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Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Gewebekulturflüssigkeit, welche eine hohe Konzentration an lebendem infektiösem Hepatitisvirus enthält
Infektiöse Hepatitis ist eine relativ häufige Krankheit, die besonders für die militärischen Streitkräfte ein akutes Problem darstellt, weil sie eine lange Untauglichkeit der von der Krankheit befallenen Personen zur Folge hat. Obwohl die Krankheit in den letzten Kriegen unter den Angehörigen der Streitkräfte häufig auftrat, ist über ihre Äthiologie wenig mehr bekannt, als dass es sich um eine Viruserkrankung handelt, die von einem Menschen auf den andern übertragen wird.
Wird die Krankheit durch Bluttransfusion übertragen, so wird sie häufig "Serumhepatitis" statt "infektiöse Hepatitis" genannt. Der hier verwendete Ausdruck "infektiöse Hepatitis" schliesst beide Bezeichnungen ein. Der Grund, warum so wenig über diese ernste Erkrankung bekannt ist, ist wahrscheinlich die Tatsache, dass alle Untersuchungen an
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erfolgreich übertragen bzw. kultiviert werden. Auch Versuche, den Virus in Zellgewebekulturen zu züchten, blieben erfolglos. Das Fehlen einer geeigneten Methode zur Kultivierung des Virus machte es unmöglich, ein zur Immunisierung gegen die Krankheit wirksames Vaccin herzustellen. Aus dem gleichen Grund war es auch unmöglich, diagnostische Tests für die Krankheit zu finden, was z.
B. für die Untersuchung, ob das Blut eines Blutspenders einen Blutabnahmebehälter mit Hepatitis infiziert, von Bedeutung ist.
Die Erfindung bezweckt die Vermeidung dieser Schwierigkeiten durch Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung einer wässerigen Gewebekulturflüssigkeit, welche eine hohe Konzentration an lebendem infektiösem Hepatitisvirus enthält.
Das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, dass man eine Gewebekultur des Detroit-6-Stammes epithelartiger Zellen oder von aus embryonalem Gewebe gewonnenen Spindelzellen, wie PD39T -Zellen mit lebendem infektiösem Hepatitisvirus beimpft und die beimpfte Kultur bei einer Temperatur zwischen
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Impfmedien bei verschiedenen diagnostischen Tests oder als Ausgangsmaterialien für die Herstellung von Vaccinen und/oder Immunisierungsseren verwendet werden.
Die zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens vorgeschlagenen besonderen Zellen sind epithelartige Zellen des Detroit-6-Stammes, welche von Berman u. a. in. der Literaturstelle"Blood",
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ber, Milz, Niere, die Haut, die Eingeweide oder der ganze embryonale Körper verwendet werden. Ein besonderes Beispiel ist ein aus Testikelgewebe erhaltener Zellstamm, die sogenannten PD39T-Zellen, deren Isolierung und Kultivierung im folgenden genauer beschrieben wird.
Verfahren zur Isolierung und Kultivierung : Testikel, die bei einer Autopsie von einem 11 Tage alten Individuum erhalten waren, wurden in eine Hank'sche Lösung für 2 - 4 h eingelegt, in Stücke von ungefähr 1 - 3 mm3 geschnitten und Wälzröhrchen nach der Plasmagerinnungsmethode vorbereitet. Jedes Röhr-
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chen enthielt etwa 8 - 10 Explantationen mit 2 ml eines Mediums, welches aus 75% Hank'scher Lösung, 20% flüssigem menschlichem Serum und 5% Hühnerembryonenextrakt bestand. Die Medien wurden zweibis dreimal pro Woche durch Entfernung der Hälfte des ursprünglichen Mediums aus jedem Röhrchen und Ersetzung mit einem gleichen Volumen an frischem Medium gewechselt. Die Ernte aus den ursprünglichen Explantationen bestand hauptsächlich aus Spindelzellen, die nach 4 - 8 Inkubationstagen rasch zunahmen.
Übertragung der Kultur : Nach 13 Tagen wurde das Medium von den Kulturen entfernt, die Zellen mit 2 ml Hank'scher Lösung gewaschen und etwa 2,5 ml einer 0, 25% eigen Trypsinlösung bei einem PHWert von 7,4 und einer Temperatur von 370C zu jedem Röhrchen zugegeben. Die Röhrchen wurden bei 37 C während etwa 45 - 60 min gedreht und der Inhalt der Röhrchen gesammelt und in einem Eisbad gekühlt. Die Suspension wurde bei 4-8 C mit 1500 - 1800 Umdr/min während 10 - 12 min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Die zurückbleibenden Zellen wurden in einem gleichen Volumen Nährmedium (das gleiche wie das vorher verwendete) wieder suspendiert und nochmals zentrifugiert.
Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt und das dritte Mal nur ein halbes Volumen an Nährmedium für die nochmalige Suspension verwendet. Die Suspension wurde auf eine Konzentration von 120 000 Zellen/ml verdünnt und diese Zellensuspension wurde zur Herstellung stationärer Kulturen verwendet. 1 ml der Suspension wurde in jedes Röhrchen gegeben und nach 2 Tagen Inkubation bei 370C wurde 1 ml frisches Nährmedium zu jedem Röhrchen zugegeben. Nach 8 Tagen enthielten die Röhrchen eine Monoschicht von Spindelzellen und waren nun zur Verwendung für die Zwecke der Erfindung geeignet.
Virusspektrum der Zellen : Die entwickelten Medien wurden von den in der oben beschriebenen Weise vorbereiteten stationären Röhrchen entfernt und die Zellschicht mit einer Mischung Nr. 635, die 5% Pferdeserum enthielt, gewaschen. Nach drei Waschungen wurden 1, 5 ml"Maintenance-Medium" {Medium Nr. 635 (Healy u. a., Canad. J. Biochem. & Physiol., Bd. 32 [1954], S. 327-337) plus 100/0Pferdeserum} jedem Röhrchen zugefügt. Danach wurden 0,5 ml einer Lösung, welche jeden der zu testenden Viren enthielt, den verschiedenen Röhrchen zugefügt und die Röhrchen bei 370C bebrütet. Von Zeit zu Zeit wurden die Röhrchen geprüft, um festzustellen, ob die Zellen für die zu testenden Viren empfänglich waren.
Folgende Resultate wurden erhalten :
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<tb>
<tb> Viren, <SEP> welche <SEP> einen <SEP> cytopathogenen <SEP> Zeit, <SEP> bis <SEP> der
<tb> Effekt <SEP> auf <SEP> Zellen <SEP> ausüben <SEP> Effekt <SEP> sichtbar-wird
<tb> APC, <SEP> Typ <SEP> 4, <SEP> RI-67 <SEP> 6 <SEP> Tage
<tb> APC. <SEP> Typ <SEP> 4, <SEP> RN <SEP> 11 <SEP> Tage
<tb> APC, <SEP> Typ <SEP> 2, <SEP> Ad-6 <SEP> 11 <SEP> Tage
<tb> APC, <SEP> Typ <SEP> 3, <SEP> J. <SEP> F.
<SEP> 5 <SEP> Tage
<tb> Polio <SEP> Typ <SEP> 1, <SEP> Mahoney <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Polio <SEP> Typ <SEP> 2, <SEP> MEF-1 <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Polio <SEP> Typ <SEP> 3, <SEP> Saukett <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Influenza <SEP> 1233 <SEP> 13 <SEP> Tage
<tb> Influenza <SEP> PR <SEP> 5 <SEP> Tage
<tb> Tollwut <SEP> CVS <SEP> 8 <SEP> Tage
<tb> Gelbes <SEP> Fieber, <SEP> 17D <SEP> 6 <SEP> Tage
<tb> östliche <SEP> Pferde-Encephalomyelitis <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Herpes <SEP> HF <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Vaccinia <SEP> 2 <SEP> Tage
<tb> Psittacosis, <SEP> Borg <SEP> 6 <SEP> Tage
<tb> Viren, <SEP> die <SEP> keinen <SEP> cytopathogenen
<tb> Effekt <SEP> auf <SEP> Zellen <SEP> ausüben
<tb> Influenza <SEP> WS
<tb> Epidemischer <SEP> Typhus
<tb> APC, <SEP> Typ <SEP> 1
<tb>
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Zell-Typ : Der vorherrschende Zelltyp ist eine fibroplastartige Zelle.
Die Gewebekulturen der besonderen Zellen werden in üblicher Weise bereitet. Der Zellstamm wird in Hank'schem"BBS-Medium"kultiviert, zu welchem flüssiges menschliches Serum oder Pferdeserum und embryonaler Extrakt zugegeben wurden (vgl. Stulberg u. a., Proc. Soc. Exper. Biol. and Med., Bd. 89 [1955], S. 438-441). Die Flüssigkeit wird von den 3 - 6 Tage alten Kulturen entfernt, die Zellen in einem Nährmedium, wie dem Medium 199, welches Menschen- oder Pferdeserum enthält, suspendiert und die
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schicht die Seiten der Kulturenbehälter. Die Flüssigkeit wird dekantiert und die Zellschicht mit einer sterilen Hank'schen Lösung, die Pferdeserum oder eine ähnliche physiologische Lösung enthält, gewa- schen. Die Gewebekulturen sind dann zur Beimpfung fertig.
Vorzugsweise wird die Beimpfung durchge- führt, bevor das "Supportive Maintenance-Medium" den Zellen zugegeben wird.
Als Impfmedium kann irgendeine Flüssigkeit verwendet werden, die lebenden infektiösen Hepatitis- virus enthält. Man kann z. B. Serum, Plasma oder Blut verwenden, die den Virus in verdünnter oder un- verdünnter Form enthalten, oder auch eine den Virus enthaltende Gewebekulturflüssigkeit. Man kann auch einen flüssigen Extrakt des Stuhls, der Milz, der Leber oder des Knochenmarkes von an infektiöser Hepatitis leidenden Patienten als Impfflüssigkeit verwenden.
Als supportives wässeriges Medium für die Zellen während der Inkubationsperiode kann man eines oder mehrere der üblicherweise verwendeten Medien heranziehen. Medium Nr. 199 mit einem Zusatz von 5 bis 200/0 Pferde- oder Kalbserum ergibt, wie gefunden wurde, ausgezeichnete Ergebnisse. Hank'sches BBS-Medium mit einem Zusatz von nicht-menschlichem Serum und embryonalem Extrakt kann ebenfalls verwendet werden. Im allgemeinen wird bevorzugt, von der Verwendung menschlichen Serums bei Medien abzusehen, besonders wenn die Erfindung für diagnostische Zwecke verwendet werden soll.
Nach der Beimpfung wird die beimpfte Kultur bei einer für das Zellwachstum günstigen Temperatur bebrütet. Im allgemeinen ist dies eine Temperatur zwischen 30 und 42 C, vorzugsweise zwischen 35 und 39 C. Die Inkubationszeit ist nicht besonders kritisch, aber sie soll so lange erfolgen, bis die zellulare Monoschicht aufreisst und eine Anzahl von kleinen dunklen körnigen Zellen, unregelmässig in Grösse und Aussehen, sichtbar werden, die sich zu Klumpen ballen, wobei das Chromatin eine Randstellung einnimmt. Dies erfordert im allgemeinen einige Tage. In den meisten Fällen wird die Inkubation während einer Periode von 6 bis 14 Tagen durchgeführt.
NachBeendigung der Inkubation wird die lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthaltende Flüssigkeit von dem in der Kultur vorhandenen festen Material getrennt. Dies kann durch Filtration durch ein Seitzfilter, ein Bakterienporzellanfilter oder ein Bakterienfilter aus gefrittetem Glas oder durch Dekantieren oder durch Zentrifugieren erfolgen. Die erhaltene Gewebekulturflüssigkeit enthält eine hohe Konzentration an dem lebenden infektiösen Hepatitisvirus. Diese, den lebenden Virus enthaltenden Flüssigkeiten sind nützlich für die Beimpfung anderer Gewebekulturen zur Herstellung von Vaccinen, für die Prüfung von Gammaglobulin oder für die Feststellung, ob eine gegebene Person in der Vergangenheit infektiöse Hepatitis hatte.
Wenn man die vorerwähnten Gewebekulturflüssigkeiten, die lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthalten, zur Untersuchung der Eignung einer gegebenen Gammaglobulinzubereitung für die Behandlung von infektiöser Hepatitis verwendet, nimmt man zuerst eine bekannte Menge der zu prüfenden Gammaglobulinzubereitung und löst sie in einer bekannten Menge Wasser. Von dieser Lösung wird eine Reihe geeigneter Verdünnungen (gewöhnlich zweifach von l : 5 bis 1 : 1280) hergestellt. Gleiche Volumina dieser Verdünnungen und eine geeignete Verdünnung des Virus (gewöhnlich 1 : 5) werden in gleichen Volumteilen gemischt. Nach 1/2 h Inkubationszeit bei ungefähr 20 C wird die Mischung in Gewebekultu-
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Hepatitisvirus einen cytopathogenen Effekt auf die Detroit-6-Zellen der Kultur ausgeübt hat.
Wenn das der Fall ist, wird damit angezeigt, dass bei einer bestimmten Konzentration in der Kultur das Gammaglobulin gegenüber dem infektiösen Hepatitisvirus keine Wirkung hat. Wenn am Ende der Inkubationsperiode kein cytopathogener Effekt an den Detroit-6-Zellen festgestellt wird, zeigt dies an, dass bei einer besonderen Konzentration in der Kultur das Gammaglobulin fähig ist, den infektiösen Hepatitisvirus zu neutralisieren. Auf diese Weise zeigt die vorerwähnte Prozedur nicht nur an, ob eine besondere Gammaglobulinzubereitung fähig ist, den infektiösen Hepatitisvirus zu neutralisieren, sondern gibt auch einen Hinweis auf ihre Potenz bzw. Wirksamkeit in dieser Hinsicht.
In ähnlicher Weise können die vorerwähnten Gewebekulturflüssigkeiten, die lebenden infektiösen
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Hepatitisvirus enthalten, verwendet werden, um festzustellen, ob eine gegebene Person früher infektiöse
Hepatitis hatte. Dies wird durchgeführt, indem man eine Gewebekultur von Detroit-6-Zellen herstellt und die Kultur mit einer bekannten Menge, gewöhnlich mit etwa 0,5 ml, einer Mischung beimpft, die gleiche Volumteile einer geeigneten Serumverdünnung und einer Standard Virus-Verdünnung enthält. Das
Serum wird aus dem Blut des zu untersuchenden Patienten hergestellt und mit Medium Nr. 199, gewöhn- lich einer etwa 1 : 5-Verdünnung, verdünnt.
Eine bekannte Menge des Serums oder der Verdünnung des- selben wird zu einem vorbestimmten, gewöhnlich gleichen, Volumen der Standardvirus-Verdünnung (ge- wöhnlich etwa 1 : 5) zugefügt und die Mischung zur Beimpfung der Gewebekulturen verwendet, die dann bei 35-40 C während 9 - 14 Tagen bebrütet werden. Wenn am Ende der Inkubationsperiode die Prüfung der Gewebekulturen anzeigt, dass der Virus einen cytopathogenen Effekt auf die Zellen ausgeübt hat, be- deutet dieser Test, dass der Patient in der Vergangenheit keine infektiöse Hepatitis hatte. Wenn jedoch der Virus keinen cytopathogenen Effekt auf die Zellen ausgeübt hat, hatte der Patient eine infektiöse
Hepatitis durchgemacht.
Bei einer andern Anwendung kann man feststellen, ob ein Patient gegenwärtig von infektiöser Hepa- titis befallen ist oder ob sein Blut ohne Bedenken für Transfusionszwecke verwendet werden kann. Diese..
Untersuchung wird durchgeführt, indem man eine Kultur von Detroit-6-Zellen herstellt und die Kultur mit einem Serum oder einer Serumverdünnung aus dem Blut des zu prüfenden Patienten beimpft. Die beimpfte Kultur wird dann täglich untersucht und während 9 - 14 Tagen reifen gelassen. Wenn ein cytopathogener Effekt an den Detroit-6-Zellen festgestellt wird, zeigt der Test an, dass der Patient von infektiöser Hepatitis befallen ist und/oder dass sein Blut für Transfusionszwecke nicht geeignet ist. Wenn kein cytopathogener Effekt an den Zellen festgestellt wird, leidet der Patient nicht an infektiöser Hepatitis.
Um ein Vaccin aus Gewebekulturflüssigkeiten, die lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthalten, herzustellen, behandelt man eine Gewebekulturflüssigkeit mit ultraviolettem Licht, Chemikalien oder einer Kombination dieser Massnahmen unter solchen Bedingungen, dass die Infektivität des Virus vollständig zerstört, aber die Antigenwirkung nicht beeinträchtigt wird. Als Chemikalien kann man Formaldehyd, ss-Propiolacton, Chlor oder Phenol verwenden. Da der Virus und seine Antigenwirkung gegenüber Hitze sehr widerstandsfähig sind, können bei der Herstellung der Vaccine, wenn erwünscht, erhöhte Temperaturen angewendet werden. Die optimale Temperatur hängt natürlich von dem jeweils verwendeten besonderen Mittel ab, aber im allgemeinen können Temperaturen zwischen 20 und 80 C angewendet werden.
Wenn man -Propiolacton, entweder allein oder in Kombination mit andern Mitteln, als "Abtötungsmittel"verwendet, ist eine Konzentration im Bereich von 0,001 bis 0,0025 g/ml der Gewebekulturflüssigkeit zu bevorzugen. Wird Formaldehyd als Abtötungsmittel verwendet, so liegt die anzuwendende Konzentration im Bereich von 1 : 400 bis 1 : 4000 und die Mischung wird bei erhöhter Temperatur während ungefähr 1 h bebrütet. Wenn Phenol als Abtötungsmittel verwendet wird, soll die Menge derart sein, dass die Endkonzentration in der Hähe von 0, 1 bis 0, 50/0 liegt. Ultraviolettes Licht wird vorzugsweise entweder vor oder nach der Anwendung eines der chemischen Abtötungsmittel benutzt.
Die flüssige Gewebekultur wird vorzugsweise erwärmt und dann in Form eines dünnen Films ultraviolettem Licht mit einer Wellenlänge zwischen 2000 und 3000 Angström-Einheiten während kurzer Zeit, d. i. 1 oder 2 sec oder weniger, ausgesetzt. Besonders gute Ergebnisse können bei Verwendung einer ZentrifugalFilmbildungseinrichtung erhalten werden, wie eine solche in der USA-Patentschrift Nr. 2, 725, 482 be- schrieben ist, wobei eine Durchsatzgeschwindigkeit von 200 bis 600 ml/min mit einer Ultraviolett-Leistung von 15 bis 22 W angewendet wird. Die erhaltenen Vaccine sind vollständig frei von lebenden infektiösen Hepatitisviren und sind zur Herstellung von Immunisierungsseren für Kaninchen und Affen durch Injektionen geeignet. Die Vaccine können auch für prophylaktische Zwecke verwendet werden.
Die Erfindung wird durch folgende Beispiele erläutert :
Beispiel l : Herstellung einer Gewebekulturflüssigkeit, die lebenden infektiösen Hepatitis virus enthält.
Eine Zellkultur des Detroit-6-Stammes wird in Hank's BBS-Medium mit einem Zusatz von menschlichem Serum und embryonalem Extrakt kultiviert, wie es in Proc. Soc. Exper. Biol. and Med. 89 [1955],
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Ein Serum wird aus dem Blut eines Patienten (MR 1), der von infektiöser Hepatitis befallen ist, bereitet und das Serum bis zum fünffachen Volumen mit sterilem Medium Nr. 199, das 10% Pferdeserum enthält, verdünnt. 0,5 ml des verdünnten Serums werden der Gewebekultur zugefügt und die Zellschicht mit der Beimpfungsflüssigkeit benetzt. 1, 5 ml des Mediums Nr. 199 plus 10% Pferdeserum werden zuge-
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fügt und die Kultur bei 37 C während etwa 7 Tagen bebrütet. Am Ende der Inkubationsperiode zerriss die Monoschicht der Zellen und eine Anzahl von kleinen dunklen körnigen Zellen ballte sich, wobei das Chromatin eine Randzone bildete. Diese körnigen Zellen waren unregelmässig in Aussehen und Gestalt.
Die Flüssigkeit wird von der Kultur abdekantiert und durch ein Seitzfilter oder ein ultrafeines Bakterienfilter aus gefrittetem Glas filtriert. Das Filtrat enthält lebenden infektiösen Hepatitisvirus und kann für die Bestimmung von Gammaglobulinzubereitungen, die Feststellung des Vorhandenseins von infektiöser Hepatitis in der Vergangenheit oder für die Herstellung eines abgetöteten Vaccins verwendet werden.
In ähnlicher Weise wurden lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthaltende Gewebekulturflüssigkeiten aus dem Serum von vier andern Patienten (SAL, G. Pas, D. Keb und H. Pom), die von infektiöser Hepati- tis befallen waren, hergestellt.
Anstatt der Verwendung eines lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthaltenden Serums als Beimpfungsflüssigkeit kann man auch eine Stuhlsuspension verwenden. Dies erfolgt dadurch, dass man eine Stuhlprobe eines an infektiöser Hepatitis erkrankten Patienten auf das 100fache Volumen mit steriler physiologischer Salzlösung oder Medium Nr. 199 verdünnt, zentrifugiert und 0, 5 ml der klaren überste- henden Flüssigkeit zur Beimpfung verwendet. Auf diese Weise wurden Gewebekulturflüssigkeiten mit einem Gehalt an lebendem infektiösem Hepatitisvirus aus den Stühlen von drei Patienten, die an infektiöser Hepatitis litten, hergestellt.
Beispiel 2 : Vaccinhersiellung.
Eine Suspension von Detroit-6-Zellen wird aus 100 Stammkulturen, die auf Glas in 100 g (32 oz)Flaschen gezogen waren, durch Behandlung mit einer wässerigen Lösung, enthaltend 0,02% Äthylendiaminotetraessigsäure, hergestellt. Die erhaltene Suspension wird zu 24 l Nährmedium (Medium Nr. 199 plus 20% Menschenserum) zugefügt, wobei man eine Suspension mit einem Gehalt von 60000 Zellen pro ml erhält. Nach Durchmischung wird die Suspension mittels eines Eisbades auf 0-5 C gekühlt und mit einem magnetischen Rührer in gleichmässiger Suspension gehalten. Die Suspension wird in aliquote Teile von 80 ml geteilt und in 300 sterile 100 g-Flaschen eingebracht. Die Flaschen werden dicht verschlossen und 4 Tage bei 37, 5 C bebrütet.
Zu dieser Zeit haben sich die Zellen vervielfältigt und bilden eine fast zusammenhängende Schicht, die die Seite der Kulturflaschen bedeckt. (Jede Flasche enthält ungefähr 15 Millionen Zellen. ) Die Zellschichten werden dreimal mit ungefähr 100 ml steriler Hank'scher Lösung, die 10% Pferdeserum enthält, gewaschen, um menschliches Serum zu entfernen, welches Hepatitis-Antikörper enthalten könnte. Die Kulturen sind nun fertig zur Beimpfung.
300 gewaschene Kulturen werden durch Zugabe von 4 ml einer gemäss Beispiel 1 hergestellten, lebenden infektiösen Virus enthaltenden Gewebekulturflüssigkeit besät, und die Impfflüssigkeit über die ganze Zellschicht gesprüht. Nach einer Inkubation von 30 min, zur Einleitung der Infektion, werden zu jedem Behälter 36 ml eines "Maintenance-Mediums" (Medium Nr. 199 plus 5% Pferdeserum) zugefügt.
Die Flaschen werden dann 6 Tage bei 37, 5 C bebrütet, am Ende dieser Zeit sind die Zellschichten zerrissen und einige der Zellen aufgebrochen. Die Flüssigkeiten werden gesammelt und vereinigt. Die Gesamtausbeute beträgt ungefähr 11,7 1. Proben des gesammelten Produktes werden auf ihre Lebensfähigkeit geprüft, indem man eine Probe verdünnt und die Verdünnung feststellt, in welcher an frischen Kulturen von Detroit-6-Zellen noch eine cytopathogene Änderung bewirkt wird. Die Suspension bei diesem besonderen Beispiel hatte noch bei einer Verdünnung von 10-4 oder 1 : 10000 die Fähigkeit, solche cytopathogene Änderungen zu bewirken. Die Wirkungsstärke der Flüssigkeit wurde auch in bezug auf ihre Fähigkeit, Meerschweinchen-Komplement zu fixieren, geprüft.
Diese Flüssigkeit war bei einer Verdünnung von 1 : 4 imstande, eine Einheit von Meerschweinchen-Komplement zu fixieren, in Gegenwart von zwei Einheiten von in Affenserum enthaltenen Hepatitis-Antikörpern. (Die Methode zur Ausführung dieses Komplement-Fixierungstests ist in Viral & Rickettsial Infections of Man, herausgegeben von Thomas
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Rivers, M. D., [1948], S. 72-75, J. B. Lippincott company,Suspension wird dann durch Leiten durch eine Reihe von drei Filterkerzen aus gefrittetem Glas mit gra- luierter Porosität geklärt, wobei die letzte Kerze einen mittleren Porendurchmesser von etwa 0,9 Mikron ) esitzt. Das erhaltene Filtrat ist frei von Zellklumpen und Aggregaten, enthält aber noch den lebenden infektiösen Hepatitisvirus.
Versuche mit dieser filtrierten Flüssigkeit zeigen keinen deutlichen Abfall ler Infektivität oder der Komplement-Fixierungsaktivität im Vergleich mit der rohen Flüssigkeit. Unge- 'wahr 11,2 l an klarem Filtrat werden erhalten.
Beispiel 3 : Herstellung von Gewebekulturflüssigkeiten, die lebenden infektiösen Hepatitisvirus nthalten.
Fünf Röhrchen einer Gewebekultur von PD39T-Zellen werden vorbereitet und mit 0, 5 ml einer 1 : 5-
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Verdünnung des Serums eines von infektiöser Hepatitis befallenen Patienten beimpft.
1, 5 ml "Maintenance-Lösung" (Medium Nr. 199 plus 5% Pferdeserum) werden zu jedem Röhrchen zu- gefügt und die Kulturen 10 Tage bei 37, 5 C bebrütet. Die Kulturflüssigkeiten werden durch ein Bakterienfilter mit einer mittleren Porosität von 0,3 Mikron geleitet, wobei ein Filtrat erhalten wird, das lebenden infektiösen Hepatitisvirus enthält.