DE2011366B2 - Verfahren zur Herstellung eines Nährbodenbehälters mit Matrix - Google Patents

Description

R₁-O-

ff

-c—c—o

I I

R₅ R₆

-R,

(D

in der R₁ und R₂ Wasserstoffatome, Alkylgruppen oder alkylsubstituierte Arylgruppen bedeuten und R₃ ein Wasserstoffatom ist, wenn R₄ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe ist, R₄ ein Wasserstoffatom bedeutet, wenn R₃ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe ist, R₅ ein Wasserstoffatom ist, wenn R₆ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe bedeutet, und R₆ ein Wasserstoffatom bedeutet, wenn R₅ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder eine Vinylgruppe ist, und in der η größer als 1 ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix ein vernetztes Poiyäthylenoxid, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyacrylamid, Polyvinylmethyläther oder ein vernetztes Mischpolymerisat von Maleinsäureanhydrid und Äthylen oder Vinylmethyläther oder ein vernetztes Mischpolymerisat aus einer größeren Menge eines Acryl- oder Methacrylsäuremonoesters mit einer einzigen olefinischen Doppelbindung und einer geringeren Menge eines Diesters einer dieser Säuren mit mindestens zwei olefinischen Doppelbindungen ist.

3. Verfahren nach Anspruch I und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Polymerisatlösung Nährstoffe zugesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den Nährbodenbehälter ■ mit Matrix in Form eines unlöslichen hydrophilen Gels mittels Infrarotstrahlen oder Heißluft trocknet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine ionisierende Strahlung von etwa 0,50 bis etwa 20 MeV in einer Gesamtdosis von etwa 0,05 bis 10 Megarad angewendet wird.

Das gebräuchlichste bekannte Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen besteht darin, daß man ein Nährstoffgemisch beimpft, das mittels Agar verfestigt worden war und sich in einer Petrischale befindet,

Da Agar aus pflanzlichen Rohstoffen hergestellt wird, ergeben sich bei seiner Verwendung verschiedene Nachteile. Werden beispielsweise verschiedene Arten und Gattungen von Algen zur Herstellung von Agar verwendet, so führt dies bei der festen Phase zu Unterschieden in der Gelfestigkeit, der Elastizität, Synärese, Viskosität, Transparenz, im Aschegehalt und im Gehalt an Verunreinigungen.

Ein weiterer wesentlicher Nachteil von Agar-Nährboden besteht darin, daß sie an dei Innenoberfläche einer Petrischale nicht gut haften. Dreht mar. die Schale um und schlägt kräftig dagegen, so löst sich der Nährboden meist ganz von der Schale oder wenigstens in dem Maße, daß Organismen in die entstehenden Hohlräume eindringen können.

Es sind bereits Nährbodenbehälter aus einem thermoplastischen Kunststoff, nämlich Polystyrol, bekannt, z. B. der Einwegbehälter nach der USA.-Patentschrift 2 874091, bei dem der Agar-Nährboden an der Schale haften soll. Diese Nährböden lösen sich aber doch bei einem kräftigen Schlag ab, wie er z. B. beim Transport oder in der Praxis vorkommen kann.

In der USA.-Patentschrift 3 247 078 ist ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen unter Verwendung einer Polyäthylenoxid-Matrix beschrieben. Nach diesem Verfahren wird das Polymerisat entwässert und in herkömmlicher Weise zu kleinen Teilchen vermählen. Der Nährboden wird hierauf durch Zugabe von Wasser und einem oder mehreren Nährstoffen hergestellt, mit dem Nährbodenbehälter jedoch nicht fest verbunden und kann sich daher genauso wie ein Agar-Nährboden ablösen.

Es ist auch schon eine als Nährboden geeignete Matrix beschrieben worden, welche durch Bestrahlung einer im Nährbodenbehälter befindlichen wäßrigen Polymerisatlösung hergestellt wird, wobei sich durch die Bestrahlung ein unlösliches hydrophiles Gel aus Polyacrylamid bildet. Die Bestrahlung erfolgt mit sichtbarem Licht in Gegenwart von organischen Katalysatoren, wie Riboflavin. Eine dauerhafte feste Verbindung zwischen der Matrix und dem Nährbodenbehälter, durch die eine Ablösung der Matrix wirksam verhindert wird, läßt sich auf diese Weise aber nicht erzielen.

überraschenderweise kann das vorstehend geschilderte Problem aber durch Maßnahmen behoben werden, welche im wesentlichen auf der gleichförmigen Einwirkung von ionisierender Strahlung beruhen und wobei die Oberfläche der verwendeten Polymerisatlösung sowie die Grenzfläche zwischen Lösung und Behälterwand die gleiche Strahlungsdosis empfangen. Auf diese Weise wird eine so feste Verbindung zwischen dem Hydrogei der Matrix und der Wand des Nährbodenbehälters erzielt, daß eher der Behälter zerstört wird als daß sich diese Verbindung löst.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Nährbodenbehälters mit Matrix, wobei eine wäßrige Polymerisatlösung im Behälter selbst durch Bestrahlung in ein unlösliches hydrophiles Gel überführt wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß durch Verwendung einer ionisierenden Strahlung und entsprechender Einstellung von optimaler Dicke der Polymerisatlösung und Strahlungsenergie die gleiche Strahlungsdosis an die Oberfläche der Polymerisatlösung und die Grenzfläche zwischen Lösung und Behälterwand abgegeben und eine vernetzte Poly-

2 Oi1

merisatmatrix der nachstehenden allgemeinen Formel erzeugt wird

R₁-O-

-c—c—ο-

R₅ R₆

-R,

(D

in der R₁ und R₂ Wasserstoffatome, Alkylgruppen oder alkylsubstituierte Arylgruppen bedeuten und R₃ ein Wasserstoffatom ist, wenn R₄ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenvl- oder Vinylgruppe ist, R₄ ein Wasserstoffatom bedeutet, wenn R₃ ein Wasjerstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe ist, R₅ ein Wasserstoffatom ist, wenn R₆ ein Wasserstoifatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe bedeutet, und R₆ ein Wasserstoffatom bedeutet, wenn R₅ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe ist, und in der η größer als 1 ist.

Die unter Verwendung der vorgenannten vernetzten Polymerisate hergestellten Nährbodenbehälter mit Matrix haben folgende Vorteile:

Sie werden nur einmal verwendet und können vor Gebrauch sterilisiert und transportiert werden, ohne daß sich die Matrix vom Behälter ablöst. Die Matrix im Behälter kann in entwässerter Form gelagert oder transportiert werden, und man kann ihr vor Gebrauch Wasser oder andere Flüssigkeiten auf einfache Weise wieder zusetzen, ohne daß die Haftung am Behälter dadurch beeinträchtigt wird. Die Mikroorganismen werden dabei an der Oberfläche der Matrix zurückgehalten, wodurch eine bessere Identifizierung der zu untersuchenden Mikroorganismen möglich ist. Eine Nährstoffe enthaltende Matrix fördert das Wachstum der Mikroorganismen und beschränkt gleichzeitig ihr Schwärmen auf ein Minimum.

Für die Ausbildung der transparenten, unlöslichen, hydrophilen Gele bevorzugt verwendete Polymerisate sind: Polyäthylenoxid, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyacrylamid, Polyvinylmethyläther oder Mischpolymerisate von Maleinsäureanhydrid und Äthylen oder Vinylmethyläther.

Außerdem sind erfindungsgemäß Hydrogele von vernetzten hydrophilen Polymerisaten geeignet, die aus einem größeren Anteil eines polymerisierbaren Acrylsäure- oder Methacrylsäuremonoesters mit nur einer olefinischen Doppelbindung und einem kleineren Anteil eines polymerisierbaren Diesters einer dieser Säuren, wobei der Diester mindestens zwei olefinische Doppelbindungen aufweist, gebildet worden sind (vgl. USA.-Patentschrift 3 220 960).

Beispiele Tür erfindungsgemäß besonders bevorzugte unlösliche hydrophile Gele sind solche aus wasserunlöslichem Polyäthylenoxid, wasserunlöslichen Mischpolymerisaten von Äthylenoxid und Propylenoxid und wasserunlöslichen alkylsubstituierten Phenyläthern von Äthylenoxidpclymerisaten, die als Alkylgruppen Methyl- und/oder Butylgruppen enthalten. Diese Polymerisate sind bei jeder Temperatur wasserunlöslich, halten Flüssigkeiten, Lösungen und Suspensionen zurück und bilden Gele, insbesondere können sie sehr große Mengen Wasser, d. h. etwa das 10- bis lOOfache ihres Trockengewichts, aufnehmen.

Der hier verwendete Ausdruck »ionisierende Strahlung« bezeichnet eine Strahlung mit ausreichend hoher Energie, so daß die Polymerisatmoleküle und, falls ein Lösungsmittel verwendet wird, die Lösungsmittelmoleküle angeregt und/oder ionisiert werden. Geeignete Strahlenquellen sind Gammastrahlen erzeugende radioaktive Isotope, wie ⁶⁰Co und ¹³⁷Cs, Elemente aus verbrauchten Kernbrennstoffen, Röntgenstrahlen, z. B. solche, die von herkömmlichen Röntgenapparaten erzeugt werden, und Elektronenstrahlen, die z. B. von einem Van-de-Graaff-Generator, einem Linearbeschleuniger oder einem Resonanztransformator erzeugt werden. Die ionisierenden Strahlungen haben im allgemeinen eine Energie von etwa 0,05 bis 20 MeV.

Vor der Bestrahlung wird das Polymerisat in Wasser, einem herkömmlichen organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch von Wasser und einem wassermischbaren, organischen Lösungsmittel gelöst.

Die Strahlungsdosis, der die Polymerisatlösungen ausgesetzt werden müssen, hängt von einer Reihe von Variablen ab. Wenn die Bestrahlung mit verhältnismäßig niedriger Energie und in Gegenwart eines Radikalfängers, wie Sauerstoff, durchgeführt wird, sind im allgemeinen sehr hohe Gesamtdosen erforderlich. Wird dagegen die Bestrahlung unter Bedingungen durchgeführt, die eine verhältnismäßig lange Existenz der gebildeten freien Radikale fördern, z. B. wenn die Bestrahlung mit hoher Dosis in Abwesenheit von Sauerstoff oder in Lösung durchgeführt wird, wobei Sauerstoff schnell verbraucht wird, so bilden sich die unlöslichen hydrophilen Gele sehr rasch. Das bevorzugte Verfahren besteht darin, daß man eine wäßrige Lösung des betreffenden Polymerisats einer ionisierenden Strahlung mit einer Energie von etwa 0,50 bis etwa 20 MeV in einer Gesamtdosis von etwa 0,05 bis 10 Megarad aussetzt.

Die beim erfindungsgemäßen Verfahren gebildeten hydrophilen Gele bestehen vorzugsweise aus Polymerisaten, die Einheiten mindestens einer der nachstehenden allgemeinen Formeln enthalten:

R₁ R;

-CH — O-

-CH-O-

R₃ R₄

(H)

(III)

in denen R₁ ein Wasserstoffatom ist, wenn R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe ist, und R₂ ein Wasserstoffatom bedeutet, wenn R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenvl- oder Vinylgiuppe ist, R₃ ein Wasserstoffatom bedeutet, wenn R₄ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe ist, und R₄

2 Ol 1 366

ein WasserstolTatom bedeutet, wenn R₃ ein Wasserstoflatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinyigruppe ist.

Zur Herstellung der Nährbodenbehälter mit Matrix werden günstig Äthyienoxidpolymerisate mit einer reduzierten Viskosität von mindestens 0,5 bis mindestens 75 bzw. einer Viskosität von 225 cP in 5%iger wäßriger Lösung bei 25⁰C bis zu 12 00OcP und darüber in l%iger wäßriger Lösung bei 25° C verwendet. Besonders günstig sind Äthylenoxidhomopolymerisate und -mischpolymerisate, die mindestens 50 Gewichtsprozent Äthyienoxid in mischpolymerisierter Form mit bis zu 50 Gewichtsprozent mindestens eines weiteren niederen Alkylenoxids. wie Propylenoxid, Butylenoxid oder Styroloxid, enthalten.

Man mißt die reduzierte Viskosität nach folgender Methode: 100 ml Acetonitril werden in eine zylindrische, 226 ml fassende Flasche mit Schraubdeckelverschiuß gegeben. Unter ständigem Rühren werden 0,200 g des Polymerisats in die Flasche gegeben. Der Schraubdeckelverschluß der Flasche wird mit einem Stück Aluminiumfolie ausgekleidet, vorsichtig auf die Flasche gesetzt und fest verschlossen. Die Flasche wird in eine Drehschüttelmaschine mit einem Hub von 15,24 cm gespannt und 16 ± 0,5 Stunden geschüttelt. Anschließend wird die Lösung unter Druck durch eine grobe Glasfilterfritte filtriert. Es wird die Zeit gemessen, die die Lösung benötigt, um durch ein geeichtes Ubbelohde-Viskosime-er mit hängendem Niveau bei 30+ 0,0 Γ C zu fließen. Man verwendet eine gute Stoppuhr mit einem 10-Sekunden-Zifferblatt, das in Zehntelsekundeneinheiten eingeteilt ist, die bei einem Test über 60 Minuten mit 0,f% Genauigkeit arbeitet. Es wird außerdem die Zeit gemessen, in der das Acetonitril durch das Viskosimeter fließt.

Die Berechnung erfolgt nach folgenden Gleichungen

SS-

SS

SC-AC
AC

SV

= SC,

= SV

= RV.

Die nachstehende Tabelle erläutert das Verhältnis des Durchschnittsmolekulargewichts von Polyäthylenoxid zu dessen reduzierter Viskosität und zur Viskosität in wäßriger Lösung.

PoIy-

merisatcehalt

des

Aceto- Viskosität
nitrils

(Gewichtsprozent)

0,2 0,2

Durchschnittliches
Molgewicht

(Annäherungswert)

150 000
10 000000

Viskosität in wäßriger Lösung bei 25 C

200 c P (5gewichtsprozentige Lösung) 7000—9000 c P

(1 gewichtsprozentige Lösung)

Viskosimeterkorrektur,
Durchlaufzeit des Acetonitril Sek..
korrigierte Durchlaufzeit des Acetonitrils Sek.,

Durchlaufzeit der Polymerisatlösung, Sek., korrigierte Durchlaufzeit der Polymerisatlösung, Sek.,
spezifische Viskosität,
reduzierte Viskosität,
Konzentration des Polymerisats (g)
100 ml Acetonitril.

Der Ausdruck »Viskosität in wäßriger Lösung« bezieht sich auf die Viskosität der angegebenen Polymerisatkonzentration in Wasser, gemessen mit einem Brookfield-Viskosimeter, Modell RVF, unter Verwendung einer Spindel Nr. 1 mit 2 U/Min., falls nichts anderes angegeben ist. Die Viskosität wird bei etwa 24° C gemessen.
Wie vorstehend bereits erwähnt, besteht das hervorstechendste Merkmal der Erfindung darin, daß die Matrix mit dem Nährbodenbehälter fest verbunden ist, und zwar so fest, daß im allgemeinen der Behälter eher bricht, bevor sich die Matrix ablöst. In der Praxis wird diese innige Verbindung gleichzeitig mit der Bestrahlung bzw. dem Unlöslichmachen der Polymerisatlösung erzielt.

Es ist daher besonders wichtig, daß die Bestrahlungsdosis an der Grenzfläche zwischen Behälter und Matrix so hoch ist, daß beide fest miteinander verbunden werden und das Polymerisat unlöslich gemacht wird. Dabei ist zu beachten, daß bei einer Elektronenstrahlung einheitlicher Energie die Strahlungsdosis von der Eindringtiefe abhängt. Die an der Oberfläche der Lösung absorbierte Dosis beträgt etwa 60% der Maximaldosis. Die Maximaldosis wird bei etwa einem Drittel der Gesamteindringtiefe abgegeben und nimmt danach ab. Die Eindringtiefe, bei der die Ionisierung gleich der an der Oberfläche ist, entspricht etwa zwei Dritteln der Gesamteindringtiefe.

Wenn also alle Teile der Polymerisatlösung die gleiche Minimaldosis absorbieren sollen, beträgt die wirksame Eindringtiefe etwa zwei Drittel der Gesamteindringtiefe. Da ein Elektronenstrahl mit einer Energie von 1 MeV eine maximale Eindringtiefe von etwa

0,5 g/cm² besitzt, beträgt die wirksame Eindringtiefe etwa 0,33 g/cm². Das Unlöslichmachen des hydrophilen Gels und dessen Verbindung mit den Seiten und dem Boden des Behälters muß daher unter Bedingungen erfolgen, die eine geeignete Strahlungs-

dosis Tür alle Teile des Materials sichern.

Die nachstehende Tabelle I erläutert Eindringtiefe und Dicke von Polyäthylenoxidlösungen, die mit Elektronen verschiedener Energie bestrahlt werden können. Die »optimale Dicke« (wenn man eine Dichte von 1 annimmt) ist diejenige, bei der die Lösung oben und unten die gleiche Dosis aufnimmt, so daß das Gel mit dem Nährbodenbehälter zufriedenstellend verbunden wird.

2 Ol 1

Tabelle

Energie

0,5 MeV
1,0 MeV
2,0 MeV
3,0 MeV

Maximale
Eindringtiefe

(cm)

0,24
0,45
0,9
1,32

Verwendbare Dicke der Polymerisatlösung

0,18
0,37
0,73
1,07

Dosis	oben	)	Optimale Dicke der Polymerisatlösung	Dosis	oben	*)
1	unten	(cm)	1	unten
I	0,4	0,15	1	1
1	0,4	0,29	1	1
1	0,4	0,58	1	1
	0,4	0,87		1

") Wenn die an der Oberfläche aufgenommene Energie 1 Einheit beträgt, so beträgt die am Boden aufgenommene Dosis nur 0,4 der Oberflächendosis. *) Gleiche Dosen an der Oberfläche und am Boden.

Wenn man beispielsweise die Eindringtiefe in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdosis graphisch darstellt, wobei die bei einem Elektronenstrahl mit einer Energie von 1 MeV abgegebene Energie (In Prozent) μ gegen die Dicke der Polymerisatlösung aufgetragen wird, ergibt sich, daß für eine 85 ml fassende Petrischale etwa 16,4 cm³ der Polymerisatlösung erforderlich sind, damit die bei Eintritt in bzw. Austritt aus der Polymerisatlösung absorbierte Dosis gleich hoch ist. Es ist daher wichtig, die geeignete Bestrahlungsdosis zum Unlöslichmachen der Polymerisatlösung und zu ihrer Verbindung mit dem Nährbodenbehälter auszuwählen.

In der Praxis können erfindungsgemäß Nährbodenbehälter mit oder ohne Nährstoffzusätzen hergestellt werden. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Polymerisatlösungen unlöslich zu machen und die Nährstoffe unmittelbar vor Gebrauch zuzugeben. In anderen Fällen können die Nährstoffe der Polymerisatlösung bzw. dem hydrophilen Gel unmittelbar nach dessen Herstellung zugesetzt werden. Der erhaltene Nährbodenbehälter ist dann gebrauchsfertig.

Beispiele für verwendbare Nährstoffe sind Proteine und ihre Abbauprodukte, Nucleinsäuren und deren Abbauprodukte, Kohlenhydrate, Fette. Vitamine, Hormone, Diagnosehilfsmittel, Farbstoffe, anorganische Makro- und Mikronährstoffe.

Neben der Tatsache, daß die Matrix mit dem Nährbodenbehälter fest verbunden ist und daß die Nährstoffe in nahezu jedem Herstellungsstadium zugesetzt werden können, hat der Nährbodenbehälter den weiteren Vorteil, daß das die Matrix bildende hydrophile Gel entwässert und wieder mit Wasser versetzt gequollen werden kann. Diese Eigenschaft ist besonders vorteilhaft, wenn man sterile Matrizes über längere Zeiträume lagern oder verhältnismäßig große Mengen von Flüssigkeiten zugeben will, die die zu züchtenden Organismen enthalten. Zum Beispiel lassen sich zur Analyse von Wasser, Bier. Wein. Körperflüssigkeiten u. dgl. leicht Platten herstellen, indem man die Flüssigkeit einfach auf den ganz oder teilweise entwässerten Nährboden gießt und von der Nährbodenmatrix absorbieren läßt. Diese Eigenschaft ist auch dann von Vorteil, wenn nur wenige Organismen in der Flüssigkeit anwesend sind. Während man Agar nur mit einer geringen Menge Flüssigkeit bestreichen kann, kann man verhältnismäßig große Mengen Flüssigkeit auf die entwässerte Nährbodcnmatrix gießen. Dadurch sind auf der Matrix mehr Organismen anwesend, und sie lassen sich genauer identifizieren.

Die Matrix, die gegebenenfalls Nährstoffquellen enthtilt, kann auf beliebige Weise entwässert werden. Beispielswelse kann man den das unlöslich gemachte, hydrophile Gel enthaltenden Nährbodenbehälter mittels Infrarotstrahlen oder Heißluft trocknen. Im allgemeinen kann man das hydrophile Gel nahezu völlig entwässern, es bleibt trotzdem fest mit der Schale verbunden, wenn man ihm wieder Wasser zusetzt.

Das unlöslich gemachte, hydrophile OeI wirkt überdies als Filter und hü¹t die Organismen an seiner Oberfläche zurück. Dies 1st besonders vorteilhaft bei der mikrobiologischen Untersuchung von Flüssigkeiten, wie Wasser oder KörperflUssigkelten, die direkt auf das hydrophile OeI gegossen und von diesem absorbiert werden. Daher ist mit dem Vorteil, daß das hydrophile Gel mit dem Behälter fest verbunden ist und keine Flüssigkeit zwischen dem Gel und der Behälterwandung eindringen kann, der weitere Vorteil verbunden, daß die Organismen durch diese Filterwirkung an der Geloberfläche konzentriert sind.

Es wurde außerdem festgestellt, daß das Schwärmen von mobilen Organismen auf ein Minimum beschränkt ist. Bei einer gegebenen Anzahl von Kolonien auf Agar bzw. dem erfindungsgemäß verwendeten hydrophilen Gel zeigte sich, daß die auf dem letzteren gewachsenen Kolonien isoliert sind und sich leicht abtrennen lassen. Dadurch braucht mar in vielen Fällen keine Antibiotika oder sonstige Stoffe zuzugeben, um das Wachstum von Kolonien zn hemmen, die das der zu untersuchenden Organismer stören oder die Identifizierung erschweren.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung eines an Petrischalen fest verbundene hydrophilen Gels

In herkömmliche Petrischalen (Durchmesse 85 mm), die gereinigt worden waren, indem man si einer Strahlenentladung ausgesetzt hatte, werdei 15 m! einer 3,4gewichtsprozentigen wäßrigen Poly äthylenoxidlösung von Koagulierqualität gegeber Vor dem Eingießen wird die Lösung durch mecha nische Scherbeanspruchung auf einf Viskosität vo 500 bis 1000 cP unter der ursprünglichen Viskositä eingestellt. Durch Mikrofiltration werden Verur reinigungen abgetrennt, und die Lösung wird ai pH 7,0 eingestellt.

Die die Polyäthylenoxidlösung enthaltenden Sch; len werden dann mit energiereicher Strahlung ai einem Van-de-Graaff-Generator bestrahlt. Die al

309 584,3(

sorbierte Dosis beträgt etwa 0,7 Megarad während etwa 6 Sekunden. Nach der Bestrahlung werden die Schalen mittels Infrarotstrahlen getrocknet und entwässert, so daß das verbleibende Gel ein Gewicht von etwa 8 g aufweist. Sowohl vor als auch nach der Bestrahlung ist das Gel fest mit der Schale verbunden, und Versuche, es abzulösen, sind nicht erfolgreich.

Eine sterile Nährstoffquelle, z. B. Trypsin-Sojabrühe, wird hierauf in einige der Schalen gegeben. Die Konzentration der Nährbrühe wird so eingestellt, daß die Endkonzentration der üblicherweise für die Züchtung von Mikroorganismen verwendeten entspricht. Nach der Absorption der Nährbrühe können die Schalen beimpft werden.

In die übrigen Schalen wird hierauf Trypsin-Sojabrühe gegeben und 4 bis 6 Stunden einziehen gelassen. Das Gel wird dann mittels Heißluft praktisch bis zur Trockne weiter entwässert. Anschließend werden die Petrischalen in Polyäthylenfolien verpackt und mit Äthylenoxid sterilisiert.

Ein Teil der Schalen wird durch Zugabe der entsprechenden Menge destillierten Wassers gebrauchsfertig gemacht. Diese Platten werden für übliche mikrobiologische Untersuchungen verwendet.

Zu einem weiteren Teil der Schalen wird eine Probe ungereinigtes Wasser gegeben. Nach der Absorption des Wassers werden die Platten über Nacht bei 37,5°C inkubiert. Man erhält gut isolierte Kolonien der normalerweise in ungereinigtem Wasser enthaltenen Organismen.

Beispiele 2 bis 8

In ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 werden Nährböden enthaltende Petrischalen hergestellt, die andere unlösliche hydrophile Gele enthalten, die mit dem Boden und der Wandung der Schalen fest verbunden sind. Die verwendeten Polymerisate und andere An-

gaben sind in der nachstehenden Tabelle Il aufgeführt.

Tabelle II

Beispiel	Polymerisat
2	Polyvinylpyrrolidon
3	Polyvinylalkohol
4	Polyacrylamid
5	Polyvinylmethyläther
6	Polyacrylsäure
7	Maleinsäureanhydrid/Äthylen- Mischpolymerisat
8	Maleinsäureanhydrid/Vinylmethyl- äther-Mischpolymerisat

Konzentration der Lösung

(Gewichtsprozent)

4 3 3 und

2,5 pH

3,6 und 7,0
2,5 und 6,2
4,0, 5,4; 7,0

4.3, 2,5;
12,0

2.4, 4,0
2,4

2,0

Bestrahlungsdosis

(Megarad)

0,7—2,1
0,7—2,1
0,7—2,1
0,7-1,5

0,7—2,1
0,7—2,0

0,7—2,1

Aussehen der Gele

zufriedenstellend zufriedenstellend zufriedenstellend zufriedenstellend

zufriedenstellend zufriedenstellend

zufriedensicillend

Versuche, die unlöslichen hydrophilen Gele von liehen, zur Züchtung von Mikroorganismen verwenden Petrischalen abzulösen, indem man die umge- 45 deten Konzentration entspricht, dehten Schalen kräftig auf eine harte Oberfläche In Tabelle III it di M d

drehten Schalen kräftig auf eine harte Oberfläche schlägt, sind nicht erfolgreich. Weitere Versuche, die Gele durch Biegen der Schalen selbst abzulösen, führen zum Bruch der Schalen. Die Gele bleiben unversehrt.

Beispiel 9

Zum Vergleich der wachstumsfördernden Eigenschaften von Platten mit Nährstoffe enthaltenden, hydrophilen Gelen der Erfindung, und solchen mit Agar, das dieselben Nährstoffe enthält, wird eine Reihe von Petrischalen, die das gemäß Beispiel 1 unlöslich gemachte, koagulierte Polyäthylenoxid und Nährstoffe und solche, die Agar und Nährstoffe enthalten, hergestellt und mit Escherichia coli beimpft.

Die Polyäthylenoxid-Platten werden gemäß Beispiel 1 hergestellt,und das Gel wird, wie in der nachstehenden Tabelle III angegeben, auf ein Gewicht von 7,0 bis 8,0 g je Platte entwässert. Zu jeder Platte wird die angegebene Menge Trypsin-Sojabrühenlösung gegeben, deren Konzentration so eingestellt wird, daß sie bei Gleichgewicht der Lösung mit dem Gel. einer Agar-Platte mit Nährstoifen in der übtration entspricht.

In Tabelle III ist die Menge des entwässerten Gels die verwendete Menge Trypsin-Sojabrühe (in MiHi liter) und deren Konzentration angegeben.

Tabelle III

	Gewicht des	TS B-Lösung
Serie	entwässerten Gels	(m!)
	<g>	3,0
1	7,0	5,0
2	7,0	3,0
3	8,0	5,0
4	8,0	3,0
5	7,0	5,0
6	7,0

Tilcr der TSB lösung

(n)

3,33 2,40 3,68 2,60 3,33 2,40

Die Agar-Platten werden auf herkömmliche Weis hergestellt, indem man 15,0 g Trypsin-Sojabrühe i 500 ml destilliertem Wasser suspendiert, dem 7,5 Bacto-Agar zugesetzt worden waren. Die Suspensio

2 Ol1 366

wird hierauf gekocht, bis der gesamte Agar gelöst ist, und anschließend 15 Minuten bei 121^c C im Dampf sterilisiert. Anschließend werden Platten mit dem gleichen Volumen pro Schale gegossen wie bei dem Polyäthylenoxid.

Beide Plattenarten werden nach der folgenden Methode mit Escherichia coli beimpft:

Eine 24 Stunden alte Kultur von Escherichia coli in Trypsin - Sojabrühe wird nacheinander vom 10~'fachen auf das 10~⁷fache verdünnt, indem man jeweils 1,0 ml in 9,0 ml sterile Kochsalzlösung gibt. Anschließend werden jeweils 0,1 ml der auf das 10~⁶fache verdünnten Lösung aseptisch auf jeweils 20 Polyäthylenoxid- und 20 Agar-Platten gegeben. In ähnlicher Weise werden jeweils 0,1 ml der 10~⁷fach verdünnten Lösung aseptisch auf jeweils 20 Polyäthylenoxid- und 20 Agar-Platten gegeben. 0,1ml der 10~⁶fach verdünnten Lösung entsprechen einer Beimpfung von 10"⁷/ml und 0,1 ml der 10"⁷fach verdünnten Lösung einer Beimpfung von 10~⁸/ml.

Die Organismen werden auf der Oberfläche der Polyäthylenoxid- und der Agar-Platten durch Aufstreichen mit einem sterilen, gebogenen Glasstab verteilt. Auf diese Weise wird eine gleichmäßige Verteilung der eingeimpften Organismen auf den Oberflächen der Nährböden und das Wachstum von zählbaren, isolierten Kolonien gewährleistet. Die Platten werden hierauf 24 Stunden bei 37,5⁰C inkubiert. Anschließend werden die Kolonien mittels eines Kolonienzählers gezählt.

In Tabelle IV ist die Durchschnittszahl der Kolonien für jeweils 10 Platten mit Poiyail.ylenoxid bzw. Agar bei einer 1Q~⁷- bzw. 10~⁸iachen Verdünnung angegeben.

Tabelle IV

Anzahl der Kolonien

Durchschnittliche
Verdünnung

ΙΟ"⁷
ΙΟ"⁸

Serie
I

219

25

Serie

214
21

Serie
3

229
24

Serie

203
23

Serie
5

212
25

Serie
6

212

20

Agar-Serie

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Polyäthylenoxid-Platten hinsichtlich der Anzahl der Organismen eine bessere Wachstumsförderung zeigen als die Agar-Platten.

Beispiel 10

Es wird eine Nährlösung von Trypsin-Sojabrühe mit geeigneter Konzentration hergestellt und im Dampf sterilisiert. Die in Kolben enthaltene Lösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und mit nicht aufbereitetem Süßwasser versetzt. Die Kolben werden hierauf einige Zeit geschüttelt, um eine gleichmäßige Dispersion des Süßwassers und der darin als Verunreinigungen enthaltenen Organismen zu erreichen.

Auf eine Reihe von nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellten Platten mit 8 g Polyäthylenoxid-Gel werden jeweils 7,0 ml der vorstehenden Lösung unter aseptischen Bedingungen gegossen. Die Lösung wird auf der ganzen Geloberfläche durch leichtes Kippen und Drehen der Platten gleichmäßig verteilt. Anschließend werden die Platten bei Raumtemperatur

so lange stehengelassen, bis das Gel die Lösung ganz absorbiert hat, und hierauf 24 Stunden bei 37,5° C inkubiert. Jede Platte ist mit den verschiedensten, als Verunreinigungen im Wasser enthaltenen Organismen besiedelt; die Kolonien sind isoliert und treten nur an der Geloberfläche auf. Unter der Geloberfläche werden keine Organismen festgestellt, woraus sich ergibt, daß sie das Gel vollständig zurückgehalten hat.

In ähnlicher Weise wird sterile Trypsin-Sojabrühe mit einer 10~⁷fach verdünnten Lösung von Escherichia coli versetzt. 7,0 ml dieser Lösung werden auf das entwässerte Polyäthylenoxid gegeben, und die Platten werden wie vorstehend beschrieben inkubiert. Alle Organismen werden an der Geloberfläche zurückgehalten, es wird kein Organismenwachstum unterhalb der Oberfläche festgestellt.

Beispiel II

Zum Nachweis der Verhinderung des Schwärmens von Mikroorganismen der Gattung Proteus werden Versuche durchgeführt, bei denen das Schwärmen von Kulturen auf Platten, die unter Verwendung von Polyäthylenoxid von Koagulierqualität bzw. von Agar hergestellt worden waren, verglichen wird. Die Polyäthylenoxid-Platten werden hergestellt, indem man 1,0 ml Trypsin-Sojabrühe aufteilweise entwässerte Polyäthylenoxid-Platten gibt, die nach Beispiel 1 hergestellt worden waren. Das Gewicht des Gels vor der Zugabe beträgt 8,0 g. Die Konzentration der Trypsin-Sojabrühe wird so eingestellt, daß die erhaltene Platte die übliche Nährstoffkonzentration aufweist. Es werden Agar-Platten mit der gleichen Konzentration von Trypsin-Sojabrühe hergestellt, indem man der Nährlösung 1,5% Agar zusetzt.

20 Polyäthylenoxid- und 20 Agar-Platten werden jeweils mit 0,1 ml einer 10~⁶fach verdünnten, 24 Stunden alten Kultur von Proteus mirabilis versetzt. Das Impfgut wird mittels eines sterilen, gebogenen Glasstabs gleichmäßig auf der Geloberfläche verteilt, und die Platte wird 24 Stunden bei 37,5° C inkubiert. Die Agar-Platten weisen eine kräftige Wachstumsschicht

15. über der gesamten Oberfläche auf, was auf die starke Ausbreitung der Proteus-Organismen zurückzuführen ist. Es sind keine isolierten Kolonien vorhanden und daher ist eine Kolonienzählung nicht möglich Bei den Polyäthylenoxid-Platten erhält man dagegen sehr gut isolierte Kolonien, da die Ausbreitung dei Mikroorganismen gehemmt wurde. Die Polyäthylenoxid-Platten weisen etwa 100 bis 200 gut abgegrenzt« Einzeikolonien auf, die sich nicht ausbreiten. Irr . Gegensatz zu den Agar-Platten lassen sich die KoIonien leicht zählen.

Beispiel 12

Zur Feststellung der wachstumsfördernden Eigenschaften anderer erfindungsgemäß verwendbarer unlöslicher, hydrophiler Gele werden Nährböden ir Petrischalen hergestellt, die die verschiedenen Poly merisate enthalten, und mit verschiedenen Kulturer beimpft. Die hydrophilen Gele werden nach Beispiel 1 aus Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyvinyl methyiäther, Polyacrylamid oder Mischpolymerisater von Maleinsäureanhydrid und Äthylen oder Vinyl

.14

13 14

methyläther hergestellt. Außerdem wird das hydro- weisen bessere wachstumsfördernde Eigenschal

phile Gel gemäß der USA.-Patentschrift 3 220960 hinsichtlich der Anzahl der erhaltenen Organisti

verwendet. auf als die Agar-Platten. Ähnliche Versuche ergel

Zu Vergleichszwecken werden Platten mit Agar außerdem, daß diese Stoffe als Filter wirken und

und den gleichen Nährstoffen verwendet. D.a die 5 Schwärmen von Mikroorganismen auf ein Minim

unlöslichen Polymerisate enthaltenden Petrischalen beschränken.

Claims (1)

2 Ol I Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstel.ung eines Nährbodenbehälters mit Matrix, wobei eine wäßrige PoIymerisatlösung irn Behälter selbst durch Bestrahlung in ein unlösliches hydrophiles Gel überführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß durch Verwendung einer ionisierenden Strahlung und entsprechender Einstellung von optimaler Dicke der Polymerisatlösung und Strahlungsenergie die gleiche Strahlungsdosis an die Oberfläche der Polymerisatlösung und die Grenzfläche zwischen Lösung und Behälterwand abgegeben und eine vernetzte Polymerisatmatrix der nachstehenden allgemeinen Formel erzeugt wird