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Verfahren zur Herstellung einer Poliomyelitis-Virus-Vaccine
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Poliomyelitis-VirusVaccine durch kombinierte Einwirkung von UV-Strahlung und chemischen Inaktivierungsmitte) n auf wässerige Flüssigkeiten, die lebende Poliomyelitis-Viren der Typen 1, 2 und 3 enthalten, wobei jede einzelne der beiden Massnahmen nicht ausreicht. die Gesamtmenge der vorhandenen lebenden PoliomyelitisViren abzutöten ;
das Verfahren besteht darin, dass man die Poliomyelitis-Virus-Lösung, die einzelne der Typen oder ein Gemisch derselben enthalten kann, gleichzeitig oder in beliebiger Reihenfolge nacheinander der Einwirkung von UV - Licht und 8-Propiolacton in der Weise aussetzt, dass man die wässerige Flüssigkeit als dünnen Film von zweckmässig nicht mehr als 100 Schichtdicke während 0, 5-2 Sekunden einer Bestrahlung von 12500 bis 32000 Mikrowatt je caf mit einer UV-Lichtquelle, die einen hohen An-
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werden, dass die eine ausreicht, um den Grossteil der lebenden Poliomyelitis-Viren abzutöten und die an- dere imstande ist, alle noch vorhandenen lebenden Viren abzutöten. Die Reihenfolge, in der die beiden Mittel verwendet werden, ist nicht kritisch.
Die Viruslösung kann sowohl zuerst der Einwirkung von ultra- violetter Bestrahlung und dann der Einwirkung von S-Propiolacton ausgesetzt als auch in umgekehrter
Reihenfolge der Behandlung unterworfen werden ; In beiden Fällen erhält man ebenso zufriedenstellende
Resultate. Schliesslich können die beiden Massnahmen auch gleichzeitig durchgeführt werden.
Es ist bereits bekannt, Vaccine durch kombinierte Einwirkung von UV-Strahlung und chemischer Inaktivierungsmittel, wie Formaldehyd, auf wässerige Flüssigkeiten, die lebende Viren, enthalten, herzustellen. Gegenüber dem Bekannten weist das erfindungsgemässe Verfahren wesentliche Vorteile auf. So besitzt die erfindungsgemäss herstellbare Vaccine auch eine höhere Antigenwirksamkeit als eine nach dem bekannten Verfahren hergestellte Vaccine. Im Gegensatz zu einer mit Formaldehyd inaktivierten Vaccine, zeigen die in der erfindungsgemäss erhaltene Vaccine vorhandenen abgetöteten Poliomyelitis-Viren keine Neigung sich bei der Lagerung zu reaktivieren. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass 6-Propiolacton, im Gegensatz zu andern chemischen Mitteln, wie Formaldehyd, bei der Lagerung unter Bildung ungiftiger Nebenprodukte zerfällt.
Die Erfindung ist für die verschiedenen Arten des Poliomyelitis-Virus, nämlich die Typen 1, 2 und 3 anwendbar. Bei der praktischen Ausführung der Erfindung können Mischungen dieser Typen als Ausgangsmaterial verwendet werden, vorzugsweise wird aber jede Virusart getrennt behandelt, worauf die einzelnen Lösungen vereinigt werden.
Die wässerige Lösung der lebenden Poliomyelitis-Viren, die als Ausgangsmaterial des Verfahrens dient, kann in üblicher Weise aus einer Gewebekultur, die mit Poliomyelitis-Virus infiziert wurde, vorzugsweise nach dem Verfahren von Dulbecco et al. (Journal of Experimental Medicine, Band 99 [1954], S. 16'1'hergestellt werden. Nach diesem Verfahren behandelt man zerkleinerte Affennieren mit Trypsin, um Fremdgewebe zu entfernen, lässt die isolierten Zellen sich in einem Gewebekulturmedium vermehren und beimpft mit Poliomyelitis-Virus. Man bebrütet bei 36-37 C bis die Zellen vollständig zerstört sind und filtriert die virushaltige Flüssigkeit ab. Obgleich dieses Verfahren bevorzugt wird, kann die Trypsinbehandlung gegebenenfalls weggelassen werden.
In diesem letzten Fall kann jedoch der Protein-
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gehalt der Vaccine übermässig hoch sein und soll vor der Verwendung bestimmt werden, um zu vermeiden, dass eine Vaccine, welche allergische Reaktionen hervorrufen könnte, erhalten wird. Bei der Herstellung von Misch-Vaccinen mit mehr als einer Poliomyelitis-Virus-Art kann man die gesammelten Kulturflussigkeiten, welche je eine Virusart enthalten, vor Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens vereinigen, jedoch ist es im allgemeinen vorzuziehen, die einzelnen Vaccinen erst nach Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens zu mischen. Für praktische Zwecke soll der Infektionstiter der wässeri- gen Flüssigkeit einen hohen Wert, nämlich wenigstens 10-5, zweckmässig höher als 10-5, besitzen.
Vor der weiteren Behandlung ist die wässerige Viruslösung unter Kühlung, zweckmässig bei einer Temperatur im Bereich von-5 bis 10oC, zu halten. Das Ausgangsmaterial für das erfindungsgemässe Verfahren wird im allgemeinen unter aseptischen Bedingungen hergestellt, es wird jedoch aus Sicherheitsgründen durch ein Bakterienfilter filtriert. Ausserdem kann man Lösungen der lebenden Viren vor der Behandlung konzentrieren und bzw. oder teilweise reinigen.
Bei der Ultraviolettbestrahlung soll die durchschnittliche Dicke des der Bestrahlung ausgesetzten Flüssigkeitsfilmes im allgemeinen nicht grösser als 100 u und vorzugsweise 50 ,li oder weniger sein. Bei einer Filmdicke von etwas mehr als 100 p ist eine längere Bestrahlungsdauer erforderlich und der Verlust an Antigenwirksamkeit ist dementsprechend höher. Die verwendete Ultraviolettlichtquelle soll vorzugsweise etwa 95% der Energie bei einer Wellenlänge von 2537 Angström-Einheiten ausstrahlen. Lichtquellen, die einen etwas geringeren Anteil an Energie bei dieser erwünschten Wellenlänge aussenden, sind zwar noch brauchbar, aber weniger wirksam.
Zur Erzielung bester Ergebnisse wird daher eine gleichmässige Lichtquelle mit einer Emission von 95% der Energie bei einer Wellenlänge von 2537 Angström-Einheiten und mit einer Gesamtleistung von 10 bis 25 Watt in einem Abstand von etwa 1 cm von der Oberfläche des zu bestrahlenden wässerigen Mediums verwendet. Das Mass der Bestrahlungsintensität soll im allgemeinen der- art sein, dass die Lichtquelle je cm2 der der Bestrahlung ausgesetzten Filmoberfläche etwa l2500 - 32000 Mikrowatt liefert.
Wenn man eine wässerige Virusflüssigkeit mit einem Infektionstiter im Bereich von 10-5 bis 10-8 als Ausgangsmaterial verwendet und die angegebener Bestrahlungsbedingungen einhält, wird ein ausserordentlich hoher Anteil der lebenden Organismen innerhalb einer Einwirkungszeit von wenigen Sekunden abgetötet. Die Länge der Einwirkungsdauer kann beträchtlich variiert werden, aber im allgemeinen ist es wünschenswert, die Einwirkungsdauer möglichst gering zu halten, um eine zu weitgehende Herabsetzung der Antigenwirksamkeit des Virus zu vermeiden. Die besten Ergebnisse werden erfindungsgemäss bei einer Bestrahlungsdauer von etwa 0, 5 bis 2 Sekunden erreicht.
Zum Beispiel vermindert ultraviolettes Licht mit einer Wellenlänge von 2 537 Angström-Einheiten und mit einer Intensität von etwa 25000 Mikrowatt/cnf bei der Einwirkung auf einen Film mit einer durchschnittlichen Dicke von 50 u innerhalb einer Sekunde den Infektionstiter von 10-1 auf etwa 10-1. Im allgemeinen sollen die Bestrahlungsbedingungen so gewählt werden, dass der Infektionstiter auf einen Wert im Bereich von 10-0, 5
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zeitigen Bestrahlung dünner Filme oder Ströme mit ultraviolettem Licht für die praktische Durchführung der Erfindung verwendet werden.
Die Temperatur der wässerigen Flüssigkeit während der Bestrahlung ist nicht kritisch und kann bei Raumtemperatur oder tiefer liegen, jedoch erhält man bessere Ergebnisse, wenn die Bestrahlung bei höherer Temperatur, zweckmässig 37 - 400C durchgefùhrt wird.
Erfindungsgemäss soll B-Propiolacton in geringerer Menge angewendet werden, als zur vollständigen Abtötung der in der unbehandelten wässerigen Flüssigkeit vorhandenen Gesamtmenge an lebenden Poliomyelitis-Viren notwendig ist und soll im allgemeinen in Mengen von 0, 0002 bis 0, 0010 g, vorzugsweise im Bereich von 0, 0004bis 0, 0006 g/ml, der Virusflüssigkeit zugesetzt werden. Wennss-Propiolacton in grösserer Menge verwendet wird, kann der Überschuss nach Inaktivierung des Virus durch Erhitzen zerstört werden. Soweit man bisher feststellen konnte, erfordert jede Poliomyelitis-Virus-Art die Verwendung un-
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-Propiolacton.Infolge der Säure- und Alkaliempfindlichkeitvon 20 bis 4ÚOC ;/-Ii arbeiten.
Die Inaktivierung mit 6-Propiolacton geht sehr rasch vor sich und ist irreversibel, so dass das Virus bei Lagerung, Verdünnung oder weiterer Behandlung nicht wieder auflebt. Die Abtötung des Virus ist gewöhnlich innerhalb 2 Stunden oder weniger bei einer Temperatur von 37 C vollständig. Es ist wichtig, 6 -Propiolacton frisch zu verwenden. ss-Propiolacton, welches nicht unter Kühlung gelagert wurde oder welches mit Feuchtigkeit in Berührung gekommen war, soll nicht verwendet werden.
Das handelsübliche 6-Propiolacton in gereinigter Form wirkt zufriedenstellend.
Die vorhergehenden Ausführungen beziehen sich aus Gründen der Vereinfachung nur auf die Behandlung wässeriger Flüssigkeiten mit voll virulenten Poliomyelitis-Viren. Selbstverständlich kann das erfindungsgemässe Verfahren in gleicher Weise mit Flüssigkeiten durchgeführt werden, die bereits einer teilweisen Inaktivierung unterworfen wurden.
Bei der Durchführung des Verfahrens wurde gefunden, dass die besten Ergebnisse erhaben werden, wenn die wässerige Ausgangslösung vor der weiteren Behandlung entweder einer Filtration durch ein Bakterienfilter, wie ein Seitzfilter, oder einer Filtration durch eine ultrafeine Glasfritte unterworfen wird.
Gegebenenfalls können die erfindungsgemäss erhaltenen Vaccinen durch Zusatz keimtötender Mittel,
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stabilisiert werden.
Die erfindungsgemäss herstellbaren Vaccinen enthalten weder lebende Poliomyelitis-Viren noch le- bende Bakterien, Hefen oder Schimmelpilze. Säugetiere, die Rir eine Infektion mit lebendem Polio- myelitis - Virus empfänglich sind, werden nach subcutaner, intradermaler oder intramuskulärer Injektion dieser Produkte gegen eine Infektion durch die entsprechenden lebenden Viren immunisiert. Die erfin- dungsgemäss hergestellten Vaccinen können gegebenenfalls zu Adsorbat-Impfstoffen durch Fällung mit
Aluminiumverbindungen, insbesondere Aluminiumphosphat, weiterverarbeitet, oder Säugetieren zwecks
Immunisierung verabreicht werden. Die Produkte können unverdünnt verwendet werden oder, wenn ihre
Wirksamkeit höher ist als den Standardwerten entspricht, mit einer entsprechenden Menge eines geeigne- ten sterilen wässerigen Mediums, z.
B. mit steriler Hank'scher Lösung, sterilen Salzlösungen und steri- lem destilliertem Wasser, verdünnt werden.
Die Erfindung wird durch folgende Beispiele erläutert : Beispiel l : Zellen für die Entwicklung von Poliomyelitis-Virus werden nach dem Verfahren von
Dulbecco, Journal of Experimental Medicine, 99 [1954], S. 167 gewonnen, indem man zuerst eine Sus- pension von isolierten Epithelzellen von Affennieren (vgl. Dulbecco, Proc. Nat. Acad. Scí-., 38 [19f2], S. 747), durch Trypsinbehandlung vonmaceriertem Nierengewebe vongesunden Cynomolgus- oder Rhesus- affen bereitet. Diese Zellen lässt man sich an einer geeigneten Glasfläche in einem üblichen Gewebekul- turmedium vermehren.
Die so erhaltene Schicht vonentwickelten Nierenzellen wird dann mit einer Stammkultur von Poliomyelitis-Virus der Type 1 (Mahoney-Stamm) beimpft und die Mischung bei 36-37 C stehen gelassen, bis die Zerstörung der Zellen vollständig ist und grosse Mengen von neuem Virus frei geworden sind. Die virushaltige Flüssigkeit wird aufgefangen und durch eine ultrafeine Glasfrittenkerze filtriert. Das Filtrat mit den lebenden Poliomyelitis-Viren der Type 1 wird auf Virusgehalt, Bakteriensterilität und Stammreinheit untersucht. In gleicher Weise werden Filtrate mit lebenden Viren der Type 2 (MEF-1-Stamm) und 3 (Saukett-Stamm) hergestellt.
41der Poliomyelitis-Viren der Type lenthaltendenFiltratesmit einem Infektionstiter von 10 werden auf 4 C gekühlt und mit 20 ml einer 100#gen wässerigen Lösung mit einem Gehalt von 6- Propiolacton (0, 115 g/ml) unter Rühren versetzt. Die erhaltene Lösung, die 0, 0005 g/ml B-Propiolacton enthält, wird bei dieser Temperatur 2Stundenstehen gelassen und dann durch die in der USA-Patentschrift Nr. 2, 725, 482 (Research Laboratory Division of General Motors Corporation, Detroit, Michigan) beschriebene Bestrahlungseinrichtung mit einer Geschwindigkeit von 600 ml pro Minute geleitet, wobei sie einer Ultraviolettbestrahlung von 25 Watt Leistung ausgesetzt wird.
Diese Einrichtung enthält ein vertikal angeordnetes, schnell rotierendes zylindrisches becherartiges Gefäss, mit einer normalen Betriebsgeschwindigkeit von 1700 Umdr/min, in welches sechs Ultraviolettröhrenlampen von ungefähr 30 cm Länge in gleichem Abstand voneinander axial eingehängt und ungefähr 1 cm von der Innenwand entfernt sind. Der Innendurchmesser am oberen Rand des Gefässes beträgt ungefähr 9, 5 cm und die Neigung nach aussen vom geschlossenen Bodenende etwa 10. Die Standhöhe der inneren Gefässwand beträgt ungefähr 40 cm.
Die effektive Intensität der Ultraviolettbestrahlung an der Innenfläche des Gefässes ist ungefähr 25 000 Mikrowatt/cd. Die durchschnittliche Filmdicke der der Bestrahlung ausgesetzten Lösung beträgt ungefähr 75 II und die Gesamtzeit der Einwirkung der Bestrahlung 1 Sekunde. Nach dieser kombinierten Behandlung ist kein restlicher lebende Virus in der Lösung durch die übliche Routinetitration von Affennierengeweben nachweisbar. bei welcher 10 Doppelproben von 0, 5 ml beimpft und 7 Tage aufbewahrt werden. Indessen können
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dennoch Spuren von lebendem Virus vorhanden sein ; dies kann durch einen Sicherheitstest ; z.
B. den Standardsicherheitstest, der in den Mindestanforderungen für Poliomyelitis Vaccinen (veröffentlicht am 11. November 1955 vom United States Department ofHealth, Education and Welfare) angegeben ist, nachgewiesen werden.
Die bestrahlte Lösung wird dann 3 Stunden auf 37 C gehalten. Danach ist die Lösung vollständig frei von lebendem Poliomyelitis-Virus, wie durch das negative Ergebnis des Sicherheitstestes angezeigt wird.
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die Vaccine sicher ist.
In gleicher Weise werden Poliomyelitis-Virus-Vaccinen aus Virusstämmen vom Typ 2 (MEF-1-Stamm) und die andere Partie vom Typ 3 (Saukett-Stamm). Diese Vaccinen sind ebenfalls frei von lebendem Poliomyelitis-Virus, wie durch die obenerwähnte Sicherheitstestmethode gezeigt werden kann.
Die drei Vaccinen (Typ 1, 2 und 3) besitzen einen hohen Grad an Antigenwirksamkeit und können entweder allein oder in Kombination verwendet und können auch erwünschtenfalls mit steriler Salzlösung oder steriler Hank'scher Lösung verdünnt werden.
Die Antigenwirksamkeit der in obiger Weise erhaltenen Vaccinen kann in folgender Weise geprüft werden. Es wird eine Verdünnungsreihe der Vaccine (halb bis voll logarithmisch) angelegt und eine der Verdünnungen einer Gruppe von fünf bis zehn Küken (7-10 Tage alt) mittels intramuskulärer Injektion in Dosen von 0, 5 ml in einem Abstand von zwei Wochen verabreicht. Eine Woche nach der letzten Impfung wird den Küken Blut entnommen und jedes einzelne Serum auf die Gegenwart von spezifischen Antikör- pern bei einerniedrigen Verdünnung (l : 4) untersucht.
Bei diesem Versuch werden 0, 25 ml des verdünnten Serums mit einem gleichen Volumen einer Gewebekulturflüssigkeitmit 10 - 1000 50o/oiger Gewebekultur- infektionsdosen (TCID) der entsprechenden Type des Poliomyelitis-Virus, für die im Serum Antikörper nachzuweisen sind, vermischt. Hiezu werden in einem geeigneten Behälter 0, 25 ml einer Suspension von mit Trypsin behandelten Affennieren-Zellen in einem Nährmedium mit 240000 Zellen/mI zugefügt. Die ganze Mischung wird dann unter für das Wachstum der Zellen und des Virus günstigen Bedingungen entwickelt. Nach 7 Tagen werden die Gewebekulturen mikroskopisch auf das Auftreten einer durch das Viruswachstum bedingten cytopathogenen Degeneration geprüft.
Jene Kulturen, die durch spezifische Serumantikörper gegenüber dem Virus geschützt sind, zeigen keine solche Degeneration. Von den immunisierenden Seren der Küken, welche die höchste Impfverdünnung erhielten, kann der 50%-Punkt der Antigenverdünnung oder der"Antigenverdünnungstiter"festgestellt werden. Dieses Resultat kann in üblicher Weise nach der Methode von Reed und Muench berechnet werden (American Journalof Hygiene, 27 [1938], S. 493-497 bzw. Standardtestbuch : Viral and Rickettsiallnfections of Man, River, 2. Ausgabe, S. 75-76, Verlag J. B. Lippincott Company). Diese Bestimmung zeigt an, wie weit die Antigenlösung verdünnt werden kann, um eine Immunität bei 50% der Küken hervorzurufen.
Da die Stärke der in dem Serumneutralisationstest verwendeten Virus-Dosis einen gewissen Einfluss auf den zahlenmässigen Wert des Antigenverdünnungstiters haben kann, wird die entsprechende Dosis im folgenden angegeben, um eine richtige Kennzeichnung des Wertes des Antigenverdünnungstiters wiederzugeben.
Die Ergebnisse der Bestimmung der Antigenwirksamkeit der nach der obigen Methode erhaltenen Vaccinen sind in der folgenden Tabelle I im Vergleich mit jenen der unbehandelten Filtrate, welche lebenden Virus enthalten und als Ausgangsmaterial verwendet wurden, angegeben.
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Tabelle 1
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<tb>
<tb> Untersuchte <SEP> Probe <SEP> Antigenverdünnungs- <SEP> Grenzkonzentrationstiter <SEP> dosis <SEP> (TCID)
<tb> Vaccine <SEP> der <SEP> Type <SEP> l, <SEP> erhalten <SEP> durch
<tb> Behandlung <SEP> mit <SEP> 0, <SEP> 0, <SEP> 5% <SEP> 8-Propio--2 <SEP> os <SEP>
<tb> lacton <SEP> und <SEP> Ultraviolettlicht <SEP> 204 <SEP>
<tb> Unbehandeltes <SEP> Filtrat <SEP> mit <SEP> lebendem
<tb> Poliomyelitis-Virus <SEP> (Type <SEP> 1) <SEP> 10'204
<tb> Vaccine <SEP> der <SEP> Type <SEP> 2, <SEP> erhalten <SEP> durch
<tb> Behandlung <SEP> mit <SEP> 0, <SEP> 09 <SEP> 0-Propio- <SEP>
<tb> lacton <SEP> und <SEP> Ultraviolettlicht <SEP> 10 <SEP> 32 <SEP>
<tb> Unbehandeltes <SEP> Filtrat <SEP> mit <SEP> lebendem
<tb> Poliomyelitis-Virus <SEP> (Type <SEP> 2) <SEP> 10'32
<tb> Vaccine <SEP> der <SEP> Type <SEP> 3,
<SEP> erhalten <SEP> durch
<tb> Behandlung <SEP> mit <SEP> 0, <SEP> 05% <SEP> 6-Propio- <SEP>
<tb> lacton <SEP> und <SEP> Ultraviolettlicht <SEP> 10 <SEP> 58 <SEP>
<tb> Unbehandeltes <SEP> Filtrat <SEP> mit <SEP> lebendem
<tb> Poliomyelitis-Virus <SEP> (Type <SEP> 3) <SEP> 10 <SEP> 58
<tb>
Es wurde festgestellt, dass die Antigenwirksamkeit der Produkte während langer Zeitperioden hoch bleibt. Die nach dem vorstehenden Verfahren hergestellten Vaccinen der Typen 1, 2 und 3 wurden nach einer 6monatigen Lagerung unter Kühlung mit je 3 Vol.-Teilen steriler Hank'scher Lösung verdünnt, die drei so erhaltenen Lösungen vereinigt und die Antigenwirksamkeit des vereinigten Produktes untersucht.
Dies erfolgte sowohl mit Hilfe des beschriebenen Kükentestes, der den Antigenverdünnungstiter angibt, als auch mittels eines Standardtestes, bei dem Affen an Stelle von Küken als Versuchstiere verwendet werden ; (s. Amendment Nr. 2 zu den Minimum Requirements of Poliomyelitis Vaccine, veröffentlicht am 20. Mai 19. 94 vom U.S.-Department of Health, Eduction and Welfare). Hiezu werden mehrere Rhesusaffen mit drei l ml-Dosen der Vaccine in wöchentlichen Intervallen geimpft.
Eine Woche nach dem Ende der Impfperiode wird den Tieren Blut entnommen und der Antikörpergehalt im Serum bestimmt, indem man eine Verdünnungsreihe anlegt und aliquote Teile der einzelnen Verdünnungen mit einer Standardlösung, welche eine bekannte Anzahl von Infektionseinheiten der gegebenen Type des Poliomyelitis-Virus enthält, vermischt. Der Endpunkt der Titration liegt bei jener Serumverdunnung, in der noch eine genügende Menge an Antikörpern enthalten ist, um eine bekannte Anzahl von infektiöse Einheiten des Virus in der Standardlösung exakt zu neutralisieren und nichtinfektiös zu machen.
Da der geometrische Mitteltiter von
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Anzahl der infektiösen Einheiten in der Standardlösung anzugeben, um die richtige Kennzeichnung des geometrischen Mitteltiters zu erhalten (Berechnung des geometrischen Mitteltiters siehe Amendment Nr. 2 zu den Minimum Requirements of Poliomyelitis Vaccine, veröffentlicht am 20. Mal 1954 vom U. S.-Department of Health, Education and Welfare).
Der sogenannte Affenwirksamkeitsfaktor beinhaltet für jede Virustype einen Vergleich mit dem geometrischen Mitteltiter des USA-Bezugserums (IIA-l) des National Institutes of Health. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind in der folgenden Tabelle II angegeben.
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Tabelle II
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<tb>
<tb> Kükentest <SEP> Affentest <SEP>
<tb> Untersuchte <SEP> Probe <SEP> Virus- <SEP> Antigenverdünnungs- <SEP> Grenzkonzentrations- <SEP> Geometrischer <SEP> Grenzkonzentrations- <SEP> Affenwirksamkeits- <SEP>
<tb> type <SEP> titer <SEP> dosis <SEP> (TCID) <SEP> Mitteltiter <SEP> dosis <SEP> (TCID50) <SEP> faktor <SEP> x)
<tb> Misch-Vaccine <SEP> der <SEP> Typen <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> und <SEP> 3
<tb> 1 <SEP> 10-1,2 <SEP> 24 <SEP> 83 <SEP> 53 <SEP> 1,1
<tb> des <SEP> Poliomyelitis-Virus, <SEP> abgetötet
<tb> 2 <SEP> 10-1,5 <SEP> 27 <SEP> 63 <SEP> 68 <SEP> 1, <SEP> 27
<tb> mit <SEP> 0,05% <SEP> ss-Propiolacton <SEP> und <SEP> Ultra-
<tb> 3 <SEP> 10-1,4 <SEP> 22 <SEP> 33 <SEP> 36 <SEP> 0, <SEP> 47 <SEP>
<tb> violettlicht <SEP> und <SEP> 6 <SEP> Monate <SEP> aufbewahrt.
<tb>
x)
Für einen besonderen Virustyp wird der Affenwirksamkeitsfaktor berechnet, indem man den geometrischen
Mitteltiter des untersuchten Affensert1ms durch den geometrischen Mitteltiter des Bezugserums IIA-1 (National Institutes of Health) für die gleiche Virustype dividiert. Annehmbare Mindestwerte der Affen- faktoren für die verschiedenen Typen des Poliomyelitis-Virus sind folgende: Type 1 - 0,29; Type 2-0, 25 und Type 3 - 0, 16 ; weitere Einzelheiten sind in der Veröffentlichung in Minimum Requirements of Polio- inyelitis Vaccinevom 11. November 1955vom UnitedStatesDepartment of Health, Educatioh and Welfare, ersichtlich.
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Aus der obigen Tabelle ist ersichtlich, dass die Antigenwirksamkeit der Vaccine nach 6monatiger La- gerung nicht merklich vermindert ist. Es ist festzustellen, dass die vergleichbaren Antigenverdünnungstiter der Vaccinen in den Tabellen I und II verschieden sind, was aber hauptsächlich darauf zurückzuführen ist, dass die Vaccine der Tabelle Heiner l Stachen Verdünnung unterworfen ist. Es ist bezeichnend, dass die Wirksamkeit der Vaccine nach langer Lagerung die Mindestforderungen des Regierungsstandards für jede Virustype um ein beträchtliches Mass überschreitet.
Obgleich die Gründe der besonderen Haltbarkeit der erfindungsgemäss herstellbaren Vaccinen nicht bekannt sind, kann angenommen werden, dass dies wenigstens zum Teil darauf beruhen dürfte, dass das verwendete chemische Inaktivierungsmittel, 8-Propio- lacton, im Gegensatz zu andern, wie Formaldehyd, schnell zersetzt wird und dabei in ungiftige Nebenprodukte übergeht, die mit den Antigenfaktoren der Vaccine verträglich sind bzw. keinen ungunstigen Effekt auf diese ausüben.
Beispiel 2 : Eine wässerige Lösung von lebendem Poliomyelitis-Virus der Type 1 (Mahoney, Infektionstiter 104),welches nach der im Beispiel l beschriebenen Arbeitsweise bereitet wurde, wird durch ein ultrafeines Glasfrittenfilter filtriert. Zu 41 des Filtrates werden 20 ml einer legen (0, 115 g/ml) wässerigen 8-Propiolactonlösung zugefügt.
Die erhaltene Mischung mit 0, 0005 g 6-Propiolacton je ml wird 2 Stunden auf 37 C erwärmt, wobei der Infektionstiter auf weniger als 10-awl sinkt und wird dann in gleicher Weise wie im Beispiel l einer Ultraviolettbestrahlung ausgesetzt ; die Schichtdicke des Flüssigkeitfilmes beträgt ungefähr 50 jn und die Einwirkungszeit etwas weniger als l Sekunde. Die erhaltene Virus-
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liefert ein negatives Ergebnis.
In gleicher Weise werden zwei weitere Partien von Poliomyelitis-Virus-Vaccinen aus Virusstämmen der Type 2 (MEF-1-Stamm) und der Type 3 (Saukett-Stamm) hergestellt ; diese Vaccinen sind gleichfalls frei von lebendem Poliomyelitis-Virus.
Die drei so erhaltenen Vaccinen (Type 1, 2 und 3) besitzen ebenfalls eine hohe Antigenwirksamkeit.
Die Bestimmung des Antigenverdünnungstiters, des geometrischen Mitteltiters und des Affenwirksamkeitsfaktors erfolgt nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IU angegeben.
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Tabelle III
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<tb>
<tb> Kükentest <SEP> Affentest <SEP>
<tb> Untersuchte <SEP> Probe <SEP> Antigenverdünnlmgs- <SEP> Grenzkonzentrations- <SEP> Geomeuischer <SEP> Grenzkonzentrations- <SEP> Affenwirksamkeits- <SEP>
<tb> titer <SEP> dosis <SEP> (TCID) <SEP> Mitteltiter <SEP> dosis <SEP> (TCID50) <SEP> faktor
<tb> Vaccine <SEP> der <SEP> Type <SEP> 1, <SEP> erhalten <SEP> durch
<tb> Behandlung <SEP> mit <SEP> 0, <SEP> 05% <SEP> 8-Propio- <SEP>
<tb> lacton <SEP> und <SEP> Ultraviolettlicht <SEP> 10-2, <SEP> 0 <SEP> 204 <SEP> 525 <SEP> 43 <SEP> 13, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Unbehandeltes <SEP> Filtrat <SEP> mit <SEP> lebendem
<tb> Poliomyelitis-Virus <SEP> (Type <SEP> 1) <SEP> 10-2,33 <SEP> 204 <SEP> - <SEP> Vaccine <SEP> der <SEP> Type <SEP> 2, <SEP> erhalten <SEP> durch
<tb> Behandlung <SEP> mit <SEP> 0,05% <SEP> ss-Propiolacton <SEP> und <SEP> Ultraviolettlicht <SEP> 10-2,
8 <SEP> 32 <SEP> 141 <SEP> 32 <SEP> 1, <SEP> 18 <SEP>
<tb> Unbehandeltes <SEP> Filtrat <SEP> mit <SEP> lebendem
<tb> Poliomyelitis-Virus <SEP> (Type <SEP> 2) <SEP> 10-3,0 <SEP> 32 <SEP> - <SEP> Vaccine <SEP> der <SEP> Type <SEP> 3, <SEP> erhalten <SEP> durch
<tb> Behandlung <SEP> mit <SEP> 0,05% <SEP> ss-Propiolacton <SEP> und <SEP> ultraviolettlicht <SEP> 10-1,67 <SEP> 58 <SEP> 100 <SEP> 58 <SEP> 1,45
<tb> Unbehandeltes <SEP> Filtrat <SEP> mit <SEP> lebendem
<tb> Poliomyelitis-Virus <SEP> (Type <SEP> 3) <SEP> 10-2,5 <SEP> 58 <SEP> - <SEP> -
<tb>
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Ans Tabelle IH ist ersichtlich, dass die Antigenwirksamkeit dieser Vaccinen im wesentlichen ebenso gross ist, wie jene der unbehandelten Kontrollproben und dass der Affenwirksamkeitsfaktor oberhalb der Mindestforderungen des staatlichen Standards liegt.
Die Antigenwirksamkeit nach 6monatiger Lagerzeit wurde gemäss Beispiel 1 bestimmt, wobei die in der folgenden Tabelle IV angegebenen Ergebnisse erzielt wurden.
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Tabelle IV
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<tb>
<tb> Kükentest <SEP> Affentest
<tb> Untersuchte <SEP> Probe <SEP> Virus-Antigenverdtinnungs-Grenzkonzentrations- <SEP> Geometrischer <SEP> Grenzkonzentrations-Affenwirksamkeits- <SEP>
<tb> type <SEP> titer <SEP> dosis <SEP> (TCID) <SEP> Mitteltiter <SEP> dosis <SEP> (TCID <SEP> 50) <SEP> faktor <SEP>
<tb> Misch-Vaccine <SEP> der <SEP> Typen <SEP> l, <SEP> 2 <SEP> und <SEP> 3
<tb> 1 <SEP> 10-1,37 <SEP> 24 <SEP> 26 <SEP> 53 <SEP> 0, <SEP> 35
<tb> des <SEP> Poliomyelitis-Virus, <SEP> abgetötet
<tb> 2 <SEP> 10-1,10 <SEP> 27 <SEP> 42 <SEP> 68 <SEP> 0,82
<tb> mit <SEP> 0, <SEP> 05% <SEP> B-Propiolacton <SEP> und <SEP> Ultra-
<tb> 3 <SEP> 10-2,34 <SEP> 22 <SEP> 18 <SEP> 36 <SEP> 0, <SEP> 26
<tb> violettlicht <SEP> und <SEP> 6 <SEP> Monate <SEP> aufbewahrt. <SEP>
<tb>
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Tabelle IV erläutert ferner die Stabilität dererfindungsgemassenVaccinenach längerer Lagerzeit und lnfacher Verdünnung. Sie zeigt schliesslich, dass auch zufriedenstellende Resultate erhalten werden können, wenn die Reihenfolge der Inaktivierungsschritte geändert wird.
Beispiel 3 : Eine nach Beispiel 1 erhaltene wässerige Lösung von lebendem Poliomyelitis-Virus der Type 1 (Mahoney, Infektionstiter 10-6). wird durch ein ultrafeines Glasfrittenfilter filtriert und das Filtrat auf eine Temperatur von 4 C gekühlt. Zu 4 l des gekühlten Filtrates werden unter Rühren 40 ml einer
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igen ss-Propiolacton 2 Stunden bei der gleichen Temperatur gehalten. Die Mischung wird dann gemäss Beispiel 2 einer Ultraviolettbestrahlung ausgesetzt, worauf die Flüssigkeit gesammelt, auf 37 C erhitzt und bei dieser Temperatur 3 Stunden gehalten wird. Die so erhaltene Virus-Vaccine wird mit 3 Vol.-Teilen Hank'scher Lösung verdünnt.
Die Abwesenheit von lebendem Poliomyelitis-Virus wird durch das negative Ergebnis des Sicherheitstestes angezeigt.
Die Ergebnisse der Bestimmung der Antigenwirksamkeit sind in der folgenden Tabelle V im Vergleich mit vergleichbaren Ergebnissen für unbehandelte Ausgangsmaterialien angegeben.
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Tabelle V
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<tb>
<tb> Kükentest <SEP> Affentest
<tb> Untersuchte <SEP> Probe <SEP> Antigenverdünntmgs- <SEP> Grenzkonzen <SEP> rations- <SEP> Geomeuischer <SEP> Grenzkonzentrations- <SEP> Affenwirksamkeits- <SEP>
<tb> titer <SEP> dosis <SEP> (TCID) <SEP> Mitteltiter <SEP> dosis <SEP> (TCID) <SEP> faktor
<tb> Vaccine <SEP> der <SEP> Type <SEP> 1, <SEP> erhalten <SEP> durch
<tb> Behandlung <SEP> mit <SEP> 0,1% <SEP> ss-propiolacton <SEP> und <SEP> Ultraviolettlicht <SEP> 10-1,5 <SEP> 204 <SEP> 218 <SEP> 53 <SEP> 5,8
<tb> Unbehandeltes <SEP> Filtrat <SEP> mit <SEP> lebendem
<tb> Poliomyelitis-Virus <SEP> (Type <SEP> l) <SEP> 10'2''3 <SEP> 204-- <SEP>
<tb>
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Die Daten der Tabelle V zeigen, dass die Verwendung eines relativ höheren Anteiles an ss-Propiolacton eine Vaccine ergibt,
welche den Nlindeststandard für den W1rksamkeitfaktor bedeutend überschreitet.
Beispiel 4 : Eine nach Beispiel l erhaltene wässerige Lösung von lebendem Poliomyelitis-Virus der Type 1 (Mahoney, Infektionstiter 10-6), wird durch ein ultrafeines Glasfrittenfilter filtriert. Zu 4 l des
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gen (0, 115 giml)triert und eine Probe einem Standardsicherheitstest unterworfen, der ein negatives Ergebnis liefert.
In gleicher Weise werden zwei weitere Partien von Poliomyelitis-Vaccinen aus Virusstämmen der Type 2 (\lEF-l-Stamm) und der Type q (Saukett-Stamm) hergestellt, diese Vaccine sind gleichfalls frei von lebendem Poliomyelitis-Virus.
Die drei erhaltenen Vaccine (Type 1, 2 und 3) besitzen einen hohen Grad an Antigenwirksamkeit. wie durch Bestimmung des Antigenverdunnungstiters, des geometrischenMitteltitersund des Affenwirksamkeitsfaktors festgestellt werden kann. Die Ergebnisse der Antigenwirksamkeitsbestimmung sind in der folgenden Tabelle VI im Vergleich mit vergleichbaren Ergebnissen von unbehandelten Filtraten mit lebendem Virus, die als Ausgangsmaterial verwendet wurden, angegeben.
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<tb>
<tb> Tabelle <SEP> VI
<tb>
KilkentestA ffentest
Untersuchte Probe Antigenverdünnungs- Grenzkonzentrations- Geometrischer Grenzkonzentrations- Affenwirksamkeits- titer dosis (TCID50) Mitteltiter dosis (TClDso) faktor Vaccine der Type 1, erhalten durch Behandlung mit 0,1% ss-Propiolacton und Ultraviolettlicht 10-1,5 204 178 53 4,78 Unbehandeltes Filtrat mit lebendem Poliomyelitis-Virus (Type 1)] 0' 04-- Vaccine der Type 2, erhalten durch Behandlung mit 0, 1% ss-Propio- lacton und Ultraviolettlicht 10-2,53 32 320 68 2,5 Unbehandeltes Filtrat mit lebendem Poliomyelitis-Virus (Type 2) 10-'"32-- Vaccine der Type 3, erhalten durch Behandlung mit 0, ss-PropiolactonundUltraviolettlicht10-1,55810361,
6 Unbehandeltes Filtrat mit lebendem Poliomyelitis-Virus (Type 3) 10-2,5 58 - -
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Die Antigenwirksamkeit der Vaccinen wurde nach 6monatiger Lagerung ebenfalls in der vorstehend angegebenen Weise bestimmt. Die Ergebnisse dieser Bestimmung sind in der folgenden Tabelle VU angegeben.
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Tabelle VII
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<tb>
<tb> Kükentest <SEP> Affentest <SEP>
<tb> Untersuchte <SEP> Probe <SEP> Virus-Antigenverdünnungs-Grenzkonzentrations-Geometrischer <SEP> Grenzkonzentrations-Affenwirksamkeits- <SEP>
<tb> type <SEP> titer <SEP> dosis <SEP> (TCID) <SEP> Mitteltiter <SEP> dosis <SEP> (TCID50) <SEP> faktor
<tb> Misch-Vaccine <SEP> enthaltend <SEP> die <SEP> Typen
<tb> 1, <SEP> 2 <SEP> und <SEP> 3 <SEP> des <SEP> Poliomyelitis-Virus, <SEP> 1 <SEP> 10-1,3 <SEP> 24 <SEP> 60 <SEP> 53 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP>
<tb> abgetötet <SEP> mit <SEP> 0, <SEP> 1% <SEP> ss-Propiolacton <SEP> 2 <SEP> 10-1,0 <SEP> 27 <SEP> 91 <SEP> 68 <SEP> 1, <SEP> 76 <SEP>
<tb> und <SEP> Ultraviolettlicht <SEP> und <SEP> 6 <SEP> Monate <SEP> 3 <SEP> 10-. <SEP> 22 <SEP> 53 <SEP> 36 <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP>
<tb> aufbewahrt.
<tb>
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