DE2011366C3

DE2011366C3 - Verfahren zur Herstellung eines Nährbodenbehälters mit Matrix

Info

Publication number: DE2011366C3
Application number: DE19702011366
Authority: DE
Inventors: Robert Harold Pomona Eikhof; Paul Arliss Warwick King; John Riverdale Nobile
Original assignee: Union Carbide Corp
Current assignee: Union Carbide Corp
Priority date: 1969-03-10
Filing date: 1970-03-10
Publication date: 1974-09-05
Also published as: DE2011366B2; NL7003392A; GB1295337A; DE2011366A1; BE747154A; FR2037915A5; CH525958A; CA924224A

Description

R₁-O-

-c—c—o-

-R,

O)

20

in der R₁ und R₂ Wasserstoffatome, Alkylgruppen oder alkylsubstituierte Arylgruppen bedeuten und R₃ ein Wasserstoffatom ist, wenn R₄ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe ist, R₄ ein Wasserstoffatom bedeutet, wenn R₃ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe ist, R₅ ein Wasserstoffatom ist, wenn R₆ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe bedeutet, und R₆ ein Wasserstoffatom bedeutet, wenn R₅ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder eine Vinylgruppe ist, und in der η größer als ! ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix ein vernetztes Polyäthylenoxid, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyacrylamid, Polyvinylmethyläther oder ein vernetztes Mischpolymerisat von Maleinsäureanhydrid und Äthylen oder Vitiylmethyläther oder ein vernetztes Mischpolymerisat aus einer größeren Menge eines Acryl- oder Methacrylsäuremonoesters mit einer einzigen olefinischen Doppelbindung und einer geringeren Menge eines Diesters 45· einer dieser Säuren mit mindestens zwei olefinischen Doppelbindungen ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Polymerisatlösung Nährstoffe zugesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den Nährbodenbehälter · mit Matrix in Form eines unlöslichen hydrophilen Gels mittels Infrarotstrahlen oder Heißluft trocknet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine ionisierende Strahlung von etwa 0,50 bis etwa 20 MeV in einer Gesamtdosis von etwa 0,05 bis 10 Megarad angewendet wird.

Das gebräuchlichste bekannte Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen besteht darin, daß man ein Nährstoffgemisch beimpft, das mittels Agar verfestigt worden war und sich in einer Petrischale Da Agar aus pflanzlichen Rohstoffen hergestellt wird, ergeben sich bei seiner Verwendung verschiedene Nachteile. Werden beispielsweise verschiedene Arten und Gattungen von Algen zur Herstellung von Agar verwendet, so führt dies bei der festen Phase zu Unterschieden in der Gelfestigkeit, der Elastizität, Synärese, Viskosität, Transparenz, im Aschegehalt und im Gehalt an Verunreinigungen.

Ein weiterer wesentlicher Nachteil von Agar-Nährboden besteht darin, daß sie an der Innenoberfläche einer Petrischale nicht gut haften. Dreht man die Schale um und schlägt kräftig dagegen, so löst sich der Nährboden meist ganz von der Schale oder wenigstens in dem Maße, daß Organismen in die entstehenden Hohlräume eindringen können.

Es sind bereits Nährbodenbehälter aus einem thermoplastischen Kunststoff, nämlich Polystyrol, bekannt, z.B. der Einwegbehälter nach der USA.-Patentschrift 2 874091, bei dem der Agar-Nährboden an der Schale haften soll. Diese Nährböden lösen sich aber doch bei einem kräftigen Schlag ab, wie er z. B. beim Transport oder in der Praxis vorkommen kann.

In der USA.-Patentschrift 3247 078 ist ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen unter Verwendung einer Polyäthylenoxid-Matrix beschrieben. Nach diesem Verfahren wird das Polymerisat entwässert und in herkömmlicher Weise zu kleinen Teilchen vermählen. Der Nährboden wird hierauf „ durch Zugabe von Wasser und einem oder mehreren Nährstoffen hergestellt, mit dem Nährbodenbehälter jedoch nicht fest verbunden und kann sich daher genauso wie ein Agar-Nährboden ablösen.

Es ist auch schon eine als Nährboden geeignete Matrix beschrieben worden, welche durch Bestrahlung einer im Nährbodenbehälter befindlichen wäßrigen Polymerisatlösung hergestellt wird, wobei sich durch die Bestrahlung ein unlösliches hydrophiles Gel aus Polyacrylamid bildet. Die Bestrahlung erfolgt mit sichtbarem Licht in Gegenwart von organischen Katalysatoren, wie Riboflavin. Eine dauerhafte feste Verbindung zwischen der Matrix und dem Nährbodenbehälter, durch die eine Ablösung der Matrix wirksam verhindert wird, läßt sich auf diese Weise aber nicht erzielen.

überraschenderweise kann das vorstehend geschilderte Problem aber durch Maßnahmen behoben werden, welche im wesentlichen auf der gleichförmigen Einwirkung von ionisierender Strahlung beruhen und wobei die Oberfläche der verwendeten Polymerisatlösung sowie die Grenzfläche zwischen Lösung und Behälterwand die gleiche Strahlungsdosis empfangen. Auf diese Weise wird eine so feste Verbindung zwischen dem Hydrogel der Matrix und der Wand des Nährbodenbehälters erzielt, daß eher der Behälter zerstört wird als daß sich diese Verbindung löst.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Nährbodenbehälters mit Matrix, wobei eine wäßrige Polymerisatlösung im Behälter selbst durch Bestrahlung in ein unlösliches hydrophiles Gel überführt wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß durch Verwendung einer ionisierenden Strahlung und entsprechender Einstellung von optimaler Dicke der Polymerisatlösung und Strahlungsenergie die gleiche Strahlungsdosis an die Oberfläche der Polymerisatlösung und die Grenzfläche zwischen Lösung und Behälterwand abgegeben und ^ine vernetzte Poly-

merisatmatrix der nachstehenden allgemeinen Formel erzeugt wird

R₁-O-

R₃ R₄

-c— c—o I I
R₅ R₆

(D

in der R_t und R₂ Wasserstoffatome. Alkylgruppen oder alkylsubstituierte Arylgruppen bedeuien und R₃ ein Wasserstoffatom ist, wenn R₄ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe ist, R₄ ein Wasserstoffatom bedeutet, wenn R₃ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-. Phenyl- oder Vinylgruppe ist, R₅ ein Wasserstoffatom >st, -venn

R₆ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe bedeutet, und R₆ ein Wasserstoffatom bedeutet, wenn R₅ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe ist, und in der η größer als 1 ist.

Die unter Verwendung der vorgenannten vernetzten Polymerisate hergestellten Nährbodenbehälter mit Matrix haben folgende Vorteile:

Sie werden nur einmal verwendet und können vor Gebrauch sterilisiert und transportiert werden, ohne daß sich die Matrix vom Behälter ablöst. Die Matrix im Behälter kann in entwässerter Form gelagert oder transportiert werden, und man kann ihr vor Gebrauch Wasser oder andere Flüssigkeiten auf einfache Weise wieder zusetzen, ohne daß die Haftung am Behälter dadurch beeinträchtigt wird. Die Mikroorganismen werden dabei an der Oberfläche der Matrix zurückgehalten, wodurch eine bessere Identifizierung der zu untersuchenden Mikroorganismen möglich ist. Eine Nährstoffe enthallende Matrix fördert das Wachstum der Mikroorganismen und beschränkt gleichzeitig ihr Schwärmen auf ein Minimum.

Für die Ausbildung der transparenten, unlöslichen, hydrophilen Gele bevorzugt verwendete Polymerisate sind: Polyäthylenoxid, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyacrylamid, Polyvinylmethyläther oder Mischpolymerisate von Maleinsäureanhydrid und Äthylen oder Vinylmethyläther.

Außerdem sind erfindungsgemäß Hydrogele von vernetzten hydrophilen Polymerisaten geeignet, die aus einem größeren Anteil eines polymerisicrbaren Acrylsäure- oder Methacrylsäuremonoesters mit nur einer olefinischen Doppelbindung und einem kleineren Anteil eines polymerisierbaren Diesters einer dieser Säuren, wobei der Diester mindestens zwei olefinische Doppelbindungen aufweist, gebildet worden sin'« (vgl. USA.-Patentschrift 3 220 960).

Beispiele für erfindungsgemäß besonders bevorzugte unlösliche hydrophile Gele sind solche aus wasserunlöslichem Polyäthylenoxid, wasserunlöslichen Mischpolymerisaten von Äthylenoxid und Propylenoxid und wasserunlöslichen alkylsubstituierten Phenyläthern von Äthylenoxidpolymerisaten, die als Alkylgruppen Methyl- und/oder Butylgruppen enthalten. Diese Polymerisate sind bei jeder Temperatur wasserunlöslich, halten Flüssigkeiten. Lösungen und Suspensionen zurück und bilden Gele, insbesondere können sie sehr große Mengen Wasser. d. h. etwa das 10- bis lOOfache ihres Trockengewichts. aufnehmen

Der hier verwendete Ausdruck »ionisierende Strahlung« bezeichnet eine Strahlung mit ausreichend hoher Energie, so daß die Polymerisatmoleküle und, falls ein Lösungsmittel verwendet wird, die Lösungsmittelmoleküle angeregt und/oder ionisiert werden. Geeignete Strahlenquellen sind Gammastrahlen erzeugende radioaktive Isotope, wie ⁶⁰Co und ¹³⁷Cs, Elemente aus verbrauchten Kernbrennstoffen, Röntgenstrahlen, z. B. solche, die von herkömmlichen ίο Röntgenapparaten erzeugt werden, und Elektronenstrahls, die z. B. von einem Van-de-Graaff-Generator, einem Linearbeschleuniger oder einem Resonanztransformator erzeugt werden. Die ionisierenden Strahlungen haben im allgemeinen eine Energie von etwa 0,05 bis 20 MeV.

Vor der Bestrahlung wird das Polymerisat in Wasser, einem herkömmlichen organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch von Wasser und einem wassermischbaren, organischen Lösungsmittel gelöst. Die Strahlungsdosis, der die Polymerisatlösungen ausgesetzt werden müssen, hängt von einer Reihe von Variablen ab. Wenn die Bestrahlung mit verhältnismäßig niedriger Energie und in Gegenwart eines Radikalfängers, wie Sauerstoff, durchgeführt wird, sind im allgemeinen sehr hohe Gesamtdosen erforderlich. Wird dagegen die Bestrahlung unter Bedingungen durchgeführt, die eine verhältnismäßig lange Existenz der gebildeten freien Radikale fördern, z. B. wenn die Bestrahlung mit hoher Dosis in Ab-Wesenheit von Sauerstoff oder in Lösung durchgeführt wird, wobei Sauerstoff schnell verbraucht wird, so bilden sich die unlöslichen hydrophilen Gele sehr rasch. Das bevorzugte Verfahren besteht darin, daß man eine wäßrige Lösung des betreffenden PoIymerisats einer ionisierenden Strahlung mit einer Energie von etwa 0,50 bis etwa 20 MeV in einer Gesamtdosis von etwa 0,05 bis 10 Megarad aussetzt. Die beim erfindungsgemäßen Verfahren gebildeten hydrophilen Gele bestehen vorzugsweise aus PoIymerisaten, die Einheiten mindestens einer der nachstehenden allgemeinen Formeln enthalten:

4-C CH-O-

■4-C CH-Ο

(H)

oder

(UI)

in denen R₁ ein Wasserstoffatom ist. wenn R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe ist, und R₂ ein Wasserstoffatom bedeulet. wenn R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Phony)- oder Vinylgruppe ist, R₃ ein Wasserstoffatom bedeutet, wenn R₄ ein Wasserstoffatom oder cine Methyl-. Phenyl- oder Vinylgruppe ist, und R₄

em Wasserstoflatom bedeutet, wenn R₃ ein Wassersioiiatom oder eine Methyl-, Phenyl- oder Vinylgruppe ist.

Zur Herstellung der Nährbodenbehälter mit Mainx werden günstig Äthylenoxidpolymerisate mit einer reduzierten Viskosität von mindestens 0,5 bis mindestens 75 bzw. einer Viskosität von 225 cP in 3 /olger wäßriger Lösung bei 25 C bis zu 12 00OcP und darüber in l%iger wäßriger Lösung bei 25^CC verwendet. Besonders günstig sind Äthylenoxidhomopolymerisate und -mischpolymerisate, die mindestens 50 Gewichtsprozent Äthylenoxid in mischpolymerisierter Form mit bis zu 50 Gewichtsprozent mindestens eines weiteren niederen Alkylenoxide, wie Propylenoxid, Butylenoxid oder Styroloxid, enthalten.

Man mißt die reduzierte Viskosität nach folgender Methode: 100 ml Acetonitril werden in eine zylindrische, 226 ml fassende Flasche mit Schraubdeckelverschluß gegeben. Unter ständigem Rühren werden 0,200 g des Polymerisats in die Flasche gegeben. Der Schraubdeckelverschluß der Flasche wird mit einem Stück Aluminiumfolie ausgekleidet, vorsichtig auf die Flasche gesetzt und fest verschlossen. Die Flasche wird in eine Drehschüttelmaschine mit einem Hub von 15,24 cm gespannt und 16 ± 0,5 Stunden geschüttelt. Anschließend wird die Lösung unter Druck durch eine grobe Glasfiherfritte nitriert. Es wird die Zeit gemessen, die die Lösung benötigt, um durch ein geeichtes Ubbelohde-Viskosimeter mit hängendem Niveau bei 30 + 0,0!° C zu fließen. Man verwendet eine gute Stoppuhr mit einem 10-Sekunden-Zifferblatt, das in Zehntelsekundeneinheiten eingeteilt ist, die bei einem Test über 60 Minuten mit 0,1% Genauigkeit arbeitet. Es wird außerdem die Zeit gemessen, in der das Acetonitril durch das Viskosimeter fließt.

Die Berechnung erfolgt nach folgenden Gleichungen

Die nachstehende Tabelle erläutert das Verhältnii des Durchschnittsmolekulargewichts von Polyäthy lenoxid zu dessen reduzierter Viskosität und zu Viskosität in wäßriger Lösung.

AS-

SS

AS

SS

SC -AC

AC

SV
K

AC,

= SC,

= SV,

= RV.

40

45

PoIy-	Reduzierte
merisat-	Viskosität
gehah
des
Aceto
nitrils	1,5
(Gewichts	60
prozent)
0,2
0,2

Durchschnittliches
Molgewicht

(Annäherungswert)

150 000

10000000

Viskosität in wäßriger Lösung bei 25' C

200 <. P (5gewichts-

prozentige Lösung)

7000—9000 cP

(1 gewichtsprozentige Lösung)

Viskosimeterkorrektur,
Durchlaufzeit des Acetonitrils, Sek.,
korrigierte Durchlaufzeit des Acetonitrils. Sek.,

Durchlaufzeit der Polymerisatlösung. Sek.. korrigierte Durchlaufzeit der Polymerisatlösung, Sek.,
spezifische Viskosität.
reduzierte Viskosität.
Konzentration des Polymerisats (g)
100 ml Acetonitril.

55

60

in Der Ausdruck »Viskosität in wäßriger Lösung« bezieht sich auf die Viskosität der angegebenen Polymerisatkonzentration in Wasser, gemessen mit einerr Brookfield-Viskosimeter, Modell RVF, unter Verwendung einer Spindel Nr. 1 mit 2 U/Min., falls nicht., anderes angegeben ist. Die Viskosität wird bei etwa 24° C gemessen.

Wie vorstehend bereits erwähnt, besteht das hervorstechendste Merkmal der Erfindung darin, daC die Matrix mit dem Nährbodenbehälter fest verbun den ist, und zwar so fest, daß im allgemeinen dei Behälter eher bricht, bevor sich die Matrix ablöst In der Praxis wird diese innige Verbindung gleich zeitig mit der Bestrahlung bzw. dem Unlöslich machen der Polymerisatlösung erzielt.

Es ist daher besonders wichtig, daß die Bestrahlungsdosis an der Grenzfläche zwischen Behälter und Matrix so hoch ist, daß beide fest miteinander verbunden werden und das Polymerisat unlöslich gemacht wird. Dabei ist zu beachten, daß bei einei Elektronenstrahlung einheitlicher Energie die Strahlungsdosis von der Eindringtiefe abhängt. Die an dei Oberfläche der Lösung absorbierte Dosis beträgt etwa 60% der Maximaldosis. Die Maximaldosis wird bei etwa einem Drittel der Gesamteindringtiefe abgegeben und nimmt danach ab. Die Eindringtiefe, be der die Ionisierung gleich der an der Oberfläche ist, entspricht etwa zwei Dritteln der Gesamteindringtiefe. Wenn also alle Teile der Polymerisatlösung die gleiche Minimaldosis absorbieren sollen, beträgt die wirksame Eindringtiefe etwa zwei Drittel der Gesamteindringtiefe. Da ein Elektronenstrahl mit einer Energie von 1 MeV eine maximale Eindringtiefe von etwa 0,5 g/cm² besitzt, beträgt die wirksame Eindringliefe etwa 0,33 g/cm². Das Unlöslichmachen des hydrophilen Gels und dessen Verbindung mit den Seiten und dem Boden des Behälters muß daher unter Bedingungen erfolgen, die eine geeigneis Strahlungsdosis für alle Teile des Materials sichern.

Die nachstehende Tabelle I erläutert Eindringtiefc und Dicke von Polyäthylenoxidlösungen, die mil Elektronen verschiedener Energie bestrahlt werden können. Die »optimale Dicke« (wenn man eine Dichte von 1 annimmt) ist diejenige, bei der die Lösung oben und unten die gleiche Dosis aufnimmt, so daf.¹ das Gel mit dem Nährbodenbehälter zufriedenstellend verbunden wird.

	7	2 01	1 366	Dosis")	oben	unten
			1	0,4
		Tabelle 1	1	0.4
	Eindringtiefe	Verwendbare Dicke	1	0,4
Energie	(cm)	der Polymerisal- !ösimg	1	0,4
	0,24	(cm)
0,5 MeV	0,45	0,18
1,0MeV	0,9	0,37
2,0 MeV	1,32	0,73
3,0 MeV	1,07

Optimale Dicke der Polymerisatlösung

(cm)

0,15
0,29
0,58
0,87

Dosis"

oben

") Wenn die an der Oberfläche aufgenommene Energie 1 Einheit beträgt, so beträgt die am Boden aufgenommene Dosis nur 0,4 der Oberflächendosis. ^h) Gleiche Dosen ari der Oberfläche und am Boden.

Wenn man beispielsweise die Eindringtiefe in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdosis graphisch darstellt, wobei die bei einem Elektronenstrahl mit einer Energie von 1 MeV abgegebene Energie (in Prozent) gegen die Dicke der Polymerisatlösung aufgetragen wird, ergibt sich, daß für eine 85 ml fassende Petrischale etwa 16,4 cm³ der Polymerisatlösung erforderlich sind, damit die bei Eintritt in bzw. Austritt aus der Polymerisatlösung absorbierte Dosis gleich hoch ist. Es ist daher wichtig, die geeignete Bestrahlungsdosis zum Unlöslichmachen der Polymerisatlösung und zu ihrer Verbindung mit dem Nährbodenbehälter auszuwählen.

In der Praxis können erftndungsgemäß Nährbodenbehälter mit oder ohne Nährstoffzusätzen hergestellt werden. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Polymerisatlösungen unlöslich zu machen und die Nährstoffe unmittelbar vor Gebrauch zuzugeben. In anderen Fällen können die Nährstoffe der Polymerisatlösung bzw. dem hydrophilen Gel unmittelbar nach dessen Herstellung zugesetzt werden. Der erhaltene Nährbodenbehälter ist dann gebrauchsfertig.

Beispiele für verwendbare Nährstoffe sind Proteine und ihre Abbauprodukte, Nucleinsäuren und deren Abbauprodukte, Kohlenhydrate, Fette, Vitamine. Hormone, Diagnosehilfsmittel, Farbstoffe, anorganische Makro- und Mikronährstoffe.

Neben der Tatsache, daß die Matrix mit dem Nährbodenbehälter fest verbunden ist und daß die Nährstoffe in nahezu jedem Herstellungsstadium zugesetzt werden können, hat der Nährbodenbehälter den weiteren Vorteil, daß das die Matrix bildende hydrophile Gel entwässert und wieder mit Wasser versetzt gequollen werden kann. Diese Eigenschaft ist besonders vorteilhaft, wenn man sterile Matrizes über längere Zeiträume lagern oder verhältnismäßig große Mengen von Flüssigkeiten zugeben will, die die zu züchtenden Organismen enthalten. Zum Beispiel lassen sich zur Analyse von Wasser. Bier, Wein. Körperflüssigkeiten u. dgl. leicht Platten herstellen, indem man die Flüssigkeit einfach auf den ganz oder teilweise entwässerten Nährboden gießt und von der Nährbodenmatrix absorbieren läßt. Diese Eigenschaft ist auch dann von Vorteil, wenn nur wenige Organismen in der Flüssigkeit anwesend sind. Während man Agar nur mit einer geringen Menge Flüssigkeit bestreichen kann, kann man verhältnismäßig große Mengen Flüssigkeit auf die entwässerte Nährbodenmatrix gießen. Dadurch sind auf der Matrix mehr Organismen anwesend, und sie lassen sich genauer identifizieren.

Die Matrix, die gegebenenfalls Nährstoffquellen enthält, kann auf beliebige Weise entwässert werden. Beispielsweise kann man den das unlöslich gemachte.

hydrophile Gel enthaltenden Nährbodenbehälter mittels Infrarotstrahlen oder Heißluft trocknen. Im allgemeinen kann man das hydrophile Gel nahezu völlig entwässern, es bleibt trotzdem fest mit der Schale verbunden, wenn man ihm wieder Wasser zusetzt.

Das unlöslich gemachte, hydrophile Gel wirkt überdies als Filter und hält die Organismen an seiner Oberfläche zurück. Dies ist besonders vorteilhaft bei der mikrobiologischen Untersuchung von Flüssigkeiten, wie Wasser oder Körperflüssigkeiten, die direkt auf das hydrophile Gel gegossen und von diesem absorbiert werden. Daher ist mit dem Vorteil, daß das hydrophile Gel mit dem Behälter fest verbunden ist und keine Flüssigkeit zwischen dem Gel und der Behälterwandung eindringen kann, der weitere Vorteil verbunden, daß die Organismen durch diese Filterwirkung an der Geloberfläche konzentriert sind.

Es wurde außerdem festgestellt, daß das Schwärmen von mobilen Organismen auf ein Minimum beschränkt ist. Bei einer gegebenen Anzahl von Kolonien auf Agar bzw. dem erfindungsgemäß verwendeten hydrophilen Gel zeigte sich, daß die auf dem letzteren gewachsenen Kolonien isoliert sind und sich leicht abtrennen lassen. Dadurch braucht man in vielen Fällen keine Antibiotika oder sonstige Stoffe zuzugeben, um das Wachstum von Kolonien zu hemmen, die das der zu untersuchenden Organismen stören oder die Identifizierung erschweren. Die Beispiele erläutern die Erfindung.

50

Beispiel 1

Herstellung eines an Petrischalen fest verbundener hydrophilen Gels

In herkömmliche Petrischalen (Durchmesse 85 mm), die gereinigt worden waren, indem man sii einer Strahlenentladung ausgesetzt hatte, werdei 15 ml einer 3.4gewichtsprozentigen wäßrigen Poly athylenoxidlösung von Koagulierqualität gegeber Vor dem Eingießen wird die Lösung durch mecha nische Scherbeanspruchung auf eine Viskosität vo 500 bis 1000 cP unter der ursprünglichen Viskosits eingestellt. Durch Mikrofiltration werden Verur reinigungen abgetrennt, und die Lösung wird ai pH 7.0 eingestellt.

Die die Polyäthylenoxidlösung enthaltenden Sch; len werden dann mit energicreicher Strahlung ai einem Van-de-Graaff-Gcncrator bestrahlt. Die al

409 636/2!

2 Ol 1

sorbierte Dosis beträgt elwa 0,7 Megarad während etwa 6 Sekunden. Nach der Bestrahlung werden die Schalen mittels Infrarotstrahlen getrocknet und entwässert, so daß das verbleibende Gel ein Gewicht von etwa 8 g aufweist. Sowohl vor als auch nach der Bestrahlung ist das Gel fest mit der Schale verbunden, und Versuche, es abzulösen, sind nicht erfolgreich.

Eine sterile Nährstoffquelle, z. B. Trypsin-Sojabrühe, wird hierauf in einige der Schalen gegeben. Die Konzentration der Nährbrühe wird so eingestellt, daß die Endkonzentration der üblicherweise für die Züchtung von Mikroorganismen verwendeten entspricht. Nach der Absorption der Nährbrühe können die Schalen beimpft werden.

In die übrigen Schalen wird hierauf Trypsin-Sojabrühe gegeben und 4 bis 6 Stunden einziehen gelassen. Das Gel wird dann mittels Heißluft praktisch bis zur Trockne weiter entwässert. Anschließend werden die Petrischalen in Polyäthylenfolien verpackt und mit Äthylenoxid sterilisiert.

Ein Teil der Schalen wird durch Zugabe der entsprechenden Menge destillierten Wassers gebrauchsfertig gemacht. Diese Platten werden für übliche mikrobiologische Untersuchungen verwendet.

Zu einem weiteren Teii der Schalen wird eine Probe ungereinigtes Wasser gegeben. Nach der Absorption des Wassers werden die Platten über Nacht bei 37,5°C inkubiert. Man erhält gut isolierte Kolonien der normalerweise in ungereinigtem Wasser enthaltenen Organismen.

Beispiele 2 bis 8

In ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 werden Nährböden enthaltende Petrischalen hergestellt, die andere unlösliche hydrophile Gele enthalten, die mit dem Boden und der Wandung der Schalen fest verbunden sind. Die verwendeten Polymerisate und andere Angaben sind in der nachstehenden Tabelle II aufgeführt,

Tabelle II

Beispiel	Polymerisat	Konzentralion der Lösung (Gewichts prozent)
2	Polyvinylpyrrolidon	4
3	Polyvinylalkohol	3
4	Polyacrylamid	3 und 2
5	Polyvinylmethyläther	2
6	Polyacrylsäure	4
7	Maleinsäureanhydrid/Äthylen- Mischpolymerisat	2
8	Maleinsäureanhydrid/Vinylmethyl- äther-Misch polymerisat	2.5

PH

3,6 und 7,0
2,5 und 6,2
4,0, 5,4; 7,0

4.3, 2,5;
12,0

2.4, 4,0
2.4

2.0

Bestrahlungsdosis

(Megarad)

0,7—2,1
0,7—2,1
0,7—2,1
0,7—1,5

0.7—2,1
0,7-2,0

0,7—2,1

Aussehen der Gele

zufriedenstellend
zufriedenstellend
zufriedenstellend
zufriedenstellend

zufriedenstellend
zufriedenstellend

zufriedenstellend

Versuche, die unlöslichen hydrophilen Gele von den Petrischalen abzulösen, indem man die umgedrehten Schalen kräftig auf eine harte Oberfläche schlägt, sind nicht erfolgreich. Weitere Versuche, die Gele durch Biegen der Schalen selbst abzulösen, führen zum Bruch der Schalen. Die Gele bleiben unversehrt.

Beispiel 9

Zum Vergleich der wachstumsfördernden Eigenschaften von Platten mit Nährstoffe enthaltenden, hydrophilen Gelen der Erfindung und solchen mit Agar, das dieselben Nährstoffe enthält, wird eine Reihe von Petrischalen, die das gemäß Beispiel 1 unlöslich gemachte, koagulierte Polyäthylenoxid und Nährstoffe und solche, die Agar und Nährstoffe enthalten, hergestellt und mit Escherichia coli beimpft.

Die Polyäthylenoxid-Platten werden gemäß Beispiel 1 hergestellt, und das Gel wird, wie in der nachstehenden Tabelle UI angegeben, auf ein Gewicht von 7,0 bis 8,0 g je Platte entwässert. Zu jeder Platte wird die angegebene Menge Trypsin-Sojabrühcnlösung gegeben, deren Konzentration so eingestellt wird, daß sie bei Gleichgewicht der Lösung mit dem Gel, einer Agar-Platte mit Nährstoffen in der üblichen, zur Züchtung von Mikroorganismen verwen deten Konzentration entspricht.

In Tabelle III ist die Menge des entwässerten Gels die verwendete Menge Trypsin-Sojabrühe (in Milli liter) und deren Konzentration angegeben.

	Gewicht	Tabelle III		TS B-Lösung	Titcr der TSB-Lösung
	des		(ml)	in)
>eric	entwässerten Gels		3,0	3,33
._	<e>_		5,0	2,40
1	7,0		3.0	3.68
2	7,0		5,0	2,60
3	ε,ο		3,0	3,33
4	8,0		5,0	2,40
5	7,0
6	7,0

Die Agar-Platten werden auf herkömmliche Weisi hergestellt, indem man 15,0 g Trypsin-Sojabrühe ii 500 ml destilliertem Wasser suspendiert, dem 7,5 j Bacto-Agar zugesetzt worden waren. Die Suspensioi

2 Oi I

wird hierauf gekocht, bis der gesamte Agar gelöst ist, und anschließend 15 Minuten bei 121⁰C im Dampf sterilisiert. Anschließend werden Platten mit dem gleichen Volumen pro Schale gegossen wie bei dem Polyäthylenoxid.

Beide Plattenarten werden nach der folgenden · Methode mit Escherichia coli beimpft:

Eine 24 Stunden alte Kultur von Escherichia coli in Trypsin-Sojabrühe wird nacheinander vom 10"¹ fachen auf das 10~⁷fache verdünnt, indem man jeweils 1,0 ml in 9,0 ml sterile Kochsalzlösung gibt. Anschließend werden jeweils 0,1 ml der auf das 10~⁶fache verdünnten Lösung aseptisch auf jeweils 20 Polyäthylenoxid- und 20 Agar-Platten gegeben. In ähnlicher Weise werden jeweils 0,1 ml der 10~⁷fach verdünnten Lösung aseptisch auf jeweils 20 Polyäthylenoxid- und 20 Agar-Platten gegeben. 0,1ml der 10~⁶fach verdünnten Lösung entsprechen einer Beimpfung von 10~⁷/ml und 0,1 ml der 10~⁷fach verdünnten Lösung einer Beimpfung von 10~⁸/ml.

Die Organismen werden auf der Oberfläche der Polyäthylenoxid- und der Agar-Platten durch Aufstreichen mit einem sterilen, gebogenen Glasstab verteilt. Auf diese Weise wird eine gleichmäßige Verteilung der eingeimpften Organismen auf den Oberflächen der Nährböden und das Wachstum von zählbaren, isolierten Kolonien gewährleistet. Die Platten werden hierauf 24 Stunden bei 37,5° C inkubiert. Anschließend werden die Kolonien mittels eines Kolonienzählers gezählt.

In Tabelle IV ist die Durchschnittszahl der Kolonien für jeweils 10 Platten mit Polyäthylenoxid bzw. Agar bei einer 10~⁷- bzw. lO~⁸fachen Verdünnung angegeben.

Tabelle IV

	Anzahl der Kolonien	Serie	Serie 3	Serie 4	Serie 5	Serie 6
— Durch schnittliche Verdünnung	_ _... Serie I	214 21	229 24	203 23	212 25	212 20
KT⁷	219 25

Agar-Seric

198 12

15-

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Polyäthylenoxid-Platten hinsichtlich der Anzahl der Organismen eine bessere Wachstumsförderung zeigen als die Agar-Platten.

Beispiel 10

Es wird eine Nährlösung von Trypsin-Sojabrühe mit geeigneter Konzentration hergestellt und im Dampf sterilisiert. Die in Kolben enthaltene Lösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und mit nicht aufbereitetem Süßwasser versetzt. Die Kolben werden hierauf einige Zeit geschüttelt, um eine gleichmäßige Dispersion des Süßwassers und der darin als Verunreinigungen enthaltenen Organismen zu erreichen.

Auf eine Reihe von nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellten Platten mit 8 g Polyäthylcnoxid-GcI werden jeweils 7,0 ml der vorstehenden Lösung unter aseptischen Bedingungen gegossen. Die Lösung wird auf der ganzen Geloberfläche durch leichtes Kippen und Drehen der Platten gleichmäßig verteilt. Anschließend werden die Platten bei Raumtemperatur so lange stehengelassen, bis das Gel die Lösung ganz absorbiert hat, und hierauf 24 Stunden bei 37,5⁰C inkubiert. Jede Platte ist mit den verschiedensten, als Verunreinigungen im Wasser enthaltenen Organismen besiedelt; die Kolonien sind isoliert und treten nur an der Geloberfläche auf. Unter der Geloberfläche werden keine Organismen festgestellt, woraus sich ergibt, daß sie das Gel vollständig zurückgehallen hat.

In ähnlicher Weise wird sterile Trypsin-Sojabrühe mit einer 10~⁷fach verdünnten Lösung von Escherichia coli versetzt. 7,0 ml dieser Lösung werden auf das entwässerte Polyäthylenoxid gegeben, und die Platten werden wie vorstehend beschrieben inkubiert. Alle Organismen werden an der Geloberfläche zurückgehalten, es wird kein Organismenwachstum unterhalb der Oberfläche festgestellt.

Beispiel 11

Zum Nachweis der Verhinderung des Schwärmens von Mikroorganismen der Gattung Proteus werden Versuche durchgeführt, bei denen das Schwärmen von Kulturen auf Platten, die unter Verwendung von Polyäthylenoxid von Koagulierqualität bzw. von Agar hergestellt worden waren, verglichen wird. Die Polyäthylenoxid-Platten werden hergestellt, indem man 1,0 ml Trypsin-Sojabrühe auf teilweise entwässerte Polyäthylenoxid-Platten gibt, die nach Beispiel 1 hergestellt worden waren. Das Gewicht des Gels vor der Zugabe beträgt 8,0 g. Die Konzentration der Trypsin-Sojabrühe wird so eingestellt, daß die erhaltene Platte die übliche Nährstoffkonzentration aufweist. Es werden Agar-Platten mit der gleichen Konzentration von Trypsin-Sojabrühe hergestellt, indem man der Nährlösung 1,5% Agar zusetzt.

20 Polyäthylenoxid- und 20 Agar-Platten werden jeweils mit 0,1 ml einer 10~⁶fach verdünnten. 24 Stunden alten Kultur von Proteus mirabilis versetzt. Das Impfgut wird mittels eines sterilen, gebogenen Glasstabs gleichmäßig auf der Geloberfläche verteilt, und die Platte wird 24 Stunden bei 37,5° C inkubiert. Die Agar-Platten weisen eine kräftige Wachstumsschicht über der gesamten Oberfläche auf. was auf die starke Ausbreitung der Proteus-Organismen zurückzuführen ist. Es sind keine isolierten Kolonien vorhanden, und daher ist eine Kolonienzählung nicht möglich. Bei den Polyäthylenoxid-Platten erhält man dagegen sehr gut isolierte Kolonien, da die Ausbreitung der Mikroorganismen gehemmt wurde. Die Polyäthylenoxid-Platten weisen etwa 100 bis 200 gut abgegrenzte Einzelkolonien auf, die sich nicht ausbreiten. Im Gegensatz zu den Agar-Platten lassen sich die Kolonien leicht zählen.

Beispiel 12

Zur Feststellung der wachstumsfordernden Eigen schäften anderer erfindungsgemäß verwendbarei unlöslicher, hydrophiler Gele werden Nährböden ii Petrischalen hergestellt, die die verschiedenen Poly merisate enthalten, und mit verschiedenen Kulturei beimpft. Die hydrophilen Gele werden nach Beispiel aus Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyvinyl mcthyläther. Polyacrylamid oder Mischpolymerisate von Maleinsäureanhydrid und Äthylen oder Viny

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methyläther hergestellt. Außerdem wird das hydro- weisen bessere wachstumsfördernde Eigenschaften

phile Gel gemäß der USA.-Patentschrift 3 220 960 hinsichtlich der Anzahl der erhaltenen Organismen

verwendet. auf als die Agar-Platten. Ähnliche Versuche ergeben

Zu Vergleichszwecken werden Platten mit Agar außerdem, daß diese Stoffe als Filter wirken und das

und den gleichen Nährstoffen verwendet. Die die 5 Schwärmen von Mikroorganismen auf ein Minimum

unlöslichen Polymerisate enthaltenden Petrischale!! beschränken.

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Claims

2 Ol 1 Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Nährbodenbehälters mit Matrix, wobei eine wäßrige PoIytnerisatLösung im Behälter selbsL durch Bestrahlung in ein unlösliches hydrophiles Gel überführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß durch Verwendung einer ionisierenden Strahlung und entsprechender Einstellung von optimaler Dicke der Polymerisatlösung und Strahlungsenergie die gleiche Strahlungsdosis an die Oberfläche der Polymerisatlösung und die Grenzfläche zwischen Lösung und Behälterwand abgegeben und eine vernetzte Polyrnerisatmatrix der nachstehenden allgemeinen Formel erzeugt wird is