einrichtung zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst ferner unterschiedliche Bereiche mit einer nicht geregelt eingestellten Umgebungsluft, die der Aufbewahrung und Lagerung jener Produktionsmaterialien dienen, für welche keine besonderen Vorkehrungen getroffen werden müssen.
Claims (9)
- Herstellungsverfahren für Zellkulturen, welches darin besteht, eine technische Einrichtung zu realisieren, welche ein oder mehrere Laboratorien zur Steuerung, ein oder mehrere Labore für die Entwicklung und/oder Laboratorien für die Produktion umfasst, wobei die Laboratorien jeweils aneinander angrenzen und von einem Gang für die Belüftung umschlossen sind, der mit den besagten Laboratorien mittels unter Überdruck stehenden Schleusen in Verbindung steht, und wobei die technische Einrichtung Reinräume mit kontrollierter Atmosphäre umfassen, wobei diese zum einen ein Labor zur Gewebeentnahme und zur Herstellung der zellulären Ausgangskulturen und zum anderen ein unmittelbar angrenzendes Labor umfassen, das der Vorbereitung und für die Inkubation von Nährmedien und der Vorbereitung von Reagenzien für die Zellkulturen dient, sowie ein oder mehrere Labore, in welche die hergestellten Produkte geprüft werden, ein Kälteraum und ein oder mehrere Labore zur Produktion von zellulären Sekundärkulturen und ein oder mehrere Labore zur Herstellung und zur Entwicklung, wobei das Ensemble der Räumlichkeiten so angeordnet ist, dass die Zu- oder die Abfuhr von Material und/oder von Personal zu jedem Raum mittels einer durch den Zustrom von gefilterter, steriler Luft unter Überdruck gesetzten Schleuse erfolgt und eine Druckkaskade zwischen dem Labor zur Herstellung der Ausgangskulturen, das mit Unterdruck betrieben wird, zum einen, und den weiteren Reinräumen zum anderen, ausgebildet wird, wobei der Gang zur Luftzirkulation, welcher im Außenbereich ausgebildet ist und in dem Atmosphärendruck herrscht, einen dazwischen liegenden Druck aufweist.
- Herstellungsverfahren für Zellkulturen gemäß Anspruch 1, umfassend die Bereitstellung einer technischen Einrichtung, in welchem das Ensemble der Räume in Form eines langgestreckten Rechtecks ausgebildet ist, umfassend die aufeinander abfolgende Anordnung eines Raums zur Entnahme von Hautgewebe, indem ein Unterdruck vorherrscht, eine Zugangsschleuse auf Überdruck, eine Ausgangsschleuse für das Personal auf Unterdruck und eine Eingangsschleuse für das Material auf Überdruck sowie einen anschließenden Raum, der für die Bereitstellung von Nährmedien und speziellen Reagenzien für die Kulturen dient, und welcher eine Eingangsschleuse auf Überdruck umfasst, einen Kontrollraum, der zur Überwachung der Verfahren und der Qualität der Produkte dient, einen Raum zur Herstellung von Fibroblasten, die in gemeinsamer Kultur mit den Keratinozyten hergestellt werden, und möglicherweise einen Raum mit einer Bestrahlungseinrichtung, einen Kälteraum, der dem Einfrieren und der Konservierung der Proben dient, einen Raum zur Vorbereitung von Sekundärkulturen, wobei jeder Raum mit dem Gang zur Luftzirkulation in Verbindung steht, der auf Atmosphärendruck gesetzt ist.
- Herstellungsverfahren für Zellkulturen, umfassend die Bereitstellung einer technischen Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Ensemble der Räume eine Gestaltung aufweist, die in einen Vorraum mündet, der zum peripheren Gang für die Luftzirkulation führt.
- Herstellungsverfahren für Zellkulturen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Raum für die Gewebeentnahme zur Behandlung der während der Biopsie entnommenen Hautfragmente dient, um Kulturen von Keratinozyten herzustellen.
- Herstellungsverfahren für Zellkulturen, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Raum für die Bestrahlung so eingerichtet ist, dass eine Bestrahlung der Zellkulturen mit Gammastrahlen ausgeführt werden kann.
- Herstellungsverfahren für Zellkulturen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Raum für die Herstellung von bestrahlten Fibroblasten die Kultivierung von Fibroblasten ermöglicht, um diese als Nährboden für Keratinozyten zu verwenden.
- Herstellungsverfahren für Zellkulturen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Kälteraum das Gefrieren und die Aufbewahrung der Zellkulturen mittels des Einfrierens bei –70°C und mittels eines mit Flüssigstickstoffs betriebenen Kryostaten erlaubt.
- Herstellungsverfahren für Zellkulturen gemäß Anspruch 1, das ferner einen Raum für Sekundärkulturen umfasst, in welchem das Wachstum der Keratinozyten nach deren Vervielfältigung in Ausgangskulturen und auch in Sekundärkulturen erfolgt, die dann in Behälter und Schalen mit doppelter, steriler Umhüllung und Polyethylenabdeckung mit dem Ziel verbracht werden, eine Transplantation der kultivierten Epidermis auszuführen.
- Herstellungsverfahren für Zellkulturen gemäß Anspruch 1, umfassend unter anderem die Bereitstellung eines oder mehreren Laboratorien für die Produktion, welche sowohl die Endbehandlung als auch die Verpackung der Produkte sicherstellten.
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