CH681545A5

CH681545A5 -

Info

Publication number: CH681545A5
Application number: CH39990A
Authority: CH
Inventors: Nakano Ryusei; Takai Masao; Sasaki Kiyoshi; Matsuzaki Harumi; Ishida Masahiko; Furukawa Tokinobu; Murakami Sei; Katoh Kenji
Original assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1989-02-15
Filing date: 1990-02-08
Publication date: 1993-04-15
Also published as: DE4002994A1

Description

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Beschreibung description

Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren für Zeiibiidung, worin Zellen in einer Brühe kultiviert werden, sowie auf Vorrichtungen für Zellbildung für die Durchführung des Verfahrens. This invention relates to methods for cell culture, in which cells are cultivated in a broth, and to devices for cell formation for carrying out the method.

Dabei bezieht sich diese Erfindung auf Zellkulturen. Im speziellen bezieht sie sich auf Verfahren von Zellbildung, geeignet für verlängerte hochdichte Kulturen, und Vorrichtungen dafür. This invention relates to cell cultures. In particular, it relates to methods of cell formation suitable for extended high density cultures and devices therefor.

In einer bekannten Vorrichtung zur Zellbildung, z.B. derjenigen beschrieben in der American National Red Cross WO-A-8 300 400, werden die gebildeten Zellen, evtl. zusammen mit Niedermolekular-Materialien enthaltenden Abfallbestandteilen, an einem Fermentor rückgeführt resp. recyclisiert. Dabei wird weder das Entfernen der Abfallprodukte noch die Rückgewinnung von Höhermolekularen wiederverwendbaren Substanzen, falls vorhanden, in Betracht gezogen. In a known device for cell formation, e.g. of those described in American National Red Cross WO-A-8 300 400, the cells formed, possibly together with waste components containing low molecular weight materials, are returned to a fermentor or. recycled. Neither the removal of the waste products nor the recovery of higher molecular weight reusable substances, if any, are considered.

Eine derartige Vorrichtung ist deshalb nicht vorteilhaft, da die Zellbildung durch die besagten Abfallprodukte wie Zellmetaboliten oder niedermolekularen, wiederverwendbaren Substanzen behindert wird, falls diese Substanzen das Zellwachstum verhindern. Such a device is not advantageous because cell formation is impeded by said waste products such as cell metabolites or low molecular weight, reusable substances if these substances prevent cell growth.

In der japanischen Patentoffenlegungsschrift Nr. 207 581/1985 ist eine bekannte Vorrichtung für Zellbildung beschrieben, die einen Zeliabscheider umfasst, wobei die Zellen von der Zellbrühe abgetrennt und in einem Fermentor aufgefangen werden, und einen Rührer, wodurch die Zellen wirkungsvoll in der Brühe des Fermentors suspendiert werden. Japanese Patent Laid-Open No. 207 581/1985 describes a known cell formation device comprising a cell separator, wherein the cells are separated from the cell broth and collected in a fermentor, and a stirrer, whereby the cells are effectively in the broth of the fermentor be suspended.

Weiter bekannt ist eine derartige Vorrichtung, wie diejenige in der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 130 683/1987 beschrieben. Obschon dieses Patent Zeiibiidung, Zellabscheidung, das Zuführen von einem Medium und Umkehr-Reinigung beschreibt, bezieht sich nichts auf verlängerte kontinuierliche Kulturbildung oder auf die Verhinderung des Verstopfens einer Membrane, die darin beschrieben ist. Also known is such a device as that described in Japanese Patent Laid-Open No. 130 683/1987. Although this patent describes cell formation, cell deposition, media delivery, and reverse cleaning, nothing relates to prolonged continuous culture formation or the prevention of membrane clogging described therein.

Mit anderen Worten befasst sich kein bekannter Stand der Technik mit der Produktivität bei Zellbildung. Im weiteren ist der bekannte Stand der Technik insofern unvorteilhaft, indem das Rühren unter Verwendung von Schaufelblättern in einer Brühe die Zellen zerstören könnte, da diese eine schlechte Resistenz gegen Scherkräfte aufweisen, wodurch die Aktivität der Zellen vermindert würde. Im weiteren würde eine hydrophile Membrane, die für das Abtrennen der Zellen in dieser Vorrichtung vorgesehen ist, öfters verunreinigt und verstopft werden. Obschon versucht wurde, die Verstopfung durch Umkehrreinigung (Regeneration) zu verhindern, ergab diese Behandlung nur einen beschränkten Effekt bei verlängerter kontinuierlicher, hochdichter Kulturbildung und damit ist es unmöglich, dadurch Verstopfung zu verhindern. Wenn die Verstopfung einmal eingetreten ist, sollte die Zellbildung unterbrochen werden, und die Membrane sollte herausgenommen und ersetzt oder regeneriert werden. Namentlich ist es notwendig, die Zellbildung zu beenden, wenn Verstopfung auftritt. In other words, no known prior art deals with productivity in cell formation. Furthermore, the known prior art is disadvantageous in that stirring with the use of airfoils in a broth could destroy the cells, since they have poor resistance to shear forces, which would reduce the activity of the cells. Furthermore, a hydrophilic membrane, which is provided for separating the cells in this device, would often be contaminated and clogged. Although attempts have been made to prevent constipation by reverse cleaning (regeneration), this treatment has only a limited effect with prolonged continuous, high-density culture formation, and it is therefore impossible to prevent constipation. Once constipation occurs, cell formation should be interrupted and the membrane should be removed and replaced or regenerated. In particular, it is necessary to stop cell formation when constipation occurs.

Es ist daher eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren von Zeiibiidung zu schaffen, worin Substanzen, die das Wachstum der Zellen verhindern, während der Zellbildung entfernt werden und worin mindestens eine der Serumkomponenten, die sehr teure, hochmolekulare Mediumkomponenten sind, welche hochdichte Kulturbildung ermöglichen, an einen Fermentor rückgeführt wird, um dadurch die Betriebskosten zu erniedrigen, sowie auch eine Vorrichtung dafür. It is therefore a first object of the present invention to provide a method of cell culture in which substances which prevent the growth of cells are removed during cell formation and in which at least one of the serum components, which are very expensive, high molecular medium components, which are high density culture formation enable to be returned to a fermentor, thereby reducing operating costs, as well as a device therefor.

Eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht im Schaffen eines Verfahrens von Zellbildung, wobei die Produktivität erhöht werden kann ohne Zerstören der Zellen während der Bildung, sowie auch einer Vorrichtung dafür. A second object of the present invention is to provide a method of cell formation where productivity can be increased without destroying the cells during formation, as well as an apparatus therefor.

Eine dritte Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht im Schaffen eines Verfahrens für Zellbildung, worin ein Zellabscheider suksessive regeneriert oder ersetzt werden kann, und eine gute Ausführbarkeit und eine hohe Produktivität erreicht wird, sowie einer Vorrichtung dafür. A third object of the present invention is to provide a method for cell formation in which a cell separator can be successively regenerated or replaced and good workability and high productivity is achieved, and an apparatus therefor.

Die erfindungsgemäss definierten Aufgaben werden mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 bzw. mittels einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 15 gelöst. The objects defined according to the invention are achieved by means of a method according to one of claims 1 to 9 or by means of a device according to one of claims 10 to 15.

Die Erfindung wird nun anschliessend beispielsweise unter Bezug auf die beigefügten Figuren näher erläutert. Dabei zeigen: The invention will now be explained in more detail, for example with reference to the accompanying figures. Show:

Fig. 1 ein Flussdiagramm eines Beispieles einer Vorrichtung für Zellbildung gemäss der vorliegenden Erfindung, 1 is a flowchart of an example of an apparatus for cell formation according to the present invention.

Fig. 2 ein Flussdiagramm eines weiteren Beispieles davon, und 2 is a flowchart of another example thereof, and

Fig. 3 und 4 entsprechende Flussdiagramme von weiteren Beispielen davon. 3 and 4 corresponding flow diagrams of further examples thereof.

Eine Ausführung der vorliegenden Erfindung wird nun unter Bezug auf Fig. 1 beschrieben. An embodiment of the present invention will now be described with reference to FIG. 1.

In Fig. 1 enthält ein Fermentor 1 ein sterilisiertes RPM-1640 Medium und Bovinserum. In einem Fermentor 2 werden human peripherale Lymphocyten (PBL) zusammen mit B Lymphosarcomen kultiviert. Diese B Lymphosarcome produzieren Interleukin 2 (IL-2). Diese Zellen werden zunächst im Fermentor In Fig. 1, a fermentor 1 contains a sterilized RPM-1640 medium and bovine serum. In a fermentor 2, human peripheral lymphocytes (PBL) are cultivated together with B lymphosarcomas. These B lymphosarcome produce interleukin 2 (IL-2). These cells are first in the fermentor

2 vermehrt, um so die Produktion von IL-2 in der Brühe zu ermöglichen. Wenn die Zellkonzentration ein bestimmtes Niveau (1 x 105 Zellen/ml) erreicht, wird die Zirkulation ausgeführt, wie in Fig. 1 dargestellt. Auf diese Art und Weise wird die Brühe, beinhaltend die Zellen und IL-2, zu einem Zellabscheider 2 increased so as to enable the production of IL-2 in the broth. When the cell concentration reaches a certain level (1 x 105 cells / ml), the circulation is carried out as shown in Fig. 1. In this way, the broth containing the cells and IL-2 becomes a cell separator

3 zugeführt, der mit einer hydrophoben Hohlfasermembrane versehen ist. Mittels diesem Zellabscheider 3 wird eine Lösung, beinhaltend die Zellen zum Fermentor 2 zurückgeführt, währenddem die Brühe, beinhaltend IL-2, aus der die Zellen entfernt worden sind, in einen Auffangtank 4 zugeführt wird. Als nächstes wird die Brühe in ein Ultrafiltriergerät 5 zugeführt, das mit einer Membrane versehen ist, deren Fraktionier-Molekulargewicht vorab auf 20 000 eingestellt worden ist. Dann wird das IL-2 und Abfallprodukte, die beide je ein Molekulargewicht, kleiner als das Fraktioniermolekulargewicht der besagten Membrane, haben, durch das Membran hindurch und in einen Auffangtank 6 zugeführt. Das Molekulargewicht von IL-2 beträgt unge5 3 supplied, which is provided with a hydrophobic hollow fiber membrane. A solution containing the cells is returned to the fermentor 2 by means of this cell separator 3, while the broth containing IL-2, from which the cells have been removed, is fed into a collecting tank 4. Next, the broth is fed into an ultrafilter 5 which is provided with a membrane whose fractionation molecular weight has been set to 20,000 in advance. Then the IL-2 and waste products, both of which have a molecular weight less than the fractionation molecular weight of said membrane, are fed through the membrane and into a collecting tank 6. The molecular weight of IL-2 is around 5

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fähr 15 000. Auf der anderen Seite werden Materialien, die nicht durch die besagte Membrane hindurchtreten können, nämlich solche Mediumkomponenten mit einem Molekulargewicht grösser als 20 000 und ein Teil von IL-2, zurück an den Auffangtank 4 zurückgeführt und wiederum im Ultrafiltriergerät 5 filtriert. Wenn die Konzentration von IL-2 niedriger wird als ein vorbestimmtes Niveau, wird die zurückbleibende Brühe, in welcher Substanzen mit einem Molekulargewicht oberhalb 20 000 aufkonzentriert werden, zurück zum Fermentor 2 zurückgeführt. Auf diese Art wird IL-2 kontinuierlich während der Zirkulation aus dem System abgezogen. about 15,000. On the other hand, materials that cannot pass through the said membrane, namely those medium components with a molecular weight greater than 20,000 and part of IL-2, are returned to the collecting tank 4 and again filtered in the ultrafiltration device 5 . When the concentration of IL-2 becomes lower than a predetermined level, the remaining broth, in which substances with a molecular weight above 20,000 are concentrated, is returned to Fermentor 2. In this way, IL-2 is continuously withdrawn from the system during circulation.

Anschliessend wird nun eine weitere Ausführung gemäss der vorliegenden Erfindung unter Bezug auf Fig. 2 beschrieben. A further embodiment according to the present invention will now be described with reference to FIG. 2.

In Fig. 2 umfasst ein Fermentor 1 sterilisiertes RDF-Medium, das durch Mischen von RPMI-1640 Medium, Ham F-12 Medium und «Eagle's» Medium, modifiziert gemäss der Methode von Doulbecco in einem Verhältnis von 2:1:1, und Bovenserum hergestellt worden ist. In einem Fermentor 2 werden IgA-produzierende Mäusehybridome, die durch Verschmelzen von Mäuse-Myelome mit Human B Zellen erhalten worden sind, kultiviert. Wenn die Zellkonzentration eines bestimmten Niveaus (1 x 105 Zellen/ml) erreicht, wird die Zirkulation, gezeigt in Fig. 2 durchgeführt. Damit wird die Brühe, beinhaltend die Zellen und IgA, an einen Zellabscheider 3 zugeführt, der mit einer hydrophoben Hohlfasermembrane versehen ist. Durch diesen Zellabscheider 3 wird eine Lösung, beinhaltend die Zellen, zum Fermentor 2 zurückgeführt, währenddem die Brühe, beinhaltend IgA, von der die Zellen entfernt worden sind, in einen Auffangtank 4 zugeführt wird. Anschliessend wird die Brühe in ein Ultrafiltrationsgerät 5 zugegeben, das mit einer Membrane versehen ist, deren Fraktioniermolekulargewicht vorgängig bei 20 000 ajustiert worden ist. Die Zellabfallprodukte, die alle ein Molekulargewicht, kleiner als das Fraktioniermolekulargewicht der besagten Membrane haben, passieren durch die Membrane und werden in einen Auffangtank 6 zugeführt. Auf der anderen Seite wird das Material, das nicht durch die besagte Membrane hindurchgelangt, namentlich solches mit einem Molekulargewicht oberhalb 20 000 und einige niedermolekulare Materialien, die nicht durch die Membrane hindurchgelangt sind, zum Auffangtank 4 zurückgeführt und erneut im Ultrafiltrationsgerät 5 filtriert. Die Lösung, von der Materialien mit einem Molekulargewicht kleiner als 20 000 ausreichend entfernt worden sind, wird in ein weiteres Ultrafiltrationsgerät 7 zugeführt, das mit einer Membrane versehen ist, deren Fraktioniermolekulargewicht bei 100 000 eingestellt worden ist. Mit dieser Membrane wird Albumin, das eine der Serumkomponenten im Medium mit einem Molekulargewicht kleiner als 100 000 ist, an den Fermentor 2 zurückgeführt. Andererseits wird IgA mit einem Molekulargewicht oberhalb 100 000 im Auffangtank 4 zusammengefasst und die Brühe, beinhaltend IgA, wird aus dem System abgezogen. In Fig. 2, a fermentor 1 comprises sterilized RDF medium, which by mixing RPMI-1640 medium, Ham F-12 medium and "Eagle's" medium, modified according to the Doulbecco method in a ratio of 2: 1: 1, and Bovenserum has been made. IgA-producing mouse hybridomas which have been obtained by fusing mouse myelomas with human B cells are cultivated in a fermentor 2. When the cell concentration reaches a certain level (1 x 105 cells / ml), the circulation shown in Fig. 2 is carried out. The broth, containing the cells and IgA, is thus fed to a cell separator 3, which is provided with a hydrophobic hollow fiber membrane. Through this cell separator 3, a solution containing the cells is returned to the fermentor 2, while the broth containing IgA, from which the cells have been removed, is fed into a collecting tank 4. The broth is then added to an ultrafiltration device 5 which is provided with a membrane, the fractionation molecular weight of which has previously been adjusted to 20,000. The cell waste products, all of which have a molecular weight less than the fractionation molecular weight of said membrane, pass through the membrane and are fed into a collecting tank 6. On the other hand, the material that does not pass through the said membrane, namely that with a molecular weight above 20,000 and some low molecular weight materials that have not passed through the membrane, is returned to the collecting tank 4 and filtered again in the ultrafiltration device 5. The solution, from which materials with a molecular weight of less than 20,000 have been sufficiently removed, is fed into a further ultrafiltration device 7, which is provided with a membrane, the fractionation molecular weight of which has been set at 100,000. With this membrane, albumin, which is one of the serum components in the medium with a molecular weight of less than 100,000, is returned to the fermenter 2. On the other hand, IgA with a molecular weight above 100,000 is collected in the collecting tank 4 and the broth containing IgA is withdrawn from the system.

Mit Hilfe dieses Systems ist es möglich, separat nützliche Substanzen, deren Molekulargewichte kleiner oder höher sind als dasjenige der Serumkomponente, die an den Fermentor 2 zurückgeführt wird, in der Kultur der Zellen abzuführen, wodurch es möglich wird, gleichzeitig besagte nützliche hoch-oder niedermolekulare Substanzen zu erzeugen, ohne dass sich unerwünschte Effekte, wie die Inhibition des Wachstums der Zellen, einstellen. In diesen Ausführungen kann entweder Gravitäts-Sedimentation, Zentrifugation oder Filtration im Zellseparator 3 angewendet werden. Im weiteren kann entweder Membranfiltration, Ultrafiltration, Dialyse, Umkehrosmose oder Adsorption in den Ultrafiltrationsgeräten 5 und 7 angewendet werden. With the aid of this system, it is possible to separate separately useful substances whose molecular weights are smaller or higher than that of the serum component which is returned to the fermentor 2 in the culture of the cells, thereby making it possible to simultaneously use said useful high or low molecular weight Generate substances without undesirable effects such as inhibiting the growth of cells. In these versions, either gravity sedimentation, centrifugation or filtration in the cell separator 3 can be used. Furthermore, either membrane filtration, ultrafiltration, dialysis, reverse osmosis or adsorption can be used in the ultrafiltration devices 5 and 7.

Beispiele von nützlichen Substanzen, die durch die Zellen in diesen Ausführungen erzeugt werden, umfassen Lymphokine, Enzyme und Zellwachstumsförderer. Im speziellen können hierzu Interferon, Interleukin, Immunoglobulin, Immunoglobulin G und Human-Immunglobulin angeführt werden. Weiter enthält die Brühe, in welcher die Zellen kultiviert werden, Wachstumspromotoren, wie Transferrin, Insulin, Albumin und Ethanolamin. Die vorliegende Erfindung kann durch näherungsweise Steuerung des fraktionierten Molekulargewichtes von jedem Ultrafiltrationsmembran ausgeführt werden, unter Berücksichtigung der Kombination der oben erwähnten nützlichen Substanzen mit den oben erwähnten Wachstumsförderer. Wenn das Molekulargewicht der nützlichen Zielsubstanz kleiner ist als dasjenige der Mediumkomponente, die wiederverwendet wird, so sollte z.B. das Fraktioniermolekulargewicht der Ultrafiltrationsmembrane, womit die zellfreie Brühe separiert werden muss, grösser sein als dasjenige der nützlichen Substanz und Abfallprodukte sollten nicht oberhalb demjenigen der Mediumkomponente liegen, die wiederverwendet wird. Examples of useful substances that are produced by the cells in these embodiments include lymphokines, enzymes and cell growth promoters. In particular, interferon, interleukin, immunoglobulin, immunoglobulin G and human immunoglobulin can be mentioned. The broth in which the cells are cultivated also contains growth promoters such as transferrin, insulin, albumin and ethanolamine. The present invention can be carried out by approximately controlling the fractional molecular weight of each ultrafiltration membrane, considering the combination of the above-mentioned useful substances with the above-mentioned growth promoters. If the molecular weight of the useful target substance is smaller than that of the medium component to be reused, e.g. the fractionation molecular weight of the ultrafiltration membrane, with which the cell-free broth has to be separated, is greater than that of the useful substance and waste products should not be above that of the medium component which is reused.

Wenn das Molekulargewicht der nützlichen Zielsubstanz grösser ist als dasjenige der Mediumkomponente, die wiederverwendet wird, sollte auf der anderen Seite das Fraktioniermolekulargewicht der Ultrafiltrationsmembrane, womit die Abfallprodukte von der zellfreien Brühe in einem ersten Schritt entfernt werden, grösser sein als diejenigen der Abfallprodukte, sollte aber nicht höher liegen als diejenigen der nützlichen Substanz und der Mediumkomponente. Das Fraktioniermolekulargewicht der Ultrafiltrationsmembrane, womit die Mediumkomponente in einem zweiten Schritt entfernt wird, sollte grösser sein als dasjenige der Mediumkomponente, sollte aber nicht höher liegen als dasjenige der nützlichen Substanz. Die Mediumkomponente wird dadurch abgeschieden und an den Fermentor zurückgeführt und wiederverwendet. On the other hand, if the molecular weight of the useful target substance is greater than that of the medium component to be reused, the fractional molecular weight of the ultrafiltration membrane, which removes the waste products from the cell-free broth in a first step, should be greater than that of the waste products, but should are no higher than those of the beneficial substance and the medium component. The fractionation molecular weight of the ultrafiltration membrane, with which the medium component is removed in a second step, should be greater than that of the medium component, but should not be higher than that of the useful substance. The medium component is thereby separated and returned to the fermentor and reused.

Die vorliegende Erfindung kann zur Bildung, z.B. von tierischen Zellen, pflanzlichen Zellen und Mikroorganismen angewendet werden ohne durch die vorab erwähnten Ausführungen eingeschränkt zu werden. The present invention can be used to form e.g. of animal cells, plant cells and microorganisms are used without being restricted by the aforementioned statements.

Nun wird ein Beispiel einer Vorrichtung für Zellbildung gemäss der vorliegenden Erfindung beschrieben, worin Zellen unter Verwendung einer Druckluftförderkraft, unter Bezug auf die Fig. 3 beschrieben, gemischt und kultiviert werden. An example of an apparatus for cell formation according to the present invention will now be described, in which cells are mixed and cultivated using a compressed air conveying force described with reference to FIG. 3.

In Fig. 3 ist eine Verbindungsöffnung 12 in der oberen Seite von einem Fermentor 11 angeordnet, währenddem eine andere Verbindungsöffnung 13 im In Fig. 3, a connection opening 12 is arranged in the upper side of a fermentor 11, while another connection opening 13 in

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unteren Teil angeordnet ist, z.B am Boden davon. Diese Verbindungsöffnungen sind über eine Leitung 14 verbunden und ein Zellabscheider 15 ist in der Mitte der Leitung 14 vorgesehen. Ein Aufgussapparat 16 ist nahe dem Boden des Fermentors 11 ausgebildet, um ein Gas, das für die Kulturbildung benötigt wird, einzuführen. Im weiteren erzeugt das Gas, das vom Aufgussapparat 16 eingeführt wird, ebenfalls einen Rühreffekt, um so die Zellen effektiv in der Brühe zu suspendieren. lower part, e.g. on the bottom of it. These connection openings are connected via a line 14 and a cell separator 15 is provided in the middle of the line 14. An infusion apparatus 16 is formed near the bottom of the fermenter 11 to introduce a gas needed for culture formation. Furthermore, the gas introduced by the infusion apparatus 16 also produces a stirring effect so as to effectively suspend the cells in the broth.

Weiter wird ein Gas von einem anderen Aufgussapparat 17 zugeführt, der nahe dem unteren Ende der Leitung 14 angeordnet ist, das eine Treibkraft erzeugt, wodurch die, die Zellen enthaltende Brühe innerhalb der Leitung zirkuliert wird. Wenn ein Ventil 18 geöffnet wird und so ein Gas vom Aufgussapparat 16 in den Fermentor 11 eingeführt wird, führt die Treibkraft, die durch das Gas erzeugt wird, zur Konvention und dem Rühren der Brühe 10, die die Zellen enthält. Further, a gas is supplied from another infusion apparatus 17, which is located near the lower end of the pipe 14, which generates a driving force, whereby the broth containing the cells is circulated within the pipe. When a valve 18 is opened and a gas is introduced from the infusion apparatus 16 into the fermentor 11, the driving force generated by the gas leads to the convention and the stirring of the broth 10 which contains the cells.

Wenn ein Ventil 19 geöffnet wird und ein Gas vom Aufgussapparat 17 zugeführt wird, wird das Schüttgewicht der Brühe, die über dem Aufgussapparat 17 angeordnet ist, infolge der erzeugten Gasblasen erniedrigt. When a valve 19 is opened and a gas is supplied from the infusion apparatus 17, the bulk density of the broth, which is arranged above the infusion apparatus 17, is reduced due to the gas bubbles generated.

Andererseits enthält die Brühe im Bereich der Leitung 14 keine Gasblasen. Daher ist das Schüttgewicht davon das gleiche wie die Dichte der Brühe per se. Dadurch wird die Brühe, beinhaltend die Zellen, während dem Durchführen der Kulturbildung, von der Verbindungsöffnung 12 zur Verbindungsöffnung 14 zirkuliert und an die Verbindungsöffnung 13 via dem Zellabscheider 15 zurückgeführt. On the other hand, the broth in the area of line 14 contains no gas bubbles. Therefore, the bulk density thereof is the same as the density of the broth per se. Thereby, the broth containing the cells is circulated from the communication port 12 to the communication port 14 during the culture formation, and returned to the communication port 13 via the cell separator 15.

Wenn die Bildung fortschreitet und die Zellkonzentration den erwünschten Grad erreicht, werden die Ventile 21 und 31 geöffnet und die Pumpe 22 betrieben. Dadurch wird die Brühe mit den nützlichen Substanzen und den Abfallmaterialien in den Zellabscheider 15 zugeführt, worin Zellen davon separiert werden, und dann in eine Ultrafiltrationsvorrichtung 24 via einer Leitung 23 zugeführt werden. Dann werden die erzeugten nützlichen Substanzen und Abfallprodukte von den Mediumkomponenten separiert. Die Lösung, enthaltend die nützlichen Substanzen und die Abfallprodukte, wird in eine nachfolgende Vorrichtung (nicht gezeigt) eingegeben, wie beispielsweise eine Reinigungsvorrichtung, und dann einer erwünschten Weiterbehandlung unterzogen. As the formation progresses and the cell concentration reaches the desired level, the valves 21 and 31 are opened and the pump 22 is operated. Thereby, the broth with the useful substances and the waste materials is fed into the cell separator 15, where cells are separated therefrom, and then fed into an ultrafiltration device 24 via a line 23. Then the generated useful substances and waste products are separated from the medium components. The solution containing the useful substances and the waste products is fed into a subsequent device (not shown), such as a cleaning device, and then subjected to a desired further treatment.

Andererseits werden die oben erwähnten abgetrennten Mediumkomponenten von der Leitung 26 an den Fermentor 11 via das Ventil 31 zurückgeführt und dann wiederverwendet. On the other hand, the above-mentioned separated medium components are returned from the line 26 to the fermentor 11 via the valve 31 and then reused.

Auf diese Weise werden die so produzierten nützlichen Substanzen und Abfallprodukte in das nachfolgende Gerät extrahiert. Andererseits wird das Medium enthaltende Serum während der Umkehrreinigung der Zell-abscheidenden Membrane 32 in einer Grössenordnung entsprechend der Extraktion dem Fermentor 11 via einer Leitung 27 und einem Ventil 28 zugeführt. In this way, the useful substances and waste products produced in this way are extracted into the subsequent device. On the other hand, the serum containing the medium is supplied to the fermentor 11 via a line 27 and a valve 28 in an order of magnitude corresponding to the extraction during the reverse cleaning of the cell-separating membrane 32.

Der Zellabscheider 15 kann ohne Schliessen der Ventile 29, 30, 21 und 28 ersetzt werden. Namentlich die Wartung des Zellabscheiders 15 kann leicht ausgeführt werden, ohne dass das Kulturbildungsverfahren beendet werden muss. The cell separator 15 can be replaced without closing the valves 29, 30, 21 and 28. In particular, the maintenance of the cell separator 15 can be carried out easily without the culture formation process having to be ended.

Da der Fermentor 11, der Zellabscheider 15 und der Aufgussapparat 17 vom oberen Teil in dieser Reihenfolge gegen den unteren Teil zu angeordnet sind, wie dies im beschriebenen Beispiel der Fall ist, kann die Brühe, zu welcher eine Treibkraft gegeben wird, die Membrane im Zellabscheider 15 waschen. Im weiteren kann der Inhalt des Fermentors 11 durch das Vorsehen einer oberen Anschlussöffnung 12 beim Zentrum des Fermentors 11 (nicht gezeigt), gleichmässiger gerührt werden. Since the fermenter 11, the cell separator 15 and the infusion apparatus 17 are arranged from the upper part in this order to the lower part, as is the case in the example described, the broth to which a driving force is added can the membrane in the cell separator Wash 15. Furthermore, the contents of the fermenter 11 can be stirred more evenly by providing an upper connection opening 12 at the center of the fermenter 11 (not shown).

In der vorliegenden Erfindung ist der Zellabscheider ausserhalb des Fermentors angeordnet, wodurch es möglich wird, die zellabscheidende Membrane auch während des Zellbildungsverfahrens leicht zu ersetzen. In the present invention, the cell separator is arranged outside the fermenter, which makes it possible to easily replace the cell-separating membrane even during the cell formation process.

Im weiteren kann das Kleben von Zellen auf der Oberfläche der Membrane durch Zirkulation der Brühe innerhalb der Leitung unter Verwendung einer lufttreibenden Kraft verhindert werden, die durch das Zuführen eines Gases von einem Aufgussapparat erzeugt wird, der in der Mitte der Leitung angeordnet ist, und durch das Variieren des Druckes an der Oberfläche der Membrane durch Strömen von Gasblasen um die zellabscheidende Membrane herum. Auf diese Weise kann das Verstopfen der Membrane verhindert werden. Die Gasblasen, die vom Aufgussapparat in den unteren Teil des Fermentors zugeführt werden, führen Sauerstoff zu, der für die Zellbildung benötigt wird, und erzeugen gleichzeitig eine Strömung der Brühe, um so die Sedimention der Zellen im Fermentor zu verhindern. Auf diese Art und Weise kann in der Brühe eine Strömung durch die Verwendung der lufttreibenden Kraft erzeugt werden, ohne Applikation von irgendwelchen Scherkräften. Deshalb werden die Zellen nie beschädigt werden. Es ist eine spezielle Eigenschaft der Zellen, dass sie eine schlechte Resistenz gegen Scherkräfte aufweisen, wie beispielsweise die tierischen Zellen. Furthermore, cell sticking to the surface of the membrane can be prevented by circulating the broth within the conduit using an air blowing force generated by supplying a gas from an infusion apparatus located in the center of the conduit and through varying the pressure on the surface of the membrane by flowing gas bubbles around the cell-separating membrane. This prevents the membrane from clogging. The gas bubbles, which are fed from the infusion apparatus into the lower part of the fermenter, supply oxygen, which is required for cell formation, and at the same time generate a flow of the broth, in order to prevent sedimentation of the cells in the fermentor. In this way, a flow can be generated in the broth through the use of the air driving force, without application of any shear forces. Therefore the cells will never be damaged. It is a special property of cells that they have poor resistance to shear forces, such as animal cells.

Nun wird eine weitere Ausführung gemäss der vorliegenden Erfindung unter Bezug auf Fig. 4 beschrieben. Another embodiment according to the present invention will now be described with reference to FIG. 4.

In Fig. 4 weisen diejenigen Teile die gleichen Referenzzahlen auf, die analogen Teile in Fig. 3 entsprechen und die mit diesen übereinstimmen und deshalb nicht noch einmal beschrieben werden. In FIG. 4, those parts have the same reference numbers which correspond to analog parts in FIG. 3 and which correspond to them and are therefore not described again.

In dieser Vorrichtung wird Luft durch Öffnen eines Ventils 19 zugeführt, um so eine treibende Kraft zur Zirkulation der Brühe im Fermentor 11 und dem Zellabscheider 15 zu erzeugen. Verknappung in der Luftzufuhr wird durch Öffnen eines Ventils 18 kompensiert. Im Falle von Perfusionsbildung wird die Brühe exklusiv durch eine Zellabscheidungsmem-brane 32 durch Öffnen eines Ventils 21 filtriert. Wenn die Brühe im Fermentor 11 durch Filtrieren auf eine bestimmte Menge erniedrigt wird, wird das Ventil 21 geschlossen und das Ventil 28 geöffnet, um dadurch das Medium während der Umkehrreinigung der Membrane 32 zuzuführen. Wenn die Brühe im Fermentor auf ein bestimmtes Niveau erhöht wird, wird auf der anderen Seite das Ventil 28 geschlossen und das Ventil 21 geöffnet, gefolgt durch die oben erwähnte Fiitrierung. Die Niveauänderung der In this device, air is supplied by opening a valve 19 so as to generate a driving force for the circulation of the broth in the fermenter 11 and the cell separator 15. Shortages in the air supply are compensated for by opening a valve 18. In the case of perfusion formation, the broth is exclusively filtered through a cell separation membrane 32 by opening a valve 21. When the broth in the fermentor 11 is reduced to a certain amount by filtration, the valve 21 is closed and the valve 28 is opened, thereby supplying the medium to the membrane 32 during the reverse cleaning. On the other hand, when the broth in the fermentor is raised to a certain level, the valve 28 is closed and the valve 21 is opened, followed by the above-mentioned filtering. The level change of

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Brühe im Fermentor wird durch einen Niveausensor gesteuert. Die Filtration der Brühe und die Zuführung des Mediums werden unter Verwendung von einer Pumpe ausgeführt. Broth in the fermentor is controlled by a level sensor. The filtration of the broth and the feeding of the medium are carried out using a pump.

Wenn die oben erwähnte Perfusionsbildung für eine längere Zeit betrieben wird, wird die zellabscheidende Membrane 32 verstopft. In diesem Fall kann die Perfusionsbildung ohne Beendigung mittels den nachfolgenden beiden Methoden weitergeführt werden. If the above-mentioned perfusion formation is operated for a long time, the cell-separating membrane 32 becomes blocked. In this case, perfusion formation can be continued without termination using the following two methods.

Die erste Methode dafür umfasst das Entfernen der verstopften Bestandteile unter Verwendung von Dampf, um so die Membrane zu regenerieren. Diese Behandlung kann auf die folgende Art und Weise durchgeführt werden. Zunächst wird Luft zugeführt, währenddem das Ventil 19 geschlossen ist, und die Brühe im Zellabscheider 15 wird in den Fermentor 11 über die Leitung 14 zugeführt. Anschliessend werden die Ventile 19, 21, 28, 29 und 30 geschlossen, währenddem die Ventile 33 und 34 geöffnet werden und der Zellabscheider 15 wird durch das Hindurchführen von Kühlwasser durch die Hülle abgekühlt. Wenn die Temperatur im Zellabscheider bis auf ein bestimmtes Niveau erniedrigt worden ist, fällt der Druck in besagtem Zellabscheider, so dass ein Vakuum entsteht. Das Medium wird dann durch Öffnen des Ventils 28 zugeführt und der Druckunterschied zwischen der Aussenseite und dem Inneren des Zellabscheiders wird auf Null ausgeglichen. Als nächstes wird das Ventil 28 geschlossen, während diejenigen bei 21,29 und 30 geöffnet werden und die oben erwähnte Perfusionsbildung wird weitergeführt. The first method of doing this involves removing the clogged components using steam to regenerate the membrane. This treatment can be carried out in the following way. First, air is supplied while the valve 19 is closed, and the broth in the cell separator 15 is supplied to the fermentor 11 via the line 14. The valves 19, 21, 28, 29 and 30 are then closed, while the valves 33 and 34 are opened, and the cell separator 15 is cooled by passing cooling water through the casing. When the temperature in the cell separator has been reduced to a certain level, the pressure in said cell separator drops, so that a vacuum is created. The medium is then supplied by opening the valve 28 and the pressure difference between the outside and the inside of the cell separator is equalized to zero. Next, valve 28 is closed while those at 21, 29 and 30 are opened and the above-mentioned perfusion formation continues.

Die zweite Methode dafür umfasst das Ersetzen der zellabscheidenden Membrane 32. In diesem Fall wird die Brühe im Zellabscheider 15 hin zum Fermentor 11 ähnlich der ersten Methode zugeführt. Dann wird die zellabscheidende Membrane 32 ersetzt, währenddem die Ventile 29, 13 und 19 geschlossen sind. Nach Beendigung des Ersatzes wird Dampf für Sterilisation hindurchgeführt, ähnlich der Methode 1, und das Medium wird zugespiesen, um so die ursprüngliche Perfusionsbildung weiterzuführen. In der vorliegenden Erfindung werden folglich die Zellen und die Brühe vom Fermentor zum Zellabscheider während der Abscheidung der kultivierten Zellen zugeführt. Wenn Umkehrreinigung (Regeneration) im grossen Massstab durchzuführen ist, kann das Zuführen der Brühe, beinhaltend die Zellen, durch Schliessen der Ventile unterbrochen werden. Dann wird das Ablaufventil des Zellabscheiders geöffnet und Dampf durch die Hohlfasermembrane in umgekehrter Richtung zu derjenigen während der Zellabscheidung hinduchgeführt. Dadurch wird der besagte Druck direkt auf die Innenseite der Hohlfaser appliziert, um so die Umkehrreinigung (Regeneration) in grossem Massstab durchzuführen. Wenn die Brühe Materialien enthält, wie Proteine, die thermisch denaturiert würden und sich dadurch eine grosse Menge von abgeschiedenen Stoffen bei einer hohen Konzentration bilden würde, ist es wirkungsvoller, die Innenseite des Zellabscheiders oder des Membrans beispielsweise mit Wasser vor der Umkehrreinigung auszuwaschen. Nach Beendigung der Umkehrreinigung wird das The second method for this involves replacing the cell-separating membrane 32. In this case, the broth in the cell separator 15 is fed towards the fermentor 11 similar to the first method. Then the cell separating membrane 32 is replaced while the valves 29, 13 and 19 are closed. When replacement is complete, steam is passed through for sterilization, similar to Method 1, and the medium is added to continue the original perfusion. Accordingly, in the present invention, the cells and broth are supplied from the fermentor to the cell separator during the separation of the cultivated cells. If reverse cleaning (regeneration) is to be carried out on a large scale, the supply of the broth, including the cells, can be interrupted by closing the valves. Then the drain valve of the cell separator is opened and steam is passed through the hollow fiber membrane in the opposite direction to that during the cell separation. As a result, the said pressure is applied directly to the inside of the hollow fiber in order to carry out the reverse cleaning (regeneration) on a large scale. If the broth contains materials, such as proteins, that would be thermally denatured and thereby form a large amount of deposited substances at a high concentration, it is more effective to wash the inside of the cell separator or membrane, for example with water, before the reverse cleaning. After the reverse cleaning is finished, it will

Ablaufventil geschlossen, gefolgt von einer Sterilisation. Dann wird die Zufuhr von Hochdruckdampf beendet, währenddem die Temperatur bei hohem Niveau gehalten wird. Nachdem der Zellabscheider abgekühlt ist, wird frisches Medium zur Hohlfaser zugeführt, in welcher der Druck reduziert worden ist, gefolgt vom Abscheiden der Zellen. Drain valve closed, followed by sterilization. Then the supply of high pressure steam is stopped while the temperature is kept at a high level. After the cell separator has cooled, fresh medium is fed to the hollow fiber in which the pressure has been reduced, followed by separating the cells.

Wenn die Zellabscheidemembrane nicht mehr weiter brauchbar ist, wird das Zuführen der Brühe, beinhaltend die Zellen, in derselben Art und Weise, wie oben beschrieben, unterbrochen, und der Zellabscheider, beinhaltend die Zellabscheidemembrane, wird ersetzt. Die Sterilisation wird in derselben Art und Weise durchgeführt, wie oben dargestellt, und ein frisches Medium wird hinzufördert, gefolgt wiederum vom Abscheiden der Zellen. When the cell separation membrane is no longer usable, the supply of the broth containing the cells is stopped in the same manner as described above and the cell separator including the cell separation membrane is replaced. The sterilization is carried out in the same manner as shown above, and a fresh medium is added, again followed by the separation of the cells.

Obwohl Verschlammen und Verstopfen der Membrane bei solcher Perfusionsbildung nicht verhinderbar ist, ist es möglich, die Zellbildung für eine verlängerte Zeitperiode durch Regeneration oder Ersetzen der Membrane, wie oben beschrieben, durchzuführen. Weiter ist zu erwarten, dass die Produktivität der Zielsubstanz dadurch erhöht werden kann. Although silting and clogging of the membrane cannot be prevented with such perfusion formation, it is possible to carry out the cell formation for an extended period of time by regeneration or replacement of the membrane as described above. It is also expected that the productivity of the target substance can be increased.

Gemäss der vorliegenden Erfindung können nützliche Substanzen und Abfallprodukte von Mediumkomponenten, durch vorgängiges Einstellen der Fraktioniermolekulargewichte von einem Membran für das Abtrennen einer Zell-freien Brühe kleiner oder grösser als diejenigen der nützlichen Substanzen (Zellmetaboliten) oder Abfallprodukte, entfernt werden. Weiter ermöglicht das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung, Albumin zurück zu einem Fermentor zu rezyklisieren, das eine teure Serumkomponente ist, um damit die Betriebskosten zu senken. According to the present invention, useful substances and waste products of medium components can be removed by setting the fractionation molecular weights of a membrane for separating a cell-free broth beforehand to be smaller or larger than those of the useful substances (cell metabolites) or waste products. Furthermore, the method according to the present invention makes it possible to recycle albumin back to a fermentor, which is an expensive serum component, in order to lower the operating costs.

Nun werden die Wirkungen eines Fermentors beschrieben, in welchem eine Brühe durch Gebrauch einer Druckluftkraft gerührt wird. Da ein Zellabscheider ausserhalb des Fermentors angeordnet ist, ist es nicht notwendig, den Fermentor beim Ersetzen des Zellabscheiders zu öffnen. Es ist daher möglich, den Zellabscheider während dem Weiterführen der Zellbildung zu ersetzen. Im weiteren kann die Ersatzprozedur einfach ausgeführt werden und damit kann sowohl eine hohe Produktivität wie auch eine gute Wartung, wie auch Betriebsdurchführung erreicht werden. Ähnlich kann eine Zellabscheidemembrane ersetzt werden, ohne Beenden (Unterbrechen) der Zellbildung, wodurch verlängerte Zellbildung möglich wird. The effects of a fermenter in which a broth is stirred by using a compressed air force will now be described. Since a cell separator is arranged outside the fermenter, it is not necessary to open the fermenter when replacing the cell separator. It is therefore possible to replace the cell separator while cell formation continues. In addition, the replacement procedure can be carried out simply and thus high productivity as well as good maintenance and operation can be achieved. Similarly, a cell separation membrane can be replaced without stopping (interrupting) cell formation, thereby allowing prolonged cell formation.

Da die Brühe unter Verwendung einer Treibkraft, erzeugt durch das Zuführen eines Gases von einem Aufgussapparat, gerührt wird, ohne die Verwendung einer Rührvorrichtung, werden die Zellen niemals durch den Rühreffekt beschädigt, was weiter die Produktivität erhöht. Since the broth is stirred using a driving force generated by supplying gas from an infusion apparatus without using a stirrer, the cells are never damaged by the stirring effect, which further increases productivity.

Claims

1. A method for cell formation in which cells are cultured in a broth, characterized by: A) a step in which the cells are separated from the broth and then those

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deposited cells are returned to a fermentor (2.11); and B) a step in which one or more medium components, one or more useful substances generated by the cells and one or more waste products are separated from the broth from which the cells have been removed, and at least part of the medium component (n) is returned to the fermentor (2, 11).

2. The method for cell formation according to claim 1, characterized in that the molecular weight of said useful substance or substances is smaller than that of said medium component.

3. A method for cell formation according to claim 1, characterized in that said cells are separated from said broth using a hydrophobic membrane (32).

4. The method for cell formation according to claim 1, characterized in that the one or more useful substances and media component (s) are further separated into the media components and useful substances with a molecular weight greater than that of at least one of the media component (s) .

5. A method for cell formation according to claim 4, characterized in that said cells are separated from said broth using a hydrophobic membrane (32).

6. A method for cell formation according to one of claims 1 to 4, characterized in that a gas is fed in the middle of a passage (14) which is arranged outside of said fermenter (11) and which is intended to separate the broth between to circulate the upper part (12) and the lower part (13) of the fermenter (11), thereby generating a circulation driving force, mixing the contents of the fermenter, and cultivating.

7. A method for cell formation according to any one of claims 1 to 4, characterized in that a cell separator (3, 15) with a cell separation membrane (32) is used in the separation of said cells from said broth and that reverse cleaning and replacement of said cell separation membrane is carried out during cell formation.

8. A method for cell formation according to claim 1, characterized by circulation of a broth within a circulation passage (14) which is arranged outside a fermenter (11) between the upper part of the fermenter and the lower part thereof, so as to carry out stirring and cultivation, and by supplying a gas in the middle of said passageway located outside of said fermenter so as to produce a circulating flow force, thereby stirring and cultivating, whereby the cells are separated from the broth within the circulating passageway at the lower part of said.

9. The method for cell formation according to claim 8, characterized in that a cell separator (15) consisting of a hydrophobic hollow fiber membrane (32) is used for separating the cells from the broth; the hollow fiber membrane is sterilized with steam in said cell separator; and the inside of the cell separator is cooled after maintaining the high temperature during the sterilization and the medium is conveyed inside the cell separator using the vacuum negative pressure.

10. A cell formation apparatus for performing the method of claim 1, comprising means (3, 15) for separating the cells from the broth and returning the cells thus separated back to a fermentor (2, 11) and separation means (5, 24) for dividing said broth, characterized in that the separating means comprise means for separating said broth, from which the cells have been separated, into one or more medium components, one or more useful substances produced by the Cells, and one or more waste products; and means for returning at least a portion of said medium components back to the fermentor.

11. A cell formation apparatus for performing the method of claim 1, comprising means (3, 15) for separating cells in the broth and returning the cells thus separated back to a fermentor (2, 11) and separating means (5, 24) for dividing said broth, characterized in that the separating means comprise means for dividing said broth, from which the cells have been separated, into waste products, high molecular weight useful substances and one or more medium components; Means for further dividing the high molecular weight useful substances and medium components into medium components and useful substances with a molecular weight which is greater than that of at least one of the medium components; and means for returning at least one of the medium components back to said fermentor.

12. Device for cell formation according to one of claims 10 or 11, characterized by connecting openings (12, 13) which are interconnected by a line (14) which is provided outside a fermenter (11), the openings at the top and lower parts of the fermenter are arranged, an outlet (12) and an inlet (13) being respectively provided in the upper and lower parts of the fermenter (11) as said connection openings; and an infusion apparatus (16) for supplying a gas and a cell separator (15) for separating the cells from the broth, provided in the middle of said line (14).

13. The cell formation device according to claim 12, characterized in that said cell separator (15) is provided with valves on the front and rear thereof so that said cell separator is removable, and with a steam pipeline and a hydrophobic hollow fiber membrane (32) used as a cell separation membrane to form said cell separator.

14. Device for cell formation according to claim

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15. Device for cell formation according to one of claims 10 or 11, characterized in that a cell separator is arranged below the fermenter; an infusion apparatus is located at the top of said cell separator; that the connection opening, arranged in the upper part of said fermenter, is connected to the lower part of the cell separator via a line, and that the connection opening in the lower part of the fermenter is connected to the upper part of the cell separator.

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12, characterized in that said cell separator (15) comprises a hydrophobic hollow fiber membrane (32) as a cell separation membrane.