DE4002994A1 - Verfahren und vorrichtung zur zuechtung von zellen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Züchtung von Zellen in Form einer Dauerkultur mit hoher Dichte.

Bei der in WO-A 83 00 400 beschriebenen Vorrichtung zum Züchten von Zellen werden die gezüchteten Zellen wahlweise zusammen mit den molekularen, Abfallstoffe enthaltenden Materialien zu einem Fermenter zurückgeführt. Dabei wird weder die Entfernung von Abfallstoffen noch die Wiederge­ winnung von brauchbaren, hochmolekularen Substanzen, wenn sie vorhanden sind, berücksichtigt.

Bei einer solchen Vorrichtung ist es nachteilig, daß die Zellenzüchtung durch die Abfallstoffe gehemmt wird, nämlich durch Zell-Stoffwechselprodukte oder niedermolekulare brauchbare Substanzen, wenn diese Substanzen das Wachstum der Zellen behindern würden.

Aus der JP-A 2 07 581/1985 ist eine Vorrichtung zum Züchten von Zellen bekannt, die einen Zellabscheider, durch den die Zellen von der Zellbouillon getrennt und in einem Fermenter gesammelt werden, sowie einen Rührer aufweist, durch den die Zellen wirksam in der Bouillon in dem Fermenter suspen­ diert werden.

Aus der JP-A 1 30 683/1987 ist ferner eine Vorrichtung für die Züchtung, die Abtrennung von Zellen, die Zuführung eines Mediums und die Rücklaufreinigung bekannt, wobei jedoch weder auf eine verlängerte kontinuierliche Züchtung noch auf die Unterbindung des Verstopfens einer Membran Bezug genommen ist.

Das bedeutet, daß der Stand der Technik in keiner Weise die Produktivität der Zellzüchtung in Betracht zieht. Nach­ teilig ist ferner, daß ein Rühren unter Verwendung von Schaufeln in einer Bouillon Zellen zerstören kann, die einen geringen Widerstand gegen Scherkräfte haben, wodurch die Aktivität der Zellen verringert wird. Die hydrophile Membran, wie sie zur Trennung der Zellen bei den bekannten Vorrichtungen verwendet wird, setzt sich häufig zu. Obwohl versucht wird, ein solches Zusetzen durch Rückführreinigung bzw. Regeneration zu unterbinden, hat diese Behandlung nur einen begrenzten Effekt auf eine langlebige kontinuierliche Kultur hoher Dichte, so daß es unmöglich ist, dadurch ein Verstopfen bzw. Zusetzen zu verhindern. Wenn sich eine solche Verstopfung einstellt, muß die Zellzüchtung einge­ stellt und die Membran herausgenommen und ersetzt oder regeneriert werden. Die Zellzüchtung muß also beendet werden, wenn ein solches Zusetzen eintritt.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht deshalb darin, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Züchtung von Zellen zu schaffen, bei welchem das Wachstum der Zellen hemmende Substanzen während der Zellzüchtung entfernt werden und wenigstens eine der Serenkomponenten, bei denen es sich um teure hochmolekulare Medienkomponenten handelt, welche eine Züchtung mit hoher Dichte erlauben, zu einem Fermenter zurückgeführt wird, um dadurch die Betriebskosten zu verringern.

Ferner soll erfindungsgemäß die Produktivität der Zellzüch­ tung gesteigert werden, ohne daß Zellen während des Züch­ tungsvorgangs beschädigt werden. Der dabei verwendete Zellabscheider soll leicht regenerierbar oder austauschbar sein und einfach gewartet werden können, um eine hohe Produktivität zu erreichen.

Diese Aufgabe wird mit dem im Patentanspruch 1 angegebenen Verfahren und mit der Vorrichtung nach Anspruch 11 gelöst, wobei die erfindungsgemäßen Maßnahmen in den Unteransprü­ chen 2 bis 10 und die erfindungsgemäßen Merkmale in den Unteransprüchen 12 bis 18 vorteilhaft weitergebildet sind.

Erfindungsgemäß werden somit in einem Zellabscheider ge­ trennte Zellen zu einem Fermenter zurückgeführt, während eine Serumkomponente oder Serenkomponenten, die wenigstens einen bestimmten Anteil einer Mediumkomponente oder von Medienkomponenten sind, die von einer Bouillon durch eine Ultrafiltrationseinrichtung abgetrennt wurden, zu dem Fer­ menter zurückgeführt werden. Dadurch kann die Serumkompo­ nente bzw. können die Serenkomponenten wiederverwendet werden, was vom Standpunkt der Wirtschaftlichkeit vorteil­ haft ist. Weiterhin wird ein verwendbares Produkt oder werden verwendbare Produkte wahlweise von der Bouillon abgetrennt, so daß keine Gefahr besteht, daß die Produktion behindert wird. Der Zellabscheider wird außerhalb des Fermenters angeordnet. Ferner wird ein Luftrührsystem verwendet. Dadurch ist es möglich, Schäden an den Zellen zu verhindern. Außerdem ist es möglich, den Zellabscheider auch während der Zellzüchtung leicht auszutauschen. Der Züchtungswirkungsgrad kann somit gesteigert werden.

Anhand von Zeichnungen werden Ausführungsbeispiele der Erfindung näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 schematisch eine erste Ausführungsform einer Vor­ richtung für die Züchtung von Zellen,

Fig. 2 schematisch eine zweite Ausführungsform einer Vorrichtung für die Züchtung von Zellen,

Fig. 3 schematisch eine dritte Ausführungsform einer Vorrichtung zum Züchten von Zellen und

Fig. 4 schematisch eine vierte Ausgestaltung der Vorrich­ tung zum Züchten von Zellen.

Die Vorrichtung von Fig. 1 hat einen Fermenter 1, der sterilisiertes RBM-1640-Medium und Rinderserum enthält. In einem Fermenter 2 werden menschliche periphere Lymphozyten (PBL) zusammen mit B-Lymphosarkomen gezüchtet. Diese B-Lymphosarkomen erzeugen Interleukin 2(IL-2). Diese Zellen werden zuerst in dem Fermenter 2 gezüchtet, so daß in der Bouillon IL-2 erzeugt werden kann. Wenn die Zellenkonzen­ tration einen bestimmten Pegel, beispielsweise 1×10⁵ Zel­ len/ml erreicht, wird die in Fig. 1 gezeigte Zirkulation durchgeführt. Dabei wird die die Zellen und IL-2 enthalten­ de Bouillon zu einem Zellabscheider 3 gebracht, der mit einer hydrophoben Hohlfasermembran versehen ist. Zu diesem Zellabscheider 3 wird eine die Zellen enthaltende Lösung zu dem Fermenter 2 zurückgeführt, während die IL-2 enthaltende Bouillon, von der die Zellen entfernt worden sind, in einen Aufnahmebehälter 4 geführt wird. Als nächstes wird die Bouillon in eine Ultrafiltriereinrichtung 5 eingebracht, die mit einer Membran versehen ist, deren Fraktioniermole­ kulargewicht vorher auf 20 000 eingestellt worden ist. Das IL-2 und Abfallstoffe, die jeweils ein Molekulargewicht haben, das kleiner ist als das Fraktioniermolekulargewicht der Membran, gehen durch die Membran hindurch und gelangen in den Aufnahmebehälter 6. Das Molekulargewicht von IL-2 beträgt etwa 15 000. Materialien, die nicht durch die Mem­ bran durchgehen können, also solche Medienkomponenten, die jeweils ein Molekulargewicht von mehr als 20 000 haben, und ein Teil des IL-2 werden zu dem Aufnahmebehälter 4 zurück­ geführt, und erneut in der Ultrafiltriereinrichtung gefil­ tert. Wenn die Konzentration des IL-2 niedriger wird als ein vorgegebener Pegel, wird die restliche Bouillon, in der Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 20 000 konzentriert sind, zu dem Fermenter 2 zurückgeführt. Da­ durch wird das IL-2 kontinuierlich aus dem System während der Umwälzung entnommen. Bei der in Fig. 2 gezeigten Aus­ führungsform enthält der Fermenter 1 sterilisiertes RDF- Medium, das dadurch hergestellt worden ist, daß RPMl-1640- Medium, Ham F-12-Medium und Eagle-Medium, modifiziert nach der Doulbecco-Methode, in einem Verhältnis von 2 : 1 : 1 und Rinderserum gemischt werden. In einem Fermenter 2 werden IgA erzeugende Mäusehybridomen gezüchtet, die man durch Verschmelzung von Mäusemyelomen mit menschlichen B-Zellen erhält. Wenn die Zellenkonzentration einen be­ stimmten Pegel von beispielsweise 1×10⁵/ml erreicht, wird die in Fig. 2 gezeigte Umwälzung ausgeführt. Die Bouillon, welche die Zellen und IgA enthält, wird einem Zellabscheider 3 zugeführt, der mit einer hydrophoben Hohlfasermembran versehen ist. Von diesem Zellabscheider 3 wird eine die Zellen enthaltende Lösung zu dem Fermenter 2 zurückgeführt, während die IgA enthaltende Bouillon, aus der die Zellen entfernt worden sind, in einen Aufnahmebe­ hälter 4 geführt wird. Als nächstes wird die Bouillon in eine Ultrafiltriereinrichtung 5 eingebracht, die mit einer Membran versehen ist, deren Fraktioniermolekulargewicht auf 20000 eingestellt worden ist. Zellabfallstoffe, die ein Molekulargewicht haben, das kleiner als das Fraktioniermo­ lekulargewicht der Membran ist, gehen durch die Membran hindurch und werden in einen Aufnahmebehälter 6 einge­ bracht. Materialien, die nicht durch die Membran hindurch können, nämlich Materialien, deren Molekulargewicht 20 000 überschreitet, sowie einige niedermolekulare Materialien, die nicht durch die Membran hindurchgegangen sind, werden zu dem Aufnahmebehälter 4 zurückgeführt und erneut in der Ultrafiltriereinrichtung 5 filtriert. Die Lösung, aus der Materialien mit einem Molekulargewicht von weniger als 20 000 in ausreichendem Maße entfernt sind, wird dann in eine weitere Ultrafiltriereinrichtung 7 geführt, die mit einer Membran versehen ist, deren Fraktioniermolekularge­ wicht auf 10 000 eingestellt worden ist. Mit dieser Membran wird Albumin, welches eine der Serenkomponenten in dem Medium mit einem Molekulargewicht von weniger als 100 000 ist, zum Fermenter 2 zurückgeführt. IgA mit einem Moleku­ largewicht von mehr als 100 000 wird in dem Aufnahmebehäl­ ter 4 gesammelt. Die IgA enthaltende Bouillon wird aus dem System entfernt.

Dieses System ermöglicht es, separat brauchbare Substanzen, deren Molekulargewicht höher oder niedriger als die der zu dem Fermenter 2 zurückzuführenden Serumkomponente sind, bei der Züchtung von Zellen zu entnehmen, bei der gleichzeitig brauchbare hochmolekulare und niedermolekulare Stoffe erzeugt werden, ohne daß irgenwelche unerwünschten Effekte auftreten, wie eine Hemmung des Zellenwachstums.

Bei diesen Ausführungsformen kann in dem Zellabscheider 3 eine Schwerkraftsedimentation, eine Zentrifugierung oder Filtration verwendet werden. Ferner kann in den Ultrafil­ triereinrichtungen 5 und 7 eine Membranfiltration, eine Ultrafiltration, eine Dialyse, eine umgekehrte Osmose oder Adsorption eingesetzt werden.

Beispiele für brauchbare Substanzen, die von den Zellen bei diesen Ausführungsformen erzeugt werden, umfassen Lympho­ kin, Enzyme und Zellenwachstumsbeschleuniger. Als solche sind insbesondere zu nennen Interferon, Interleukin, Immu­ noglobulin, Immunoglobulin G und menschliches Immunoglobu­ lin. Die Bouillon, in der die Zellen gezüchtet werden, enthält Wachstumsbeschleuniger, wie Transferrin, Insulin, Albumin und Ethanolamin. Die Erfindung läßt sich zur geeig­ neten Steuerung des Fraktioniermolekulargewichts in der Ultrafiltriermembran verwenden, während die Kombination der vorstehend erwähnten brauchbaren Stoffe mit den oben er­ wähnten Wachstumsbeschleunigern berücksichtigt wird. Wenn beispielsweise das Molekulargewicht der angestrebten brauchbaren Substanz kleiner ist als das der wiederzuver­ wendenden Mediumkomponente, sollte das Fraktioniermoleku­ largewicht der Ultrafiltriermembran, durch die die zell­ freie Bouillon abzutrennen ist, größer sein als das des brauchbaren Stoffs und der Abfallmaterialien, jedoch nicht das der wiederzuverwendenden Mediumkomponente überschrei­ ten.

Wenn das Molekulargewicht der zum Ziel gesetzten brauchba­ ren Substanz größer ist als das der wiederzuverwendenden Mediumkomponente, sollte das Molekulargewicht der Ultrafil­ triermembran, durch die die Abfallstoffe aus der zellfreien Bouillon in dem ersten Schritt entfernt wurden, größer sein als das der Abfallstoffe, sollte jedoch nicht das der brauchbaren Substanz und der Mediumkomponente überschrei­ ten. Das Fraktioniermolekulargewicht der Ultrafiltriermem­ bran, mit der die Mediumkomponente in dem zweiten Schritt entfernt wird, sollte größer sein als das der Mediumkompo­ nente, jedoch das der brauchbaren Substanz nicht über­ schreiten. Die so abgetrennte Mediumkomponente soll zu dem Fermenter zurückgeführt und dann erneut benutzt werden.

Die Erfindung läßt sich auf die Züchtung beispielsweise von tierischen Zellen, Pflanzenzellen und Mikroorganismen anwenden, ohne auf die vorher erwähnten Ausführungen be­ schränkt zu sein.

Anhand von Fig. 3 wird eine Ausführung einer Vorrichtung zur Züchtung von Zellen beschrieben, mit der Zellen unter Einsatz einer Lufthebekraft gemischt und gezüchtet werden.

Wie aus Fig. 3 zu ersehen ist, ist an der Oberseite eines Fermenters 11 eine Verbindungsöffnung 12 vorgesehen, wäh­ rend in seinem unteren Teil, beispielsweise an seinem Boden, eine Verbindungsöffnung 13 positioniert ist. Die Verbindungsöffnungen sind über eine Leitung 14 und einen Zellabscheider 15, der in der Mitte der Leitung 14 ange­ ordnet ist, verbunden. ln der Nähe des Bodens des Fermen­ ters 11 ist für die Zuführung eines für die Züchtung erfor­ derlichen Gases eine Ausblaseinrichtung 16 vorgesehen. Das von der Ausblaseinrichtung 16 zugeführte Gas übt gleichzei­ tig eine Rührwirkung aus, so daß die Zellen in der Bouillon wirksam suspendiert werden.

Ein von einer anderen, in der Nähe des Bodens der Leitung 14 angeordneten Ausblaseinrichtung 17 zugeführtes Gas sorgt für die Treibkraft, um die die Zellen enthaltende Bouillon in der Leitung umzuwälzen. Wenn ein Ventil 18 geöffnet und somit ein Gas aus der Ausblaseinrichtung 16 in den Fermen­ ter 11 zugeführt wird, führt die von dem Gas verursachte Treibkraft zu einer Konvektion und Rührung der die Zellen enthaltenden Bouillon 10.

Wenn ein Ventil 19 geöffnet und Gas aus der Ausblaseinrich­ tung 17 zugeführt wird, wird die scheinbare Dichte der über der Ausblaseinrichtung 17 vorhandenen Bouillon aufgrund der so herbeigeführten Blasenbildung abgesenkt.

Andererseits enthält die Bouillon auf der Seite der Leitung 14 keine Blasen. Somit entspricht ihre scheinbare Dichte der Dichte der Bouillon als solche. Dadurch wird die die Zellen enthaltende Bouillon von der Verbindungsöffnung 12 zur Verbindungsöffnung 14 zirkulieren gelassen und zu der Verbindungsöffnung 13 über den Zellabscheider 15 zurückge­ führt, während mit der Züchtung fortgefahren wird.

Wenn der Züchtungsprozeß fortschreitet und die Zellenkon­ zentration den gewünschten Pegel erreicht, werden Ventile 21 und 31 geöffnet und eine Pumpe 22 angetrieben. Dadurch wird die brauchbare Substanzen und Abfallstoffe enthaltende Bouillon in den Zellabscheider 15 geführt, wo die Zellen davon abgetrennt werden, und dann in eine Ultrafiltrierein­ richtung 24 über eine Leitung 23 transportiert. Anschlie­ ßend werden die erhaltenen brauchbaren Substanzen und Abfallstoffe aus den Medienkomponenten entfernt. Die brauchbare Substanzen und Abfallstoffe enthaltende Lösung wird in eine nicht gezeigte darauffolgende Einrichtung, beispielsweise einen Reiniger, geführt und dann einer gewünschten Behandlung unterworfen.

Die vorstehend erwähnten abgetrennten Medienkomponenten werden aus der Leitung 26 zum Fermenter 11 über das Ventil 31 zurückgeführt und dann wieder verwendet.

Somit werden die erzeugten brauchbaren Substanzen und Abfallstoffe in die darauffolgende Einrichtung extrahiert. Außerdem wird das Medium enthaltende Serum in einer der Extraktion entsprechenden Menge dem Fermenter 11 über eine Leitung 27 und ein Ventil 28 zugeführt, während die die Zellen abtrennende Membran 32 durch Umkehrung gereinigt wird.

Der Zellabscheider 15 kann ohne Schließen der Ventile 29, 30, 21 und 28 ersetzt werden. So kann die Wartung des Zellabscheiders 15 in einfacher Weise ausgeführt werden, ohne daß der Züchtungsprozeß beendet werden muß.

Da der Fermenter 11, der Zellabscheider 15 und die Aus­ blaseinrichtung 17 in dieser Reihenfolge im gezeigten Ausführungsbeispiel von oben nach unten angeordnet sind, kann die Bouillon, der eine Treibkraft erteilt wird, die Membran in den Zellabscheider 15 waschen. Außerdem kann der Inhalt des Fermenters gleichförmiger dadurch gerührt wer­ den, daß in der Mitte des Fermenters 11 eine obere, nicht gezeigte Verbindungsöffnung vorgesehen wird.

Der Zellabscheider ist gemäß der Erfindung außerhalb des Fermenters angeordnet, wodurch es möglich ist, die die Zellen abtrennende Membran auch während der Zellzüchtung leicht auszutauschen.

Das Anhaften der Zellen an der Oberfläche der Membran kann dadurch verhindert werden, daß die Bouillon in der Leitung Mit Hilfe einer Lufthebekraft zirkulieren gelassen wird, die dadurch herbeigeführt wird, daß von einer Ausblasein­ richtung ein Gas zugeführt wird, die sich in der Mitte der Leitung befindet, und daß der Druck an der Oberfläche der Membran geändert wird, indem Blasen um die die Zellen abtrennende Membran herum strömen gelassen werden. Dadurch kann ein Verstopfen der Membran unterbunden werden. Die von der im unteren Teil des Fermenters angeordneten Ausbla­ seinrichtung zugeführten Blasen führen bei der Züchtung erforderlichen Sauerstoff zu und sorgen gleichzeitig für einen Strom der Bouillon derart, daß die Sedimentation von Zellen in dem Fermenter verhindert wird. Somit kann die Bouillon unter Verwendung der Lufthebekraft strömen, ohne daß irgendeine Scherkraft aufgeprägt wird. Deshalb werden die Zellen niemals beschädigt. Dies ist insbesondere we­ sentlich für Zellen, die einen geringen Widerstand gegen eine Scherkraft haben, wie dies beispielsweise bei tieri­ schen Zellen der Fall ist.

Bei der in Fig. 4 gezeigten Vorrichtung wird Luft durch Öffnen eines Ventils 19 zugeführt, um der Bouillon in dem Fermenter 11 und in dem Zellabscheider 15 eine treibende Kraft für die Umwälzung zu erteilen. Wenn zu wenig Luft vorhanden ist, wird ein Ventil 18 geöffnet. Bei einer Perfusionszüchtung wird die Bouillon ausschließlich durch eine Zellen abtrennende Membran 32 durch Öffnen eines Ventils 21 filtriert. Wenn die Bouillon in dem Fermenter 11 auf eine bestimmte Menge durch Filtrieren abgenommen hat, wird das Ventil 21 geschlossen und wird das Ventil 28 geöffnet, um dadurch das Medium zuzuführen, während eine Rückführreinigung der Membran 32 stattfindet. Wenn die Bouillon in dem Fermenter auf einen vorgegebenen Pegel gesteigert wird, wird andererseits das Ventil 28 geschlos­ sen und wird das Ventil 21 geöffnet, worauf das erwähnte Filtern erfolgt. Eine Änderung des Pegels der Bouillon in dem Fermenter wird durch einen Pegelsensor überwacht. Das Filtrieren der Bouillon und die Zuführung des Mediums werden jeweils unter Verwendung einer Pumpe durchgeführt.

Wenn die erwähnte Perfusionszüchtung eine lange Zeit fort­ gesetzt wird, stellt sich bei der die Zellen trennende Membran 32 ein Zusetzen ein. In diesem Fall kann die Perfu­ sionszüchtung ohne Unterbrechung durch die zwei folgenden Methoden fortgesetzt werden.

Bei der ersten Methode werden die die Membran zusetzenden Stoffe unter Einsatz von Dampf entfernt, um so die Membran zu regenerieren. Diese Behandlung kann auf folgende Weise durchgeführt werden. Zunächst wird Luft zugeführt, während das Ventil 19 geschlossen wird. Die Bouillon in dem Zellab­ scheider 15 wird in den Fermenter 11 über die Leitung 14 eingeführt. Als nächstes werden die Ventile 19, 21, 28, 29 und 30 geschlossen, während die Ventile 33 und 34 geöffnet werden. Der Zellabscheider 15 wird gekühlt, indem Kühlwas­ ser durch den Mantel geführt wird. Wenn die Temperatur in dem Zellabscheider auf einen vorgegebenen Wert abgesenkt worden ist, wird der Druck in dem Zellabscheider ein Vaku­ um. Nun wird das Medium durch Öffnen des Ventils 28 zuge­ führt. Der Druckunterschied zwischen der Außenseite und der Innenseite des Zellabscheiders wird auf 0 einreguliert. Danach wird das Ventil 28 geschlossen, während die Ventile 21, 29 und 30 geöffnet werden. Die perfusionszüchtung wird fortgesetzt.

Bei dem zweiten Verfahren wird die die Zellen trennende Membran 32 ausgetauscht. Dabei wird die Bouillon in dem Zellabscheider 15 zum Fermenter 11 wie bei dem ersten Verfahren geführt. Dann wird die die Zellen trennende Membran 32 ausgetauscht, während die Ventile 29, 30 und 19 geschlossen sind. Nach Abschluß des Austausches wird Dampf für die Sterilisierung ähnlich wie beim ersten Verfahren zugeführt. Das Medium wird so zugeführt, daß die Anfangs­ perfusionszüchtung ausgeführt wird. Bei der Erfindung werden deshalb die Zellen und die Bouillon von dem Fermen­ ter zu dem Zellabscheider während der Abtrennung der ge­ züchteten Zellen zugeführt. Wenn eine Rücklaufreinigung bzw. Regeneration im großen Maßstab auszuführen ist, kann die Zuführung der die Zellen enthaltenden Bouillon durch Schließen der Ventile eingestellt werden. Dann wird ein Abzugsventil des Zellabscheiders geöffnet und Dampf durch die Hohlfasermembran entgegengesetzt zu der Richtung hin­ durchgeführt, wie sie während der Zellenabtrennung bewirkt wird. Somit liegt der Druck direkt an der Innenseite der Hohlfaser an, wodurch die Rückstromreinigung bzw. Regenera­ tion in großem Maßstab bewirkt werden kann. Wenn die Bouil­ lon Materialien, wie Proteine, enthält, die thermisch denaturiert würden, so daß sich eine große Menge an Nieder­ schlägen bei einer hohen Konzentration bilden würden, ist es zweckmäßig, die Innenseite des Zellabscheiders oder der Membran beispielsweise mit Wasser vor der Rückführreinigung zu waschen. Nach dem Abschluß der Rückführreinigung wird das Abzugsventil geschlossen, worauf die Sterilisierung folgt. Dann wird die Zuführung des Hochdruckdampfs beendet, während die Temperatur auf einem hohen Wert gehalten wird. Nachdem sich der Zellabscheider abgekühlt hat, wird der Hohlfaser frisches Medium zugeführt, in der sich der Druck reduziert hat, worauf die Abtrennung der Zellen folgt.

Wenn die die Zellen trennende Membran nicht länger brauch­ bar ist, wird die Zuführung der die Zellen enthaltenden Bouillon in gleicher Weise wie oben beschrieben eingestellt und der Zellabscheider mit der die Zellen trennenden Mem­ bran wird ausgetauscht. Dann erfolgt eine Sterilisierung wie oben beschrieben, wonach frisches Medium zugeführt wird, worauf die Zellen wieder abgetrennt werden können.

Da das Verstopfen der Membran bei einer solchen perfusions­ züchtung unvermeidbar ist, ist es möglich, die Zellzüchtung für einen langen Zeitraum durch Regenerierung oder Aus­ tausch der Membran in der beschriebenen Weise durchzufüh­ ren. Weiterhin kann die Produktivität der Zielsubstanz dadurch gesteigert werden.

Erfindungsgemäß können somit brauchbare Substanzen und Abfallstoffe aus Medienkomponenten durch vorheriges Ein­ stellen des Fraktioniermolekulargewichts einer Membran zum Abtrennen einer zellfreien Bouillon auf einen Wert entfernt werden, der kleiner oder größer als der Wert der Bouillon für die brauchbaren Substanzen, wie Zell-Stoffwechselpro­ dukte oder Abfallstoffe ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht ferner, Albumin, das eine teure Serumkomponente ist, zurück zu einem Fermenter zu rezyklisieren, wodurch die Betriebskosten abgesenkt werden können. Im folgenden wird die Wirkung eines Fermenters erläutert, in welchem eine Bouillon unter Einsatz einer Lufthebekraft gerührt wird. Da der Zellabscheider außerhalb des Fermenters ange­ ordnet ist, ist es nicht erforderlich, den Fermenter nach dem Austausch des Zellabscheiders zu öffnen. Es ist deshalb möglich, den Zellabscheider auszutauschen, während mit der Zellzüchtung fortgefahren wird. Da der Austauschvorgang leicht ausführbar ist, ergeben sich sowohl eine hohe Pro­ duktivität als auch eine gute Wartungsmöglichkeit. In gleicher Weise kann eine Zellen abtrennende Membran ausge­ tauscht werden, ohne die Zellzüchtung zu beenden oder einzustellen, wodurch eine Zellzüchtung über lange Zeit­ räume möglich ist.

Da die Bouillon unter Verwendung einer Treibkraft gerührt wird, die durch Zuführen eines Gases von einer Ausblasein­ richtung verursacht wird, ohne einen Rührer zu verwenden, werden die Zellen beim Rühren nicht beschädigt, was die Produktivität weiter steigert.

Claims (18)

1. Verfahren zum Züchten von Zellen, bei dem Zellen in einer Bouillon gezüchtet werden, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Zellen von der Bouil­ lon getrennt werden und dann die so abgetrennten Zellen zurück zu einem Fermenter geführt werden und daß eine Mediumkomponente bzw. Medienkomponenten eine brauchbare Substanz bzw. brauchbare Substanzen, die von den Zellen erzeugt werden, und Abfallstoff bzw. Abfallstoffe von der Bouillon abgetrennt werden, von der die Zellen entfernt worden sind, wobei wenigstens ein Teil der Mediumkomponente bzw. der Medienkomponenten zurück zum Fermenter geführt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Molekulargewicht der brauch­ baren Substanz niedriger als das der Mediumkomponente ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Zellen aus der Bouillon unter Verwendung einer hydrophoben Membran abgetrennt werden.

4. Verfahren zum Züchten von Zellen, bei dem Zellen in einer Bouillon gezüchtet werden, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Zellen von der Bouillon abge­ trennt werden und die so abgetrennten Zellen zu dem Fermenter zurückgeführt werden, daß Abfallstoff bzw. Abfallstoffe, eine hochmolekulare brauchbare Substanz bzw. hochmolekulare brauchbare Substanzen und eine Mediumkomponente bzw. Medienkomponenten aus der Bouillon abgetrennt werden, von der die Zellen entfernt worden sind, und daß die hochmolekulare brauchbare Substanz bzw. die hochmolekularen brauchbaren Substanzen sowie die Mediumkomponente bzw. die Medienkomponenten weiter­ hin in die Mediumkomponente bzw. die Medienkomponenten und eine brauchbare Substanz bzw. brauchbare Substanzen unterteilt werden, die ein Molekulargewicht haben, das größer ist als das von wenigstens einer der Medienkompo­ nenten, wobei wenigstens eine der Medienkomponenten zurück zum Fermenter geführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Zellen von der Bouillon durch Verwendung einer hydrophoben Membran abgetrennt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß in der Mitte einer Leitung, die außerhalb des Fermenters angeordnet ist, ein Gas zuge­ führt wird, das die Bouillon zwischen dem oberen und dem unteren Teil des Fermenters so zirkulieren läßt, daß eine Zirkulationstreibkraft herbeigeführt wird, wodurch der Inhalt des Fermenters gemischt und die Züchtung durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß ein Zellabscheider mit einer zellenabtrennenden Membran für die Abtrennung von Zellen aus der Bouillon verwendet wird und daß eine Rückführ­ reinigung und ein Austausch der die Zellen abtrennenden Membran während der Zellzüchtung ausgeführt wird.

8. Verfahren zum Züchten von Zellen, bei dem Zellen in einer Bouillon gezüchtet werden, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Bouillon in einem Umwälzka­ nal, der außerhalb eines Fermenters angeordnet ist, zwischen dem oberen Teil des Fermenters und dessen unteren Teil so umgewälzt wird, daß ein Rühren und Züchten durchgeführt wird, wobei ein Gas in der Mitte des Kanals zugeführt wird, der sich außerhalb des Fer­ menters befindet, so daß eine Zirkulationstreibkraft gebildet wird, wodurch ein Rühren und Züchten durchge­ führt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Zellen von der Bouillon in dem Umwälzkanal abgetrennt werden, der sich am unteren Teil des Fermenters befindet.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß ein aus einer hydrophoben Hohlfasermembran bestehender Zellabscheider zum Ab­ trennen der Zellen aus der Bouillon verwendet wird, daß die Hohlfasermembran in dem Zellabscheider mit Dampf sterilisiert wird und daß die Innenseite des Zellabscheiders gekühlt wird, nachdem die hohe Tempe­ ratur bei der Sterilisation aufrechterhalten wurde, und das Medium unter Ausnutzung des Unterdrucks in dem Zellabscheider zugeführt wird.

11. Vorrichtung zum Züchten von Zellen in einer Bouillon mit Einrichtungen zum Abtrennen der Zellen von der Bouillon und zum Zurückführen der so abgetrennten Zellen zurück zu einem Fermenter und mit Einrichtungen zur Aufteilung der Bouillon in eine brauchbare Sub­ stanz bzw. brauchbare Substanzen und in eine nicht brauchbare Substanz bzw. nicht brauchbare Substanzen und zum Zurückführen der so abgetrennten brauchbaren Substanz bzw. brauchbaren Substanzen zum Fermenter, gekennzeichnet durch Einrichtungen zur Aufteilung der Bouillon, aus der die Zellen entfernt worden sind, in eine Mediumkomponente bzw. in Medien­ komponenten, in eine brauchbare Substanz bzw. brauch­ bare Substanzen, die von den Zellen erzeugt wurden, und in einen Abfallstoff bzw. Abfallstoffe, sowie durch Einrichtungen zum Zurückführen wenigstens eines Teils der Medienkomponenten zurück zum Fermenter.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11 dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Molekulargewicht der brauchhbaren Substanz kleiner als das der Mediumkompo­ nente ist.

13. Vorrichtung zum Züchten von Zellen in einer Bouillon mit Einrichtungen zum Abtrennen der Zellen von der Bouillon und zum Zurückführen der so abgetrennten Zellen zurück zu einem Fermenter und mit Einrichtungen zur Aufteilung der Bouillon in eine brauchbare Sub­ stanz bzw. brauchbare Substanzen und in eine nicht brauchbare Substanz bzw. nicht brauchbare Substanzen und zum Zurückführen der so abgetrennten brauchbaren Substanz bzw. brauchbaren Substanzen zum Fermenter gekennzeichnet durch Einrichtungen zur Aufteilung der Bouillon, aus der die Zellen entfernt worden sind, in einen Abfallstoff bzw. Abfallstoffe, in eine hochmolekulare brauchbare Substanz bzw. in hochmolekulare brauchbare Substanzen und in eine Mediumkomponente bzw. in Medienkomponenten, durch Einrichtungen zur weiteren Aufteilung der hochmoleku­ laren brauchbaren Substanz bzw. brauchbaren Substanzen und der Mediumkomponente bzw. Medienkomponenten in eine Mediumkomponente bzw. Medienkomponenten und eine brauchbare Substanz bzw. brauchbare Substanzen, die ein Molekulargewicht haben, das größer ist als das von wenigstens einer der Medienkomponenten, und durch Einrichtungen zum Zurückführen wenigstens einer der Medienkomponenten zum Fermenter.

14. Vorrichtung für die Züchtung von Zellen mit Verbin­ dungsöffnungen, die über eine außerhalb eines Fermen­ ters vorgesehene Leitung miteinander verbunden sind und die am oberen und unteren Teil des Fermenters angeordnet sind, durch den eine Bouillon strömt, da­ durch gekennzeichnet, daß im oberen und unteren Teil des Fermenters als Verbindungsöffnungen ein Auslaß bzw. ein Einlaß vorgesehen sind und daß eine Ausblaseinrichtung zum Zuführen eines Gases und ein Zellabscheider zum Abtrennen von Zellen aus einer Bouillon in der Mitte der Leitung vorgesehen sind.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Zellabscheider eine Dampf­ leitung aufweist, um den Zellabscheider während der Zellzüchtung ohne Entfernen des Zellabscheiders der Züchtungsvorrichtung im Rücklauf zu reinigen, um eine Hohlfasermembran während des Zellenzüchtens auszutau­ schen.

16. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Zellabscheider eine hydro­ phobe Hohlfasermembran als Zellen abtrennende Membran aufweist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekenn­ zeichnet, daß ein Zellabscheider in dem unte­ ren Teil des Fermenters angeordnet ist, daß eine Ausblaseinrichtung am Boden des Zellabscheiders vorge­ sehen ist, daß die Verbindungsöffnung im oberen Teil des Fermenters mit dem unteren Teil des Zellabschei­ ders über eine Leitung verbunden ist und daß die Verbindungsöffnung im unteren Teil des Fermenters mit dem oberen Teil des Zellabscheiders verbunden ist.

18. Zellabscheider bestehend aus einer hydrophoben Hohl­ fasermembran, die in der Lage ist, Zellen aus einer Bouillon abzutrennen, und aus einem Gehäuse, das in der Lage ist, die Hohlfasermembran zu halten, wobei eine Leitung für die Rücklaufreinigung der Hohlfaser­ membran des Zellabscheiders mit Dampf vorgesehen ist.