DE102004032318A1 - Herstellung einer konzentrierten Lösung aus biologischen Substanzen - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer konzentrierten Lösung aus biologischen Substanzen, wie z. B. Viren, Viruspartikel, Antikörper, Proteine, unter Verwendung eines Bioreaktorsystems mit einer Filtrationseinheit in Form einer Membran oder einem Membransystem. Durch die Integration einer Parameterkontrolleinheit zur Darstellung unterschiedlicher Niveaus eines oder mehrerer Prozessparameter während des Herstellungsprozesses werden bei der vorliegenden Erfindung die Ausbeute und die Höhe der Konzentration der labilen biologischen Produkte positiv beeinflusst. DOLLAR A Bioreaktor und Filtrationseinheit sind so zu einem Bioreaktorsystem verbunden, dass bei der Filtration die labilen biologischen Substanzen gekühlt und im Membransystem zurückgehalten werden, wobei optional eine Rückführung des Filtrats zum Bioreaktor erfolgt.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer konzentrierten Lösung aus biologischen Substanzen, wie z.B. Viren, Viruspartikel, Antikörper, Proteine unter Verwendung eines Bioreaktors mit integrierter Membranfiltration.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Gebiete der Bio- und Membrantechnologie. Zielsetzung ist die Herstellung einer konzentrierten Lösung aus labilen biologischen Substanzen. Unter labil werden dabei solche biologischen Substanzen verstanden, deren Zerfall, Abbau oder Inaktivierung sich unter dem Einfluss von weiteren, in der Lösung enthaltenen Substanzen und/oder von Temperaturänderungen und/oder Druckänderungen und/oder Konzentrationsänderungen und/oder Änderungen des pH-Wertes und/oder unter Einfluss jeglicher Strahlungsarten, wie z.B. UV A, B, C, innerhalb von wenigen Stunden vollzieht. Konzentrierte Lösungen aus labilen biologischen Substanzen enthalten beispielsweise Viren, Viruspartikel, Antikörper oder Proteine oder deren Gemische in verschiedensten Kombinationen.
  • Stand der Technik
  • Labile biologische Substanzen wie Viren, Viruspartikel, Antikörper und verschiedene Proteine werden in den bisher bekannten Verfahren zu ihrer Herstellung häufig mit Hilfe von Filtrations- und Zentrifugationsprozessen aufkonzentriert. Dabei ist es üblich, die Aufkonzentrierung im Batch-Verfahren durchzuführen. Beim Batch-Prozess sind allerdings die hydrodynamischen Belastungen der Substanzen vergleichsweise hoch, so dass ein erheblicher Anteil der biologischen Substanz unmittelbar zerfällt und damit labil ist. Hinzu kommt, dass einige der biologischen Substanzen durch Bestandteile des Reaktionsmediums inaktiviert werden. Insbesondere bei der Aufkonzentrierung von Viren oder Viruspartikeln ist eine hohe Temperatursensibilität gegeben, so dass der Zerfall biologischer Substanzen oft exponentiell von der Temperatur abhängig ist.
  • In bisher bekannten Produktionsprozessen werden konzentrierte Lösungen an labilen biologischen Substanzen häufig über Fermentationsverfahren mit Biokatalysatoren wie beispielsweise Mikroorganismen, tierische oder pflanzliche Zellen, Enzymen und Zellfragmenten hergestellt. Dabei kommen sog. Bioreaktoren wie beispielsweise Rührkessel, Wirbelschichtreaktoren, Wannenstapel, Rollerflaschen zum Einsatz. Die labilen biologischen Substanzen liegen dabei intrazellulär oder extrazellulär vor.
  • Um die labilen biologischen Substanzen aus den Zellen oder dem Überstand zu isolieren, werden Zellaufschluss-, verschiedene Filtrations- sowie Zentrifugationsverfahren eingesetzt. Bisherige Verfahren wenden eine Dead end-, Cross-Flow- oder Schichtenfiltration bei großen Filtrationsflächen und moderaten Druckdifferenzen an. Meistens wird im diskontinuierlichen Satzverfahren (diskontinuierliche Verarbeitung kompletter Chargen) der Überstand einer Fermentation in einem Zug aufgearbeitet. Anschließend erfolgt eine Feinreinigung der labilen biologischen Substanzen mittels unterschiedlicher verfahrenstechnischer Methoden wie z.B. der Anwendung von Chromatographie, Extraktion oder Membrantechnologie. Zuletzt werden diese labilen biologischen Substanzen mit Hilfe von Stabilisierungs- und Konservierungsverfahren vor Zerfall und Abbau geschützt. Ein Beispiel für eine labile biologische Substanz sind retrovirale Pseudotypvektoren (J. Stitz, P. Muller, H. Merget-Millitzer and K. Cichutek, High-titer retroviral pseudotype vectors for specific targeting of human CD4-positive cells, J. Biogenic Amines, 14 (1998) 407-424), wie sie z.B. für die Transduktion von humanen T-Zellen einsetzbar sind. Diese Vektoren werden mit Hilfe von sog. Verpackungszelllinien humanen Ursprungs hergestellt und liegen extrazellulär im Mediumüberstand vor. Der Zerfall bzw. Abbau dieser Vektoren ist stark von Parametern wie pH-Wert, Temperatur und den Proteinbestandteilen im Medium abhängig (P.E. Cruz, D. Goncalves, J. Almeida, J. Moreira and M.J.T. Carrondo, Modeling retrovirus production for gene therapy. 2. Integrated optimization of bioreaction and downstream processing, J. Biotechnol. Prog., 16 (2000) 350-357). Die Vektoren werden mit Hilfe von Membranverfahren und anschließender chromatographischer Verfahren aus dem Medium abgetrennt. Vereinzelt findet auch Ultrazentrifugation Anwendung. Auf Grund des Temperatur abhängigen Zerfalls geht ein erheblicher Anteil der labilen biologischen Substanz verloren.
  • Da sich die optimalen Bedingungen des Biokatalysators oft von den optimalen Bedingungen im Bezug auf die Stabilität der labilen biologischen Substanz unterscheiden, muss bei Verfahren des Standes der Technik ein erheblicher Verlust an Produkt in Kauf genommen werden. Der satzweise Betrieb erfordert lange Verweilzeiten der labilen biologischen Substanz bei Produktionsbedingungen, was automatisch zu einem Verlust eines Teils der labilen biologischen Substanzen führt. So liegt beispielsweise die Halbwertszeit eines retroviralen Vektors bei 37°C, also der optimalen Temperatur der produzierenden Zelle, zwischen 5h und 6h, während die optimale Temperatur im Hinblick auf die Stabilität des Vektors bei 4°C und einer Halbwertszeit von 20h liegt. Andere Vakzine und Viren haben ebenfalls Temperatur abhängige Halbwertszeiten beim Zerfall (P.E. Cruz, D. Goncal ves, J. Almeida, J. Moreira and M.J.T. Carrondo, Modeling retrovirus production for gene therapy. 2. Integrated optimization of bioreaction and downstream processing, J. Biotechnol. Prog., 16 (2000) 350-357).
  • Der Stand der Technik kennt zahlreiche Verfahren zur Herstellung, Filtration und Aufkonzentrierung von Lösungen labiler biologischer Substanzen. Keines dieser Verfahren gestattet es, die drei Produktionsschritte Herstellung, Filtration und Aufkonzentrierung in einer einzigen Apparatur durchzuführen und dabei gleichzeitig Abbau, Zerfall und/oder Inaktivierung der labilen biologischen Substanzen zu verhindern.
  • Die DE 100 24 063 A1 offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen in einer Kammer, wobei Mikrokapillaren die Basis dieser Kammer darstellen. Die Kammer besitzt jedoch ebenfalls keine Vorrichtung zur Abtrennung von suspendierten oder gelösten Produkten.
  • Die DE 103 04 236 A1 beschreibt ein Bioreaktorsystem, in dem Zellen zurückgehalten werden, um diese in hohen Dichten zu kultivieren und die Versorgung über semipermeable Membranen vorzunehmen. Auch dieses System gestattet keine Abtrennung gelöster oder suspendierter Produkte. Darüber hinaus ist es nicht möglich, Filtrate rückzuführen.
  • Die DE 696 21 790 T2 offenbart eine Filtervorrichtung zur Abtrennung von Zellen, Blut, Serum oder Plasma. Eine Kultivierung von Zellen ist mit diesem System jedoch nicht vorgesehen und nicht möglich.
  • Die WO 01/04262 A2 beschreibt einen Bioreaktor zur Kultivierung von Zellen, die in einem Kultivierungsraum zurückgehalten werden, während die Medien diesen Raum durchströmen können. Gelöste oder suspendierte Produkte lassen sich mit diesem Reaktor nicht abtrennen; außerdem besteht keine Möglichkeit der Rückführung von Filtraten.
  • WO 03/070873 offenbart einen Bioreaktor, der als Festbettreaktor oder Wirbelschichtreaktor ausgeführt werden kann. Es kommen verschiedene Trägermaterialien für das Aufwachsen von Zellen und Mikroorganismen zum Einsatz. Des weiteren sind Filtrationsvorrichtungen vorgesehen, aber das Filtrat kann nicht rückgeführt werden.
  • Die WO 98/505222 offenbart ein Kultursystem, das aus einem Kulturgefäß, einem Erntegefäß und einem Zufuhrgefäß besteht. Innerhalb des Systems können un- terschiedliche Temperaturniveaus realisiert werden. Das Kultursystem ist beispielsweise zur Herstellung von viralen und retroviralen Vektoren und Vakzinen geeignet. Nachteilig an diesem System ist, dass Filtration, Aufkonzentrierung und Rückführung des Filtrates nicht möglich sind.
  • Keines der dem Fachmann bislang bekannten Verfahren gestattet es, labile biologische Substanzen in einem Bioreaktorsystem in zufrieden stellender Qualität herzustellen und die Prozesse Herstellung, Filtration und Aufkonzentrierung dieser Substanzen in einer Vorrichtung durchzuführen.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher die Nachteile im Stand der Technik zu beseitigen und, ein Bioreaktorssystem bestehend aus Bioreaktor und Filtrationseinheit und ein mittels dieses Bioreaktorsystems durchführbares einfaches Verfahren zur Herstellung, Filtration und Aufkonzentrierung labiler biologischer Substanzen deren Zerfall, Abbau oder Inaktivierung sich unter dem Einfluss von weiteren, in der Lösung enthaltenen Substanzen und/oder von Temperaturänderungen und/oder von Druckänderungen und/oder von Konzentrationsänderungen und/oder von Änderungen des pH-Wertes und/oder unter Einfluss jeglicher Strahlungsarten, wie z.B. UV A, B, C, innerhalb von wenigen Stunden vollzieht, bereitzustellen, so dass die labilen biologischen Substanzen stabil vorliegen und Filtrat in den Bioreaktor zurückgeführt wird.
  • Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Bioreaktorsystem zur Herstellung, Filtration und Aufkonzentrierung labiler biologischer Substanzen gemäß der Ansprüche 1-11 und einem Verfahren gemäß der Ansprüche 12-20.
  • Das Bioreaktorsystem besteht aus einem bekannten handelsüblichen Bioreaktor, beispielsweise einem Suspensionsreaktor, einem Festbett, einem Hohlfasermodul oder einem Wirbelbett und einer Filtrationseinheit in Form einer Membran oder einem Membransystem. Durch die Integration einer Parameterkontrolleinheit zur Darstellung unterschiedlicher Niveaus eines oder mehrerer Prozessparameter während des Herstellungsprozesses werden bei der vorliegenden Erfindung die Ausbeute und die Höhe der Konzentration der labilen biologischen Produkte positiv beeinflusst.
  • Bioreaktor und Filtrationseinheit sind so zu einem Bioreaktorsystem verbunden, dass bei der Filtration die labilen biologischen Substanzen gekühlt und im Membransystem zurück gehalten werden, wobei optional eine Rückführung des Filtrats zum Bioreaktor erfolgt.
  • 1 zeigt die schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispieles.
  • In einem Ausführungsbeispiel des Bioreaktorsystems besteht der Bioreaktor aus einem Festbettreaktor (1), dem ein Konditionierungsgefäß (3) angeschlossen ist. Festbettreaktor (1) und Konditionierungsgefäß (3) sind über mindestens eine Leitung (17) wahlweise mit peristaltischer Pumpe (15) miteinander verbunden. Eine Leitung (17) vom Konditionierungsgefäß führt beispielsweise Medium aus dem Konditionierungsgefäß (3) in den Festbettreaktor (1) sorgt für eine optimale Versorgung des Festbetts mit Medium. Das Medium wird mittels Wärmevorrichtung beispielsweise einem Wärmeaustauscher (19) in der Leitung (17) bis zu einer gewünschten einstellbaren Temperatur aufgeheizt.
  • Eine Parameterkontrolleinheit (5) ist so am Konditionierungsgefäß (3) angebracht, dass ihre Sensoren wichtige Prozessparameter, wie beispielsweise pH-Wert, Druck, Temperatur und Sauerstoff messen und eine gezielte Regelung dieser Parameter bis zu einem einstellbaren Sollwert ermöglichen. Die Regelung des pH-Wertes erfolgt dabei beispielsweise über CO2-Begasung, die Regelung des Druckes über ein Proportionalventil bzw. Manometer, die Regelung der Temperatur über eine Wärme- bzw. eine Kühlvorrichtung und die Regelung des Sauerstoff-Gehaltes mit Hilfe einer Messsonde und einer Ventilsteuerung. Eine Probe des labilen Bioprodukts wird mit Hilfe einer separaten Probennahme-Vorrichtung (nicht eingezeichnet, z.B. Pipette o.ä.) entnommen und dann quantitativ und/oder qualitativ analysiert. Vorzugsweise ist die Parameterkontrolleinheit (5) im Konditionierungsgefäß (3) integriert. Aus einem Gefäß für Zulauf (9) führt eine Leitung (17) mit einer peristaltischen Pumpe (15) zum Konditionierungsgefäß (3), vom Konditionierungsgefäß (3) führt eine weitere Leitung (17) mit einer peristaltischen Pumpe (15) zu einem Retentatgefäß (11). Das Retentatgefäß (11) ist über eine Leitung (17) mit einer Filtrationseinheit (7) verbunden, so dass Flüssigkeit mit peristaltischer Pumpe (15) durch die Filtrationseinheit (7) gepumpt wird, wobei die mit peristaltische Pumpe (15) vor oder alternativ unmittelbar nach der Filtrationseinheit (7) angeordnet ist. Die Filtrationseinheit (7) selber ist vorzugsweise eine Membran oder ein Membransystem in der durch vakuuminduzierten transmembranen Druck ein Permeatstrom durch die gesamte Filtrationseinheit (7) entsteht. Von der Filtrationseinheit (7) führt eine Leitung (17) in das Retentatgefäß (11) zurück und zusätzlich führt aus der Filtrationseinheit (7) eine Leitung zu einem Filtratgefäß (13). Vom Filtratgefäß (13) führt eine Leitung (17) mit einer peristaltischen Pumpe (15) zurück zum Konditionierungsgefäß (3).
  • Die Pumpe (15) ist dabei so eingestellt, dass die Volumina im Filtratgefäß (13) und Retentatgefäß (11) konstant bleiben. Verbrauchte Nährstoffe werden durch die Zufuhr von frischem Medium über ein Gefäß für Zulauf (9) aufgefüllt.
  • Im Bioreaktorsystem steuert die Parameterkontrolleinheit (5) mit einer Temperatursteuerung und/oder einer Vorrichtung zur Regelung weiterer Prozessparameter alle Prozessvolumina so, dass die Prozessparameter von Retentat, Filtrat und Reaktorvolumen unabhängig voneinander auf unterschiedliche oder gleiche Werte eingestellt werden. Wichtige Prozessparameter sind dabei beispielsweise Temperatur, pH-Wert, Sauerstoffkonzentration, Substratkonzentration und Metabolitkonzentration. Eine labile biologische Substanz wird anhand dieser Messung nach kurzer Verweilzeit im Bioreaktor ausgeschleust und vor der Filtration sofort auf ein die Zerfallsrate minimierendes Temperaturniveau gebracht, so dass eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute bei hoher Produktkonzentration realisiert ist. Dazu ist an der Leitung vom Konditionierungsgefäß (3) zum Retentatgefäß (11) und/oder an der Leitung vom Retentatgefäß (11) zur Filtrationseinheit (7) eine Kühlvorrichtung (nicht eingezeichnet) anbracht, die über Strahlung und/oder Wärmeleitung und/oder Konvektion (erzwungene oder freie Konvektion) eine Kühlung auf minimierendes Temperaturniveau beispielsweise von 37°C auf 4°C bewirkt.
  • Der Bioreaktor ist alternativ ein dem Fachmann bekannte Suspensionsreaktor, wie beispielsweise ein STR (Stirred Tank Reactor, diskontinuierlicher idealer Rührkessel), CSTR (Continuous Stirred Tank Reactor) oder Schlaufenreaktor, oder ein Reaktor für adhärente Zellen, beispielsweise ein Festbettreaktor, Hohlfasermodul, Wirbelbettreaktor oder Microcarriersysteme (z.B. STR indem Microcarrier, Träger auf denen die Zellen anheften, suspendiert sind). Unter Bioreaktor wird dabei allgemein der Kultivierungsraum der Mikroorganismen und/oder Zellen verstanden, in dem die optimalen zellspezifischen physikalisch/chemischen Randbedingungen für das Wachstum der Kulturen eingestellt werden.
  • Die Filtrationseinheit (7) ist eine Membran oder ein Membransystem beispielsweise eine dem Fachmann bekannte anorganische oder organische Ultrafiltrationsmembranen mit einem Porendurchmesser von 10 bis 1000 nm. Bevorzugt werden Membranen verwendet, die dampfsterilisierbar sind, um diese steril im integrierten Prozess zu betreiben. Besonders bevorzugt werden dem Fachmann bekannte keramische Membranen aus bioinerten Materialien wie beispielsweise Zirkoniumoxid, Titandioxid, Aluminiumoxid oder einer Kombination dieser Materialien (Mixed-Matrix Membranen) auch mit organischen Materialien verwendet, da dem Fachmann bekannt ist, dass die genannten Membranen aus keramischen oxidischen Materialien alle Anforderungen an die Sterilität erfüllen und eine hohe Standzeit im Prozess aufweisen. Bevorzugt erfolgt die Abtrennung der labilen biologischen Substanzen mit keramischen Membranen, da die hydrophilen Eigenschaften der keramischen Membranen eine schonende Verwendung ermöglichen.
  • Die Filtrationseinheit (7) wird entweder im Dead-end- bzw. sequenziellen Dead-end- oder im Cross-Flow-Modus mit oder alternativ ohne Rückführung des Filtrats betrieben, wobei unter Filtrationseinheit ein System verstanden wird, dass den Durchfluss eines Trägermediums erlaubt, während die in der Trägersubstanz enthaltenden Komponenten (wie labile biologische Substanzen z.B. Zellen und Viruspartikel) von einander getrennt werden.
  • In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung erfolgt der Durchfluss der Filtrationseinheit (7) über Pumpen (15) gesteuerte Leitungen (17) von einem Retentatgefäß (11) so dass Retentat durch die Filtrationseinheit (7) gepumpt wird. Von der Filtrationseinheit (7) führt eine Leitung (17) in das Retentatgefäß (11) zurück und zusätzlich eine Leitung (17) zu einem Filtratgefäß (13). Vom Filtratgefäß (13) führt eine Leitung (17) zu einem Lagerungsgefäß für die labilen biologischen Substanzen (nicht dargestellt), damit verfassen die labilen biologischen Substanzen den Prozess des Bioreaktorsystems.
  • Die Parameterkontrolleinheit besteht aus Regler für Temperatur, Volumenstände der einzelnen angeschlossenen Gefäße sowie weiteren Reglern für Substratkonzentrationen und Metabolite.
  • Die Gefäßgrößen liegen dabei für den optimalen Labormaßstab zwischen 100 ml und 10 Liter, für den Pilotmaßstab zwischen 1 L und 100L sowie für den Produktionsmaßstab zwischen 10 und 10 m3.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein einfaches Verfahren zur Herstellung, Filtration und Aufkonzentrierung labiler biologischer Substanzen deren Zerfall, Abbau oder Inaktivierung sich unter dem Einfluss von weiteren, in der Lösung enthaltenen Substanzen und/oder von Temperaturänderungen und/oder von Druckänderungen und/oder von Konzentrationsänderungen und/oder von Änderungen des pH-Wertes und/oder unter Einfluss jeglicher Strahlungsarten, wie z.B. UV A, B, C, innerhalb von wenigen Stunden vollzieht, beispielsweise die Herstellung von Viren oder viralen Partikeln in hohen Konzentrationen.
  • Dies beinhaltet die Herstellung labiler biologischer Substanzen, ihre Filtration, Reinigung und Aufkonzentrierung im erfindungsgemäßen Bioreaktorsystem sowie die optionale Rückführung des Filtrats in den Bioreaktor, wobei die Filtrationseinheit (7) vorzugsweise im Perfusions- (kontinuierliche Mediumszufuhr) oder im Batch-Betrieb durchgeführt. Die Parameterkontrolleinheit (5) misst und regelt während des ganzen Verfahrens die Prozessparameter von Retentat, Filtrat und Reaktorvolumen unabhängig voneinander auf unterschiedliche oder gleiche Werte, je nach gewünschter Einstellung. Unter Prozessparametern werden dabei Temperatur, pH-Wert, Sauerstoffkonzentration, Substratkonzentration, Metabolitkonzentration verstanden. Bevorzugt erfolgt die Einstellung so, dass die labile biologische Substanz im Bioreaktor durch einen Wärmeaustauscher mit temperiertem Medium versorgt wird und beim Verlassen des Bioreaktors durch eine Kühlvorrichtung sofort auf ein die Zerfallsrate minimierendes Temperaturniveau gebracht, so dass eine hohe Raum-Zeit-Ausbeute bei hoher Produktkonzentration realisiert ist. Das anfallende Filtrat wird in den Prozess zurückgeführt, so dass eine gegenüber dem Stand der Technik verbesserte Ausnutzung der Edukte bzw. des Substrates erfolgt.
  • Das Verfahren für die Herstellung von labilen biologischen Substanzen deren Zerfall, Abbau oder Inaktivierung sich unter dem Einfluss von weiteren, in der Lösung enthaltenen Substanzen und/oder von Temperaturänderungen und/oder von Druckänderungen und/oder von Konzentrationsänderungen und/oder von Änderungen des pH-Wertes und/oder unter Einfluss jeglicher Strahlungsarten, wie z.B.
  • UV A, B, C, innerhalb von wenigen Stunden vollzieht, besteht im wesentlichen aus folgenden Schritten:
    • I) Kultivierung der Ausgangsmaterialien zur Herstellung der labilen biologischen Substanzen im Bioreaktor mit Medium
    • II) Bestimmung des Gehaltes der labilen biologischen Substanzen im Bioreaktor
    • III) Zulauf des Mediums mit den labilen biologischen Substanzen aus dem Bioreaktor unter Kühlung in eine Filtrationseinheit
    • IV) Durchführung der Filtration in der Filtrationseinheit so dass Medium zurück zum Bioreaktor fließt und die labilen biologischen Substanzen in einem Gefäß für Filtrat aufgefangen werden
  • Die Kultivierung der Ausgangsmaterialien zur Herstellung der labilen biologischen Substanzen im Bioreaktor (1) erfolgt beispielsweise im Festbett bis zur maximalen Zellbesiedlung, dem Festbett wird über eine peristaltische Pumpe (15) Medium zugeführt, das mittels Wärmevorrichtung optimal für den jeweiligen Kultivierungsverlauf der labilen biologischen Substanzen temperiert ist.
  • Die Kultivierungsparameter werden über die Parameterkontrolleinheit (5) gemessen und zum Normwert eingestellt. Die im Festbett produzierten labilen biologischen Substanzen werden über eine pumpenbetriebene Leitung (17) in ein Konditionierungsgefäß (3) gepumpt und gelangen von dort über Leitungen (17) mit Pumpen (15) zum Retentatgefäß (11). Die Parameterkontrolleinheit (5) misst über Sensoren pH-Wert, Temperatur und Sauerstoff im Konditionierungsgefäß und regelt eine Normwerteinstellung. Eine Kühlvorrichtung erwirkt sofort nach dem Verlassen des Konditionierungsgefäß (3) ein absenken der Temperatur auf ein zerfallminimierendes Niveau. Das Retentat wird durch die Filtrationseinheit (7) beispielsweise die inneren Kanäle eines Membranmoduls gepumpt. Aufgrund eines durch peristaltischen Pumpe (15) vakuuminduzierten transmembranen Drucks entsteht ein Permeatstrom zur entgegen gesetzten Seite der Filtrationseinheit (7).
  • Das Filtrat wird im Gefäß für Filtrat (13) gesammelt und mit einer weiteren peristaltischen Pumpe (15) in das Konditionierungsgefäß (3) zurückgeführt. Die Pumpe ist so eingestellt, dass die Volumina von Filtrat und Retentat konstant bleiben. Verbrauchte Nährstoffe werden durch die Zufuhr von frischem Medium aus dem Zulauf (9) aufgefüllt.
  • Die Bestimmung des Gehaltes der labilen biologischen Substanzen im Bioreaktor erfolgt mit Hilfe einer Probennahmevorrichtung und einer nachgeschalteten Analyse. Dabei wird die labile biologische Substanz in ein steriles Gefäß mit Hilfe einer Pumpe überführt und anschließend mit Hilfe der für labile biologische Substanz spezifischen Analysemethode quantitativ bestimmt. Bei einem Viruspartikel z. B. wird ein Zelllayer in einer Verdünnungsreihe infiziert. Die infizierten Zellen lassen sich wiederum durch Färbemethoden von den nicht infizierten Zellen unterscheiden, so dass über die Zahl der infizierten Zellen ein Rückschluss auf die Konzentration des Ausgangsmediums möglich ist.
  • Sobald eine ausreichende Zelldichte im Festbett erreicht ist, wird mit der kontinuierlichen Ernte der labilen biologischen Substanzen begonnen. Dabei erfolgt der Zulauf des Mediums mit den labilen biologischen Substanzen aus dem Bioreaktor in die Filtrationseinheit (7) mit Hilfe einer Kühlvorrichtung einer Mantelkühlung oder eines Wärmetauschers (nicht dargestellt) wird der Überstand des Bioreaktors mit den labilen biologischen Substanzen sofort nach Verlassen des Konditionierungsgefäßes (3) von beispielsweise 37°C auf 4°C abgekühlt. Der Start der Filtration erfolgt mit dem Anfahren der peristaltischen Pumpe und dem öffnen der Vakuumventile auf der Filtratseite. Die Überwachung der Volumina und Volumenströme erfolgt beispielsweise mit Hilfe von Wagen (Sartorius, Germany).
  • Das Gefäß für Filtrat (13) ist mit einer Rückführung zum Konditionierungsgefäß (3) versehen. Das Filtrat wird somit im kontinuierlichen Betrieb zurückgeführt.
  • Nach einem Anfahren des Prozesses stellt sich nach einiger Zeit ein Gleichgewichtszustand ein, so dass das Volumen des Retentates und des Filtrates konstant bleibt. Aufgrund der Rückführung des Filtrates werden die labilen biologischen Substanzen z.B. Zellen im Bioreaktor weiterhin mit Nährstoffen versorgt, während die Stabilität der labilen biologischen Substanzen erhöht wird, da diese schnell auf ein optimales Temperaturniveau gebracht werden.
  • Die Filtration in der Filtrationseinheit (7) erfolgt so dass Medium zurück zum Bioreaktor fließt, während die labilen biologischen Substanzen in einem Gefäß für Filtrat (13) aufgefangen werden.
  • Mit einer weiteren peristaltischen Pumpe wird Medium zum Retentatgefäß (11) gefördert. Das Retentat wird durch die inneren Kanäle der Filtrationseinheit (7) gepumpt. Aufgrund eines durch eine Pumpe vakuuminduzierten transmembranen Drucks entsteht ein Permeatstrom zur anderen Seite des Moduls. Das Filtrat wird mit einer weiteren Pumpe in das Konditionierungsgefäß (3) zurückgeführt. Die Pumpe wird so eingestellt, dass die Volumina von Filtrat und Retentat konstant bleiben. Verbrauchte Nährstoffe werden durch die Zufuhr von frischem Medium aufgefüllt.
  • Gegenüber bestehenden Verfahren wird die Ausbeute um den Faktor 10 gesteigert.
  • Ausführungsbeispiele
  • Beispielhaft für die Herstellung von labilen biologischen Substanzen deren Zerfall, Abbau oder Inaktivierung sich unter dem Einfluss von weiteren, in der Lösung enthaltenen Substanzen und/oder von Temperaturänderungen und/oder von Druckänderungen und/oder von Konzentrationsänderungen und/oder von Änderungen des pH-Wertes und/oder unter Einfluss jeglicher Strahlungsarten, wie z.B. UV A, B, C, innerhalb von wenigen Stunden vollzieht, ist die retrovirale Verpackungszelllinie TELCeB6/pTr712-K52S (K52S).
  • TELCeB6/pTr712-K52S (K52S) wird aus der env-negativen MLV Verpackungszelllinie TELCeB6 durch Transfektion des HIV-1 env-Gens mit Hilfe des Plasmids pTr712 hergestellt (Sitz et al., Paul Ehrlich Institute, Langen, Germany). Sie produziert permanent MLV(HIV-1)-Vektorpartikel die den Transfervektor MFGInslacZ enthalten und zusätzlich den Selektionsmarker bsr implementiert, um Blastizidinresistenz zu erreichen. Unter statischen Kulturbedienungen produziert die Zelle einen Vektortiter von 2 × 105 i.E./ml. Die 52S- Zellen werden im Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Gibco/BRL, Eggenstein, Germany) unter Zugabe von 5% fetalem Kälberserum (FCS) (PAA, Germany), 800mg/l Neomycinsulfat (Roth, Giessen, Germany), 5mg/l Blastizidin S (ICN-Flow, Meckenheim, Germany) und 2mM Glutamine (ICN-Flow, Meckenheim, Germany) kultiviert. Alle Zielzellen werden im selben Medium ohne Blastizidinzugabe kultiviert.
  • Die Bestimmung des Vektortiters erfolgt über „X-Gal staining" nach Herstellerangaben. Der Vektortiter des Überstandes wird über eine Verdünnungsreihe und mit Hilfe der Infektion von CD4+ HELA Zellen gemessen. Die adhärenten Zielzellen werden mit einer Zelldichte von 1,6 × 104 Zellen pro 24-well (Nunc, Wiesbaden, Germany) 24 Stunden vor der Infektion ausgesät. Alle Zielzellen werden 4 Stunden mit dem Vektorüberständen beaufschlagt. Anschließend erfolgt ein Waschschritt mit Phosphatpuffer (PBS). Die transduzierten Zellen werden für zwei weitere Tage expandiert bevor die lacZ-positiven Zellen mit Hilfe des „X-Gal staining" blau eingefärbt werden. Anschließend werden die gefärbten Zellen ausgezählt und der Vektortiter errechnet. Weitere Verfahren zur Messung der Zelldichte, z.B. Messung der optischen Dichte sind dem Fachmann bekannt.
  • Die Konfiguration des Reaktorsystems besteht im Wesentlichen aus zwei Kammern. Ein axial durchströmtes Festbett mit einem Arbeitsvolumen von 100 bis 200 ml wird mit FibraCell® Zellkulturträgern (New Brunswick Scientific, USA) befüllt und mit einem Konditionierungsgefäß (B.Braun International, Germany) verbunden, um eine Durchströmung der im Festbett wachsenden Zellen zu erreichen. Das Volumen des Konditionierungsgefäßes wird zwischen 500 ml und 2000 ml gehalten. Der gelöste Sauerstoff wird im Konditionierungsgefäß bei einer Luftsättigung von 90 bis 100% gehalten. Der pH-Wert des Mediums wird auf 7,1 mittels CO2-Begasung geregelt. Das Medium im Konditionierungsgefäß wird kontinuierlich oder Satzweise ausgetauscht. Das Festbett wird mit einem Inokulum von exponentiell wachsenden Zellen beaufschlagt. Das Inokulum weist eine Konzentration von 3 × 107 bis 7 × 107 Zellen auf. Vom Konditionierungsgefäß besteht eine Verbindung sowie eine Rückführung zum Filtrations- bzw. Membranmodul. Das vektorhaltige Medium wird somit mit Hilfe eine peristaltischen Pumpe zur Retentatseite des Membranemoduls gepumpt, während das Filtrat zum Konditionierungsgefäß zurückgeführt wird.
  • Mit Hilfe einer keramischen Membran (Außendurchmesser 25 mm) und 19 Kanälen mit Durchmesser von 3 mm (Atech, Gladbeck, Germany) wird das Retentat bei „cross flow" Filtration aufkonzentriert. Die Membran ist aus zwei asymmetrischen Schichten aufgebaut mit Al2O3 als Trägermaterial, die erste Schicht besteht aus Zirkoniumoxid, die zweite aus TiO2.
  • Der Vektorüberstand wird mit einer peristaltischen Pumpe in das Retentatgefäß gepumpt und von dort filtriert. Dabei wird der Überstand nach verlassen des Konditionierungsgefäßes sowohl in den jeweiligen Leitungen durch Mantelkühlung oder einen Wärmetauscher gekühlt als auch in den Gefäßen selbst über einen Mantel gekühlt wird, um eine höhere Stabilität der Vektoren zu gewährleisten. Die Retentatseite wird mit der Innenseite der Membran verbunden. Mit Hilfe einer weiteren peristaltischen Pumpe wird der Vektorüberstand auf der Permeatseite bei einer Durchflussrate von 2 l min-1 durch die Membrankanäle zirkuliert. Auf der Filtratseite wird ein Vakuum von 400 mbar Transmembrandruck angelegt. Die Filtratauffangflasche ist mit einer Rückführung zum Konditionierungsgefäß versehen. Das Filtrat wird somit im kontinuierlichen Betrieb zurückgeführt. Sobald der vektorhaltige Überstand das Konditionierungsgefäß verlassen hat, wird die Temperatur von 37°C auf 4°C mit Hilfe eines Wärmetauschers oder über Mantelkühlung abgesenkt Sobald eine ausreichende Zelldichte im Festbett erreicht ist, wird mit der kontinuierlichen Ernte der Vektorpartikel begonnen. Der Start der Filtration erfolgt mit dem Anfahren der peristaltischen Pumpen und dem öffnen der Vakuumventile auf der Filtratseite. Die Überwachung der Volumina und Volumenströme erfolgt mit Hilfe von Wagen (Sartorius, Germany, nicht eingezeichnet). Nach einem Anfahren des Prozesses stellt sich nach einiger Zeit ein Gleichgewichtszustand ein, so dass das Volumen des Retentats und des Filtrates konstant bleibt. Aufgrund der Rückführung des Filtrates werden die Zellen weiterhin mit Nährstoffen versorgt, während die Stabilität des labilen Bioprodukts (in diesem Fall der retrovirale Vektor) erhöht wird, da das Produkt schnell auf ein optimales Temperaturniveau gebracht wird. Der Prozess wird in Versuchen für mindestens 24 Stunden stabil gefahren, ohne ein Absinken des Vektortiters im Retentat zu beobachten.
  • Die Verpackungszellen sind im Festbett immobilisiert. Die im Festbett produzierten retroviralen Vektorpartikel werden dabei ins Medium abgegeben und gelangen über das Konditionierungsgefäß zum Retentat. Sensoren für pH-Wert, Temperatur und Sauerstoff sind im Konditionierungsgefäß in einer Parameterkontrolleinheit integriert, um die Prozesskontrolle und Regelung zu ermöglichen. Die peristaltische Pumpe sorgt für die ständige Versorgung des Festbetts mit Medium aus dem Konditionierungsgefäß. Das Medium wird mittels Wärmevorrichtung beispielsweise einem Wärmetauscher (19) aufgeheizt. Mit einer weiteren peristaltischen Pum pe wird Medium zum Retentatgefäß gefördert. Das Retentat wird durch die inneren Kanäle des Membranmoduls gepumpt. Aufgrund eines durch eine Pumpe vakuuminduzierten transmembranen Drucks entsteht ein Permeatstrom zur anderen Seite des Moduls. Das Filtrat wird mit einer weiteren Pumpe in das Konditionierungsgefäß zurückgeführt. Die Pumpe ist so eingestellt, dass die Volumina von Filtrat und Retentat konstant bleiben. Verbrauchte Nährstoffe werden durch die Zufuhr von frischem Medium aufgefüllt.
  • In einem Kultivierungsversuch der Verpackungszelllinie K52S im 100 ml Festbettreaktor wird nach 14 Tagen ein konfluenter Zustand (maximale Zellbesiedlung des Festbettes) erreicht. Anschließend wird der Reaktor im kontinuierlichen Modus betrieben. Dabei wird die beschriebene kontinuierliche Filtration mit Rückführung angewendet. Nach Ablauf von 4 Stunden stellt sich ein Gleichgewichtszustand zwischen den einzelnen Volumenströmen im Filtrationskreislauf ein, so dass die Volumina von Retentat, Filtrat und Konditionierungsgefäß konstant bleiben. Da die Zellen bereits an niedrige Serumkonzentration adaptiert sind, wird die kontinuierliche Filtration für 24 Stunden aufrecht erhalten, ohne eine Schädigung der Zellen durch evtl. an der Membran im Retentat zurückgehaltenes Serum zu beobachten. Gegenüber bestehenden Verfahren und unter Berücksichtigung der Zerfallkonstanten der retroviralen Partikel bei verschiedenen Temperaturniveaus wird die Ausbeute und der absolute Vektortiter um den Faktor 10 gesteigert.
  • Figure 00150001
  • Bezugszeichenliste
    Figure 00160001

Claims (22)

  1. Bioreaktorssystem zur Herstellung, Filtration und Aufkonzentrierung labiler biologischer Substanzen deren Zerfall, Abbau oder Inaktivierung sich unter dem Einfluss von weiteren, in der Lösung enthaltenen Substanzen und/oder von Temperaturänderungen und/oder von Druckänderungen und/oder von Konzentrationsänderungen und/oder von Änderungen des pH-Wertes und/oder unter Einfluß von Strahlung innerhalb von wenigen Stunden vollzieht, bestehend aus einem Bioreaktor, Gefäßen für Zulauf, Retentat und/oder Filtrat, Leitungen mit peristaltischen Pumpen und einer Parameterkontrolleinheit mit Sensoren, dadurch gekennzeichnet dass eine Filtrationseinheit vorhanden ist, die so zum Bioreaktor angeordnet ist, dass bei der Filtration die labilen biologischen Substanzen im Membransystem zurück gehalten werden und dass eine Kühlungsvorrichtung angebracht ist, die die labilen biologischen Substanzen nach Austritt aus dem Bioreaktor kühlt.
  2. Bioreaktorsystem gemäß Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch dass, der Bioreaktor ein Suspensionsreaktor, ein Festbett, ein Hohlfasermodul oder ein Wirbelbett ist.
  3. Bioreaktorsystem gemäß Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch dass, der Bioreaktor ein Festbett und ein Konditionierungsgefäß ist.
  4. Bioreaktorsystem gemäß der vorangegangenen Ansprüche gekennzeichnet dadurch dass die Filtrationseinheit eine Membran oder ein Membransystem ist.
  5. Bioreaktorsystem gemäß der vorangegangenen Ansprüche gekennzeichnet dadurch dass an die Filtrationseinheit Leitungen angeschlossen sind, die Filtrat über ein Gefäß für Filtrat zum Bioreaktor zurückführen.
  6. Bioreaktorsystem gemäß der vorangegangenen Ansprüche gekennzeichnet dadurch dass die Filtrationseinheit vorzugsweise im Perfusions- oder im Batch-Betrieb durchgeführt wird.
  7. Bioreaktorsystem gemäß der vorangegangenen Ansprüche gekennzeichnet dadurch dass, es eine Heizvorrichtung zur Temperierung des Mediums aufweist.
  8. Bioreaktorsystem gemäß der vorangegangenen Ansprüche gekennzeichnet dadurch dass, die Heizvorrichtung ein Wärmeaustauscher ist.
  9. Bioreaktorsystem gemäß der vorangegangenen Ansprüche gekennzeichnet dadurch dass, die Sensoren der Parameterkontrolleinheit Prozessparameter wie pH-Wert, Druck, Temperatur und/oder Sauerstoffgehalt misst und eine Normwerteinstellung ermöglicht.
  10. Bioreaktorsystem gemäß der vorangegangenen Ansprüche gekennzeichnet dadurch dass, die Parameterkontrolleinheit im Bioreaktor integriert ist.
  11. Bioreaktorsystem gemäß der vorangegangenen Ansprüche gekennzeichnet dadurch dass, die Kühlungsvorrichtung die labilen biologischen Substanzen nach Austritt aus dem Bioreaktor durch Strahlung und/oder Wärmeleitung und/oder Konvektion kühlt.
  12. Verfahren zur Herstellung, Filtration und Aufkonzentrierung labiler biologischer Substanzen deren Zerfall, Abbau oder Inaktivierung sich unter dem Einfluss von weiteren, in der Lösung enthaltenen Substanzen und/oder von Temperaturänderungen und/oder von Druckänderungen und/oder von Konzentrationsänderungen und/oder von Änderungen des pH-Wertes und/oder unter Einfluß von Strahlung innerhalb von wenigen Stunden vollzieht, bestehend aus den Schritten I) Kultivierung der Ausgangsmaterialien zur Herstellung der labilen biologischen Substanzen im Bioreaktor mit Medium II) Bestimmung des Gehaltes der labilen biologischen Substanzen im Bioreaktor III) Zulauf des Mediums mit den labilen biologischen Substanzen aus dem Bioreaktor unter Kühlung in eine Filtrationseinheit IV) Durchführung der Filtration in der Filtrationseinheit so dass Medium zurück zum Bioreaktor fließt und die labilen biologischen Substanzen in einem Gefäß für Filtrat aufgefangen werden.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet dass die labilen biologischen Substanzen, Viren, Viruspartikel, Proteine und/oder Antikörper sind.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet dass, die Kultivierung der Ausgangsmaterialien in einem Suspensionsreaktor, einem Festbett, einem Hohlfasermodul oder einem Wirbelbett erfolgt.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet dass, die Kultivierung der Ausgangsmaterialien in einem Festbett mit Konditionierungsgefäß erfolgt.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet dass, die Bestimmung des Gehaltes der labilen biologischen Substanzen im Bioreaktor durch einen Zellfärbetest und/oder Messung der optischen Dichte erfolgt.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet dass, die Filtration in der Filtrationseinheit durch eine Membran oder ein Membransystem erfolgt.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet dass, die Filtration in der Filtrationseinheit vorzugsweise im Perfusions- oder im Batch-Betrieb durchgeführt wird.
  19. Verfahren gemäß Anspruch 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet dass, die Sensoren der Parameterkontrolleinheit die Prozessparameter pH-Wert, Druck, Temperatur und/oder Sauerstoffgehalt misst und auf einen Normwert einstellt
  20. Verfahren gemäß Anspruch 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet dass es in einem Bioreaktorsystem nach Anspruch 1 bis 11 hergestellt wird.
  21. Verwendung eines Verfahrens gemäß Anspruch 12 bis 19 zur Herstellung von labilen biologischen Substanzen Vakzinen oder Viruspartikeln.
  22. Verwendung eines Bioreaktorsystems nach gemäß Anspruch 1 bis 11 zur Herstellung von labilen biologischen Substanzen Vakzinen oder Viruspartikeln.
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