CH681545A5 - - Google Patents

Description

1

CH 681 545 A5

2

Beschreibung

Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren für Zeiibiidung, worin Zellen in einer Brühe kultiviert werden, sowie auf Vorrichtungen für Zellbildung für die Durchführung des Verfahrens.

Dabei bezieht sich diese Erfindung auf Zellkulturen. Im speziellen bezieht sie sich auf Verfahren von Zellbildung, geeignet für verlängerte hochdichte Kulturen, und Vorrichtungen dafür.

In einer bekannten Vorrichtung zur Zellbildung, z.B. derjenigen beschrieben in der American National Red Cross WO-A-8 300 400, werden die gebildeten Zellen, evtl. zusammen mit Niedermolekular-Materialien enthaltenden Abfallbestandteilen, an einem Fermentor rückgeführt resp. recyclisiert. Dabei wird weder das Entfernen der Abfallprodukte noch die Rückgewinnung von Höhermolekularen wiederverwendbaren Substanzen, falls vorhanden, in Betracht gezogen.

Eine derartige Vorrichtung ist deshalb nicht vorteilhaft, da die Zellbildung durch die besagten Abfallprodukte wie Zellmetaboliten oder niedermolekularen, wiederverwendbaren Substanzen behindert wird, falls diese Substanzen das Zellwachstum verhindern.

In der japanischen Patentoffenlegungsschrift Nr. 207 581/1985 ist eine bekannte Vorrichtung für Zellbildung beschrieben, die einen Zeliabscheider umfasst, wobei die Zellen von der Zellbrühe abgetrennt und in einem Fermentor aufgefangen werden, und einen Rührer, wodurch die Zellen wirkungsvoll in der Brühe des Fermentors suspendiert werden.

Weiter bekannt ist eine derartige Vorrichtung, wie diejenige in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 130 683/1987 beschrieben. Obschon dieses Patent Zeiibiidung, Zellabscheidung, das Zuführen von einem Medium und Umkehr-Reinigung beschreibt, bezieht sich nichts auf verlängerte kontinuierliche Kulturbildung oder auf die Verhinderung des Verstopfens einer Membrane, die darin beschrieben ist.

Mit anderen Worten befasst sich kein bekannter Stand der Technik mit der Produktivität bei Zellbildung. Im weiteren ist der bekannte Stand der Technik insofern unvorteilhaft, indem das Rühren unter Verwendung von Schaufelblättern in einer Brühe die Zellen zerstören könnte, da diese eine schlechte Resistenz gegen Scherkräfte aufweisen, wodurch die Aktivität der Zellen vermindert würde. Im weiteren würde eine hydrophile Membrane, die für das Abtrennen der Zellen in dieser Vorrichtung vorgesehen ist, öfters verunreinigt und verstopft werden. Obschon versucht wurde, die Verstopfung durch Umkehrreinigung (Regeneration) zu verhindern, ergab diese Behandlung nur einen beschränkten Effekt bei verlängerter kontinuierlicher, hochdichter Kulturbildung und damit ist es unmöglich, dadurch Verstopfung zu verhindern. Wenn die Verstopfung einmal eingetreten ist, sollte die Zellbildung unterbrochen werden, und die Membrane sollte herausgenommen und ersetzt oder regeneriert werden. Namentlich ist es notwendig, die Zellbildung zu beenden, wenn Verstopfung auftritt.

Es ist daher eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren von Zeiibiidung zu schaffen, worin Substanzen, die das Wachstum der Zellen verhindern, während der Zellbildung entfernt werden und worin mindestens eine der Serumkomponenten, die sehr teure, hochmolekulare Mediumkomponenten sind, welche hochdichte Kulturbildung ermöglichen, an einen Fermentor rückgeführt wird, um dadurch die Betriebskosten zu erniedrigen, sowie auch eine Vorrichtung dafür.

Eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht im Schaffen eines Verfahrens von Zellbildung, wobei die Produktivität erhöht werden kann ohne Zerstören der Zellen während der Bildung, sowie auch einer Vorrichtung dafür.

Eine dritte Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht im Schaffen eines Verfahrens für Zellbildung, worin ein Zellabscheider suksessive regeneriert oder ersetzt werden kann, und eine gute Ausführbarkeit und eine hohe Produktivität erreicht wird, sowie einer Vorrichtung dafür.

Die erfindungsgemäss definierten Aufgaben werden mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 bzw. mittels einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 15 gelöst.

Die Erfindung wird nun anschliessend beispielsweise unter Bezug auf die beigefügten Figuren näher erläutert. Dabei zeigen:

Fig. 1 ein Flussdiagramm eines Beispieles einer Vorrichtung für Zellbildung gemäss der vorliegenden Erfindung,

Fig. 2 ein Flussdiagramm eines weiteren Beispieles davon, und

Fig. 3 und 4 entsprechende Flussdiagramme von weiteren Beispielen davon.

Eine Ausführung der vorliegenden Erfindung wird nun unter Bezug auf Fig. 1 beschrieben.

In Fig. 1 enthält ein Fermentor 1 ein sterilisiertes RPM-1640 Medium und Bovinserum. In einem Fermentor 2 werden human peripherale Lymphocyten (PBL) zusammen mit B Lymphosarcomen kultiviert. Diese B Lymphosarcome produzieren Interleukin 2 (IL-2). Diese Zellen werden zunächst im Fermentor

2 vermehrt, um so die Produktion von IL-2 in der Brühe zu ermöglichen. Wenn die Zellkonzentration ein bestimmtes Niveau (1 x 105 Zellen/ml) erreicht, wird die Zirkulation ausgeführt, wie in Fig. 1 dargestellt. Auf diese Art und Weise wird die Brühe, beinhaltend die Zellen und IL-2, zu einem Zellabscheider

3 zugeführt, der mit einer hydrophoben Hohlfasermembrane versehen ist. Mittels diesem Zellabscheider 3 wird eine Lösung, beinhaltend die Zellen zum Fermentor 2 zurückgeführt, währenddem die Brühe, beinhaltend IL-2, aus der die Zellen entfernt worden sind, in einen Auffangtank 4 zugeführt wird. Als nächstes wird die Brühe in ein Ultrafiltriergerät 5 zugeführt, das mit einer Membrane versehen ist, deren Fraktionier-Molekulargewicht vorab auf 20 000 eingestellt worden ist. Dann wird das IL-2 und Abfallprodukte, die beide je ein Molekulargewicht, kleiner als das Fraktioniermolekulargewicht der besagten Membrane, haben, durch das Membran hindurch und in einen Auffangtank 6 zugeführt. Das Molekulargewicht von IL-2 beträgt unge5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

2

3

CH 681 545 A5

4

fähr 15 000. Auf der anderen Seite werden Materialien, die nicht durch die besagte Membrane hindurchtreten können, nämlich solche Mediumkomponenten mit einem Molekulargewicht grösser als 20 000 und ein Teil von IL-2, zurück an den Auffangtank 4 zurückgeführt und wiederum im Ultrafiltriergerät 5 filtriert. Wenn die Konzentration von IL-2 niedriger wird als ein vorbestimmtes Niveau, wird die zurückbleibende Brühe, in welcher Substanzen mit einem Molekulargewicht oberhalb 20 000 aufkonzentriert werden, zurück zum Fermentor 2 zurückgeführt. Auf diese Art wird IL-2 kontinuierlich während der Zirkulation aus dem System abgezogen.

Anschliessend wird nun eine weitere Ausführung gemäss der vorliegenden Erfindung unter Bezug auf Fig. 2 beschrieben.

In Fig. 2 umfasst ein Fermentor 1 sterilisiertes RDF-Medium, das durch Mischen von RPMI-1640 Medium, Ham F-12 Medium und «Eagle's» Medium, modifiziert gemäss der Methode von Doulbecco in einem Verhältnis von 2:1:1, und Bovenserum hergestellt worden ist. In einem Fermentor 2 werden IgA-produzierende Mäusehybridome, die durch Verschmelzen von Mäuse-Myelome mit Human B Zellen erhalten worden sind, kultiviert. Wenn die Zellkonzentration eines bestimmten Niveaus (1 x 105 Zellen/ml) erreicht, wird die Zirkulation, gezeigt in Fig. 2 durchgeführt. Damit wird die Brühe, beinhaltend die Zellen und IgA, an einen Zellabscheider 3 zugeführt, der mit einer hydrophoben Hohlfasermembrane versehen ist. Durch diesen Zellabscheider 3 wird eine Lösung, beinhaltend die Zellen, zum Fermentor 2 zurückgeführt, währenddem die Brühe, beinhaltend IgA, von der die Zellen entfernt worden sind, in einen Auffangtank 4 zugeführt wird. Anschliessend wird die Brühe in ein Ultrafiltrationsgerät 5 zugegeben, das mit einer Membrane versehen ist, deren Fraktioniermolekulargewicht vorgängig bei 20 000 ajustiert worden ist. Die Zellabfallprodukte, die alle ein Molekulargewicht, kleiner als das Fraktioniermolekulargewicht der besagten Membrane haben, passieren durch die Membrane und werden in einen Auffangtank 6 zugeführt. Auf der anderen Seite wird das Material, das nicht durch die besagte Membrane hindurchgelangt, namentlich solches mit einem Molekulargewicht oberhalb 20 000 und einige niedermolekulare Materialien, die nicht durch die Membrane hindurchgelangt sind, zum Auffangtank 4 zurückgeführt und erneut im Ultrafiltrationsgerät 5 filtriert. Die Lösung, von der Materialien mit einem Molekulargewicht kleiner als 20 000 ausreichend entfernt worden sind, wird in ein weiteres Ultrafiltrationsgerät 7 zugeführt, das mit einer Membrane versehen ist, deren Fraktioniermolekulargewicht bei 100 000 eingestellt worden ist. Mit dieser Membrane wird Albumin, das eine der Serumkomponenten im Medium mit einem Molekulargewicht kleiner als 100 000 ist, an den Fermentor 2 zurückgeführt. Andererseits wird IgA mit einem Molekulargewicht oberhalb 100 000 im Auffangtank 4 zusammengefasst und die Brühe, beinhaltend IgA, wird aus dem System abgezogen.

Mit Hilfe dieses Systems ist es möglich, separat nützliche Substanzen, deren Molekulargewichte kleiner oder höher sind als dasjenige der Serumkomponente, die an den Fermentor 2 zurückgeführt wird, in der Kultur der Zellen abzuführen, wodurch es möglich wird, gleichzeitig besagte nützliche hoch-oder niedermolekulare Substanzen zu erzeugen, ohne dass sich unerwünschte Effekte, wie die Inhibition des Wachstums der Zellen, einstellen. In diesen Ausführungen kann entweder Gravitäts-Sedimentation, Zentrifugation oder Filtration im Zellseparator 3 angewendet werden. Im weiteren kann entweder Membranfiltration, Ultrafiltration, Dialyse, Umkehrosmose oder Adsorption in den Ultrafiltrationsgeräten 5 und 7 angewendet werden.

Beispiele von nützlichen Substanzen, die durch die Zellen in diesen Ausführungen erzeugt werden, umfassen Lymphokine, Enzyme und Zellwachstumsförderer. Im speziellen können hierzu Interferon, Interleukin, Immunoglobulin, Immunoglobulin G und Human-Immunglobulin angeführt werden. Weiter enthält die Brühe, in welcher die Zellen kultiviert werden, Wachstumspromotoren, wie Transferrin, Insulin, Albumin und Ethanolamin. Die vorliegende Erfindung kann durch näherungsweise Steuerung des fraktionierten Molekulargewichtes von jedem Ultrafiltrationsmembran ausgeführt werden, unter Berücksichtigung der Kombination der oben erwähnten nützlichen Substanzen mit den oben erwähnten Wachstumsförderer. Wenn das Molekulargewicht der nützlichen Zielsubstanz kleiner ist als dasjenige der Mediumkomponente, die wiederverwendet wird, so sollte z.B. das Fraktioniermolekulargewicht der Ultrafiltrationsmembrane, womit die zellfreie Brühe separiert werden muss, grösser sein als dasjenige der nützlichen Substanz und Abfallprodukte sollten nicht oberhalb demjenigen der Mediumkomponente liegen, die wiederverwendet wird.

Wenn das Molekulargewicht der nützlichen Zielsubstanz grösser ist als dasjenige der Mediumkomponente, die wiederverwendet wird, sollte auf der anderen Seite das Fraktioniermolekulargewicht der Ultrafiltrationsmembrane, womit die Abfallprodukte von der zellfreien Brühe in einem ersten Schritt entfernt werden, grösser sein als diejenigen der Abfallprodukte, sollte aber nicht höher liegen als diejenigen der nützlichen Substanz und der Mediumkomponente. Das Fraktioniermolekulargewicht der Ultrafiltrationsmembrane, womit die Mediumkomponente in einem zweiten Schritt entfernt wird, sollte grösser sein als dasjenige der Mediumkomponente, sollte aber nicht höher liegen als dasjenige der nützlichen Substanz. Die Mediumkomponente wird dadurch abgeschieden und an den Fermentor zurückgeführt und wiederverwendet.

Die vorliegende Erfindung kann zur Bildung, z.B. von tierischen Zellen, pflanzlichen Zellen und Mikroorganismen angewendet werden ohne durch die vorab erwähnten Ausführungen eingeschränkt zu werden.

Nun wird ein Beispiel einer Vorrichtung für Zellbildung gemäss der vorliegenden Erfindung beschrieben, worin Zellen unter Verwendung einer Druckluftförderkraft, unter Bezug auf die Fig. 3 beschrieben, gemischt und kultiviert werden.

In Fig. 3 ist eine Verbindungsöffnung 12 in der oberen Seite von einem Fermentor 11 angeordnet, währenddem eine andere Verbindungsöffnung 13 im

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

5

CH 681 545 A5

6

unteren Teil angeordnet ist, z.B am Boden davon. Diese Verbindungsöffnungen sind über eine Leitung 14 verbunden und ein Zellabscheider 15 ist in der Mitte der Leitung 14 vorgesehen. Ein Aufgussapparat 16 ist nahe dem Boden des Fermentors 11 ausgebildet, um ein Gas, das für die Kulturbildung benötigt wird, einzuführen. Im weiteren erzeugt das Gas, das vom Aufgussapparat 16 eingeführt wird, ebenfalls einen Rühreffekt, um so die Zellen effektiv in der Brühe zu suspendieren.

Weiter wird ein Gas von einem anderen Aufgussapparat 17 zugeführt, der nahe dem unteren Ende der Leitung 14 angeordnet ist, das eine Treibkraft erzeugt, wodurch die, die Zellen enthaltende Brühe innerhalb der Leitung zirkuliert wird. Wenn ein Ventil 18 geöffnet wird und so ein Gas vom Aufgussapparat 16 in den Fermentor 11 eingeführt wird, führt die Treibkraft, die durch das Gas erzeugt wird, zur Konvention und dem Rühren der Brühe 10, die die Zellen enthält.

Wenn ein Ventil 19 geöffnet wird und ein Gas vom Aufgussapparat 17 zugeführt wird, wird das Schüttgewicht der Brühe, die über dem Aufgussapparat 17 angeordnet ist, infolge der erzeugten Gasblasen erniedrigt.

Andererseits enthält die Brühe im Bereich der Leitung 14 keine Gasblasen. Daher ist das Schüttgewicht davon das gleiche wie die Dichte der Brühe per se. Dadurch wird die Brühe, beinhaltend die Zellen, während dem Durchführen der Kulturbildung, von der Verbindungsöffnung 12 zur Verbindungsöffnung 14 zirkuliert und an die Verbindungsöffnung 13 via dem Zellabscheider 15 zurückgeführt.

Wenn die Bildung fortschreitet und die Zellkonzentration den erwünschten Grad erreicht, werden die Ventile 21 und 31 geöffnet und die Pumpe 22 betrieben. Dadurch wird die Brühe mit den nützlichen Substanzen und den Abfallmaterialien in den Zellabscheider 15 zugeführt, worin Zellen davon separiert werden, und dann in eine Ultrafiltrationsvorrichtung 24 via einer Leitung 23 zugeführt werden. Dann werden die erzeugten nützlichen Substanzen und Abfallprodukte von den Mediumkomponenten separiert. Die Lösung, enthaltend die nützlichen Substanzen und die Abfallprodukte, wird in eine nachfolgende Vorrichtung (nicht gezeigt) eingegeben, wie beispielsweise eine Reinigungsvorrichtung, und dann einer erwünschten Weiterbehandlung unterzogen.

Andererseits werden die oben erwähnten abgetrennten Mediumkomponenten von der Leitung 26 an den Fermentor 11 via das Ventil 31 zurückgeführt und dann wiederverwendet.

Auf diese Weise werden die so produzierten nützlichen Substanzen und Abfallprodukte in das nachfolgende Gerät extrahiert. Andererseits wird das Medium enthaltende Serum während der Umkehrreinigung der Zell-abscheidenden Membrane 32 in einer Grössenordnung entsprechend der Extraktion dem Fermentor 11 via einer Leitung 27 und einem Ventil 28 zugeführt.

Der Zellabscheider 15 kann ohne Schliessen der Ventile 29, 30, 21 und 28 ersetzt werden. Namentlich die Wartung des Zellabscheiders 15 kann leicht ausgeführt werden, ohne dass das Kulturbildungsverfahren beendet werden muss.

Da der Fermentor 11, der Zellabscheider 15 und der Aufgussapparat 17 vom oberen Teil in dieser Reihenfolge gegen den unteren Teil zu angeordnet sind, wie dies im beschriebenen Beispiel der Fall ist, kann die Brühe, zu welcher eine Treibkraft gegeben wird, die Membrane im Zellabscheider 15 waschen. Im weiteren kann der Inhalt des Fermentors 11 durch das Vorsehen einer oberen Anschlussöffnung 12 beim Zentrum des Fermentors 11 (nicht gezeigt), gleichmässiger gerührt werden.

In der vorliegenden Erfindung ist der Zellabscheider ausserhalb des Fermentors angeordnet, wodurch es möglich wird, die zellabscheidende Membrane auch während des Zellbildungsverfahrens leicht zu ersetzen.

Im weiteren kann das Kleben von Zellen auf der Oberfläche der Membrane durch Zirkulation der Brühe innerhalb der Leitung unter Verwendung einer lufttreibenden Kraft verhindert werden, die durch das Zuführen eines Gases von einem Aufgussapparat erzeugt wird, der in der Mitte der Leitung angeordnet ist, und durch das Variieren des Druckes an der Oberfläche der Membrane durch Strömen von Gasblasen um die zellabscheidende Membrane herum. Auf diese Weise kann das Verstopfen der Membrane verhindert werden. Die Gasblasen, die vom Aufgussapparat in den unteren Teil des Fermentors zugeführt werden, führen Sauerstoff zu, der für die Zellbildung benötigt wird, und erzeugen gleichzeitig eine Strömung der Brühe, um so die Sedimention der Zellen im Fermentor zu verhindern. Auf diese Art und Weise kann in der Brühe eine Strömung durch die Verwendung der lufttreibenden Kraft erzeugt werden, ohne Applikation von irgendwelchen Scherkräften. Deshalb werden die Zellen nie beschädigt werden. Es ist eine spezielle Eigenschaft der Zellen, dass sie eine schlechte Resistenz gegen Scherkräfte aufweisen, wie beispielsweise die tierischen Zellen.

Nun wird eine weitere Ausführung gemäss der vorliegenden Erfindung unter Bezug auf Fig. 4 beschrieben.

In Fig. 4 weisen diejenigen Teile die gleichen Referenzzahlen auf, die analogen Teile in Fig. 3 entsprechen und die mit diesen übereinstimmen und deshalb nicht noch einmal beschrieben werden.

In dieser Vorrichtung wird Luft durch Öffnen eines Ventils 19 zugeführt, um so eine treibende Kraft zur Zirkulation der Brühe im Fermentor 11 und dem Zellabscheider 15 zu erzeugen. Verknappung in der Luftzufuhr wird durch Öffnen eines Ventils 18 kompensiert. Im Falle von Perfusionsbildung wird die Brühe exklusiv durch eine Zellabscheidungsmem-brane 32 durch Öffnen eines Ventils 21 filtriert. Wenn die Brühe im Fermentor 11 durch Filtrieren auf eine bestimmte Menge erniedrigt wird, wird das Ventil 21 geschlossen und das Ventil 28 geöffnet, um dadurch das Medium während der Umkehrreinigung der Membrane 32 zuzuführen. Wenn die Brühe im Fermentor auf ein bestimmtes Niveau erhöht wird, wird auf der anderen Seite das Ventil 28 geschlossen und das Ventil 21 geöffnet, gefolgt durch die oben erwähnte Fiitrierung. Die Niveauänderung der

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

CH 681 545 A5

8

Brühe im Fermentor wird durch einen Niveausensor gesteuert. Die Filtration der Brühe und die Zuführung des Mediums werden unter Verwendung von einer Pumpe ausgeführt.

Wenn die oben erwähnte Perfusionsbildung für eine längere Zeit betrieben wird, wird die zellabscheidende Membrane 32 verstopft. In diesem Fall kann die Perfusionsbildung ohne Beendigung mittels den nachfolgenden beiden Methoden weitergeführt werden.

Die erste Methode dafür umfasst das Entfernen der verstopften Bestandteile unter Verwendung von Dampf, um so die Membrane zu regenerieren. Diese Behandlung kann auf die folgende Art und Weise durchgeführt werden. Zunächst wird Luft zugeführt, währenddem das Ventil 19 geschlossen ist, und die Brühe im Zellabscheider 15 wird in den Fermentor 11 über die Leitung 14 zugeführt. Anschliessend werden die Ventile 19, 21, 28, 29 und 30 geschlossen, währenddem die Ventile 33 und 34 geöffnet werden und der Zellabscheider 15 wird durch das Hindurchführen von Kühlwasser durch die Hülle abgekühlt. Wenn die Temperatur im Zellabscheider bis auf ein bestimmtes Niveau erniedrigt worden ist, fällt der Druck in besagtem Zellabscheider, so dass ein Vakuum entsteht. Das Medium wird dann durch Öffnen des Ventils 28 zugeführt und der Druckunterschied zwischen der Aussenseite und dem Inneren des Zellabscheiders wird auf Null ausgeglichen. Als nächstes wird das Ventil 28 geschlossen, während diejenigen bei 21,29 und 30 geöffnet werden und die oben erwähnte Perfusionsbildung wird weitergeführt.

Die zweite Methode dafür umfasst das Ersetzen der zellabscheidenden Membrane 32. In diesem Fall wird die Brühe im Zellabscheider 15 hin zum Fermentor 11 ähnlich der ersten Methode zugeführt. Dann wird die zellabscheidende Membrane 32 ersetzt, währenddem die Ventile 29, 13 und 19 geschlossen sind. Nach Beendigung des Ersatzes wird Dampf für Sterilisation hindurchgeführt, ähnlich der Methode 1, und das Medium wird zugespiesen, um so die ursprüngliche Perfusionsbildung weiterzuführen. In der vorliegenden Erfindung werden folglich die Zellen und die Brühe vom Fermentor zum Zellabscheider während der Abscheidung der kultivierten Zellen zugeführt. Wenn Umkehrreinigung (Regeneration) im grossen Massstab durchzuführen ist, kann das Zuführen der Brühe, beinhaltend die Zellen, durch Schliessen der Ventile unterbrochen werden. Dann wird das Ablaufventil des Zellabscheiders geöffnet und Dampf durch die Hohlfasermembrane in umgekehrter Richtung zu derjenigen während der Zellabscheidung hinduchgeführt. Dadurch wird der besagte Druck direkt auf die Innenseite der Hohlfaser appliziert, um so die Umkehrreinigung (Regeneration) in grossem Massstab durchzuführen. Wenn die Brühe Materialien enthält, wie Proteine, die thermisch denaturiert würden und sich dadurch eine grosse Menge von abgeschiedenen Stoffen bei einer hohen Konzentration bilden würde, ist es wirkungsvoller, die Innenseite des Zellabscheiders oder des Membrans beispielsweise mit Wasser vor der Umkehrreinigung auszuwaschen. Nach Beendigung der Umkehrreinigung wird das

Ablaufventil geschlossen, gefolgt von einer Sterilisation. Dann wird die Zufuhr von Hochdruckdampf beendet, währenddem die Temperatur bei hohem Niveau gehalten wird. Nachdem der Zellabscheider abgekühlt ist, wird frisches Medium zur Hohlfaser zugeführt, in welcher der Druck reduziert worden ist, gefolgt vom Abscheiden der Zellen.

Wenn die Zellabscheidemembrane nicht mehr weiter brauchbar ist, wird das Zuführen der Brühe, beinhaltend die Zellen, in derselben Art und Weise, wie oben beschrieben, unterbrochen, und der Zellabscheider, beinhaltend die Zellabscheidemembrane, wird ersetzt. Die Sterilisation wird in derselben Art und Weise durchgeführt, wie oben dargestellt, und ein frisches Medium wird hinzufördert, gefolgt wiederum vom Abscheiden der Zellen.

Obwohl Verschlammen und Verstopfen der Membrane bei solcher Perfusionsbildung nicht verhinderbar ist, ist es möglich, die Zellbildung für eine verlängerte Zeitperiode durch Regeneration oder Ersetzen der Membrane, wie oben beschrieben, durchzuführen. Weiter ist zu erwarten, dass die Produktivität der Zielsubstanz dadurch erhöht werden kann.

Gemäss der vorliegenden Erfindung können nützliche Substanzen und Abfallprodukte von Mediumkomponenten, durch vorgängiges Einstellen der Fraktioniermolekulargewichte von einem Membran für das Abtrennen einer Zell-freien Brühe kleiner oder grösser als diejenigen der nützlichen Substanzen (Zellmetaboliten) oder Abfallprodukte, entfernt werden. Weiter ermöglicht das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung, Albumin zurück zu einem Fermentor zu rezyklisieren, das eine teure Serumkomponente ist, um damit die Betriebskosten zu senken.

Nun werden die Wirkungen eines Fermentors beschrieben, in welchem eine Brühe durch Gebrauch einer Druckluftkraft gerührt wird. Da ein Zellabscheider ausserhalb des Fermentors angeordnet ist, ist es nicht notwendig, den Fermentor beim Ersetzen des Zellabscheiders zu öffnen. Es ist daher möglich, den Zellabscheider während dem Weiterführen der Zellbildung zu ersetzen. Im weiteren kann die Ersatzprozedur einfach ausgeführt werden und damit kann sowohl eine hohe Produktivität wie auch eine gute Wartung, wie auch Betriebsdurchführung erreicht werden. Ähnlich kann eine Zellabscheidemembrane ersetzt werden, ohne Beenden (Unterbrechen) der Zellbildung, wodurch verlängerte Zellbildung möglich wird.

Da die Brühe unter Verwendung einer Treibkraft, erzeugt durch das Zuführen eines Gases von einem Aufgussapparat, gerührt wird, ohne die Verwendung einer Rührvorrichtung, werden die Zellen niemals durch den Rühreffekt beschädigt, was weiter die Produktivität erhöht.

Claims (15)

Patentansprüche

1. Verfahren für Zellbildung, worin Zellen in einer Brühe kultiviert werden, gekennzeichnet durch: A) einen Schritt, in welchem die Zellen von der Brühe abgeschieden werden und dann die derart

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

g

CH 681 545 A5

10

abgeschiedenen Zellen zu einem Fermentor (2,11) zurückgeführt werden; und B) einen Schritt, in welchem eine oder mehrere Mediumkomponenten, eine oder mehrere nützliche Substanzen, die durch die Zellen erzeugt werden und ein oder mehrere Abfallprodukte von der Brühe abgeschieden werden, von welcher die Zellen entfernt worden sind, und mindestens ein Teil der Mediumkomponente(n) zum Fermentor (2, 11 ) zurückgeführt wird.

2. Verfahren für Zellbildung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht der besagten nützlichen Substanz oder Substanzen kleiner ist als dasjenige der besagten Mediumkomponente.

3. Verfahren für Zellbildung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten Zellen von der besagten Brühe unter Venwendung einer hydrophoben Membrane (32) getrennt werden.

4. Verfahren für Zellbildung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die eine oder die mehreren nützlichen Substanzen und Medienkom-ponente(n) weiter in die Medienkomponenten und nützlichen Substanzen aufgetrennt werden mit einem Molekulargewicht grösser als dasjenige von mindestens einer der Medienkomponente(n).

5. Verfahren für Zellbildung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten Zellen von besagter Brühe unter Verwendung einer hydrophoben Membrane (32) abgeschieden werden.

6. Verfahren für Zellbildung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Gas in der Mitte einer Durchführung (14) zugeführt wird, die ausserhalb des besagten Fermentors (11) angeordnet ist und die dafür vorgesehen ist, um die Brühe zwischen dem oberen Teil (12) und dem unteren Teil (13) des Fermentors (11) zu zirkulieren, wodurch so eine Zirkulationstreibkraft erzeugt wird, wobei der Inhalt des Fermentors gemischt wird, und die Kulturbildung betrieben wird.

7. Verfahren für Zellbildung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zellabscheider (3, 15) mit einer Zellabscheidemembrane (32) bei der Abtrennung der besagten Zellen von der besagten Brühe verwendet wird und dass Umkehrreinigung und Ersatz der besagten Zellabscheidemembrane während der Zellbildung ausgeführt wird.

8. Verfahren für Zellbildung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Zirkulation einer Brühe innerhalb eines Zirkulationsdurchganges (14), der ausserhalb eines Fermentors (11) zwischen dem oberen Teil des Fermentors und dem unteren Teil davon angeordnet ist, um so Rühren und Kultivierung durchzuführen, und durch das Zuführen eines Gases in der Mitte des besagten Durchganges, angeordnet ausserhalb des besagten Fermentors, um so eine Zirkulationsströmungskraft ' zu erzeugen, wodurch Rühren und Kultivieren betrieben wird, wobei die Zellen von der Brühe innerhalb des Zirkulationsdurchganges beim unteren Teil des besagten abgetrennt werden.

9. Verfahren für Zellbildung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zellabscheider (15), bestehend aus einer hydrophoben Hohlfasermembrane (32), verwendet wird für das Abtrennen der Zellen von der Brühe; die Hohlfasermembrane im besagten Zellabscheider mit Dampf sterilisiert wird; und die Innenseite des Zellabscheiders nach dem Aufrechterhalten der hohen Temperatur bei der Sterilisation abgekühlt wird und das Medium unter Ausnützung des Vakuumunterdruckes innerhalb des Zellabscheiders zugefördert wird.

10. Vorrichtung für Zellbildung für die Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, umfassend Mittel (3, 15) für das Abtrennen der Zellen von der Brühe und Zurückführen der derart abgetrennten Zellen zurück zu einem Fermentor (2, 11) und Auf-trenn-Mittel (5, 24) für das Aufteilen der besagten Brühe, dadurch gekennzeichnet, dass die Auftrennmittel Mittel umfassen für das Auftrennen der besagten Brühe, von welcher die Zellen abgetrennt worden sind, in eine oder mehrere Mediumkomponenten, eine oder mehrere nützliche Substanzen, hergestellt durch die Zellen, und eine oder mehrere Abfallprodukte; und Mittel für das Zurückführen mindestens eines Teils der besagten Mediumkomponenten zurück zum Fermentor.

11. Vorrichtung für Zellbildung für die Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, umfassend Mittel (3, 15) für das Abtrennen von Zellen in der Brühe und Zurückführen der derart abgetrennten Zellen zurück zu einem Fermentor (2, 11) und Auf-trenn-Mittel (5, 24) für das Aufteilen der besagten Brühe, dadurch gekennzeichnet, dass die Auftrennmittel Mittel umfassen für das Aufteilen der besagten Brühe, von welcher die Zellen abgetrennt worden sind, in Abfallprodukte, hoch-molekulare nützliche Substanzen und eine oder mehrere Mediumkomponenten; Mittel für das weitere Aufteilen der hoch-molekularen nützlichen Substanzen und Mediumkomponenten in Mediumkomponenten und nützliche Substanzen mit einem Molekulargewicht, das grösser ist als dasjenige von mindestens einer der Mediumkomponenten; und Mittel für das Zurückführen mindestens einer der Mediumkomponenten zurück zu besagtem Fermentor.

12. Vorrichtung für Zellbildung nach einem der Ansprüche 10 oder 11, gekennzeichnet durch Verbindungsöffnungen (12, 13), die untereinander durch eine Leitung (14) verbunden sind, die ausserhalb eines Fermentors (11) vorgesehen ist, wobei die Öffnungen bei den oberen und unteren Teilen des Fermentors angeordnet sind, wobei ein Auslass (12) und ein Einlass (13) entsprechend im oberen und unteren Teil des Fermentors (11) als die besagten Verbindungsöffnungen vorgesehen sind; und einen Aufgussapparat (16) für das Zuführen eines Gases und einen Zellabscheider (15) für das Abtrennen der Zellen von der Brühe, in der Mitte der besagten Leitung (14) vorgesehen.

13. Vorrichtung für Zellbildung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte Zellabscheider (15) mit Ventilen frontseitig und rückseitig davon versehen ist, damit der besagte Zellabscheider entfernbar ist, und mit einer Dampfrohrleitung und einer hydrophoben Hohlfasermembrane (32), verwendet als Zelltrennmembrane zur Bildung des besagten Zellabscheiders.

14. Vorrichtung für Zellbildung nach Anspruch

5

10

15. Vorrichtung für Zellbildung nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zellabscheider unterhalb des Fermentors angeordnet ist; ein Aufgussapparat am oberen Ende des besagten Zellabscheiders angeordnet ist; dass die Verbindungsöffnung, im oberen Teil des besagten Fermentors angeordnet, mit dem unteren Teil des Zellabscheiders über eine Leitung verbunden ist, und dass die Verbindungsöffnung im unteren Teil des Fermentors mit dem oberen Teil des Zellabscheiders verbunden ist.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

6

11

CH 681 545 A5

12, dadurch gekennzeichnet, dass besagter Zellabscheider (15) eine hydrophobe Hohlfasermembrane (32) als Zellabscheidemembrane umfasst.