CN102639722A - 糖液的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供以含纤维素的生物质为原料来制造糖液的方法，通过下述糖液的制造方法来制造发酵抑制物的量极少的糖液，所述制造方法包括下述工序：工序(1)，将含纤维素的生物质进行水解来制造糖水溶液；工序(2)，将所得的糖水溶液通过纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤，由非透过侧回收纯化糖液，由透过侧除去发酵抑制物的工序。

Description

糖液的制造方法
技术领域
本发明涉及由含纤维素的生物质制造糖液的方法。
背景技术
以糖为原料的化学品发酵生产工艺被用于各种工业原料生产中。作为该成为发酵原料的糖，现在工业上使用来源于甘蔗、淀粉、甜菜等食用原料的糖，但是从今后世界人口增加引起食用原料价格暴涨、或与食用竞争这样的伦理方面出发，构建由可再生的非食用资源、即含纤维素的生物质来有效地制造糖液的工艺，或者以所得的糖液为发酵原料有效地转换成工业原料的工艺成为今后的课题。
在由含纤维素的生物质制造糖液的方法中，作为使用硫酸的糖液的制造方法，公开了使用浓硫酸将纤维素和半纤维素进行酸水解来制造糖液的方法(专利文献1或2)；通过将含纤维素的生物质用稀硫酸进行水解处理之后再用纤维素酶等进行酶处理来制造糖液的方法(非专利文献1)。
此外，作为不使用酸的方法，公开了使用250～500℃左右的亚临界水将含纤维素的生物质进行水解来制造糖液的方法(专利文献3)；通过在对含纤维素的生物质进行亚临界水处理之后再进行酶处理来制造糖液的方法(专利文献4)；以及通过在将含纤维素的生物质用240～280℃的加压热水进行水解处理之后再进行酶处理来制造糖液的方法(专利文献5)。
然而，在含纤维素的生物质的水解中存在如下问题：在纤维素或半纤维素成分等分解的同时，生成的葡萄糖、木糖等糖也进行分解反应，从而还生成了糠醛、羟甲基糠醛等呋喃化合物、或甲酸、乙酸、乙酰丙酸等有机酸这样的副产物。此外，由于含纤维素的生物质包含作为芳香族聚合物的木质素成分，因此在酸处理工序中，木质素成分被分解，同时作为副产物生成了低分子量酚类等芳香族化合物。这些化合物在利用微生物的发酵工序中具有阻碍作用，引起微生物的增殖抑制，使发酵产物的收率降低，因此也被称为发酵抑制物，在利用含纤维素的生物质糖液作为发酵原料时是大问题。
作为在糖液制造过程中除去这样的发酵抑制物的方法，公开了称为过碱化(overliming)的方法(非专利文献2)。在该方法中，在对酸处理后的纤维素或糖化液添加石灰进行中和的工序中，通过加热到60℃左右并保持一定时间，从而将糠醛、HMF等发酵抑制物与石膏成分一起除去。然而，在过碱化中，存在甲酸、乙酸、乙酰丙酸等有机酸的除去效果低等问题。
此外，作为除去发酵抑制物的其它方法，公开了通过在由含纤维素的生物质形成的糖液中吹入水蒸气来蒸发除去发酵抑制物的方法(专利文献6)。然而，在这样的蒸发除去方法中存在如下问题：要依赖于发酵抑制物的沸点，特别是沸点低的有机酸等发酵抑制物的除去效率低，为了获得充分的除去效率，必须提供大量的能量。
此外，也有通过离子交换来除去发酵抑制物的方法(专利文献7)，但存在成本问题。此外，也有使用木质类碳化物、即活性炭等进行吸附除去的方法，但存在除去对象限于疏水性化合物这样的课题(专利文献8)。
专利文献1：日本特表平11-506934号公报
专利文献2：日本特开2005-229821号公报
专利文献3：日本特开2003-212888号公报
专利文献4：日本特开2001-95597号公报
专利文献5：日本特许3041380号公报
专利文献6：日本特开2004-187650号公报
专利文献7：日本特表2001-511418号公报
专利文献8：日本特开2005-270056号公报
非专利文献1：A.Aden等，“Lignocellulosic Biomass to EthanolProcess Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute AcidPrehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover”NRELTechnical Report(2002)
非专利文献2：M.Alfred等，“Effect of pH，time and temperature ofoverliming on detoxification of dilute-acid hydrolyzates for fermentationby Saccaromyces cerevisiase”Process Biochemistry，38，515-522(2002)
发明内容
发明所要解决的课题
在本发明中，提供解决上述课题的方法，即在糖液制造的工序中除去在由含纤维素的生物质制造糖的工序中生成的发酵抑制物的方法，还提供发酵抑制物量极少的纯化糖液的制造方法。
用于解决课题的方法
本发明者们对上述课题进行了深入研究，结果发现，在由含纤维素的生物质制造糖的工序中，通过将糖液通过纳滤膜和/或反渗透膜，可以分离除去作为发酵原料的糖和发酵抑制物。即，本发明具有以下的[1]～[14]的构成。
[1].一种糖液的制造方法，是以含纤维素的生物质为原料来制造糖液的方法，该方法包括下述工序：
工序(1)，将含纤维素的生物质进行水解来制造糖水溶液；
工序(2)，将所得的糖水溶液通过纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤，由非透过侧回收纯化糖液，由透过侧除去发酵抑制物。
[2].根据[1]所述的糖液的制造方法，其中，将所述工序(2)的糖水溶液的pH值调整为1～5。
[3].根据[1]或[2]所述的糖液的制造方法，其中，所述发酵抑制物包含选自有机酸、呋喃类化合物和酚类化合物中的1种或2种以上。
[4].根据[3]所述的糖液的制造方法，其中，所述有机酸是甲酸或乙酸。
[5].根据[3]所述的糖液的制造方法，其中，所述呋喃类化合物是羟甲基糠醛或糠醛。
[6].根据[3]所述的糖液的制造方法，其中，所述酚类化合物是香草醛、乙酰香草醛或丁香酸。
[7].根据[1]～[6]的任一项所述的糖液的制造方法，其中，所述工序(2)的纯化糖液是以单糖为主成分的糖液。
[8].根据[1]～[7]的任一项所述的糖液的制造方法，其中，在所述工序(2)的处理之前，将所述工序(1)所获得的糖水溶液通过精滤膜和/或超滤膜来除去微粒和高分子成分。
[9].根据[1]～[8]的任一项所述的糖液的制造方法，其中，将所述工序(2)的糖水溶液的温度调整为1～15℃，且用纳滤膜进行过滤。
[10].根据[1]～[8]的任一项所述的糖液的制造方法，其中，将所述工序(2)的糖水溶液的温度调整为40～80℃，且用反渗透膜进行过滤。
[11].根据[1]～[10]的任一项所述的糖液的制造方法，其中，所述工序(2)是将糖水溶液通过纳滤膜进行过滤，再将所得的滤液通过反渗透膜进行过滤的工序。
[12].根据[1]～[11]的任一项所述的糖液的制造方法，其中，所述工序(2)的纳滤膜和/或反渗透膜的功能层是聚酰胺。
[13].根据[1]～[12]的任一项所述的糖液的制造方法，其特征在于，所述工序(2)的纳滤膜的功能层以交联哌嗪聚酰胺为主成分，并且含有化学式1所示的构成成分，
Figure BDA0000067135400000041
化学式1
式中，R表示-H或-CH3，n表示0～3的整数。
[14].一种化学品的制造方法，其中，使用通过[1]～[13]的任一项所述的糖液的制造方法获得的糖液作为发酵原料。
发明的效果
根据本发明，能够从来源于含纤维素的生物质的糖水溶液中完全地除去作为发酵抑制物的糠醛、HMF等呋喃化合物、乙酸、甲酸、乙酰丙酸等有机酸、香草醛等酚类化合物，另一方面，可以高纯度、高收率地制造葡萄糖、木糖等糖。其结果是，通过使用本发明所获得的纯化糖液作为发酵原料，可以提高各种化学品的发酵生产的效率。
附图说明
图1显示纳滤膜/反渗透膜的过滤装置的概略。
图2显示平膜试验中使用的不锈钢制的元件的示意图。
图3是用纳滤膜过滤糖液时不同pH值下的通量的比较图。
图4是用纳滤膜过滤糖液之前通过精滤膜或处理的方法得到的通量的比较图。
图5是用精滤膜过滤水热处理液时过滤前后膜表面的扫描型电子显微镜的拍摄照片。
图6是在观察图5的扫描电子显微镜照片的过程中用附带的能量分散型X射线分析装置测定元素分布得到的结果。
图7是显示酵母用表达载体pTRS11的物理图谱的图。
具体实施方式
以下，更详细地说明本发明。
作为本发明的糖液的制造方法中使用的含纤维素的生物质，可列举蔗渣、柳枝稷、玉米秸秆、稻秸、麦秸等草本类生物质、以及树木、废建材等木质类生物质等。这些含纤维素的生物质中含有作为由糖脱水缩合而得的多糖的纤维素或半纤维素，能够通过将这样的多糖进行水解来制造可用作发酵原料的糖液。
本发明的糖液是指通过含纤维素的生物质的水解而获得的糖水溶液。一般来说，糖是根据单糖的聚合度来分类的，分成葡萄糖、木糖等单糖类、由2～9个单糖脱水缩合而成的寡糖类、以及由10个以上单糖脱水缩合而成的多糖类。本发明的糖液是指包含单糖作为主成分的糖液，具体而言，包含葡萄糖或木糖作为主成分。此外，还包含少量的纤维二糖等寡糖、以及阿拉伯糖、甘露糖等单糖。此处所说的主成分为单糖，是指溶解在水中的单糖、寡糖、多糖的糖类中的总重量的80重量％以上为单糖。具体而言，作为溶解于水中的单糖、寡糖、多糖的分析方法，可以用HPLC通过与标准品进行比较来定量。具体的HPLC条件是，没有反应液，柱使用Luna NH2(Phenomenex社制)，流动相为超纯水∶乙腈＝25∶75，流速为0.6mL/分钟，测定时间为45分钟，检测方法为RI(示差折射率)，温度为30℃。
接下来，对本发明的糖液的制造方法中的工序(1)、即将含纤维素的生物质进行水解的工序进行说明。
当将含纤维素的生物质进行水解时，可以直接使用含纤维素的生物质，也可以实施蒸煮、微粉碎、炸碎等公知的处理，通过这样的处理可以提高水解效率。
对含纤维素的生物质的水解工序没有特别限制，具体地主要列举下述6种方法：处理法A：仅使用酸的方法；处理法B：在酸处理后再使用酶的方法；处理法C：仅使用水热处理的方法；处理法D：在水热处理后再使用酶的方法；处理法E：在碱处理后再使用酶的方法；处理法F：在氨处理后再使用酶的方法。
在处理法A中，在含纤维素的生物质的水解中使用酸。关于所使用的酸，可列举硫酸、硝酸、盐酸等，优选使用硫酸。
关于酸的浓度，没有特别的限制，可以使用0.1～99重量％的酸。在酸的浓度为0.1～15重量％、优选为0.5～5重量％的情况下，反应温度在100～300℃、优选为120～250℃的范围内设定，反应时间在1秒～60分钟的范围内设定。对处理次数没有特别限定，只要将上述处理进行1次以上即可。特别地在将上述处理进行2次以上的情况下，第1次与第2次以后的处理可以在不同条件下进行。
此外，在酸的浓度为15～95重量％、优选为60～90重量％的情况下，反应温度在10～100℃的范围内设定，反应时间在1秒～60分钟的范围内设定。
对上述酸处理的次数没有特别限定，只要将上述处理进行1次以上即可。特别地在将上述处理进行2次以上的情况下，第1次与第2次以后的处理可以在不同条件下进行。
由于通过酸处理而获得的水解物包含硫酸等酸，因此为了作为发酵原料使用而需要进行中和。中和可以对通过固液分离从水解物中除去了固体成分的酸水溶液进行，也可以在包含固体成分的状态下直接进行。对中和所使用的碱试剂没有特别限制，优选为一元碱试剂。如果酸、碱成分都为二元以上的盐，则在进行工序(2)时有时不能透过纳滤膜，而且在液体被浓缩的过程中液体中会析出盐，从而导致膜污染。
在使用一元碱的情况下，可列举氨、氢氧化钠、氢氧化钾等，没有特别限定。
在使用二元以上的碱试剂的情况下，为了在工序(2)中不析出盐，需要减少酸、碱量，或在工序(2)中设置除去析出物的机构。在使用二元以上的碱的情况下，从成本方面出发，优选使用氢氧化钙。在使用氢氧化钙的情况下，中和会生成石膏成分，因此需要通过固液分离来除去石膏。作为固液分离的方法，有离心分离法、膜分离法，没有特别限定，可以设置多种分离工序进行除去。
使用酸的水解具有下述特征：一般从结晶性低的半纤维素成分开始发生水解，接着是结晶性高的纤维素成分被分解。因此，使用酸可以获得含有大量来源于半纤维素的木糖的液体。此外，在酸处理中，可以进一步通过将上述处理后的生物质固体成分在比上述处理更加高压、高温的条件下进行反应，从而进一步将结晶性高的纤维素成分分解而获得含有大量来源于纤维素的葡萄糖的液体。可以通过设定进行水解的2阶段工序来设定适合半纤维素、纤维素的水解条件，从而可以提高分解效率和糖收率。此外，通过将在第1分解条件下获得的糖液与在第2分解条件下获得的糖液进行分离，从而可以制造水解物中包含的单糖成分比率不同的2种糖液。即，也可以按照在第1分解条件下获得的糖液以木糖为主成分、在第2分解条件下获得的糖液以葡萄糖为主成分的方式进行分离。通过这样地将糖液中包含的单糖成分进行分离，也可以分成使用糖液中的木糖作为发酵原料的发酵和使用葡萄糖作为发酵原料的发酵，可以选择各发酵中使用的最适微生物种类来使用。另外，通过长时间用酸进行高压高温处理，可以在不分离半纤维素成分、纤维素成分的情况下一次获得来源于两成分的糖。
在处理法B中，再用酶对处理法A中获得的处理液进行处理，将含纤维素的生物质进行水解。处理法B中使用的酸的浓度优选为0.1～15重量％，更优选为0.5～5重量％。反应温度可以在100～300℃的范围内设定，优选设定在120～250℃。反应时间可以在1秒～60分钟的范围内设定。对处理次数没有特别限定，只要将上述处理进行1次以上即可。特别地在将上述处理进行2次以上的情况下，第1次与第2次以后的处理可以在不同条件下进行。
通过酸处理而获得的水解物包含硫酸等酸，为了进一步用酶进行水解反应、或为了作为发酵原料使用，需要进行中和。中和可以与处理法A中的中和同样地进行。
作为上述酶，只要是具有纤维素分解活性的酶即可，可以使用一般的纤维素酶，优选具有结晶性纤维素分解活性的外切型纤维素酶、或包含内切型纤维素酶的纤维素酶。作为这样的纤维素酶，优选木霉属细菌产生的纤维素酶。木霉属细菌是归类于丝状菌的微生物，是向细胞外大量分泌多种纤维素酶的微生物。在本发明中使用的纤维素酶优选为来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶。此外，作为水解中使用的酶，为了提高葡萄糖的生成效率，还可以添加作为纤维二糖分解酶的β-葡糖苷酶，将其与上述纤维素酶一并用于水解。作为β-葡糖苷酶，没有特别的限制，优选来源于曲霉属的β-葡糖苷酶。使用了这样的酶的水解反应优选在pH值为3～7左右进行，更优选在pH值5左右进行。反应温度优选为40～70℃。此外，优选在利用酶的水解结束时进行固液分离来除去未分解的固体成分。作为固体成分的除去方法，有离心分离法、膜分离法等，没有特别的限制。此外，可以组合使用多种这样的固液分离方法。
在酸处理后再用酶来水解含纤维素的生物质的情况下，优选在第1水解中通过酸处理来水解结晶性低的半纤维素，接着作为第2水解通过使用酶来水解结晶性高的纤维素。通过在第2水解中使用酶，可以更有效地进行含纤维素的生物质的水解工序。具体而言，在利用酸的第1水解中，主要发生含纤维素的生物质中包含的半纤维素成分的水解和木质素的部分分解，将其水解物分离成酸溶液和含纤维素的固体成分，通过对含纤维素的固体成分添加酶来进行水解。由于分离、回收而得的稀硫酸溶液中包含作为戊糖的木糖作为主成分，因此可以对酸溶液进行中和来分离出糖水溶液。此外，可以由含纤维素的固体成分的水解反应产物来获得以葡萄糖为主成分的单糖成分。另外，还可以将通过中和而得的糖水溶液与固体成分混合，向其中添加酶进行水解。
在处理法C中，不特别地添加酸，添加水使得含纤维素的生物质为0.1～50重量％，然后在100～400℃的温度下处理1秒～60分钟。通过在这样的温度条件下进行处理来使纤维素和半纤维素水解。对处理次数没有特别限定，只要将该处理进行1次以上即可。特别地在将该处理进行2次以上的情况下，第1次与第2次以后的处理可以在不同条件下进行。
使用水热处理的水解具有下述特征：一般从结晶性低的半纤维素成分开始发生水解，接着是结晶性高的纤维素成分被分解。因此，可以使用水热处理来获得含有大量的来源于半纤维素的木糖的液体。此外，在水热处理中，还可以通过将上述处理后的生物质固体成分在比上述处理更高压、高温的条件下进行反应，从而进一步将结晶性高的纤维素成分分解而获得含有大量的来源于纤维素的葡萄糖的液体。可以通过设定进行水解的2阶段工序来设定适合半纤维素、纤维素的水解条件，从而能够提高分解效率和糖收率。此外，通过将在第1分解条件下获得的糖液和在第2分解条件下获得的糖液进行分离，可以制造水解物中包含的单糖成分比率不同的2种糖液。即，也可以按照在第1分解条件下获得的糖液以木糖为主成分、在第2分解条件下获得的糖液以葡萄糖为主成分的方式进行分离。通过这样地将糖液中包含的单糖成分进行分离，也可以分成使用糖液中的木糖作为发酵原料的发酵和使用葡萄糖作为发酵原料的发酵，可以选择使用各发酵中使用的最适微生物种类使用。
在处理法D中，对处理法C所获得的处理液，再利用酶将含纤维素的生物质进行水解。
上述酶使用与处理法B同样的酶。此外，对于酶处理条件，也可采用与处理法B同样的条件。
在水热处理之后使用酶将含纤维素的生物质进行水解的情况下，在第1水解中，通过水热处理进行结晶性低的半纤维素的水解，接着作为第2水解通过使用酶进行结晶性高的纤维素的水解。通过在第2水解中使用酶，可以更有效地进行含纤维素的生物质的水解工序。具体而言，在利用水热处理的第1水解中，主要发生含纤维素的生物质中包含的半纤维素成分的水解和木质素的部分分解，将其水解物分离成水溶液和含纤维素的固体成分，通过对含纤维素的固体成分添加酶来进行水解。在分离、回收得到的水溶液中包含作为戊糖的木糖作为主成分。此外，可以由含纤维素的固体成分的水解反应产物来获得以葡萄糖为主成分的单糖成分。另外，可以将通过水热处理而获得的水溶液与固体成分混合，向其中添加酶进行水解。
在处理法E中，所使用的碱更优选氢氧化钠或氢氧化钙。只要这些碱以浓度为0.1～60重量％的范围添加到含纤维素的生物质中，在100～200℃、优选为110～180℃的温度范围内进行处理即可。对处理次数没有特别限定，只要将上述处理进行1次以上即可。特别地在将上述处理进行2次以上的情况下，第1次与第2次以后的处理可以在不同条件下进行。
由于通过碱处理而获得的处理物包含氢氧化钠等碱，因此为了再利用酶进行水解反应，需要进行中和。中和可以对通过固液分离从水解物中除去了固体成分后的碱水溶液进行，也可以在包含固体成分的状态下直接进行。对中和所使用的酸试剂没有特别的限制，更优选为一元的酸试剂。如果进行工序(2)时酸、碱成分都为二元以上的盐，则不能透过纳滤膜，而且在液体被浓缩的过程中液体中会析出盐，导致膜污染。
在使用一元酸的情况下，可列举硝酸、盐酸等，没有特别限定。
在使用二元以上的酸试剂的情况下，为了在工序(2)中不析出盐，需要减少酸、碱量，或在工序(2)中设置除去析出物的机构。在使用2价以上的酸的情况下，优选为硫酸、磷酸。在使用氢氧化钙的情况下，通过中和而生成石膏成分，因此需要通过固液分离来除去石膏。作为固液分离的方法，有离心分离法、膜分离法，没有特别限定，可以设置多种分离工序进行除去。
上述酶可使用与处理法B同样的酶。此外，对于酶处理条件，也可采用与处理法B同样的条件。
在碱处理后再利用酶将含纤维素的生物质进行水解的情况下，通过与含碱的水溶液混合并加热，来除去半纤维素和纤维素成分周围的木质素成分，使半纤维素成分和纤维素成分形成容易反应的状态，然后利用酶将未通过碱处理中的水热被分解的部分的结晶性低的半纤维素、结晶性高的纤维素进行水解。具体而言，在利用碱的处理中，主要发生含纤维素的生物质中包含的一部分半纤维素成分的水解和木质素的部分分解，将其水解物分离成碱溶液和含纤维素的固体成分，对于含纤维素的固体成分成分，通过调整pH值再添加酶来进行水解。此外，在碱溶液浓度低的情况下，可以不分离固体成分而直接在中和后添加酶进行水解。可以由含纤维素的固体成分的水解反应产物来获得以葡萄糖、木糖为主成分的单糖成分。此外，由于在分离、回收而得的碱溶液中除了木质素以外还包含作为戊糖的木糖作为主成分，因此也可以中和碱溶液而分离出糖水溶液。此外，可以将通过中和而获得的糖水溶液与固体成分混合，向其中添加酶进行水解。
处理法F的氨处理条件依照日本特开2008-161125和日本特开2008-535664。例如，所使用的氨以浓度相对于含纤维素的生物质为0.1～15重量％的范围添加到含纤维素的生物质中，在4～200℃、优选为90～150℃下进行处理。所添加的氨可以为液体状态或气体状态的任一种。此外，添加形态可以是纯氨也可以是氨水溶液的形态。对处理次数没有特别限定，只要将上述处理进行1次以上即可。特别地在将上述处理进行2次以上的情况下，第1次与第2次以后的处理可以在不同条件下进行。
为了将通过氨处理而获得的处理物再利用酶进行水解反应，需要进行氨中和或氨除去。中和可以对通过固液分离从水解物中除去了固体成分后的氨进行，也可以在包含固体成分的状态下直接进行。对中和所使用的酸试剂没有特别的限制。可列举例如盐酸、硝酸、硫酸等，但是考虑到对工艺配管的腐蚀性和不会成为发酵抑制因子，更优选硫酸。氨除去可以通过将氨处理物保持减压状态而使氨挥发成气体状态而除去。此外，除去的氨可以回收再利用。
已知在氨处理后再使用酶的水解中，一般通过氨处理使纤维素的结晶结构发生变化，变成容易进行酶反应的结晶结构。因此，使酶对这样的氨处理后的固体成分作用，从而可以有效地进行水解。上述酶可使用与处理法B同样的酶。此外，关于酶处理条件，也可采用与处理法B同样的条件。
此外，在使用氨水溶液的情况下，在氨处理时，除了氨以外，水成分有时也会获得与处理法C(水热处理)同样的效果，有时会发生半纤维素的水解和/或木质素的分解。在用氨水溶液处理后再用酶将含纤维素的生物质进行水解的情况下，通过与包含氨的水溶液混合并加热，从而除去半纤维素和纤维素成分周围的木质素成分，使半纤维素成分和纤维素成分形成容易反应的状态，然后利用酶将未通过氨处理中的水热被分解的部分的结晶性低的半纤维素、结晶性高的纤维素进行水解。具体而言，在利用氨水溶液的处理中，主要发生含纤维素的生物质中包含的部分半纤维素成分的水解和木质素的部分分解，将其水解物分离成氨水溶液和含纤维素的固体成分，对于含纤维素的固体成分，通过调整pH值再添加酶来进行水解。此外，在氨浓度为接近100％的高浓度的情况下，可以在通过脱气除去大量氨之后，在不分离固体成分的情况下直接在中和后添加酶进行水解。可以由含纤维素的固体成分的水解反应产物来获得以葡萄糖、木糖为主成分的单糖成分。此外，由于分离、回收而得的氨水溶液中除木质素以外还包含作为戊糖的木糖作为主成分，因此也可以对碱溶液进行中和而分离出糖水溶液。此外，可以将通过中和而获得的糖水溶液与固体成分混合，向其中添加酶进行水解。
工序(1)所获得的糖水溶液可通过用如上所述的离心分离法或膜分离法除去固体成分来获得。此时，根据其分离条件、特别是所使用的分离膜不同，有时固体成分的除去不充分而包含微粒。作为这样的微粒的构成成分，可以例示木质素、单宁、二氧化硅、钙、未分解的纤维素等，但是不特别限于这些成分。此外，对微粒的粒径也没有特别的限制。此外，除了微粒以外，还可包含水溶性高分子成分。作为糖水溶液中包含的水溶性高分子，包含大量的寡糖、多糖、单宁，或者在利用了酶的糖水溶液的情况下，包含大量的酶。
由于糖水溶液中包含的微粒或水溶性高分子的存在，在连续运行后述的纳滤膜和/或反渗透膜处理时，虽然能够运行，但是会引起膜污染，因此有时纳滤膜和/或反渗透膜的交换频率会升高。在该情况下，优选在工序(1)的后处理中，将糖水溶液通过能够切实地除去这样的微粒和水溶性高分子的精滤膜和/或超滤膜来除去微粒。作为过滤的方法，有压滤、真空过滤、离心过滤等，没有特别的限制。此外，作为过滤操作，大体上分为恒压过滤、恒流过滤、非恒压非恒流过滤，没有特别的限制。此外，作为过滤操作，为了有效地除去固体成分，可以2次以上使用精滤膜或超滤膜进行多级过滤，而且对此时使用的膜的材料和性状没有特别的限制。
本发明中使用的精滤膜是指平均细孔径为0.01μm～5mm的膜，简称为微孔过滤膜、MF膜等。此外，本发明所使用的超滤膜是指截留分子量为1,000～200,000的膜，简称为超滤膜、UF膜等。此处，超滤膜的孔径过小而难以用电子显微镜等测量膜表面的细孔径，因而以截留分子量这样的值代替平均细孔径作为孔径大小的指标。所谓截留分子量，正如日本膜学会编膜学実験シリ一ズ第III卷人工膜编编辑委元/木村尚史·中尾真一·大矢晴彦·仲川勤(1993共立出版)第92页中的记载的“以溶质的分子量为横轴、以阻挡率为纵轴将数据进行绘图而得的曲线称为截留分子量曲线。并且将阻挡率为90％的分子量称为膜的截留分子量。”那样，作为表示超滤膜的膜性能的指标是本领域技术人员公知的。
作为这些精滤膜或超滤膜的材质，只要可以实现除去上述微粒这样的本发明的目的即可，没有特别的限制，可列举纤维素、纤维素酯、聚砜、聚醚砜、氯化聚乙烯、聚丙烯、聚烯烃、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚1，1-二氟乙烯、聚四氟乙烯等有机材料，或不锈钢等金属，或陶瓷等无机材料。精滤膜或超滤膜的材质只要根据水解物的性状或运行成本来适当选择即可，优选为有机材料，优选为氯化聚乙烯、聚丙烯、聚1，1-二氟乙烯、聚砜、聚醚砜。
此外，特别是通过将工序(1)所获得的糖水溶液用超滤膜进行过滤，可以由非透过侧回收糖化所使用的酶。对回收酶的工序进行说明。使本发明的工序(1)所获得的糖液通过超滤膜，水解中使用的酶的分子量在10,000～100,000的范围内，由于使用具有能够阻挡这些酶的截留分子量的超滤膜，从而可以从非透过侧成分中回收酶。优选通过使用截留分子量为10,000～30,000的范围的超滤膜，可以有效地回收水解所使用的酶。对所使用的超滤膜的形态没有特别限定，可以是平膜、中空丝膜中的任一种。通过将回收的纤维素酶再利用于工序(1)的水解，可以减少酶使用量。在将这样利用超滤膜过滤糖水溶液时，优选预先将糖水溶液通过精滤膜进行处理，除去微粒。
在以上所述的工序(1)之后，作为用精滤膜和/或超滤膜进行处理的工序，可列举例如，处理法α：用精滤膜进行过滤的方法；处理法β：在离心分离处理后，用精滤膜进行过滤的方法；处理法γ：在离心分离处理后，用精滤膜进行过滤，再用超滤膜进行过滤的方法；处理法δ：在用压滤器进行固液分离后，将滤液用超滤膜进行过滤的方法；处理法ε：在用压滤器进行固液分离后，进行精密过滤处理，再将其滤液用超滤膜进行过滤的方法；等等。
关于处理法α，在工序(1)所获得的糖液中例如以未分解物纤维素为代表的固体成分、以来源于高分子的凝胶成分为代表的特别容易堵塞精滤膜表面的物质少的情况下，仅用精滤膜进行固液分离，能够除去附着于未分解的纤维素和/或生物质的、具有数十nm以上粒径的二氧化硅等无机成分。如果不除去这些固体成分，则在工序(2)中通过纳滤膜和/或反渗透膜表面时，会损伤膜表面而引起膜破坏、和/或在短时间内沉积在表面而引起通量降低。
此外，在例如未分解纤维素等固体物质多、仅用精滤膜时通量经时地大幅度降低而不能全部过滤的情况下，通过根据处理法β预先进行离心分离处理再进行精滤膜处理，可以除去附着于未分解的纤维素和/或生物质的、具有数十nm以上粒径的二氧化硅等无机成分。在处理法β中，即使在处理法α中显示的固体成分、凝胶成分少的情况下，也可以通过离心分离处理来预先除去质量比较大的成分，因而具有精滤膜的维护可以较少、降低工艺成本的效果。
此外，通过在处理法β之后设置超滤膜的处理法γ，能够除去用精滤膜无法除去的数十nm以下的无机粒子成分、来源于木质素的水溶性高分子成分(单宁)、虽然通过水解被分解但不能分解到单糖而处于寡糖至多糖水平的分解中途的糖类、以及水解糖时所使用的酶等。无机粒子成分会在后述的工序(2)中损伤膜而引起膜破坏、和/或沉积在膜上而引起通量降低。此外，甚至通常发生凝聚而以数十nm尺寸存在的数nm尺寸以下的极微粒子、簇也有可能进入膜内使其堵塞。同样地，单宁、寡糖、多糖、酶会在膜上凝胶化而沉积、使膜内堵塞。由此，通过再加上超滤膜，从而具有抑制工序(2)中的膜污染而可以使膜的维护成本大幅度降低的效果。此外，在水解时利用酶的工序的情况下，还具有下述优势：可以用超滤膜来回收酶，可以将被超滤膜阻挡的酶送回工序(1)的水解工序进行再利用。
而且，在选择了固液分离工序为压滤、离心过滤、高速离心分离等可以进一步提高固液分离时液体澄清度的方法即处理法δ的情况下，也可以从处理法γ中省略精密过滤工序而直接进行超滤膜工序。
此外还考虑到，在液体的澄清度低、即浊度高的情况下，会引起超滤膜工序的膜污染增大而使超滤膜的维护成本增加，因此结合超滤膜的运行成本，为了防止超滤膜污染，可以通过选择将精滤膜处理加入到超滤膜处理之前的澄清度高的固液分离法即处理法ε，从而设计成精滤膜和超滤膜的合计运行成本低于仅使用超滤膜的处理法δ那样。
接下来，对本发明的糖液的制造方法中的工序(2)进行说明，所述工序(2)是将糖水溶液通过纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤，由非透过侧回收纯化糖液，由透过侧除去发酵抑制物的工序。
本发明的所说的发酵抑制是指，在使用以包含发酵抑制物的含纤维素的生物质为原料的糖液作为发酵原料来制造化学品时，与使用试剂单糖作为发酵原料的情况相比，化学品的生产量、蓄积量或生产速度降低的现象。由于根据糖化液中存在的发酵抑制物的种类和它们的量的不同而微生物受到的抑制程度也不同，另外根据所使用的微生物种类或作为其生产物的化学品的种类不同其抑制程度也不同，因此对这样的发酵抑制的程度在本发明中没有特别限定。
在通过上述含纤维素的生物质的水解处理方法而获得的糖水溶液中，虽然根据处理方法或含纤维素的生物质原料的种类不同而发酵抑制物的量或成分有差异，但是都包含发酵抑制物，都可以将该糖水溶液通过工序(2)的处理方法进行处理来除去发酵抑制物。发酵抑制物是指由含纤维素的生物质水解而生成的化合物，并且是指在以通过本发明的制造方法而获得的糖液为原料的发酵工序中具有如上所述的抑制作用的物质，特别是指在含纤维素的生物质的酸处理工序中生成的物质，大体上分为有机酸、呋喃类化合物、酚类化合物。
作为有机酸，可列举乙酸、甲酸、乙酰丙酸等作为具体例。作为呋喃类化合物，可列举糠醛、羟甲基糠醛(HMF)等。这样的有机酸或呋喃类化合物是作为单糖的葡萄糖或木糖的分解产物。
此外，作为酚类化合物，可列举香草醛、乙酰香草醛、香草酸、丁香酸、没食子酸、松柏醛、二氢松柏醇、氢醌、儿茶酚、乙酰愈创木酮、高香草酸、4-羟基苯甲酸、4-羟基-3-甲氧基苯基衍生物(海伯特酮(Hibbert’sketones))等作为具体例，这些化合物来源于木质素或木质素前体。
此外，在使用废建材或胶合板等作为含纤维素的生物质时，有时作为发酵抑制物包含木材加工工序中使用的粘合剂、涂料等成分。作为粘合剂，可列举尿素树脂、三聚氰胺树脂、酚树脂、尿素-三聚氰胺共聚树脂等。作为来源于这样的粘合剂的发酵抑制物，可列举乙酸、甲酸、甲醛等。
由上述工序(1)获得的糖水溶液中包含上述物质中的至少1种作为发酵抑制物，实际上可包含多种。另外，这些发酵抑制物能够通过薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱等一般分析方法进行检测和定量。
本发明中使用的纳滤膜也被称为纳米过滤器(纳米过滤膜、NF膜)，是一般被定义为“透过一价离子、阻挡二价离子的膜”的膜。是被认为具有数纳米左右的微小孔隙的膜，主要用于阻挡水中的微小粒子和/或分子、离子、盐类等。
本发明中使用的反渗透膜也被称为RO膜，是一般被定义为“包含1价离子并具有脱盐功能的膜”的膜。是被认为具有数埃至数纳米左右的超微小孔隙的膜，主要用于在海水淡水化和/或超纯水制造等中除去离子成分。
此外，本发明中的“通过纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤”是指，将含纤维素的生物质水解而获得的糖液通过纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤，将溶解的糖、特别是葡萄糖和/或木糖等单糖的糖液阻挡或滤出在非透过侧，使发酵抑制物作为透过液或滤液透过。
作为评价本发明中使用的纳滤膜和/或反渗透膜的性能的方法，可以通过计算糖水溶液中包含的对象化合物(发酵抑制物或单糖等)的透过率(％)来进行评价。透过率(％)的计算方法示于式1。
透过率(％)＝(透过侧的对象化合物浓度/非透过液的对象化合物浓度)×100…(式1)。
只要是能够具有高精度和再现性地测定式1中的对象化合物浓度的分析方法即可，优选使用高效液相色谱、气相色谱等。对于本发明中使用的纳滤膜和/或反渗透膜，在对象化合物是单糖的情况下，优选其透过率低的膜，另一方面，在对象化合物是发酵抑制物的情况下，优选其透过率高的膜。
此外，作为纳滤膜的透过性能，优选使用在0.3MPa的过滤压下，膜单位面积的氯化钠(500mg/L)的透过流量(m3/m2/天)为0.5～0.8的纳滤膜。作为膜单位面积的透过流量(膜透过流量或通量)的评价方法，可以通过测定透过液量、采集透过液量的时间和膜面积由式2计算出。
膜透过流量(m3/m2/天)＝透过液量/膜面积/采集时间…(式2)。
对提供给纳滤膜和/或反渗透膜的糖水溶液的pH值没有特别的限制，优选pH值为1～5。这是因为，如果pH值小于1，则长期使用时有时膜会变质而通量、透过率等膜性能显著降低，如果pH值大于5，则有时乙酸、甲酸、乙酰丙酸等有机酸的除去率会显著降低。纳滤膜和/或反渗透膜由于膜表面带电，因此在溶液中离子化的物质比非离子化的物质更容易被除去或阻挡，因此在糖水溶液中所含的有机酸的含量高的情况下，或者需要较高的除去效果的情况下，通过将糖水溶液的pH值调整到上述范围，可以显著地提高其除去效率。此外，作为将糖水溶液的pH值调整到1～5而通过纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤的效果，有抑制膜污染的效果。一般而言，随着pH值降低，初始通量值降低，但特别地对于来源于含纤维素的生物质的糖水溶液而言，pH值为1～5能够保持膜的长期稳定性。
此外，特别是对于反渗透膜，更优选将糖水溶液的pH值调整到1～3。这是因为与纳滤膜同样地，如果pH值小于1，则长期使用时有时膜会变质而通量、透过率等膜性能会显著降低，如果pH值大于3，则有时不能获得充分的有机酸除去率。由于反渗透膜相对于纳滤膜的孔径等更小等理由，可推测出如果不进一步抑制由溶出成分的离子性产生的电荷，则作为有机酸的有效半径的离子半径增大，不能保持与纳滤膜同等的除去性能。
另外，如果在反渗透膜中也使用可降低操作压力的低压/超低压型的反渗透膜，则即使原水的调整pH值大于3，也可以具有与非低压/超低压型的RO膜同等的有机酸除去率，得到降低pH值调整所使用的酸使用量和降低后期工序的发酵工序中的pH值调整所使用的碱使用量的效果，此外由于与非低压/超低压型的反渗透膜相比有机酸的除去率提高，因此在本发明中优选使用。此处低压/超低压型的反渗透膜是指，在0.75MPa的过滤压、pH值6.5的条件下，膜单位面积的氯化钠(500mg/L)的透过流量(m3/m2/天)为0.4以上的反渗透膜。
对糖水溶液的pH值调整所使用的酸或碱没有特别的限制。作为酸，优选为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸，从不易发生发酵时的抑制的观点出发，更优选硫酸、硝酸、磷酸，从经济性的观点出发，进一步优选硫酸。作为碱，从经济性的观点出发，优选氨、氢氧化钠、氢氧化钙和包含它们的水溶液，从膜污染的观点出发，更优选作为1价离子的氨、钠，从不易发生发酵时的抑制的观点出发，进一步优选氨。
进行糖水溶液的pH值调整的阶段只要在纳滤膜和/或反渗透膜处理之前即可。此外，在利用酶进行含纤维素的生物质的水解的情况下，水解反应时可以预先将pH值调整到5以下。此外，在使用利用超滤膜再利用酶的工艺的情况下，如果使pH值降低到4以下则容易发生酶失活，因此优选对超滤膜处理后的滤液进行pH值调整。
对提供给本发明中的纳滤膜和/或反渗透膜的糖水溶液的温度没有特别的限制，为了提高所使用的膜在过滤时的发酵抑制物除去能力，可以进行适当设定。
具体而言，在用纳滤膜进行过滤的情况下，为了提高纳滤膜的发酵抑制物除去能力，优选设定糖水溶液的温度为40～80℃。这是因为，在用纳滤膜进行过滤时糖水溶液的温度在40℃以上的范围温度越高除去能力越大，但是如果高于80℃，则有时由于纳滤膜会变质而丧失膜特性。
此外，在用反渗透膜进行过滤的情况下，为了提高反渗透膜的发酵抑制物除去能力，优选设定糖水溶液的温度为1～15℃。如果在用反渗透膜进行过滤时糖水溶液的温度低于1℃，则由于配管中结冰而导致装置故障，如果高于15℃，则不大能显现降低损失的效果。这是因为，关于上述的温度控制，如果温度高，则有时由于膜膨胀而分子量大的物质被除去，除去量也倾向于提高，如果温度低，则有时发生膜收缩而膜的孔径变小，糖向滤液侧的损失降低。
一般而言，纳滤膜与反渗透膜相比被严格划分到孔径大的类别中，因此认为，在工序(2)中使用纳滤膜的情况下，使发酵抑制物透过而除去的物质重量比反渗透膜大，另一方面，作为目标产物的单糖向透过侧损失的重量也比反渗透膜大。特别是在糖浓度高的情况下该倾向强烈显现。另一方面认为，在工序(2)中使用反渗透膜的情况下，由于孔径小，因此与纳滤膜相比能够除去分子量大的抑制物的重量减少。因此，优选根据通过上述所示处理而获得的糖液的发酵抑制物的重量大小和主要发酵抑制物的分子量，从纳滤膜和反渗透膜中选择适当的膜使用。所选择的膜的种类不限于1种，可以根据糖液的组成从纳滤膜和反渗透膜中组合利用多种膜进行过滤。
另外发现，在用纳滤膜获得纯化糖液的情况下，随着在纳滤膜的浓缩侧捕捉到的单糖被纯化而浓度提高，单糖向滤液侧损失的倾向急剧增强。另一方面，在用反渗透膜进行纯化的情况下，即使浓缩侧的单糖浓度提高，单糖的损失倾向也几乎恒定地接近零，但是从除去发酵抑制物的观点出发，纳滤膜比反渗透膜性能优异。因此发现，通过使用与反渗透膜相比能够除去更多发酵抑制物的纳滤膜进行纯化工序，直到判断为糖向滤液的损失大的浓度，然后使用与纳滤膜相比发酵抑制物的除去效率稍差但能够无损失地浓缩单糖的反渗透膜来继续进行纯化工序，从而可以在抑制单糖向滤液侧损失的同时除去大量发酵抑制物。因此，在本发明中，在组合纳滤膜和反渗透膜来获得纯化糖液的情况下，对其组合没有特别限定，优选首先将工序(1)所获得的糖水溶液用纳滤膜进行过滤，再将所得的滤液用反渗透膜进行过滤。
本发明中使用的纳滤膜的材料，可以使用乙酸纤维素系聚合物、聚酰胺、聚酯、聚酰亚胺、烯类聚合物等高分子材料，不限于由上述1种材料构成的膜，可以是包含多种膜材料的膜。此外，其膜结构可以是在膜的至少一面具有致密层并具有从致密层向膜内部或另一面孔径逐渐增大的微细孔的不对称膜、或在不对称膜的致密层上具有由其它材料形成的非常薄的功能层的复合膜中的任一种。作为复合膜，可以使用例如，日本特开昭62-201606号公报中记载的、在以聚砜为膜材料的支持膜上构成了由聚酰胺的功能层形成的纳米过滤器而得的复合膜。
其中，优选兼备高耐压性和高透水性、高溶质除去性能且具有优异势能(potential)的以聚酰胺作为功能层的复合膜。为了可以维持对操作压力的耐久性、高透水性、阻挡性能，具有以聚酰胺作为功能层，并用由多孔质膜或无纺布形成的支撑体保持该功能层的结构的复合膜是适合的。此外，作为聚酰胺半透膜，在支撑体上具有通过多官能胺与多官能酰卤的缩聚反应而获得的交联聚酰胺的功能层而成的复合半透膜是适合的。
在以聚酰胺为功能层的纳滤膜中，作为构成聚酰胺的单体的优选羧酸成分，可列举例如，1，3，5-苯三甲酸、二苯甲酮四甲酸、1，2，4-苯三酸、1，2，4，5-苯四酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸、萘二甲酸、苯基苯甲酸、吡啶甲酸等芳香族羧酸，如果考虑对制膜溶剂的溶解性，则更优选1，3，5-苯三酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸和它们的混合物。
作为构成上述聚酰胺的单体优选的胺成分，可列举间苯二胺、对苯二胺、联苯胺、二氨基二苯甲烷、4，4’-二氨基二苯醚、联茴香胺、3，3’，4-三氨基二苯醚、3，3’，4，4’-四氨基二苯醚、3，3’-二羟基联苯胺、1，8-萘二胺、单甲基间苯二胺、单甲基对苯二胺、3，3’-单甲基氨基-4，4’-二氨基二苯醚、4，N，N’-(4-氨基苯甲酰)-间(对)-苯二胺-2，2’-双(4-氨基苯基苯并咪唑)、2，2’-双(4-氨基苯基苯并唑)、2，2’-双(4-氨基苯基苯并噻唑)等具有芳香环的伯二胺、哌嗪、哌啶或它们的衍生物等仲二胺，其中以包含哌嗪或哌啶作为单体的交联聚酰胺为功能层的纳滤膜由于具有耐压性、耐久性、以及耐热性、耐化学性，因此优选使用。更优选以上述交联哌嗪聚酰胺或交联哌啶聚酰胺为主成分并且含有上述化学式1所示的构成成分的聚酰胺，进一步优选以交联哌嗪聚酰胺为主成分并且含有上述化学式1所示的构成成分的聚酰胺。此外，上述化学式1中，优选使用n＝3的物质。作为以交联哌嗪聚酰胺为主成分并且含有上述化学式1所示的构成成分的聚酰胺为功能层的纳滤膜，可列举例如，日本特开昭62-201606号公报中记载的纳滤膜，作为具体例，可列举以交联哌嗪聚酰胺为主成分并且含有上述化学式1中n＝3的物质为构成成分的聚酰胺为功能层的、東レ株式会社制的交联哌嗪聚酰胺系纳滤膜的UTC60。
纳滤膜一般作为螺旋型膜组件使用，本发明中使用的纳滤膜也优选作为螺旋型膜组件使用。作为优选的纳滤膜组件的具体例，可列举例如，作为乙酸纤维素系的纳滤膜的GE Osmonics社制纳滤膜的GEsepa，以聚酰胺为功能层的アルファラバル社制纳滤膜的NF99或NF99HF、以交联哌嗪聚酰胺为功能层的フイルムテツク社制纳滤膜的NF-45、NF-90、NF-200、NF-270或NF-400、或以交联哌嗪聚酰胺为主成分并且含有上述化学式1所示的构成成分的聚酰胺为功能层的包含東レ株式会社制的UTC60的東レ株式会社制的纳滤膜组件SU-210、SU-220、SU-600或SU-610，更优选以聚酰胺为功能层的アルファラバル社制纳滤膜的NF99或NF99HF、以交联哌嗪聚酰胺为功能层的フイルムテツク社制纳滤膜的NF-45、NF-90、NF-200或NF-400，或以交联哌嗪聚酰胺为主成分并且含有上述化学式1所示的构成成分的聚酰胺为功能层的包含東レ株式会社制的UTC60的東レ株式会社制的纳滤膜组件SU-210、SU-220、SU-600或SU-610，进一步优选以联哌嗪聚酰胺为主成分并且含有上述化学式1所示的构成成分的聚酰胺为功能层的包含東レ株式会社制的UTC60的東レ株式会社制的纳滤膜组件SU-210、SU-220、SU-600或SU-610。
工序(2)中的利用纳滤膜进行的过滤可以施加压力，该过滤压优选为0.1～8MPa的范围。如果过滤压低于0.1MPa，则膜透过速度降低，如果高于8MPa，则可能会带来膜损伤的影响。此外，如果过滤压在0.5～7MPa的范围内，则膜透过流量高，因此可以使糖溶液有效地透过，并且带来膜损伤的影响的可能性低，因此更加优选，特别优选1～6MPa的范围。
作为本发明中使用的反渗透膜的材料，可列举以乙酸纤维素系聚合物为功能层的复合膜(以下也称为乙酸纤维素系反渗透膜)或以聚酰胺为功能层的复合膜(以下也称为聚酰胺系反渗透膜)。此处，作为乙酸纤维素系聚合物，可列举乙酸纤维素、二乙酸纤维素、三乙酸纤维素、丙酸纤维素、丁酸纤维素等纤维素的有机酸酯，可以使用单一有机酸的酯或有机酸酯的混合物、以及混合有机酸的酯。作为聚酰胺，可列举以脂肪族和/或芳香族二胺为单体的线状聚合物或交联聚合物。
作为本发明中使用的反渗透膜的具体例，可列举例如，東レ株式会社制的作为聚酰胺系反渗透膜组件的超低压型的SUL-G10、SUL-G20、低压型的SU-710、SU-720、SU-720F、SU-710L、SU-720L、SU-720LF、SU-720R、SU-710P、SU-720P、以及包含UTC80作为反渗透膜的高压型的SU-810、SU-820、SU-820L、SU-820FA、東レ株式会社制的乙酸纤维素系反渗透膜SC-L100R、SC-L200R、SC-1100、SC-1200、SC-2100、SC-2200、SC-3100、SC-3200、SC-8100、SC-8200、日东电工株式会社制的NTR-759HR、NTR-729HF、NTR-70SWC、ES10-D、ES20-D、ES20-U、ES15-D、ES15-U、LF10-D、アルファラバル制的RO98pHt、RO99、HR98PP、CE4040C-30D、GE制的GE Sepa、Filmtec制的BW30-4040、TW30-4040、XLE-4040、LP-4040、LE-4040、SW30-4040、SW30HRLE-4040、KOCH制TFC-HR、TFC-ULP、TRISEP制的ACM-1、ACM-2、ACM-4等。
在本发明中，优选使用具有聚酰胺系材质的反渗透膜。这是因为，在长时间使用乙酸纤维素系膜时，有时在前期工序中使用的酶、特别是纤维素酶成分的一部分透过而使作为膜材料的纤维素分解。
作为膜形态，可以使用平膜型、螺旋型、中空丝型等适当形态的膜。
工序(2)中的利用反渗透膜的过滤可以施加压力，该过滤压优选为0.1～8MPa的范围。如果过滤压低于0.1MPa，则膜透过速度可能降低，如果高于8MPa，则可能带来膜损伤的影响。此外，如果过滤压在0.5～7MPa的范围，则膜透过流量高，因此可以使糖溶液有效地透过，并且带来膜损伤的影响的可能性低，因此更加优选，特别优选为1～6MPa的范围。
在上述工序(2)中，发酵抑制物通过透过纳滤膜和/或反渗透膜而被从糖水溶液中除去。在上述发酵抑制物中，优选HMF、糠醛、乙酸、甲酸、乙酰丙酸、香草醛、乙酰香草醛或丁香酸能够被透过除去。另一方面，糖水溶液中包含的糖分在纳滤膜和/或反渗透膜的非透过侧被阻挡或过滤出。作为糖分，主成份是葡萄糖、木糖等单糖，但也包含二糖、寡糖等在工序(1)的水解工序中未被完全分解成单糖的糖成分。
在工序(2)中，从纳滤膜和/或反渗透膜的非透过侧得到的纯化糖液相对于通过纳滤膜和/或反渗透膜之前的糖水溶液，特别是发酵抑制物含量相对于初始含量降低。该纯化糖液中包含的糖成分是来源于含纤维素的生物质的糖，本质上与工序(1)的水解中获得的糖成分没有大的变化。即，作为本发明的纯化糖液中包含的单糖，是以葡萄糖和/或木糖作为主成分而构成的。葡萄糖与木糖的比率根据工序(1)的水解工序不同而变化，在本发明中没有限定。即，在以半纤维素为主进行水解的情况下，木糖成为主要的单糖成分，在半纤维素分解之后仅分离出纤维素成分并进行水解的情况下，葡萄糖成为主要的单糖成分。此外，在不特别地将半纤维素的分解和纤维素的分解分开进行的情况下，包含葡萄糖和木糖作为主要的单糖成分。
另外，可以暂且使用以蒸发器为代表的浓缩装置将上述工序(2)所获得的纯化糖液进行浓缩，此外还可以进一步将纯化糖液用纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤来提高浓度，但是从减少用于浓缩的能量这样的观点出发，优选采用以纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤来进一步提高纯化糖液浓度的工序。该浓缩工序中使用的膜是以被处理水的透过压以上的压力差为驱动力来除去离子和/或低分子量分子的过滤膜，可以采用例如乙酸纤维素等纤维素系膜、使多官能胺化合物与多官能酰卤进行缩聚而在微多孔性支持膜上设置了聚酰胺分离功能层的膜等。为了抑制纳滤膜和/或反渗透膜表面的沾污即污染，还优选采用将具有至少1个与酰卤基反应的反应性基团的化合物的水溶液被覆在聚酰胺分离功能层的表面、在分离功能层表面残存的酰卤基与该反应性基团之间形成共价键而得到的主要用于污水处理的低污染膜等。作为本发明中使用的纳滤膜和/或反渗透膜，更优选采用至少相对于工序(2)中使用的纳滤膜和/或反渗透膜，葡萄糖或木糖等单糖的阻挡率更高的膜。
浓缩所使用的纳滤膜或反渗透膜的具体例依照上述的纳滤膜或反渗透膜的具体例。
此外，还可以将由工序(2)作为滤液排出的水在水解和/或糖纯化等制造糖的工序或随后的发酵和/或化学品纯化等制造化学品的工序中进行再利用。而且，可以在将滤液用纳滤膜和/或反渗透膜再过滤一次之后进行该再利用。更优选下述方法：在将pH值调整为1～5再用纳滤膜和/或反渗透膜进行纯化之后，将该滤液用纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤，然后进行该再利用。进一步优选下述方法：在将pH值调整为1～5再用纳滤膜和/或反渗透膜进行纯化之后，使pH值上升，用纳滤膜和/或反渗透膜特异地选择性除去有机酸，再进行该再利用。
接下来，对使用由本发明的糖液的制造方法获得的纯化糖液作为发酵原料的化学品的制造方法进行说明。
通过使用本发明中获得的纯化糖液作为发酵原料，能够制造化学品。本发明中获得的纯化糖液包含作为用于微生物或培养细胞生长的碳源的葡萄糖和/或木糖作为主成分，另一方面，呋喃化合物、有机酸、芳香族化合物等发酵抑制物的含量极少，因此能够作为发酵原料、特别是碳源有效地使用。
本发明的化学品的制造方法中使用的微生物或培养细胞，可列举例如，在发酵工业中常用的面包酵母等酵母、大肠杆菌、棒状杆菌等细菌、丝状菌、放线菌、动物细胞、昆虫细胞等。所使用的微生物、细胞可以是从自然环境分离出的微生物、细胞，还可以是通过突变和/或基因重组而使部分性质发生了改变的微生物、细胞。特别是由于来源于含纤维素的生物质的糖液中包含木糖等戊糖，因此优选使用强化了戊糖的代谢途径的微生物。
作为本发明的化学品的制造方法中使用的培养基，优选使用除了纯化糖液以外还适当含有氮源、无机盐类、以及根据需要的氨基酸、维生素等有机微量营养素的液体培养基。本发明的纯化糖液中，作为碳源包含葡萄糖、木糖等微生物能够利用的单糖，根据情况，作为碳源，还可以补加葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖等糖类、含有这些糖类的淀粉糖化液、甘薯糖蜜、甜菜糖蜜、高级糖蜜、乙酸等有机酸、乙醇等醇类、甘油等，从而作为发酵原料使用。作为氮源，可使用氨气、氨水、铵盐类、脲、硝酸盐类、其它辅助使用的有机氮源、例如油粕类、大豆水解液、酪蛋白分解物、其它氨基酸、维生素类、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉提取物、蛋白胨等肽类、各种发酵菌体及其水解物等。作为无机盐类，可以适当添加磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。
在本发明中使用的微生物的生长需要特定营养素的情况下，该营养物只要以标准品或含有该营养物的天然物的形式添加即可。此外，根据需要可以使用消泡剂。
微生物的培养通常在pH值4～8、温度20～40℃的范围内进行。培养液的pH值通过无机酸或有机酸、碱性物质以及尿素、碳酸钙、氨气等来调节，通常调节成pH值4～8范围内的预定值。如果需要提高氧气的供给速度，则可以使用在空气中加入氧气将氧气浓度保持在21％以上、或对培养加压、提高搅拌速度、提高通气量等方法。
作为使用由本发明的糖液的制造方法而获得的纯化糖液作为发酵原料的化学品的制造方法，可采用本领域技术人员公知的发酵培养方法，但从生产性的观点出发，优选采用WO2007/097260中公开的连续培养方法。
作为由本发明的化学品的制造方法制造的化学品，只要是由上述微生物和/或细胞在培养液中产生的物质就没有限制。作为本发明所制造的化学品的具体例，可以列举醇、有机酸、氨基酸、核酸等发酵工业中大量生产的物质。例如，作为醇，可以列举乙醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、甘油等，作为有机酸，可以列举乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸、核酸、肌苷、鸟苷等核苷、肌苷酸、鸟苷酸等核苷酸，以及尸胺等二胺化合物。此外，本发明也能够应用于酶、抗生素、重组蛋白质等物质的生产。
实施例
以下，关于本发明的糖液的制造方法，为了进行更详细的说明，列举实施例进行说明。然而，本发明不限于这些实施例。
(参考例1)单糖浓度的分析方法
所得的糖水溶液中包含的单糖浓度在以下所示的HPLC条件下通过与标准品的比较进行定量。
柱：Luna NH2(Phenomenex公司制)
流动相：超纯水∶乙腈＝25∶75(流速0.6mL/分钟)
反应液：无
检测方法：RI(示差折射率)
温度：30℃。
(参考例2)发酵抑制物浓度的分析方法
糖液中包含的呋喃系发酵抑制物(HMF、糠醛)和酚系发酵抑制物(香草醛、乙酰香草醛、丁香酸、乙酰丙酸、4-羟基苯甲酸)在以下所示的HPLC条件下通过与标准品的比较进行定量。
柱：Synergi HidroRP 4.6mm×250mm(Phenomenex制)
流动相：乙腈-0.1％H3PO4(流速1.0mL/分钟)
检测方法：UV(283nm)
温度：40℃。
糖液中包含的有机酸系发酵抑制物(乙酸、甲酸)在以下所示的HPLC条件下通过与标准品的比较进行定量。
柱：Shim-Pack SPR-H与Shim-Pack SCR101H(株式会社岛津制作所制)的串联
流动相：5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/分钟)
反应液：5mM对甲苯磺酸，20mM Bis-Tris，0.1mM EDTA·2Na(流速0.8mL/分钟)
检测方法：电导率
温度：45℃。
(参考例3)利用稀硫酸处理-酶处理来水解含纤维素的生物质的水解工序
关于将工序(1)的含纤维素的生物质进行水解的工序，对使用0.1～15重量％的稀硫酸和酶的含纤维素的生物质的水解方法举例进行说明。
作为含纤维素的生物质，使用了稻秸。将上述含纤维素的生物质浸泡在1％的硫酸水溶液中，在150℃下用高压釜(日东高压株式会社制)处理30分钟。在处理后，进行固液分离，将硫酸水溶液(以下称为稀硫酸处理液)与硫酸处理纤维素分离。接着将硫酸处理纤维素与稀硫酸处理液搅拌混合使得固体成分浓度为10重量％，然后用氢氧化钠将pH值调整到5左右。在该混合液中添加作为纤维素酶的木霉纤维素酶(シグマ·アルドリツチ·ジヤパン)和ノボザイム188(来源于黑曲霉的β-葡糖苷酶制剂，シグマ·アルドリツチ·ジヤパン)，一边在50℃下搅拌混合3天，一边进行水解反应。然后，进行离心分离(3000G)，分离除去未分解纤维素或木质素，获得了糖水溶液。糖水溶液的浊度为700NTU。此外糖水溶液中包含的发酵抑制物和单糖的组成分别如表1和表2所示。
表1发酵抑制物的定量
  稀硫酸处理液   糖水溶液
  甲酸   0.1g/L   0.1g/L
  乙酸   2.0g/L   2.4g/L
  HMF   100mg/L   125mg/L
  糠醛   560mg/L   875mg/L
  香草醛   60mg/L   90mg/L
  乙酰香草醛   120mg/L   146mg/L
  丁香酸   10mg/L   15mg/L
  乙酰丙酸   9mg/L   10mg/L
表2单糖的定量
  稀硫酸处理液   糖水溶液
  葡萄糖   3g/L   25g/L
  木糖   15g/L   12g/L
  阿拉伯糖   0.8g/L   1g/L
  甘露糖   0.9g/L   1g/L
(参考例4)利用水热处理-酶处理来水解含纤维素的生物质的水解工序
关于将工序(1)的含纤维素的生物质进行水解的工序，对使用水热处理和酶的含纤维素的生物质的水解方法举例进行说明。
作为含纤维素的生物质，使用了稻秸。将上述含纤维素的生物质浸泡在水中，一边搅拌一边在180℃下用高压釜(日东高压株式会社制)处理20分钟。此时的压力为10MPa。在处理后，使用离心分离(3000G)将溶液成分(以下称为水热处理液)与处理生物质成分进行固液分离。水热处理液的pH值为4.0，水热处理液的浊度为800NTU。
接下来，在测定处理生物质成分的含水率之后，添加RO水使得以上述的绝干处理生物质换算的固体成分浓度为15重量％，再添加作为纤维素酶的木霉纤维素酶(シグマ·アルドリツチ·ジヤパン)和ノボザイム188(来源于黑曲霉的β-葡糖苷酶制剂，シグマ·アルドリツチ·ジヤパン)，一边在50℃下搅拌混合3天，一边进行水解反应。然后，进行离心分离(3000G)，分离除去未分解纤维素或木质素，获得了糖水溶液。糖水溶液的pH值为5.2，糖水溶液的浊度为900NTU。此外水热处理液和糖水溶液中包含的发酵抑制物和单糖的组成如表3和表4所示。
表3发酵抑制物的定量
  水热处理液   糖水溶液
  甲酸   1.1g/L   0.1g/L
  乙酸   2.2g/L   0.5g/L
  HMF   139mg/L   10mg/L
  糠醛   8mg/L   15mg/L
  香草醛   50mg/L   3mg/L
  乙酰香草醛   2mg/L   13mg/L
  丁香酸   1mg/L   1mg/L
表4单糖的定量
  水热处理液   糖水溶液
  葡萄糖   2g/L   50g/L
  木糖   15g/L   8g/L
  阿拉伯糖   0.5g/L   1g/L
  甘露糖   0.5g/L   0.5g/L
(参考例5)利用氨处理-酶处理来水解含纤维素的生物质的水解工序
关于将工序(1)的含纤维素的生物质进行水解的工序，对使用5.0～100重量％氨水和酶的含纤维素的生物质的水解方法举例进行说明。作为含纤维素的生物质，使用了稻秸。将上述含纤维素的生物质添加到小型反应器(耐压硝子工业株式会社制，TVS-N2 30mL)中，用液氮冷却。在该反应器中注入氨气，使样品完全浸渍在液态氨中。关闭反应器的盖子，在室温下放置15分钟左右。接着，在150℃的油浴中处理1小时。在处理后，从油浴中取出反应器，立即在通风装置中放出氨气，然后再用真空泵将反应器内抽真空直到10Pa，使上述含纤维素的生物质干燥。将该经处理的含纤维素的生物质与纯水搅拌混合使得固体成分浓度为15重量％，然后用硫酸将pH值调整到5左右。在该混合液中添加作为纤维素酶的木霉纤维素酶(シグマ·アルドリツチ·ジヤパン)和ノボザイム188(来源于黑曲霉的β-葡糖苷酶制剂，シグマ·アルドリツチ·ジヤパン)，一边在50℃下搅拌混合3天，一边进行水解反应。然后，进行离心分离(3000G)，分离除去未分解纤维素或木质素，获得了糖水溶液。糖水溶液的浊度为600NTU。此外糖水溶液中包含的发酵抑制物和单糖的组成如表5和表6所示。
表5发酵抑制物的定量
  糖水溶液
  甲酸   1.1g/L
  乙酸   0.5g/L
  HMF   500mg/L
  糠醛   5mg/L
  香草醛   20mg/L
  乙酰香草醛   18mg/L
  丁香酸   2mg/L
表6单糖的定量
  糖水溶液
  葡萄糖   50g/L
  木糖   25g/L
  阿拉伯糖   2g/L
  甘露糖   1g/L
(实施例1)将稀硫酸处理-酶处理糖水溶液通过纳滤膜或反渗透膜进行过滤的工序
关于将参考例3中所得的糖水溶液通过纳滤膜(NF膜)或反渗透膜(RO膜)进行过滤，从非透过侧回收纯化糖液，从透过侧除去发酵抑制物的工序，列举实施例进行说明。将参考例3所得的糖水溶液20L进一步使用细孔径0.05μm的PVDF膜进行过滤，再通过纳滤膜或反渗透膜组件进行处理。在图1所示的膜过滤装置的原水槽1中注入实施例2所得的糖水溶液20L。然后，在原水槽1中添加200L的RO水。作为图2的附图标记7所示的纳滤膜，设置交联哌嗪聚酰胺系纳滤膜UTC60(東レ株式会社制)，作为RO膜，设置交联全芳香族聚酰胺系反渗透膜UTC80(東レ株式会社制)，将原水温度调整为25℃、将高压泵3的压力调整为3MPa，除去透过液。除去透过液共计200L，将原水槽中残留的不足20L的溶液用RO水稀释到20L，将其作为纯化糖液。
将参考例3所得的糖水溶液和上述纯化糖液中包含的发酵抑制物(HMF、糠醛、香草醛、乙酰香草醛、丁香酸)在参考例1所示的HPLC条件下通过与标准品的比较进行定量。此外，单糖浓度在参考例1记载的HPLC条件下通过与标准品的比较进行定量。其结果归纳于表7和表8。通过分析显示出，作为发酵抑制物，包含乙酸、甲酸、糠醛、HMF、香草醛、乙酰香草醛、丁香酸、乙酰丙酸。此外，作为各糖液中包含的单糖，葡萄糖和木糖是主成分。此外还检测到了极少量的阿拉伯糖、甘露糖。而且可以确认纯化糖液与参考例3中所得的糖水溶液相比，发酵抑制物量大幅减少。另一方面可以确认，糖浓度没有大幅减少，通过将糖水溶液通过纳滤膜或反渗透膜进行处理，从而可以作为透过液除去发酵抑制物，从非透过侧回收发酵抑制物浓度降低了的纯化糖液。
表7发酵抑制物的定量
  糖水溶液   NF膜纯化糖液   RO膜纯化糖液
  甲酸   0.1g/L   0g/L   0g/L
  乙酸   2.4g/L   0.2g/L   1.2g/L
  HMF   125mg/L   18mg/L   90mg/L
  糠醛   875mg/L   88mg/L   240g/L
  香草醛   90mg/L   2.7mg/L   62mg/L
  乙酰香草醛   146mg/L   9mg/L   103mg/L
  丁香酸   15mg/L   0mg/L   10mg/L
  乙酰丙酸   10mg/L   0mg/L   3mg/L
表8单糖的定量
  糖水溶液   NF膜纯化糖液   RO膜纯化糖液
  葡萄糖   25g/L   24g/L   25g/L
  木糖   12g/L   11.2g/L   12g/L
  阿拉伯糖   1g/L   0.96g/L   1g/L
  甘露糖   1g/L   0.98g/L   1g/L
(实施例2)将水热处理-酶处理糖水溶液通过纳滤膜或反渗透膜进行过滤的工序
关于将参考例4中所得的糖水溶液通过纳滤膜或反渗透膜进行过滤，从非透过侧回收纯化糖液，从透过侧除去发酵抑制物的工序，用与实施例1同样的方法来获得纯化糖液，对发酵抑制物和单糖浓度进行了定量。其结果归纳于表9和表10。通过分析显示出，作为发酵抑制物，包含乙酸、甲酸、糠醛、HMF，香草醛、乙酰香草醛、丁香酸。此外，作为各糖液中包含的单糖，葡萄糖和木糖是主成分。此外还检测到了极少量的阿拉伯糖、甘露糖。
表9发酵抑制物的定量
  糖水溶液   NF膜纯化糖液   RO膜纯化糖液
  甲酸   0.1g/L   0g/L   0g/L
  乙酸   0.5g/L   0g/L   0.2g/L
  HMF   10mg/L   1mg/L   6mg/L
  糠醛   15mg/L   0mg/L   3g/L
  香草醛   3mg/L   0mg/L   1mg/L
  乙酰香草醛   13mg/L   1mg/L   3mg/L
  丁香酸   1mg/L   0mg/L   0mg/L
表10单糖的定量
  糖水溶液   NF膜纯化糖液   RO膜纯化糖液
  葡萄糖   50g/L   49g/L   50g/L
  木糖   8g/L   7.2g/L   8g/L
  阿拉伯糖   1g/L   0.96g/L   1g/L
  甘露糖   0.5g/L   0.48g/L   0.5g/L
可以确认各纯化糖液与参考例4中所得的糖水溶液相比，发酵抑制物的量大幅减少。此外另一方面可以确认，糖浓度没有大幅减少，通过将糖水溶液通过纳滤膜或反渗透膜进行处理，从而可以作为透过液除去发酵抑制物，从非透过侧回收发酵抑制物浓度降低了的纯化糖液。
(实施例3)将氨处理-酶处理糖水溶液通过纳滤膜或反渗透膜进行过滤的工序
关于将参考例5所得的糖水溶液通过纳滤膜或反渗透膜进行过滤，从非透过侧回收纯化糖液，从透过侧除去发酵抑制物的工序，用与实施例1同样的方法来获得纯化糖液，对发酵抑制物和单糖进行了定量。其结果归纳于表11和表12。通过分析显示出，作为发酵抑制物，包含乙酸、甲酸、糠醛、HMF、香草醛、乙酰香草醛、丁香酸。此外，作为各糖液中包含的单糖，葡萄糖和木糖是主成分。此外还检测到了极少量的阿拉伯糖、甘露糖。
表11发酵抑制物的定量
表12单糖的定量
  糖水溶液   NF膜纯化糖液   RO膜纯化糖液
  葡萄糖   50g/L   49g/L   50g/L
  木糖   25g/L   21g/L   25g/L
  阿拉伯糖   2g/L   1.8g/L   2g/L
  甘露糖   1g/L   0.9g/L   1g/L
可以确认，各纯化糖液与参考例5中所得的糖水溶液相比，发酵抑制物的量大幅减少。此外另一方面可以确认，糖浓度没有大幅减少，通过将糖水溶液通过NF膜或RO膜进行处理，从而可以作为透过液除去发酵抑制物，从非透过侧回收发酵抑制物浓度降低了的纯化糖液。
(实施例5)将水热处理液通过纳滤膜或反渗透膜进行过滤的工序
关于将参考例4中获得的水热处理液通过纳滤膜或反渗透膜进行过滤，从非透过侧回收纯化糖液，从透过侧除去发酵抑制物的工序，用与实施例1同样的方法来获得纯化糖液，对发酵抑制物和单糖浓度进行了定量。其结果归纳于表13和表14。通过分析显示出，作为发酵抑制物，包含乙酸、甲酸、糠醛、HMF、香草醛、乙酰香草醛、丁香酸。此外，作为各糖液中包含的单糖，葡萄糖和木糖是主成分。此外还检测到了极少量的阿拉伯糖、甘露糖。
表13发酵抑制物的定量
  糖水溶液   NF膜纯化糖液   RO膜纯化糖液
  甲酸   1.1g/L   0g/L   0.3g/L
  乙酸   2.2g/L   0g/L   0.2g/L
  HMF   139mg/L   1mg/L   6mg/L
  糠醛   8mg/L   0mg/L   3mg/L
  香草醛   50mg/L   1.2mg/L   31mg/L
  乙酰香草醛   2mg/L   0mg/L   1mg/L
  丁香酸   1mg/L   0mg/L   0mg/L
表14单糖的定量
  糖水溶液   NF膜纯化糖液   RO膜纯化糖液
  葡萄糖   2g/L   1.8g/L   2g/L
  木糖   15g/L   13g/L   15g/L
  阿拉伯糖   0.5g/L   0.48g/L   0.5g/L
  甘露糖   0.5g/L   0.48g/L   0.5g/L
可以确认，各纯化糖液与参考例4中获得的水热处理液相比，发酵抑制物的量大幅减少。此外另一方面可以确认，糖浓度没有大幅减少，通过将糖水溶液通过NF膜或RO膜进行处理，从而可以作为透过液除去发酵抑制物，从非透过侧回收发酵抑制物浓度降低了的纯化糖液。
(实施例6)使用模型糖液通过纳滤膜或反渗透膜进行过滤的工序
作为将生物质进行水解处理后的糖水溶液的模型糖液，准备了糖浓度高的糖液(模型糖水溶液A)和糖浓度低的糖液(模型糖水溶液B)。表15和16显示它们各自的组成。
表15模型糖液的组成(单糖)
  葡萄糖   木糖
 模型糖水溶液A   40g/L   20g/L
 模型糖水溶液B   2g/L   1g/L
表16模型糖液的组成(发酵抑制物)
  甲酸   乙酸   HMF   糠醛   香草醛
  模型糖水溶液A   2g/L   2g/L   1g/L   1g/L   1g/L
  模型糖水溶液B   2g/L   2g/L   1g/L   1g/L   1g/L
用与实施例1同样的方法对使用硫酸或氢氧化钠将pH值调整为0.5、1、2、3、4、5、6、7后的模型糖液A和B进行过滤，用参考例1中记载的方法对透过液中包含的发酵抑制物和糖的浓度进行了定量。结果示于表17～20。单糖的透过率在模型糖液A和B中有差异，但未观察到由pH值产生的差异。此外，关于发酵抑制物的透过率，观察到了由pH值产生的差异，但在模型糖液A和B之间未观察到差异。
表17纳滤膜1的糖的透过率的比较
  葡萄糖   木糖
 模型糖水溶液A   10％   15％
 模型糖水溶液B   3％   5％
表18各pH下的纳滤膜的发酵抑制物透过率的比较
Figure BDA0000067135400000361
表19反渗透膜的糖透过率的比较
  葡萄糖   木糖
  模型糖水溶液A   0.2％   0.4％
  模型糖水溶液B   0％   0％
表20各pH下的反渗透膜的发酵抑制物透过率的比较
Figure BDA0000067135400000362
由以上结果发现了，纳滤膜和反渗透膜都能够在滤液侧除去发酵抑制物并同时提高单糖浓度。此外判明了，在糖浓度高的情况下，在纳滤膜的滤液侧损失单糖的比例增加，另一方面，对于反渗透膜，糖损失无变化，几乎没有。此外发现了根据pH值不同有机酸的除去率大幅度变化。
(实施例7)将水热处理-酶处理糖水溶液通过反渗透膜进行过滤的工序(由pH值调整引起的污染抑制效果)
研究了参考例4中所得的糖水溶液的由pH值调整引起的污染抑制效果。将参考例4中所得的糖水溶液10L用精滤膜(ミリポア社制，细孔径0.45μm的PVDF膜)进行过滤。此时的浊度为1NTU以下。再用超滤膜(GESEPA PW系列，聚醚砜，截留分子量10000)进行过滤。然后，将该滤液分成每份2L，使用硫酸和氨将pH值分别调整为1、2、3、5、7，用与实施例1同样的方法通过反渗透膜进行过滤直到原水槽变为0.5L(浓缩倍率4倍)，取透过液总量的经时变化的差分计算出回收透过液时的通量。通量的计算结果示于图3。其结果是，在pH值为1时，通量非常小、过滤花费长时间，在pH值为7时，出现了从运行中途开始通量明显降低。在pH值为2、3、5时也从约1.5小时后观察到降低，但推想这是因为糖浓度增高、透过压大幅度上升的缘故。此外，糖水溶液和纯化糖液的单糖以及发酵抑制物浓度如表21和表22所示，可以确认，与单糖按照浓缩倍率被浓缩相比，发酵抑制物的浓缩程度低，从而从糖水溶液中除去了发酵抑制物。
表21单糖浓度
Figure BDA0000067135400000371
表22发酵抑制物的定量
Figure BDA0000067135400000381
(实施例8)将水热处理液通过纳滤膜进行过滤的工序(精滤膜、超滤膜的污染抑制效果)
关于将参考例4中获得的水热处理液在用纳滤膜进行浓缩之前进行了过滤处理的情况下的污染抑制效果，通过减小了容量的加速度试验进行了研究。准备下述3种液体：参考例4中获得的水热处理液仅仅直接进行离心分离处理而得的液体、进行了精滤膜(ミリポア社制，细孔径0.45μm的PVDF膜)处理而得的液体、进行了超滤膜(GE SEPA PW系列，聚醚砜，截留分子量10000)处理而得的液体，并将这3种液体的pH值调整为3。此时的浊度是，离心分离处理液为800NTU，剩下2种都为1NTU以下。用与实施例1同样的方法将各液体2L通过纳滤膜进行过滤直到原水槽变为0.5L，取透过液总量的经时变化的差分计算出回收透过液时的通量。通量的计算结果示于图4。其结果是，如果仅进行离心分离处理，则浊度高、浓缩中通量也急剧降低。推想形成浊度的成分在浓缩中附着在膜上，从而使膜的过滤性急剧变差。
(实施例9)污染成分的鉴定
将参考例4中获得的水热处理液在曝气洗涤的同时进行精密过滤，将精密过滤后的膜进行真空干燥并用扫描电子显微镜装置(株式会社日立ハイテクノロジ一ズ制S-4800)进行观察。再使用该扫描电子显微镜装置附带的能量分散型X射线分析装置(株式会社堀场制作所制EX-250)进行成分分析。其结果是，在精滤膜上观察到了大量的如图5所示的凝胶状沉积物和数nm至数微米水平的粒子。对于该成分，用能量分散型X射线分析装置的映射模式研究了成分的分散，结果在与粒子同样的位置检测到了大量的Si(硅)和O(氧)(图6)。推想该粒子状成分是SiO2(二氧化硅)。此外，作为周围的凝胶状成分，观察到了C(碳)和O(氧)。由此推想凝胶状成分是未分解的纤维素、木质素等。再将精密过滤后的滤液用超滤膜进行过滤，将超滤膜用RO水轻轻地洗涤，然后使其真空干燥，用扫描电子显微镜一边施加20kV的电压一边在100倍的倍率下用能量分散型X射线分析装置在不同的3点仅进行元素分析。结果检测到C(碳)为72～77％，O(氧)为20～25％。由此推想除去成分是通过水溶性的多糖、单宁、多酚等沉积在超滤膜上而被除去的。
(实施例10)酶的回收
对从上述参考例1中所得的糖水溶液中回收了酶的例子进行说明。在酶的回收中，在8000系列搅拌杯(Stirred Cells Series 8000，ミリポア)上设置截留分子量10,000的聚醚砜制超滤膜(直径44.5mm，ミリポア)，使用氮气瓶进行加压过滤。在加压过滤中，将实施例1中获得的糖液50mL添加到非透过侧，作为透过液除去了45mL。测定了在非透过侧残留的糖液5mL的酶浓度(蛋白质浓度)。对于酶浓度，使用BCA测定试剂盒(BCAProtein Assay Regent kit，ピアス社)进行测定，以牛白蛋白(2mg/mL)作为标准品测定562nm的吸光度，进行比色定量。其结果是可以确认，以初始添加时的酶浓度作为100％，参考例1中回收的酶浓度可以回收作为相对值为10～60％的范围。
(实施例11)由糖水溶液温度变化引起的发酵抑制物除去能力的变化
关于将参考例5中获得的氨处理-酶处理糖水溶液用精滤膜、超滤膜进行过滤后，再通过纳滤膜进行过滤，从非透过侧回收纯化糖液，从透过侧除去发酵抑制物的工序，列举实施例进行说明。将参考例5中所得的糖水溶液4L用精滤膜(ミリポア社制，细孔径0.45μm的PVDF膜)进行过滤。此时的浊度为1NTU以下。再用超滤膜(GE SEPAG PW系列聚醚砜截留分子量10000)进行过滤。对于该糖水溶液，用硫酸将其pH值调整为3，然后在糖水溶液温度25℃或50℃的条件下，用与实施例1同样的方法，每次2L通过反渗透膜进行过滤至原水槽变为0.5L，回收透过液。过滤结束后，用RO水进行稀释使液体总共为2L，制成了纯化糖液。糖水溶液温度为25℃时和50℃时的纯化糖液的浓度如表23所示，随着糖水溶液温度上升而发酵抑制物的除去能力得到改善。推想这是因为糖水溶液温度上升引起膜的孔径增大的缘故。
表23由糖水溶液温度变化引起的发酵抑制物除去能力的变化
  糖水溶液处理前   糖水溶液25℃处理   糖水溶液50℃处理
  甲酸   1.1g/L   0.6g/L   0.2g/L
  乙酸   0.5g/L   0.3g/L   0.1g/L
  糠醛   5mg/L   3mg/L   1mg/L
  香草醛   20mg/L   16mg/L   10mg/L
  乙酰香草醛   18mg/L   16mg/L   12mg/L
  丁香酸   2mg/L   1.9mg/L   1.2mg/L
(实施例12)由糖水溶液温度变化引起的单糖损失抑制水平的变化
关于将参考例5中获得的氨处理-酶处理糖水溶液用精滤膜、超滤膜过滤后，再通过纳滤膜进行过滤，从非透过侧回收纯化糖液，从透过侧除去发酵抑制物的工序，列举实施例进行说明。将参考例5中所得的糖水溶液4L用精滤膜(ミリポア社制，细孔径0.45μm的PVDF膜)进行过滤。此时的浊度为1NTU以下。再用超滤膜(GE SEPA PW系列，聚醚砜，截留分子量10,000，GE Osmonics社制)进行过滤。对于该糖水溶液，用硫酸将其pH值调整为3之后，在糖水溶液温度25℃或10℃的条件下用与实施例1同样的方法，每次2L通过纳滤膜分次进行过滤至原水槽变为0.5L，回收透过液。过滤结束后，用RO水进行稀释使液体总共为2L，作为纯化糖液。糖水溶液温度为25℃时与10℃时的纯化糖液的浓度如表24所示，由于温度上升而糖的损失量得到了改善。推想这是因为糖水溶液温度的降低引起膜的孔径减小的缘故。
表24由糖水溶液温度变化引起的糖损失量变化
  糖水溶液处理前   糖水溶液25℃处理   糖水溶液50℃处理
  葡萄糖   50g/L   44g/L   50g/L
  木糖   25g/L   21g/L   25g/L
  阿拉伯糖   2g/L   1.8g/L   2g/L
  甘露糖   1g/L   0.8g/L   1g/L
(实施例13)利用各种纳滤膜的纯化糖液的制造例
将参考例3中所得的糖水溶液再使用精滤膜(ミリポア社制，细孔径0.05μm的PVDF膜)进行过滤，将由糖水溶液用RO水稀释20倍而得的溶液20L通过与实施例1同样的方法进行纳滤膜处理直到变为1L。作为90φ纳滤膜，使用了交联哌嗪聚酰胺系纳滤膜UTC60(纳滤膜1；東レ株式会社制)、交联哌嗪聚酰胺系纳滤膜NF-400(纳滤膜2；フイルムテツク制)、聚酰胺系纳滤膜NF99(纳滤膜3；アルファラバル制)、乙酸纤维素系纳滤膜GE Sepa DK(纳滤膜4；GE Osmonics社制)。计算出透过液中包含的发酵抑制物(乙酸、甲酸、HMF、糠醛、香草醛、乙酰香草醛、丁香酸、乙酰丙酸)的透过率和单糖(葡萄糖、木糖)的透过率。其结果是，尽管任意纳滤膜都可以阻挡单糖和发酵抑制物，但是特别是纳滤膜1～3，即聚酰胺系、交联哌嗪聚酰胺系的纳滤膜显示出单糖的透过率低，而发酵抑制物的透过率高(表25和表26)。
表25各种纳滤膜的发酵抑制物透过率的比较
  甲酸   乙酸   HMF   糠醛   香草醛   乙酰香草醛   丁香酸   乙酰丙酸
 纳滤膜1   99％   99％   98％   98％   99％   99％   99％   99％
 纳滤膜2   99％   99％   97％   97％   99％   99％   99％   99％
 纳滤膜3   99％   99％   98％   98％   99％   99％   99％   99％
 纳滤膜4   99％   97％   94％   94％   97％   97％   99％   99％
表26各种纳滤膜的单糖透过率的比较
  葡萄糖   木糖
 纳滤膜1   0.8％   1.2％
 纳滤膜2   1.15％   2.0％
 纳滤膜3   1.09％   1.89％
 纳滤膜4   2.16％   4.5％
(实施例14)利用各种反渗透膜的纯化糖液的制造例
将参考例5中所得的糖水溶液用精滤膜(ミリポア社制，细孔径0.45μm的PVDF膜)进行过滤。此时的浊度为1NTU以下。再用超滤膜(GE SEPAPW系列，聚醚砜，截留分子量10000)进行过滤。对于该滤液，用硫酸将其pH值调整为3后，通过与实施例1同样的方法对该滤液20L进行反渗透膜处理。作为反渗透膜，使用交联全芳香族聚酰胺系反渗透膜UTC80(反渗透膜1；東レ株式会社制)、将交联全芳香族聚酰胺系反渗透膜UTC80在50℃下在纤维素酶酶液ノボザイム188(来源于黑曲霉的β-葡糖苷酶制剂，シグマ·アルドリツチ·ジヤパン)中浸泡1天之后用RO水洗涤而得的膜(反渗透膜2)、聚酰胺系反渗透膜DESAL-3B(反渗透膜3；DESAL制)、乙酸纤维素系反渗透膜GE SEPA CE(反渗透膜4；GE Osmonics制)(比较例)、将乙酸纤维素系反渗透膜GE SEPA CE(GE Osmonics制)在50℃下在纤维素酶酶液ノボザイム188(来源于黑曲霉的β葡糖苷酶制剂，シグマ·アルドリツチ·ジヤパン)中浸泡1天之后用RO水进行洗涤而得的膜(反渗透膜5)，回收透过液直到原水的液量被浓缩到添加时的1/4。
将与透过液等量的RO水添加到原水槽内的浓缩液中，然后通过HPLC(岛津制)对原水槽和透过液中包含的发酵抑制物的浓度进行分析，计算出发酵抑制物(乙酸、甲酸、HMF、糠醛、香草醛、乙酰香草醛、丁香酸)的透过率和单糖(葡萄糖、木糖)的透过率。其结果是，尽管任意反渗透膜都可以阻挡单糖和发酵抑制物，但特别是反渗透膜1～2，即聚酰胺系、交联全芳香族聚酰胺系的反渗透膜显示出单糖的透过率低，而发酵抑制物的透过率高。此外还表明了乙酸纤维素系的膜对纤维素酶耐性弱(表27和表28)。
表27各反透过过滤膜的发酵抑制物透过率的比较
  乙酸   甲酸   HMF   糠醛   香草醛   乙酰香草醛   丁香酸
 反渗透膜1   50％   80％   25％   55％   15％   10％   10％
 反渗透膜2   50％   80％   25％   55％   15％   10％   10％
 反渗透膜3   45％   75％   20％   55％   15％   10％   10％
 反渗透膜4   30％   50％   5％   15％   5％   0％   0％
 反渗透膜5   99％   99％   99％   99％   95％   92％   85％
表28各反透过过滤膜的单糖透过率的比较
  葡萄糖   木糖
 反渗透膜1   0.1％   0％
 反渗透膜2   0.1％   0％
 反渗透膜3   0.2％   0.1％
 反渗透膜4   1.0％   2.0％
 反渗透膜5   75％   85％
(实施例15)单糖和发酵抑制物的浓缩效果的比较
为了比较单糖和发酵抑制物的浓缩效果，将糖水溶液通过纳滤膜和/或反渗透膜进行了过滤的情况下的单糖和发酵抑制物的浓缩度进行了比较。对于参考例5中获得的氨处理-酶处理糖水溶液60L，用氨水和硫酸将其pH值调整为3，然后用精滤膜进行过滤。再通过超滤膜进行过滤。此时的浊度为0.5NTU以下。将该滤液分成3份(每份20L)分别用与实施例7同样的方法进行以下处理：仅用纳滤膜进行处理直到原液侧的量变为5L(4倍浓缩)、用纳滤膜进行处理直到原液侧的量变为10L(2倍浓缩)之后用反渗透膜进行处理直到原液侧的量变为10L(再进行2倍浓缩，总共4倍浓缩)、仅用反渗透膜进行处理直到原液侧的量变为5L(4倍浓缩)。作为纳滤膜，使用了交联哌嗪聚酰胺系纳滤膜UTC60(纳滤膜1；東レ株式会社制)，作为反渗透膜，使用了交联全芳香族聚酰胺系反渗透膜UTC80(反渗透膜1；東レ株式会社制)。
在参考例1所示的条件下通过HPLC对纯化糖液中包含的单糖和发酵抑制物的浓度进行了分析，分析结果示于表29。其中，表中的浓度下方的括号内分别显示将葡萄糖稀释成50g/L之后的浓度。该结果表明了，与单糖的浓缩度相比，发酵抑制物的浓缩度低，按照纳滤膜处理、纳滤膜处理后反渗透膜处理、反渗透膜处理的顺序，与葡萄糖浓度相应的发酵抑制物除去性能依次更好。另一方面，通过合并使用纳滤膜和反渗透膜，能够抑制在糖浓度为100g/L以上的高浓度情况下显著显现的向纳滤膜的滤液侧的损失，发酵抑制物的除去性能与仅用反渗透膜进行处理的情况相比也得到了大幅度改善。
表29单糖和发酵抑制物的定量
Figure BDA0000067135400000441
(实施例16)利用低压/超低压型反渗透膜的纯化糖液的制造例
为了将与反渗透膜种类对应的单糖和发酵抑制物的浓缩效果进行比较，用与实施例6同样的方法使用模型糖液通过透过流量不同的反渗透膜进行过滤。将生物质进行水解处理而得的糖水溶液的模型糖液各自的组成示于表30。
表30模型糖液的组成
  葡萄糖   木糖   乙酸
  模型糖水溶液   40g/L   20g/L   2g/L
作为反渗透膜，使用了作为低压型的例子的Filmtec制BW-30(反渗透膜6)、東レ株式会社制SU-700(反渗透膜7)、作为超低压型的例子的KOCH制TFC-ULP(反渗透膜8)、東レ株式会社制SUL-G10(反渗透膜9)、以及作为参考的中压型的DESAL社制DESAL-3B(反渗透膜10)。各膜在0.75MPa的过滤压、pH 6.5下，膜单位面积的氯化钠(500mg/L)的透过流量(m3/m2/天)示于表31。
表31各反渗透膜的透过流量的值
  透过流量(m3/m2/天)
  反渗透膜6   0.51
  反渗透膜7   0.51
  反渗透膜8   0.9
  反渗透膜9   0.8
  反渗透膜10   0.27
用与实施例1同样的方法将使用硫酸或氢氧化钠将pH值调整为2、3、4、5、6、7而得的模型糖液A和B进行过滤，用参考例1记载的方法对透过液中包含的作为发酵抑制物的乙酸和糖的浓度进行了定量。结果示于表32和表33。关于乙酸的透过率，观察到了由pH值不同产生的差异，并观察到了低压型与超低压型相比糖损失极略微地较少的倾向。由以上结果判明，超低压/低压反渗透膜的有机酸除去性能优异，即使原水的pH值为大于3的值，也可以有效地除去发酵抑制物。
表32各pH下的各反渗透膜的乙酸透过率的比较
 反渗透膜6  反渗透膜7  反渗透膜8  反渗透膜9   反渗透膜10
  pH2.0  78％  80％  99％  99％   45％
  pH3.0  60％  65％  82％  78％   45％
  pH4.0  45％  50％  60％  58％   25％
  pH5.0  20％  20％  35％  33％   15％
  pH6.0  5％  5％  10％  10％   0％
  pH7.0  0％  0％  5％  5％   0％
表33各反渗透膜的糖透过率的比较
  葡萄糖   木糖
  反渗透膜6   0.5％   0.5％
  反渗透膜7   0.5％   0.5％
  反渗透膜8   1.0％   1.2％
  反渗透膜9   0.8％   1.0％
  反渗透膜10   0.2％   0.1％
接下来，为了更详细地说明使用本发明获得的纯化糖液作为发酵原料的化学品的制造方法，对于作为化学品的L-乳酸、D-乳酸、乙醇、尸胺、琥珀酸列举实施例进行说明。然而，能够根据本发明制造的化学品不限于以下的实施例。
(参考例6)化学品的浓度测定方法
[L-乳酸、D-乳酸]
L-乳酸或D-乳酸蓄积浓度测定通过用HPLC法测定乳酸量进行确认。
柱：Shim-Pack SPR-H(株式会社岛津制作所制)
流动相：5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/分钟)
反应液：5mM对甲苯磺酸，20mM Bis-Tris，0.1mM EDTA·2Na(流速0.8mL/分钟)
检测方法：电导率
温度：45℃。
此外，L-乳酸的光学纯度测定在以下条件下通过HPLC法进行测定。
柱：TSK-gel Enantio L1(東ソ一株式会社制)
流动相：1mM硫酸铜水溶液
流速：1.0mL/分钟
检测方法：UV254nm
温度：30℃。
此外，L-乳酸的光学纯度根据下式计算。
光学纯度(％)＝100×(L-D)/(L+D)
此处，L表示L-乳酸的浓度，D表示D-乳酸的浓度。另外，D-乳酸的光学纯度也同样地计算。
[乙醇]
乙醇蓄积浓度的测定通过气相色谱法进行定量。使用ShimadzuGC-2010 capillary GC TC-1(GL science)15 meter L.＊0.53mm I.D.，df1.5μm，用氢火焰离子化检测器进行检测、计算并评价。
[尸胺]
尸胺通过以下所示的HPLC法进行评价。
使用柱：CAPCELL PAK C18(株式会社资生堂制)
流动相：0.1％(w/w)磷酸水溶液∶乙腈＝4.5∶5.5
检测：UV360nm
样品前处理：在分析样品25μL中添加作为内标的1，4-丁二胺(0.03M)25μL、碳酸氢钠(0.075M)150μL和2，4-二硝基氟苯(0.2M)的乙醇溶液并进行混合，在37℃的温度下保温1小时。
在将上述反应溶液50μL溶解在1mL乙腈中之后，以10,000转/分钟离心5分钟，然后取上清液10μL进行HPLC分析。
[琥珀酸]
关于琥珀酸蓄积浓度的测定，用HPLC(株式会社岛津制作所LC10A，RI检测器：RID-10A，柱：アミネツクスHPX-87H)进行分析。柱温为50℃，用0.01N H2SO4平衡柱，然后进样，用0.01N H2SO4溶出，从而进行分析。
(参考例7)具有L-乳酸生产能力的酵母株的制作
具有L-乳酸生产能力的酵母株如下制成。通过将来源于人的LDH基因连接在酵母基因组上的PDC1启动子的下游，从而制成了具有L-乳酸生产能力的酵母株。聚合酶链反应(PCR)使用La-Taq(タカラバイオ株式会社)或KOD-Plus-polymerase(东洋纺株式会社制)，按照附带的操作说明进行操作。
在对人乳癌细胞株(MCF-7)进行培养回收之后，使用TRIZOL Reagent(インビトロジエン社制)来提取RNA，以所得的RNA为模板使用SuperScript Choice System(インビトロジエン社制)通过反转录反应进行cDNA的合成。这些操作的细节均依照附带的操作规程。将所得的cDNA作为接下来的PCR的扩增模板。
通过以上述操作中获得的cDNA为扩增模板，以序列号1和序列号2所示的寡核苷酸为引物集，利用KOD-Plus-polymerase(东洋纺株式会社制)通过PCR进行L-ldh基因的克隆。纯化各PCR扩增片段，将末端用T4多核苷酸激酶(タカラバイオ株式会社制)进行磷酸化，然后与pUC118载体(是用限制性酶HincII切割，并将切割面进行了去磷酸化处理后的载体)连接。连接使用DNA Ligation Kit Ver.2(タカラバイオ株式会社制)进行。用连接质粒产物转化大肠杆菌DH5α，并回收质粒DNA，从而获得亚克隆有各种L-ldh基因(序列号3)的质粒。将所得的插入有L-ldh基因的pUC118质粒用限制性酶XhoI和NotI消化，将所得的各DNA片段插入到酵母表达用载体pTRS11(图7)的XhoI/NotI切割位点中。这样获得了来源于人L-ldh基因表达质粒pL-ldh5(L-ldh基因)。另外，作为来源于人的L-ldh基因表达载体的上述pL-ldh5以单独质粒的形式保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(日本茨城县筑波市东1-1-1中央第6)(保藏日：平成17年(2005年)2月21日)，保藏编号为FERM AP-20421。
以包含来源于人LDH基因的质粒pL-ldh5为扩增模板，以序列号4和序列号5所示的寡核苷酸为引物集，通过PCR来扩增包含1.3kb的来源于人的LDH基因和来源于酿酒酵母的TDH3基因的终止子序列的DNA片段。此外，以质粒pRS424为扩增模板，以序列号6和序列号7所示的寡核苷酸为引物集，通过PCR来多扩增包含1.2kb的来源于酿酒酵母的TRP1基因的DNA片段。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离各个DNA片段，按照常规方法进行纯化。将以这里所得的1.3kb片段、1.2kb片段的混合物为扩增模板、以序列号4和序列号7所示的寡核苷酸为引物集通过PCR法获得的产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，按照常规方法制备出连接有来源于人的LDH基因和TRP1基因的2.5kb的DNA片段。用该2.5kb的DNA片段按照常规方法将牙殖酵母即酿酒酵母NBRC10505株转化成非色氨酸营养缺陷型。
如下确认所得的转化细胞是来源于人的LDH基因连接在酵母基因组上的PDC1启动子的下游的细胞。首先，按照常规方法制备转化细胞的基因组DNA，将其作为扩增模板，以序列号8和序列号9所示的寡核苷酸作为引物集，通过PCR来获得0.7kb的扩增DNA片段，从而进行确认。此外，对于转化细胞是否具有乳酸生产能力，通过用HPLC法测定乳酸量而确认了用SC培养基(METHODS IN YEAST GENETICS 2000 EDITION，CSHL PRESS)对转化细胞进行培养后的培养上清液中包含乳酸。
HPLC分析的结果是，检测到了4g/L的L-乳酸，D-乳酸为检测限以下。由以上研究确认了，该转化体具有L-乳酸生产能力。将所得的转化细胞作为酵母SW-1株用于接下来的L-乳酸发酵。
(参考例8)L-乳酸发酵(酵母)
利用参考例7中获得的酵母株(SW-1)进行L-乳酸发酵。培养基以表34所示比率混合有作为碳源的葡萄糖、作为其它成分的Yeast SyntheticDrop-out Medium Supplement Without Tryptophan(シグマ·アルドリツチ·ジヤパン，表34中的Drop-out MX)、Yeast Nitrogen Base w/o AminoAcids and Ammonium Sulfate(Difco，Yeast NTbase)和硫酸铵。培养基进行过滤灭菌(ミリポア，ステリカツプ0.22μm)后用于发酵。葡萄糖浓度使用グルコ一ステスト和光(和光纯药工业株式会社制)来定量。此外，各培养液中产生的乳酸量在与参考例6同样的条件下用HPLC测定。
表34L-乳酸发酵用培养基组成
  组成   组成成分浓度
  葡萄糖   50g/L
  Drop-out MX   3.8g/L
  Yeast NTbase   1.7g/L
  硫酸铵   5g/L
将SW-1株在试管中用5mL的发酵用培养基(前培养培养基)振荡培养过夜(前培养)。通过离心分离从前培养液中回收酵母，用灭菌水15mL充分洗涤。将洗涤后的酵母接种到表34记载组成的各培养基100mL中，用500mL容量的坂口烧瓶中振荡培养40小时(主培养)。
(参考例9)L-乳酸发酵方法(乳酸菌)
培养基使用表35所示的L-乳酸菌发酵培养基，进行高压蒸气灭菌处理(121℃，15分钟)再使用。作为乳酸菌，使用作为原核微生物的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)JCM7638株，作为培养基，使用表35所示的组成的乳酸菌乳酸发酵培养基。发酵液中包含的L-乳酸用与参考例1同样的方法评价。此外，葡萄糖浓度的测定使用了グルコ一ステストワコ一C(和光纯药工业株式会社制)。
表35乳酸菌乳酸发酵培养基
  组成   组成成分浓度浓度
  葡萄糖   50g/L
  酵母提取物   5g/L
  多聚蛋白胨   5g/L
  氯化钠   5g/L
将乳酸乳球菌JCM7638株在试管中用表35所示的以5mL氮气进行了吹扫的乳酸发酵培养基、在37℃的温度下静置培养24小时(前培养)。将所得的培养液接种到用氮气吹扫了的新鲜的乳酸发酵培养基50mL中，在37℃的温度下静置培养48小时(主培养)。
(参考例10)乙醇发酵(酵母)
研究了利用酵母株(OC2、酿酒酵母、葡萄酒酵母)的乙醇发酵。关于培养基，将参考例8的组成的培养基进行过滤灭菌(ミリポア，ステリカツプ0.22μm)后用于发酵。葡萄糖浓度的定量使用グルコ一ステスト和光(和光纯药工业株式会社制)。此外，各培养液中产生的乙醇量在与参考例7同样的条件下通过GC进行测定。
将OC2株在试管中用5mL的发酵用培养基(前培养培养基)振荡培养过夜(前培养)。通过离心分离从前培养液中回收酵母，用灭菌水15mL充分洗涤。将洗涤后的酵母接种到表34记载组成的各培养基100mL中，用500mL容量的坂口烧瓶振荡培养24小时(主培养)。
(参考例11)尸胺发酵(谷氨酸棒杆菌)
作为生产尸胺的微生物，使用日本特开2004-222569号公报中记载的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TR-CAD1株，研究了将用于同化葡萄糖的尸胺的发酵。关于培养基，按照使碳源为表36所示的葡萄糖组成且用3M的氨水将pH值调整为7.0的方式调制糖液，从而制备出尸胺发酵培养基。作为生产物的尸胺的浓度的评价用HPLC法进行测定。此外，葡萄糖浓度的测定使用了グルコ一ステストワコ一C(和光纯药工业株式会社制)。
表36尸胺发酵培养基
  组成   组成成分浓度浓度
  葡萄糖   50g/L
  柠檬酸   1g/L
  尿素   15g/L
  磷酸二氢钾   0.5g/L
  磷酸氢二钾   0.5g/L
  硫酸镁7水合物   0.5g/L
  L-苏氨酸   0.8g/L
  L-甲硫氨酸   0.6g/L
  L-亮氨酸   1.5g/L
  硫酸铁七水合物   6.0mg/L
  硫酸锰一水合物   4.2mg/L
  生物素   1.0mg/L
  硫胺素   2.0mg/L
将谷氨酸棒杆菌TR-CAD1株在试管中用添加了5mL卡那霉素(25μg/mL)的尸胺发酵培养基中振荡培养过夜(前培养)。通过离心分离从前培养液中回收谷氨酸棒杆菌TR-CAD1株，用灭菌水15mL充分洗涤。将洗涤后的菌体接种到上述培养基100mL中，用500mL容量的坂口烧瓶振荡培养24小时(主培养)。
(参考例12)D-乳酸发酵
作为微生物，使用日本特开2007-074939记载的酵母NBRC10505/pTM63株，作为培养基，使用表37所示的组成的D-乳酸生产培养基，作为生产物的D-乳酸的浓度的评价通过与参考例1同样的HPLC法来测定。此外，葡萄糖浓度的测定使用了グルコ一ステストワコ一C(和光纯药工业株式会社制)。
表37D-乳酸发酵培养基
将NBRC10505/pTM63株在试管中用5mL的D-乳酸生产培养基振荡培养过夜(前培养)。将所得的培养液接种到新鲜的D-乳酸生产培养基50mL中，用500mL容量的坂口烧瓶在30℃的温度下振荡培养24小时(主培养)。
(参考例13)琥珀酸发酵方法
作为具有琥珀酸生产能力的微生物，使用产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)ATCC53488株进行了琥珀酸的发酵。将表38的组成的菌种培养用培养基100mL加入到125mL容量的三角烧瓶中进行加热灭菌。
表38琥珀酸发酵培养基
  组成   组成成分浓度浓度
  葡萄糖   50g/L
  多聚蛋白胨   10g/L
  酵母提取物   5g/L
  磷酸氢二钾   1g/L
  氯化钠   1g/L
  氯化镁   0.2g/L
在厌氧手套箱内加入30mM Na2CO3 1mL和180mM H2SO4 0.15mL，然后加入包含0.25g/L半胱氨酸·HCl、0.25g/L Na2S的还原溶液0.5mL，然后接种ATCC53488株，在39℃下静置培养24小时(主培养)。
(实施例17)使用稀硫酸处理-酶处理糖水溶液的纯化糖液的化学品发酵
使用由利用旋转蒸发器(东京理化器械株式会社制)将实施例1的糖水溶液或纯化糖液(纳滤膜处理、反渗透膜处理)各1L在减压下(200hPa)使水蒸发而浓缩到约3倍左右而得的浓缩液、以及作为比较的试剂葡萄糖，在参考例8～13的发酵条件下在各培养基成分的浓度条件下调制适合各发酵的培养基成分，在主培养中使用。另外，在前培养中使用试剂单糖，仅在主培养时使用各糖液。其结果如表39所示，通过进行膜处理，与未处理的情况相比，发酵抑制被抑制，化学品的蓄积浓度得到了改善。
表39化学品的蓄积浓度
Figure BDA0000067135400000541
此外，关于使用了酵母的L-乳酸的发酵试验(参考例8)，发酵时的糖液的葡萄糖消耗量和对糖(葡萄糖)收率示于表40。通过将糖水溶液进行纳滤膜或反渗透膜处理，与不进行处理的情况相比，关于糖的消耗也观察到了改善倾向。
表40L-乳酸发酵中的葡萄糖消耗量和对糖收率
  糖水溶液   NF膜处理   RO膜处理   试剂单糖
  葡萄糖消耗量   31g/L   48g/L   48g/L   49g/L
  对糖(葡萄糖收率)   16％   25％   24％   28％
(实施例18)使用了水热处理-酶处理糖水溶液的纯化糖液的化学品发酵
使用由利用旋转蒸发器(东京理化器械株式会社制)将实施例2的糖水溶液或纯化糖液(纳滤膜处理、反渗透膜处理)各约1L在减压下(200hPa)使水蒸发而浓缩到约1.2倍左右而得的浓缩液、以及作为比较的试剂葡萄糖，在参考例8～13所示的发酵条件下在各培养基成分的浓度条件下调制适合各发酵的培养基成分，在主培养中使用。另外，在前培养中使用试剂单糖，仅在主培养时使用各糖液。其结果如表41所示，通过进行膜处理，与未处理的情况相比，发酵抑制被抑制，化学品的蓄积浓度得到了改善。
表41化学品的蓄积浓度
Figure BDA0000067135400000551
(实施例19)使用氨处理-酶处理糖水溶液的纯化糖液的化学品发酵
使用利用旋转蒸发器(东京理化器械株式会社制)将实施例3的糖水溶液或纯化糖液(纳滤膜处理、反渗透膜处理)各约1L在减压下(200hPa)使水蒸发而浓缩到约1.2倍左右而得的浓缩液、以及作为比较的试剂葡萄糖，在参考例8～13所示的发酵条件下在各培养基成分的浓度条件下调制适合各发酵的培养基成分，在主培养中使用。另外，在前培养中使用试剂单糖，仅在主培养时使用各糖液。其结果如表42所示，通过进行膜处理，与未处理的情况相比，发酵抑制被抑制，化学品的蓄积浓度得到了改善。
表42化学品的蓄积浓度
Figure BDA0000067135400000561
(实施例20)使用水热处理糖水溶液的纯化糖液的化学品发酵
使用由利用旋转蒸发器(东京理化器械株式会社制)将实施例4的糖水溶液或纯化糖液(NF膜处理、RO膜处理)各1L在减压下(200hPa)使水蒸发而浓缩到约20倍左右而得的浓缩液、以及作为比较的试剂葡萄糖，在参考例8～13所示的发酵条件下在各培养基成分的浓度条件下调制适合各发酵的培养基成分，在主培养中使用。另外，在前培养中使用试剂单糖，仅在主培养时使用各糖液。其结果如表43所示，通过进行膜处理，与未处理的情况相比，发酵抑制被抑制，化学品的蓄积浓度得到了改善。
表43化学品的蓄积浓度
Figure BDA0000067135400000571
(实施例21)糖水溶液的pH值对化学品制造的影响
为了研究糖水溶液的pH值对使用纯化糖液的化学品的制造的影响，将糖水溶液的pH值不同的情况下的L-乳酸发酵进行了比较、研究。作为发酵培养基的碳源，使用实施例7的2种纯化糖液(在糖水溶液pH值为3或pH值为7下进行反渗透膜处理)，并且作为对照，使用试剂葡萄糖。对实施例7的各纯化糖液0.5L用硫酸和氨水将其pH值调整为5，再对将葡萄糖浓度稀释到55g/L而得的糖液A和B(A：在pH 3下进行反渗透膜处理，B：在pH 7下进行反渗透膜处理)，按照参考例8的表34所示的L-乳酸发酵用培养基所示的比率混合Yeast Synthetic Drop-out MediumSupplement Without Tryptophan(シグマ·アルドリツチ·ジヤパン，表34 Drop-out MX)、Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and AmmoniumSulfate(Difco，Yeast NTbase)和硫酸铵，从而制成各纯化糖液A、B培养基。同样地，试剂单糖培养基按照表34所示的比率混合试剂葡萄糖进行调整。
各培养基进行过滤灭菌(ミリポア，ステリカツプ0.22μm)用于发酵。葡萄糖浓度的定量使用グルコ一ステスト和光(和光纯药工业株式会社制)。此外，各培养液中产生的乳酸量在与参考例2的有机酸的HPLC测定同样的条件下通过HPLC进行测定。
按照参考例8，将酵母SW-1株在试管中用5mL的试剂单糖培养基进行前培养，然后在纯化糖液A、B培养基、试剂单糖培养基中实施主培养，结果如表44所示，可以确认，相对于将糖水溶液(pH 7)进行了反渗透膜处理得到的纯化糖液，用糖水溶液(pH 3)进行了反渗透膜处理得到的纯化糖液与试剂单糖培养基同等地，微生物的葡萄糖消耗量增大，发酵抑制降低。此外，在乳酸蓄积浓度方面，用糖水溶液(pH 3)通过反渗透膜进行过滤处理得到的纯化糖液培养基也显示出与试剂单糖培养基同等的乳酸蓄积浓度。
表44L-乳酸发酵的结果(培养24小时后)
  葡萄糖消耗量   乳酸蓄积浓度   对糖(葡萄糖)收率
 纯化糖液A培养基   50g/L   14g/L   28％
 纯化糖液B培养基   40g/L   10g/L   25％
 试剂单糖培养基   50g/L   14g/L   28％
(实施例22)化学品的制造中的纳滤膜与反渗透膜的性能比较
为了比较化学品的制造中的纳滤膜与反渗透膜的性能，将通过利用纳滤膜得到的纯化糖液、利用反渗透膜得到的纯化糖液、利用纳滤膜和反渗透膜得到的纯化糖液进行的乙醇发酵进行了比较、研究。作为碳源，使用实施例15的3种纯化糖液(纳滤膜处理、反渗透膜处理、纳滤膜处理之后反渗透膜处理)，而且作为对照，使用试剂葡萄糖。对实施例15中获得的浓缩糖液各约0.5L用氨水将其pH值调整为5，再对葡萄糖浓度稀释到55g/L而得的糖液E、F和G(E：纳滤膜处理，F：纳滤膜处理之后反渗透膜处理，G：反渗透膜处理)按照参考例8的表34所示的比率混合YeastSynthetic Drop-out Medium Supplement Without Tryptophan(シグマ·アルドリツチ·ジヤパン，表34Drop-out MX)、Yeast Nitrogen Base w/oAmino Acids and Ammonium Sulfate(Difco，Yeast NTbase)和硫酸铵，从而制成了各纯化糖液C～E培养基。同样地，试剂单糖培养基按照表34所示的比率混合试剂葡萄糖进行调制。
各培养基进行过滤灭菌(ミリポア，ステリカツプ0.22μm)用于发酵。葡萄糖浓度的定量使用グルコ一ステスト和光(和光纯药工业株式会社制)。此外，各培养液中产生的乙醇量在参考例1的条件下通过GC进行测定。
按照参考例9，将OC2株在试管中用5mL的试剂单糖培养基进行前培养，然后在纯化糖液C～E培养基、试剂单糖培养基中实施主培养，结果如表45所示，可以确认，在使用利用纳滤膜得到的纯化糖液的E和F中微生物的葡萄糖消耗量和乙醇蓄积浓度与试剂单糖培养基同等，发酵抑制降低。此外可以确认，在使用利用反渗透膜得到的纯化糖液的E中，虽然比C和D稍差，但是与试剂单糖培养基具有几乎同等地发酵。
表45乙醇发酵的结果(培养48小时后)
  葡萄糖消耗量   乙醇蓄积浓度
 纯化糖液C培养基   50g/L   29g/L
 纯化糖液D培养基   50g/L   29g/L
 纯化糖液E培养基   48g/L   27g/L
 试剂单糖培养基   50g/L   29g/L
(参考例14)尸胺发酵大肠杆菌的制作
为了增加大肠杆菌染色体中存在的赖氨酸脱羧酶基因的表达量从而提高尸胺发酵能力，尝试制作将赖氨酸脱羧酶基因的启动子置换成了大肠杆菌的gapA基因(甘油醛脱氢酶基因)启动子的株。启动子的置换是使用FLP重组酶通过同源重组来改变基因破坏方法从而进行的。以下示出制作方法。
<1>gapA基因启动子的克隆
培养大肠杆菌W3110株，离心回收，然后使用UltraClean MicrobialDNA Isolation Kit(MO BIO社制)进行基因组DNA的提取。详细的操作方法依照附带的操作规程。
以上述那样获得的基因组DNA为模板，以寡核苷酸(序列号10(KS029)、序列号11(KS030))为引物集，通过PCR扩增gapA基因启动子(gapA基因的上游500bp，以下简称为gapA启动子)。PCR扩增反应使用KOD-Plus polymerase(东洋纺株式会社制)，反应缓冲液、dNTPmix等使用附带品。调制成50μL的反应体系，使得如上所述依照附带的操作规程调制的基因组DNA为50ng/样品，引物为50pmol/样品，且KOD-Pluspolymerase(东洋纺株式会社制)为1单位/样品。将反应溶液用PCR扩增装置iCycler(BIO-RAD社制)在94℃的温度下热变性5分钟，然后将94℃(热变性)：30秒、55℃(引物的退火)：30秒，68℃(互补链的延伸)：30秒作为1个循环进行30个循环，然后冷却到4℃的温度。另外，基因扩增用引物(序列号10(KS029)、序列号11(KS030))制作成5’末端侧和3’末端侧附加HindIII识别序列那样。
将各PCR扩增片段进行纯化，再将末端用T4多核苷酸激酶(タカラバイオ株式会社制)进行磷酸化，然后与pUC118载体(是用限制性酶HincII切割，将切割面进行去磷酸化处理后的载体)连接。连接使用DNA LigationKit Ver.2(タカラバイオ株式会社制)进行。用连接溶液转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞(タカラバイオ株式会社制)，接种到包含抗生素氨苄青霉素50μg/mL的LB平板上培养过夜。对于生长的菌落，用Miniprep回收质粒DNA，用限制性酶HindIII切割，筛选插入有gapA启动子的质粒。这一系列操作全部按照附带的操作规程进行。
<2>赖氨酸脱羧酶基因的克隆
接下来，以<1>所得的大肠杆菌W3110的基因组DNA为模板，以寡核苷酸(序列号12(CadAF2)、序列号13(CadAR2))为引物集进行PCR，从而克隆编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因。PCR扩增反应中除了仅将延伸反应变成2分钟以外，在与<1>同样的条件下进行。另外，基因扩增用引物(序列号12(CadAF2)、序列号13(CadAR2))制作成5’末端侧附加HindIII识别序列、3’末端侧附加XbaI识别序列那样。将所得的DNA片段用与<1>同样的方法与pUC118载体连接，获得了插入有cadA基因的pUC118载体。将所得的载体用限制性酶HindIII和XbaI切割，确认了插入有cadA基因的质粒。
接下来，将插入了该cadA基因的pUC118载体用限制性酶HindIII和XbaI切割，将所得的包含cadA基因的DNA片段与pUC19的HindIII/XbaI切割位点连接，回收所得的质粒DNA，用限制性酶HindIII和XbaI切割，从而筛选出插入了cadA基因的表达载体。将所得的质粒作为pHS7。
<3>氯霉素抗性基因的克隆
接下来，以氯霉素抗性基因(cat基因)和在其上下游具有FLP识别位点(FRT)的载体pKD3为模板，以寡核苷酸(序列号14、序列号15)为引物集，通过PCR来克隆cat基因。PCR扩增反应中除了仅将延伸反应变成1分钟以外，在与<1>同样的条件下进行。另外，基因扩增用引物(序列号14、序列号15)制作成5’末端侧附加BamHI识别序列、3’末端侧附加SacI识别序列那样。将所得的DNA片段用与<1>同样的方法与pUC118载体连接，获得了插入有cat基因的pUC118载体。将所得的载体用限制性酶BamHI和SacI切割，确认了插入有cat基因的质粒。
<4>将cat基因和gapA启动子插入pHS7
接下来，将插入有cat基因的pUC118载体用限制性酶BamHI切割，将所得的DNA片段导入到上述pHS7的BamHI/SacI切割位点，从而制作质粒。将所得的载体用限制性酶BamHI和SacI切割，确认了插入有cat基因。将这样得到的质粒作为pKS5。
<5>将gapA启动子-cadA基因盒导入染色体
接下来，将插入了gapA启动子的pUC118载体用限制性酶HindIII切割，将所得的DNA片段导入到上述pKS5的HindIII切割位点，从而制作质粒。以该质粒DNA为模板，以寡核苷酸(序列号16(M13 RV)、序列号11(KS030))为引物集进行PCR。PCR使用PremixTaq ExTaq Ver(タカラバイオ株式会社制)进行。通过该PCR，筛选出可获得约500bp的扩增片段的质粒作为目标质粒。将这样获得的质粒作为pKS8。
以如<4>那样获得的pKS8为模板，以寡核苷酸(序列号17(KS032)、序列号18(KS033))为引物集，通过PCR扩增包含gapA启动子、cadA基因、cat基因的DNA片段。PCR扩增反应使用KOD-Plus polymerase(东洋纺株式会社制)，反应缓冲液、dNTPmix等使用附带品。调制成50μL的反应体系，使得质粒DNA为50ng/样品、引物为50pmol/样品且KOD-Pluspolymerase(东洋纺株式会社制)为1单位/样品。将反应溶液用PCR扩增装置iCycler(BIO-RAD社制)在94℃的温度下热变性5分钟，然后将94℃(热变性)：30秒，65℃(引物的退火)：30秒，68℃(互补链的延伸)：3分30秒作为1个循环进行30个循环，然后冷却到4℃的温度。按照常规方法从电泳后的琼脂糖凝胶中提取所得的约3.5kb的扩增片段，调整为500ng/μL。
将在W3110株中导入了具有FLP重组酶的质粒pKD46而成的株(记为W3110/pKD46)接种到5mL的LB培养基中，在30℃下培养过夜(前培养)。将所得的前培养液以1％接种到5mL的SOB培养基(含有1mM阿拉伯糖)中，在30℃下进行培养至OD600变为0.6(主培养)。将主培养液离心进行集菌，然后通过用冰冷却的10％甘油洗涤3次，在最终50μL的10％甘油中悬浮菌体。在该菌体悬浮液中添加2μL上述那样纯化后的PCR扩增片段，用冰冷却30分钟。将该悬浮液转移到电穿孔用杯(0.2cm)中，使用GenePulser Xcell(BIO-RAD社制)进行电穿孔(2500V，25μF，200Ω)。在施加了电脉冲之后，在杯中添加1mL的SOC培养基，回收菌体悬浮液，在37℃下培养2.5小时。将培养液涂布在添加了25μg/L氯霉素的LB琼脂培养基上，在37℃下培养过夜。
在确认了所得的菌落在添加了氨苄青霉素的LB培养基中不生长之后，通过以提取出的基因组为模板、以寡核苷酸(序列号19(KS007)、序列号20(KS008))为引物进行PCR，来证实该菌落是作为目标的cadA基因的启动子被置换成了gapA启动子的株。目标同源重组株会获得约3.8kb的扩增片段，与此相对，没有在目标位置通过同源重组进行插入的株会获得约2.3kb的扩增片段。其结果确认了约3.8kb的扩增片段。将该cadA基因的启动子被置换成了gapA启动子的株作为W3110(gapA-cadA)株。
(实施例23)包含木糖成分的纯化糖液的制造
作为包含大量木糖成分的糖液，用氢氧化钙水溶液和硫酸将参考例3的稀硫酸处理液(木糖浓度15g/L)和参考例4的水热处理液(木糖浓度14g/L)分别调整成pH值为3和pH值为7，然后用精滤膜进行过滤。此时的浊度分别为1.0NTU以下。将上述共计4种糖水溶液通过与实施例1同样的方法进行纳滤膜处理，从而获得了纯化糖液。作为纳滤膜，使用交联哌嗪聚酰胺系纳滤膜UTC60(纳滤膜1；東レ株式会社制)，进行过滤直到各原水的液量变为添加时的1/4。此时用HPLC(株式会社岛津制作所制)分析原水槽的浓缩液中包含的发酵抑制物和单糖的浓度，结果是，发酵抑制物(乙酸、甲酸、HMF、糠醛、香草醛、乙酰香草醛、丁香酸)和单糖(葡萄糖、木糖)如表46和表47所示。
表46包含大量木糖成分的纯化糖液中所含的发酵抑制物
Figure BDA0000067135400000631
表47包含大量木糖成分的纯化糖液的单糖组成
Figure BDA0000067135400000632
(实施例24)使用木糖糖液利用大肠杆菌的尸胺发酵
利用参考例14的尸胺发酵大肠杆菌株(W3110(gapA-cadA)株)进行尸胺发酵试验。在培养基中，作为碳源，使用共计5种：实施例23的纯化糖液4种、以及作为比较的使用了试剂葡萄糖和木糖的试剂单糖。对纯化糖液各0.5L用硫酸和氨水将其pH值调整为5而得的糖液F、G、H、I(F：将水热处理液在pH值3下进行纳滤膜处理，G：将水热处理液在pH值7下进行纳滤膜处理，H：将稀硫酸处理液在pH值3下进行纳滤膜处理，I：将稀硫酸处理液在pH值7下进行纳滤膜处理)，按照表48所示的比率混合硫酸镁、硫酸铵、磷酸二氢钾、多聚蛋白胨S，分别制成纯化糖液F～I培养基。试剂单糖培养基按照表48所示的比率混合进行调整，使得试剂木糖为50g/L。各培养基进行过滤灭菌(ミリポア，ステリカツプ0.22μm)用于发酵。木糖浓度的定量使用木糖浓度测定试剂盒(メガザイム社)。
表48利用大肠杆菌的尸胺发酵用培养基组成
 组成   组成成分浓度浓度
 木糖   50g/L
 硫酸镁   1g/L
 硫酸铵   16g/L
 磷酸二氢钾   1g/L
 多聚蛋白胨S   10g/L
将W3110(gapA-cadA)株在试管中用5mL的试剂单糖培养基振荡培养过夜(前培养)。通过离心分离从前培养液中回收菌体，用灭菌水15mL充分地洗涤。将洗涤后的菌体接种到表56记载的各培养基100mL中，在500mL容量的坂口烧瓶中振荡培养24小时。其结果如表49所示，可以确认，相对于在pH值7下进行了纳滤膜处理的纯化糖液G、I，在pH值3下进行了纳滤膜处理的纯化糖液F、H的木糖消耗量增大，发酵抑制降低。此外，尸胺蓄积浓度方面，也显示出与使用试剂单糖的培养基同等的尸胺蓄积浓度。
表49尸胺发酵的结果(培养48小时后)
  木糖消耗量   尸胺蓄积浓度
 纯化糖液F培养基   47.5g/L   1.0g/L
 纯化糖液G培养基   1.2g/L   0.0g/L
 纯化糖液H培养基   44.0g/L   1.0g/L
 纯化糖液I培养基   24.5g /L   0.6g/L
 试剂单糖培养基   48.5g/L   1.0g/L
产业可利用性
根据本发明，能够从来源于含纤维素的生物质的糖水溶液中除去发酵抑制物，另一方面，能够以高纯度高收率制造包含葡萄糖、木糖等单糖的纯化糖液，因此在将该纯化糖液作为发酵原料的情况下，能够提高各种化学品的发酵生产效率。
附图标记说明
1原水槽
2安装了纳滤膜或反渗透膜的元件
3高压泵
4膜透过液流
5膜浓缩液流
6通过高压泵被输送的培养液流或纳滤膜透过液流
7纳滤膜或反渗透膜
8支撑板
Figure IDA0000067135480000011
Figure IDA0000067135480000021
Figure IDA0000067135480000031
Figure IDA0000067135480000041
Figure IDA0000067135480000061
Figure IDA0000067135480000071

Claims (14)

1.一种糖液的制造方法，是以含纤维素的生物质为原料来制造糖液的方法，该方法包括下述工序：
工序(1)，将含纤维素的生物质进行水解来制造糖水溶液；
工序(2)，将所得的糖水溶液通过纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤，由非透过侧回收纯化糖液，由透过侧除去发酵抑制物。
2.根据权利要求1所述的糖液的制造方法，其中，将所述工序(2)的糖水溶液的pH值调整为1～5。
3.根据权利要求1或2所述的糖液的制造方法，其中，所述发酵抑制物包含选自有机酸、呋喃类化合物和酚类化合物中的1种或2种以上。
4.根据权利要求3所述的糖液的制造方法，其中，所述有机酸是甲酸或乙酸。
5.根据权利要求3所述的糖液的制造方法，其中，所述呋喃类化合物是羟甲基糠醛或糠醛。
6.根据权利要求3所述的糖液的制造方法，其中，所述酚类化合物是香草醛、乙酰香草醛或丁香酸。
7.根据权利要求1～6的任一项所述的糖液的制造方法，其中，所述工序(2)的纯化糖液是以单糖为主成分的糖液。
8.根据权利要求1～7的任一项所述的糖液的制造方法，其中，在所述工序(2)的处理之前，将所述工序(1)所获得的糖水溶液通过精滤膜和/或超滤膜来除去微粒和高分子成分。
9.根据权利要求1～8的任一项所述的糖液的制造方法，其中，将所述工序(2)的糖水溶液的温度调整为1～15℃，且用纳滤膜进行过滤。
10.根据权利要求1～8的任一项所述的糖液的制造方法，其中，将所述工序(2)的糖水溶液的温度调整为40～80℃，且用反渗透膜进行过滤。
11.根据权利要求1～10的任一项所述的糖液的制造方法，其中，所述工序(2)是将糖水溶液通过纳滤膜进行过滤，再将所得的滤液通过反渗透膜进行过滤的工序。
12.根据权利要求1～11的任一项所述的糖液的制造方法，其中，所述工序(2)的纳滤膜和/或反渗透膜的功能层是聚酰胺。
13.根据权利要求1～12的任一项所述的糖液的制造方法，其特征在于，所述工序(2)的纳滤膜的功能层以交联哌嗪聚酰胺为主成分，并且含有化学式1所示的构成成分，
Figure FDA0000067135390000021
化学式1
式中，R表示-H或-CH3，n表示0～3的整数。
14.一种化学品的制造方法，其中，使用通过权利要求1～13的任一项所述的糖液的制造方法获得的糖液作为发酵原料。
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