BR112015018214B1

BR112015018214B1 - Método para produzir solução de açúcar

Info

Publication number: BR112015018214B1
Application number: BR112015018214-3A
Authority: BR
Inventors: Hiroyuki Kurihara; Katsushige Yamada; Chiaki Yamada
Original assignee: Toray Industries, Inc
Priority date: 2013-03-04
Filing date: 2014-03-03
Publication date: 2021-08-03
Also published as: EP2966173A1; BR112015018214A2; JPWO2014136711A1; CA2898969A1; WO2014136711A1; JP6485042B2; EP2966173A4; CA2898969C; EP2966173B1; US20150376669A1; US10041100B2

Abstract

método para produzir solução de açúcar trata-se de um método para produzir solução de açúcar através da repetição de um processo de preparar uma pasta fluida de uma biomassa que contém celulose pré-tratada, hidrolisar a pasta fluida com o uso da celulase de fungos filamentosos, então, submeter o hidrolisado à separação entre sólido e líquido em um componente de solução e um resíduo de hidrólise, filtrar o componente de solução através de uma membrana de ultrafiltração e recuperar a celulase de fungos filamentosos como um não permeado e recuperar a solução de açúcar como um permeado; em que o propósito é usar a solução de lavagem, obtida através da lavagem da membrana de separação após o componente de solução ter sido filtrado através de uma membrana de ultrafiltração, a celulase de fungos filamentosos ter sido recuperada como um não permeado e os melaços tiverem sido recuperados como um permeado, ao preparar a pasta fluida da biomassa que contém celulose pré-tratada para os processos de produção de solução de açúcar subsequentes. isso torna possível suprimir a adsorção da celulase de fungos filamentosos ao resíduo de hidrólise da biomassa que contém celulose e recuperar e/ou reutilizar de modo eficaz a (beta)-glicosidase que desempenha um papel importante na reação de hidrólise em particular; e mantém o custo de produção de solução de açúcar baixo.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente invenção refere-se a um método para produzir uma solução de açúcar a partir de uma biomassa que contém celulose.

TÉCNICA ANTECEDENTE

[002] Nos últimos anos, tem sido amplamente estudado um método para produzir uma solução de açúcar pela hidrólise de uma biomassa que contém celulose com o uso da celulase, de qual o consumo de energia e o ônus ambiental são pequenos. Entretanto, o maior defeito do método para produzir uma solução de açúcar com o uso da celulase é o ponto em que o custo de produção de uma solução de açúcar aumenta devido ao alto preço da celulase. Embora tenha sido proposto um método para recuperar e reutilizar a celulase usada para a hidrólise para solucionar tal problema técnico, esse é um problema em que a capacidade de reutilização é baixa, já que a celulase adsorve fortemente o resíduo de hidrólise produzido mediante a hidrólise da biomassa que contém celulose.

[003] Como um método para reduzir a adsorção de celulase ao resíduo de hidrólise, um método para ajustar a condutividade elétrica do líquido de reação a 5 a 25 mS/cm adicionando-se um sal solúvel em água mediante a hidrólise de uma biomassa que contém celulose (Documento de Patente 1), um método para adicionar partículas de carbonato de cálcio a uma quantidade de 1 a 10% em peso com base no peso de um sólido de uma biomassa que contém celulose (Documento de Patente 2) e similares são conhecidos.

DOCUMENTOS DA TÉCNICA ANTERIOR DOCUMENTOS DE PATENTE

[004] Documento de Patente 1: JP 4947223 B1

[005] Documento de Patente 2: JP 2012-100617 A

SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM SOLUCIONADOS PELA INVENÇÃO

[006] Conforme descrito acima, uma ampla variedade de tentativas de reduzir a quantidade do uso de celulase através da recuperação e reutilização da celulase usada para a hidrólise de uma biomassa que contém celulose é feita. Entretanto, já que a celulase adsorve fortemente o resíduo de hidrólise, a taxa de recuperação é baixa e o problema ainda não foi solucionado. Então, um objetivo da presente invenção é produzir uma solução de açúcar, em que a celulase pode ser recuperada mais eficazmente do que em um método convencional.

SOLUÇÕES DOS PROBLEMAS

[007] Como um resultado de estudos intensivos pelos presentes inventores para solucionar o problema mencionado acima, a presente invenção foi concluída com base nessas revelações: em um método para produzir solução de açúcar através da repetição do processo de produção de solução de açúcar com o uso de uma membrana de ultrafiltração e/ou uma membrana de microfiltração, componentes de enzima de celulase de fungos filamentosos podem ser recuperados de modo altamente eficaz com o uso de uma solução de lavagem, obtida em uma etapa de lavagem de uma membrana de separação, para preparar a calda da biomassa que contém celulose pré-tratada nos processos subsequentes.

[008] Ou seja, a presente invenção tem a seguinte constituição [1] a [6]: [1] um método para produzir solução de açúcar através da repetição de um processo de produção de solução de açúcar que compreende as etapas (1) a (3) a seguir, em que uma solução de lavagem obtida na etapa (4) de lavagem de uma membrana de separação após a etapa (3) é usada para a etapa (1) dos processos de produção de solução de açúcar subsequentes: etapa (1): preparar a calda da biomassa que contém celulose pré- tratada; etapa (2): hidrolisar a calda da biomassa que contém celulase pré-tratada na etapa (1) com o uso da celulase de fungos filamentosos; e etapa (3): submeter o hidrolisado da etapa (2) à separação entre sólido e líquido em um componente de solução e um resíduo de hidrólise e filtrar o componente de solução através de uma membrana de ultrafiltração e recuperar a celulase de fungos filamentosos como um não permeado e recuperar a solução de açúcar como um permeado; [2] o método para produzir solução de açúcar de acordo com [1], em que o permeado obtido através da filtração do componente de solução na etapa (3) através de uma membrana de microfiltração é filtrado através de uma membrana de ultrafiltração; [3] o método para produzir solução de açúcar de acordo com [2], em que a solução de lavagem obtida através da lavagem da membrana de ultrafiltração e/ou membrana de microfiltração na etapa (4) é usada na etapa (1) do processo de produção de solução de açúcar subsequente; [4] o método para produzir solução de açúcar de acordo com qualquer um dentre [1] a [3], em que a etapa (4) é a lavagem com água de lavagem que contém uma substância alcalina; [5] o método para produzir solução de açúcar de acordo com qualquer um dentre [1] a [4], em que a celulase de fungos filamentosos é de um micro-organismo do gênero Trichoderma; [6] o método para produzir solução de açúcar de acordo com qualquer um dentre [1] a [5], em que o pré-tratamento da biomassa que contém celulose na etapa (1) é o tratamento com ácido sulfúrico diluído.

EFEITOS DA INVENÇÃO

[009] De acordo com a presente invenção, é possível suprimir a adsorção da celulase de fungos filamentosos ao resíduo de hidrólise da biomassa que contém celulose. Especificamente, a β-glicosidase, que desempenha um papel importante na reação de hidrólise, pode ser eficazmente recuperada e/ou reutilizada. Como um resultado, o custo de produção de solução de açúcar pode ser reduzido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[010] A Figura 1 mostra um desenho esquemático de uma realização do método para preparar a solução de açúcar da presente invenção.

REALIZAÇÕES DA INVENÇÃO

[011] Cada etapa das realizações para executar a presente invenção será explicada doravante. No método para produzir a solução de açúcar da presente invenção, as etapas (1) a (3) explicadas abaixo e, opcionalmente, a etapa (4) são executadas repetidamente.

[012] Etapa (1): Etapa de preparar a calda da biomassa que contém celulose pré-tratada. A biomassa que contém celulose inclui a biomassa herbácea tais com bagasse, bagaço, painço amarelo, capim napier, Erianthus, restos culturais do milho, polpa de beterraba, um casco de semente de algodão, um cacho vazio de dendê, palha de arroz, palha de trigo, bambu e grama de bambu; ou biomassa de madeira tal como uma árvore tal como bétula branca e faia e materiais de construção residuais. Já que a biomassa que contém celulose contém lignina que é um polímero aromático, adicionalmente à celulose e hemicelulose, que são compostas de açúcar, a eficácia de hidrólise pela celulase pode ser melhorada submetendo-se a biomassa ao pré-tratamento. O método de pré-tratamento da biomassa que contém celulose inclui o tratamento com ácido diluído, tratamento alcalino, tratamento hidrotérmico, tratamento com água subcrítica, tratamento de micropulverização e similares. Já que a capacidade de reutilização da enzima no método para produzir a solução de açúcar da presente invenção é maior quando um material tratado com ácido sulfúrico diluído é usado, um material tratado com ácido sulfúrico diluído é preferencialmente aplicado.

[013] A concentração de sólido da calda do pré-tratamento material não é especificamente limitada, mas está preferencialmente dentro de uma faixa de 1 a 30% em peso. Quando a concentração de sólido é baixa, a concentração do açúcar produzido por hidrólise pode ser baixa e pode ser difícil utilizar o produto como uma matéria-prima para a fermentação em alguns casos. Por outro lado, quando a concentração é muito alta, pode ser difícil manipular o produto em alguns casos.

[014] O pH da calda não é especificamente limitado, mas preferencialmente 3,0 a 7,0, dentro de tal faixa, a celulase de fungos filamentosos pode atuar bem. A fim de executar uma reação de hidrólise eficazmente com quantidade menor de celulase de fungos filamentosos, o pH está mais preferencialmente dentro de uma faixa de pH 3,5 a 6,5, que está próxima ao pH ideal da celulase de fungos filamentosos e mais preferencialmente dentro de uma faixa de pH 4,0 a 6.0. Já que o pH muda no curso da hidrólise, é preferencial adicionar um tampão à solução de reação ou executar a hidrólise mantendo o pH constante com o uso de um ácido ou um álcali.

[015] Etapa (2): etapa de hidrolisar a calda do produto de pré- tratamento da biomassa que contém celulose na etapa (1) com o uso da celulase de fungos filamentosos. Os fungos filamentosos usados como uma origem da celulase incluem micro-organismos dos gêneros Trichoderma, Aspergillus, Cellulomonas, Chlostridium, Streptomyces, Humicola, Acremonium, Irpex, Mucor, Talaromyces e similares. Adicionalmente, a celulase pode ser de uma variante de qual a produtividade de celulase é melhorada submetendo-se tais micro-organismos ao tratamento de mutação por um mutagênico ou irradiação ultravioleta e similares.

[016] Dentre os fungos filamentosos, o gênero Trichoderma pode ser preferencialmente usado na presente invenção, já que o gênero Trichoderma produz um componente de enzima que tem alta atividade específica na hidrólise da celulose em uma grande quantidade na solução de cultura. Um exemplo concreto da celulase do gênero Trichoderma inclui a celulase de Trichoderma reesei QM 9414, Trichoderma reesei QM 9123, Trichoderma reesei Rut C-30, Trichoderma reesei PC 3-7, Trichoderma reesei CL-847, Trichoderma reesei MCG 77, Trichoderma reesei MCG 80 e Trichoderma viride QM 9123 e a celulase de Trichoderma reesei é mais preferencial dentre as mesmas.

[017] A celulase de fungos filamentosos é uma composição de enzima que tem uma atividade de produção de um monossacarídeo tais como glicose e xilose pela hidrólise da celulose e/ou hemicelulose e compreende preferencialmente um ou mais tipos selecionados a partir do grupo que consiste em celobioidrolase, endoglicanase, β-glicosidase, xilanase e β-xilosidase. Por exemplo, como um componente de enzima da celulase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I, celobioidrolase II, endoglicanase I, endoglicanase III, β- glicosidase, xilanase, β-xilosidase e similares podem ser exemplificados. Já que a hidrólise eficaz da celulose e/ou hemicelulose pode ser executada por um efeito concertado ou um efeito complementar de tais múltiplos componentes de enzima, tais múltiplos componentes de enzima são preferencialmente usados na presente invenção.

[018] Celobioidrolase é um termo geral de enzimas que liberam celobiose pela hidrólise de uma cadeia de celulose e um grupo de enzima que pertence à celobioidrolase é descrito como o número EC: EC 3.2.1.91. A celobioidrolase I inicia uma reação de hidrólise a partir da extremidade de redução de uma cadeia de celulose e a celobioidrolase II inicia uma reação de hidrólise a partir da extremidade de não redução.

[019] Endoglicanase é um termo geral de enzimas caracterizadas pelo início da hidrólise do meio de uma cadeia de celulose e um grupo de enzima que pertence à endoglicanase é descrito como o número EC: EC 3.2.1.4. A endoglicanase I é mais expressa dentre endoglicanases produzidas a partir da celulase de Trichoderma reesei e tem ampla especificidade de substrato. A endoglicanase III tem características de não ter nenhum módulo de ligação à celulose (CBM) e de ter peso molecular pequeno.

[020] β-Glicosidase é um termo geral de enzimas caracterizadas pela atuação em celooligossacarídeo ou celobiose e um grupo de enzima que pertence à β-glicosidase é descrito como o número EC: EC 3.2.1.21.

[021] Xilanase é um termo geral de enzimas caracterizadas pela atuação em hemicelulose ou especialmente em xilano e um grupo de enzima que pertence à xilanase é descrito como o número EC: EC 3.2.1.8.

[022] β-Xilosidase é um termo geral de enzimas caracterizadas pela atuação em um xilooligossacarídeo e um grupo de enzima que pertence à β-xilosidase é descrito como o número EC: EC 3.2.1.37.

[023] Tais componentes de celulase podem ser separados por um método conhecido tais como filtração em gel, troca iônica e eletroforese bidimensional e identificados comparando-se a sequência de aminoácidos do componente separado com um banco de dados. Os métodos analíticos conhecidos tais como a análise de N-terminal, análise de C-terminal e espectrometria de massa podem ser usados para a análise da sequência de aminoácidos.

[024] A atividade de enzima da celulase de fungos filamentosos pode ser avaliada pela atividade de hidrólise de polissacarídeo tais como atividade de degradação de Avicel, atividade de degradação de carboximetil celulose (CMC), atividade de degradação de celobiose, atividade de degradação de xilano e atividade de degradação de manana. A enzima principal que exibe atividade de degradação de Avicel é a celobioidrolase, que tem uma característica de hidrólise das regiões terminais de celulose. A enzima principal que exibe atividade de degradação de celobiose é a β-glicosidase. A enzima principal envolvida na atividade de degradação de CMC é a celobioidrolase e a endoglicanase. A enzima principal que exibe atividade de degradação de xilano é a xilanase e a β-xilosidase. O significado de "principal" no presente documento expressa que o maior envolvimento do mesmo na degradação é conhecido e significa que outros componentes de enzima estão envolvidos na degradação.

[025] Já que os fungos filamentosos produzem celulase em uma solução de cultura, a solução de cultura pode ser diretamente usada como um agente de enzima cru ou um grupo de enzima pode ser purificado por um método conhecido e formulado e a celulase purificada e formulada de fungos filamentosos pode ser usada como uma mistura de celulase de fungos filamentosos. Quando a celulase purificada e formulada de fungos filamentosos é usada, uma substância diferente da enzima, tal como um inibidor de protease, um dispersante, um acelerador de dissolução e um estabilizador, pode ser adicionada e usada. Dentre os mesmos, um produto de enzima cru é preferencialmente usado na presente invenção. O produto de enzima cru é derivado de um sobrenadante de cultura em que os fungos filamentosos foram cultivados em um meio preparado de modo que os fungos filamentosos produzam celulase por um período arbitrário. O componente de meio a ser usado não é especificamente limitado, e um meio ao qual a celulose é adicionada para intensificar a produção da celulase pode ser geralmente usado. Como um produto de enzima cru, a própria solução de cultura ou um sobrenadante de cultura a partir do qual apenas o corpo de fungo do gênero Trichoderma é removido é preferencialmente usado.

[026] A razão ponderal de cada componente de enzima no produto de enzima cru não é especificamente limitada. Por exemplo, uma solução de cultura do Trichoderma reesei contém 50 a 95% em peso de celobioidrolase e os componentes residuais contêm endoglicanase, β- glicosidase e similares. Um micro-organismo do gênero Trichoderma produz um componente de celulase forte na solução de cultura. Por outro lado, em relação à β-glicosidase, já que o micro-organismo retém uma parte grande da β- glicosidase na célula ou na camada de superfície celular, a atividade de β- glicosidase é baixa na solução de cultura. Assim, uma β-glicosidase heterogênea ou homogênea pode ser adicionada ao produto de enzima cru. Como uma β- glicosidase heterogênea, a β-glicosidase do gênero Aspergillus pode ser preferencialmente usada. Como a β-glicosidase do gênero Aspergillus, Novozyme 188 comercialmente disponível junto à Novozymes e similares podem ser exemplificados. É também possível usar uma solução de cultura na qual a atividade de β-glicosidase é melhorada introduzindo-se um gene em um microorganismo do gênero Trichoderma e cultivando o micro-organismo do Trichoderma geneticamente modificado para produzir a β-glicosidase na solução de cultura.

[027] A temperatura da reação de hidrólise está preferencialmente dentro de uma faixa de 40 a 60 °C. Especialmente, quando a celulase do gênero Trichoderma é usada, a temperatura está mais preferencialmente dentro de uma faixa de 45 a 55 °C.

[028] O período da reação de hidrólise está preferencialmente dentro de uma faixa de 2 a 200 horas. Quando o período é menor do que 2 horas, uma quantidade suficiente da produção de açúcar não pode ser obtida em alguns casos. Por outro lado, quando o período é mais do que 200 horas, a desativação das enzimas pode proceder e a capacidade de reutilização da celulase recuperada pode ser adversamente afetada em alguns casos.

[029] Etapa (3): uma etapa de submeter o hidrolisado da etapa (2) à separação entre sólido e líquido em um componente de solução e um resíduo de hidrólise e filtrar o componente de solução através de uma membrana de ultrafiltração e recuperar a celulase de fungos filamentosos como um não permeado e filtrar opcionalmente a celulase através de uma membrana de microfiltração

[030] O hidrolisado obtido pela etapa (2) pode ser separado em uma solução de açúcar e um resíduo de hidrólise pela separação entre sólido e líquido. Um método de separação entre sólido e líquido inclui a centrifugação e filtração por prensagem e a filtração por prensagem é preferencial na presente invenção.

[031] A filtração por prensagem é preferencial como a separação entre sólido e líquido já que um filtrado límpido pode ser obtido. Já que o componente de solução recuperado pela separação entre sólido e líquido é filtrado através de uma membrana de ultrafiltração na etapa (3) descrita abaixo, é preferencial pelo fato de que a quantidade de um teor de sólido ou um componente particulado fino é pequena, a partir do ponto de vista da obstrução de membrana. No caso de filtração por prensagem, já que a quantidade de um teor de sólido ou um componente particulado fino é pequena, a filtração por prensagem pode ser preferencialmente usada na presente invenção.

[032] Ademais, quando a clareza do componente de solução é baixa, é preferencial remover completamente o componente particulado fino filtrando-se o componente de solução através de uma membrana de microfiltração. A membrana de microfiltração descrita no documento no WO 2010/067785 pode ser usada.

[033] O componente de celulase de fungos filamentosos e o componente de açúcar contido no componente de solução recuperado são separados por filtração com o uso de uma membrana de ultrafiltração. Uma membrana de ultrafiltração é uma membrana com um corte de peso molecular de 500 a 200.000 e também chamada como uma membrana de ultrafiltração ou uma membrana UF. O tamanho de poro na superfície de membrana é muito pequeno para medir com um microscópio de elétrons ou similares e um valor que é chamado de corte de peso molecular é usado como um índice para o tamanho de poro, em vez do tamanho de poro médio. O corte de peso molecular é bem conhecido por um versado na técnica como um índice que indica o desempenho de membrana de ultrafiltração, conforme descrito em The Membrane Society of Japan, Maku-gaku Jikken series Volume III, artificial membrane ver., editing committee/Kimura Shoji, Nakao Shinichi Oya Haruhiko, Nakagawa Tsutomu (1993, KYORITSU SHUPPAN CO., LTD.), P92, como "A graph obtained by plotting the molecular weight of the solute on the horizontal axis and the blocking rate on the vertical axis is called as a molecular weight cutoff curve. The molecular weight with the blocking rate of 90% is referred to as molecular weight cut-off of the membrane."

[034] Na separação do componente de celulase dos fungos filamentosos e o componente de açúcar com o uso de uma membrana de ultrafiltração, o corte de peso molecular não é especificamente limitado, contanto que a glicose (peso molecular: 180) e a xilose (peso molecular: 150), que são monossacarídeos como componentes principais da solução de açúcar, possam permear e a celulase de fungos filamentosos possa ser bloqueada. O corte de peso molecular está preferencialmente dentro de uma faixa de 500 a 50.000. A partir do ponto de vista de separar uma substância estranha que exibe uma ação inibidora na reação de enzima e na enzima, o corte de peso molecular está mais preferencialmente dentro de uma faixa de 5.000 a 50.000 e mais preferencialmente dentro de uma faixa de 10.000 a 30.000.

[035] Como os materiais de uma membrana de ultrafiltração, polietersulfona (PES), polissulfona (PS), poliacrilonitrilo (PAN), fluoreto de polivinilideno (PVDF), celulose regenerada, celulose, éster de celulose, polissulfona sulfonada, poliétersulfona sulfonada, poliolefina, álcool polivinílico, metacrilato de polimetila, politetrafluoroetileno e similares podem ser usados. Já que a celulose regenerada, celulose e éster de celulose são degradados pela celulase, é preferencial usar uma membrana de ultrafiltração da qual o material é um polímero sintético tal como PES e PVDF.

[036] Como métodos de ultrafiltração, há filtração terminal e filtração de fluxo cruzado. Do ponto de vista da supressão da obstrução de membrana, é preferencial que o método é filtração de fluxo cruzado. Como uma forma de membrana da membrana de ultrafiltração a ser usada, formas apropriadas tais como o tipo de membrana de folha plana, tipo espiral, tipo tubular e o tipo de fibra oco podem ser usadas. Concretamente, o tipo G-5, o tipo G-10, o tipo G-20, o tipo G-50, o tipo PW e o tipo HWSUF junto à DESAL, HFM- 180, HFM-183, HFM-251, HFM-300, HFK-131, HFK-328, MPT-U20, MPS-U20P e MPS-U20S junto à Koch Filter Corporation, SPE1, SPE3, SPE5, SPE10, SPE30, SPV5, SPV50 e SOW30 junto à Synder Filtration, Microza (nome comercial) série UF que corresponde ao corte de peso molecular de 3.000 a 10.000 fabricado junto à Asahi Kasei Corporation, NTR 7410 e NTR 7450 fabricados junto à Nitto Denko Corporation e similares são incluídos.

[037] O hidrolisado da biomassa que contém celulose contém particulados finos insolúveis em água tais como lignina, sílica, um sal de cálcio, uma proteína agregada e celulose não degradada; ou polímeros solúveis em água tais como um oligossacarídeo, um polissacarídeo, tanina e uma proteína; e inibidores de fermentação de peso molecular baixo; um sal inorgânico; e um ácido orgânico e similares como uma impureza, adicionalmente ao açúcar. A membrana de ultrafiltração e/ou a membrana de microfiltração usadas na presente invenção geram obstrução devido à adesão de tais impurezas, especialmente um polímero solúvel em água, como operando por um longo período. Então, por meio da etapa (4) a seguir, o componente de obstrução aderido à membrana de separação pode ser removido e a eficácia da filtração pode ser mantida. Na presente invenção, uma solução de lavagem que contém o componente de obstrução da membrana de separação é recuperada e usada para os processos de produção de solução de açúcar subsequentes.

[038] Etapa (4): uma etapa de lavar a membrana de separação após a recuperação da solução de açúcar in etapa (3)

[039] A etapa (4) pode ser executada toda vez nos processos de produção de solução de açúcar da presente invenção ou pode ser executada sempre que o desempenho de filtração diminuir após as etapas (1) a (3) terem sido repetidas algumas vezes. A lavagem frequente tem ato efeito de lavagem e permite uma membrana de separação de longa duração, mas é desvantajosa em termos de custo de lavagem. Já que a maneira da adesão das impurezas que causam obstrução à membrana de separação difere-se dependendo do tipo da membrana de separação e da biomassa que contém celulose, é preferencial executar a lavagem com frequência ideal em cada processo.

[040] A lavagem da membrana de separação da presente invenção pode ser executada por um método bem conhecido por um versado na técnica. Há um método para imergir a membrana de separação em uma solução a ser usada para lavagem (doravante referida como água de lavagem), um método para filtrar a quantidade inteira de água de lavagem pela membrana de separação, um método da filtração de fluxo cruzado da água de lavagem pela membrana de separação e similares, e qualquer método pode ser usado.

[041] Adicionalmente à água, uma água de lavagem que contém uma substância ácida tal como ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido oxálico e ácido cítrico (doravante referida como uma água de lavagem ácida); uma água de lavagem que contém uma substância alcalina tal como hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio, trietanolamina, dietanolamina e monoetanolamina (doravante referida como uma água de lavagem alcalina); ou um líquido químico que contém um agente de lavagem conhecido tal como hipoclorito de sódio e um tensoativo pode ser usado como a água de lavagem e o efeito de lavagem pode ser aumentado pelo uso desses agentes de lavagem. Esses agentes de lavagem podem ser combinados e a lavagem pode ser repetida várias vezes com o uso de um ou dois ou mais tipos de águas de lavagem. Na presente invenção, já que uma solução de lavagem da membrana de separação é usada para os processos de produção de solução de açúcar subsequentes, é preferencial não usar um agente de lavagem ou usar uma água de lavagem ácida ou uma água de lavagem alcalina, do ponto de vista de que a reação de hidrólise da celulose por celulase de fungos filamentosos é difícil de ser inibida. Já que se pode acreditar que a maioria das impurezas que aderem à membrana de separação são matérias orgânicas, uma água de lavagem alcalina é adicionalmente preferencial, do ponto de vista que a água de lavagem é excelente na lavagem de uma matéria orgânica.

[042] A temperatura da água de lavagem não é especificamente limitada, entretanto, preferencialmente dentro de uma faixa de 0 a 90 °C. Quando a temperatura de lavagem é muito baixa, o efeito de lavagem pode ser insuficiente em alguns casos. Por outro lado, embora quanto maior seja a temperatura, mais excelente seja o efeito de lavagem, a própria membrana de separação pode ser danificada pelo calor em alguns casos quando a temperatura é maior do que 90 °C, e o desempenho de filtração pode diminuir. Assim, a temperatura da água de lavagem é preferencialmente 20 a 90 °C e mais preferencialmente 40 a 90 °C.

[043] Conforme descrito acima, a solução de lavagem obtida na etapa (4) contém particulados finos insolúveis em água tais como lignina, sílica, um sal de cálcio, uma proteína agregada e celulose não degradada; ou polímeros solúveis em água tais como um oligossacarídeo, um polissacarídeo, tanina e uma proteína; e uma substância inibidora de fermentação de peso molecular baixo; um sal inorgânico; e um ácido orgânico e similares. Dentre os mesmos, um componente de polímero que não passa através de uma membrana de microfiltração e/ou uma membrana de ultrafiltração suprime a adesão da celulase de fungos filamentosos ao resíduo de hidrólise da biomassa que contém celulose e exibe alto efeito na presente invenção.

[044] Quando a solução de lavagem é usada para a etapa (1) dos processos de produção de solução de açúcar subsequentes, a quantidade a ser usada não é especificamente limitada. Entretanto, quando a quantidade a ser usada é muito pequena, o efeito da presente invenção pode não ser suficientemente obtido em alguns casos. Adicionalmente, quando a quantidade a ser usada é muito grande, as impurezas no hidrolisado diminuem e o ônus na membrana de separação pode ser aumentado em alguns casos. Assim, a quantidade da solução de lavagem a ser usada na etapa (1) é preferencialmente uma quantidade obtida repetindo-se os processos de produção de solução de açúcar uma vez a 20 vezes. Mais preferencialmente, a quantidade é uma quantidade obtida repetindo-se o processo 5 a 10 vezes.

[045] Por meio do cultivo de um micro-organismo que tem uma capacidade de produzir um produto químico que usa uma solução de açúcar obtida pela presente invenção como uma matéria-prima para a fermentação, vários produtos químicos podem ser produzidos. Cultivar um micro-organismo com o uso da solução de açúcar como uma matéria-prima para a fermentação no presente documento significa utilizar um componente de açúcar ou uma fonte de amino contida na solução de açúcar como um nutriente do micro-organismo para a proliferação, cultivo e manutenção dos micro-organismos. Um exemplo concreto do produto químico inclui uma substância produzida em uma grande quantidade na indústria de fermentação tal como álcool, um ácido orgânico, um aminoácido e um ácido nucleico. Tais produtos químicos são produzidos como um produto químico que usa o componente de açúcar na solução de açúcar como uma fonte de carbono e acumulados dentro ou fora do corpo vivo no curso da fermentação dos mesmos. Os exemplos concretos de um produto químico que pode ser produzido por um micro-organismo incluem um álcool tal como etanol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol e glicerol; um ácido orgânico tal como ácido acídico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido succínico, ácido málico, ácido itacônico e ácido cítrico; um nucleosídeo tal como inosina e guanosina; um nucleotídeo tal como ácido inosínico e ácido guanílico; e um composto de amina tal como cadaverina. Ademais, é também possível aplicar a solução de açúcar da presente invenção à produção de uma enzima, um antibiótico, uma proteína recombinante e similares. Os micro-organismos usados para a produção de tais químicos podem ser qualquer micro-organismo, contanto que o micro-organismo possa produzir eficazmente um produto químico de interesse e microorganismos tais como Escherichia coli, leveduras, fungos filamentosos, basidiomicetos podem ser usados.

EXEMPLOS

[046] A presente invenção será descrita de modo mais concreto abaixo por meio dos Exemplos. Entretanto, a presente invenção nunca é limitada aos mesmos. (EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1) PRÉ-TRATAMENTO DA BIOMASSA QUE CONTÉM CELULOSE

[047] Um quilo e oitocentos gramas (1,8 kg) da biomassa que contém celulose (espiga de milho) foram imersos em 4,2 kg de solução de ácido sulfúrico aquosa 1% e tratado por um autoclave (fabricado junto à NITTO KOATSU CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) a 150 °C por 30 minutos e usado para os Exemplos a seguir. O teor de umidade do material tratado por ácido sulfúrico diluído foi 70%. (EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2) DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE B-GLICOSIDASE

[048] A atividade de β-glicosidase foi usada como um índice da eficácia de recuperação da celulase de fungos filamentosos. A atividade foi determinada e avaliada pelo método descrito abaixo.

[049] A 0,9 ml de um tampão de ácido acético a 55 (pH 5,0) que contém 4-nitrofenil-β-D-glicopiranosideo a 1,1 mM, 0,1 ml de solução de enzima foi adicionado e a reação foi executada a 30 °C (concentração final do substrato: 1 mM, concentração final do tampão: 50 mM). Após executar a reação precisamente por 10 minutos, 0,1 ml de carbonato de sódio aquoso a 2 M foi adicionado à mesma para parar a reação e a absorbância a 405 nm foi determinada (teste OD). Como uma solução em branco, a absorbância a 405 nm de uma solução de substrato a qual a solução de carbonato de sódio aquosa a 2 M e uma solução de enzima foram adicionadas nessa ordem foi similarmente determinada (solução em branco OD). No sistema de reação mencionado acima, a quantidade da enzima que produz 1 μmol por minuto de 4-nitrofenila foi definida como 1 U e o valor de atividade (U/ml) foi calculado de acordo com a fórmula a seguir. O coeficiente de extinção molecular de milimol do 4-nitrofenol no sistema de reação mencionado acima é 17,2 l/mmol/cm.

[050] A atividade de β-glicosidase (U/ml) = {(teste OD - solução em branco OD) x 1,1 (ml) x taxa de diluição da enzima} / {17,2 x 10 (minutos) x 0,1 (ml)}. (EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3) PRODUÇÃO DE UMA SOLUÇÃO DE AÇÚCAR COM O USO DE UMA MEMBRANA DE ULTRAFILTRAÇÃO E UMA MEMBRANA DE MICROFILTRAÇÃO (ETAPA 1: PREPARAÇÃO DA CALDA DA BIOMASSA QUE CONTÉM CELULOSE PRÉ- TRATADA)

[051] Quatro quilogramas (4 kg) do produto da biomassa que contém celulose (espiga de milho) tratada com ácido sulfúrico diluída do Exemplo de Referência 1 foram suspensos em água para preparar a calda e uma solução de amônio aquosa 10% foi adicionada à mesma para ajustar o pH a 5,0. Posteriormente, água foi adicionada à mesma para compor o peso bruto a 8 kg e a concentração de sólido da calda foi ajustada a 15%. (ETAPA 2: HIDRÓLISE DA CALDA DA BIOMASSA QUE CONTÉM CELULOSE PRÉ- TRATADA)

[052] À calda preparada na etapa 1, 240 ml da solução de enzima comercialmente disponível ("ACCELLERASE (nome comercial) DUET", fabricada junto à Genencor International, Inc.) foram adicionados e a reação foi executada a 50 °C por 24 horas. (ETAPA 3: RECUPERAÇÃO DE CELULASE E UMA SOLUÇÃO DE AÇÚCAR DO HIDROLISADO DA BIOMASSA QUE CONTÉM CELULOSE)

[053] O hidrolisado da etapa 2 foi filtrado por um aparelho de prensa de filtro (fabricado junto à YABUTA Industries, Co., Ltd, MO-4) e os particulados insolúveis da ordem de micra foram removidos submetendo-se o componente de solução a uma membrana de microfiltração que tem o tamanho médio de poro de 0,04 μm (fabricada junto à DESAL, série E, material: polissulfona). Como um aparelho de separação de membrana, uma unidade de membrana de folha plana de escala pequena "Sepa (nome comercial) CF-II" (fabricada junto à GE, área membrana eficaz: 140 cm2) que pode ser usada como um teste de pequena escala de filtração de um módulo de membrana espiral foi usada. A temperatura de operação foi 25 °C e a velocidade linear de superfície de membrana foi 20 cm/segundo. Cinco litros (5l) do filtrado foram obtidos e submetidos à filtração por uma membrana de ultrafiltração.

[054] Como uma membrana de ultrafiltração, uma membrana de ultrafiltração resistente ao calor (fabricada junto à DESAL, série "HWSUF") foi usada. Como um aparelho de separação de membrana, "Sepa (nome comercial) CF-II" (fabricada junto à GE, área membrana eficaz: 140 cm2) foi usada. A temperatura de operação foi 25 °C e a velocidade linear de superfície de membrana foi 20 cm/segundo. Controlando a pressão de operação de modo que o fluxo de membrana tenha sido constante a 0,1 m/D, 4 l dentre 5 l foram filtrados. O filtrado foi recuperado como uma solução de açúcar e o não permeado foi recuperado como uma solução de celulase recuperada, respectivamente. (ETAPA 4: LAVAGEM DAS MEMBRANAS DE SEPARAÇÃO)

[055] A membrana de microfiltração e a membrana de ultrafiltração usadas na etapa 3 foram lavadas com o uso de uma solução de hidróxido de sódio aquosa a 0,0125 M como a água de lavagem. Primeiro, a filtração de fluxo cruzado foi executada com o uso de 2 l de água de lavagem, na temperatura de água de lavagem de 25 °C, na pressão de operação de 0,1 MPa e na velocidade linear de superfície de membrana de 30 cm/segundo o filtrado foi recuperado como a solução de lavagem 1 da membrana de separação. Depois, a lavagem de membrana foi executada com o uso de outros 2 l de água de lavagem, sob as mesmas condições de operação e circulando-se o fluxo cruzado por 20 minutos. Após 20 minutos, a solução circulada foi recuperada como a solução de lavagem 2 da membrana de separação. O aparelho de separação de membrana foi igual a este usado na etapa 3. (EXEMPLO COMPARATIVO 1) USO DA ÁGUA DE LAVAGEM NÃO UTILIZADA

[056] Como a água de lavagem, 2 l da solução de hidróxido de sódio aquosa a 0,0125 M não utilizada foram usados na etapa 1 para preparar a calda de um material pré-tratado. Já que a concentração de sólido da calda não poderia ser ajustada a 15% apenas por 2 l da solução de hidróxido de sódio aquosa, água foi adicionada à mesma para suprir a carência. Pelo método descrito no Exemplo de Referência 3 em termos de outras condições, uma solução de celulase recuperada foi obtida e a determinação de atividade foi executada de acordo com o Exemplo de Referência 2.

(EXEMPLO 1) USO DA SOLUÇÃO DE LAVAGEM DAS MEMBRANAS DE SEPARAÇÃO

[057] Após repetir as etapas 1 a 3 dos processos de produção de solução de açúcar do Exemplo de Referência 3 cinco vezes, a membrana de separação foi lavada pelo mesmo método que na etapa 4, e a solução de lavagem 1 da membrana de separação e a solução de lavagem 2 da membrana de separação foram combinadas e recuperadas como a solução de lavagem 1 + 2 da membrana de separação. Após repetir as etapas 1 a 3 mais cinco vezes, a membrana de separação foi lavada, e a solução de lavagem 1 da membrana de separação e a solução de lavagem 2 da membrana de separação foram recuperadas separadamente. A quantidade total de cada solução de lavagem recuperada da membrana de separação foi usada na etapa 1 para preparar a calda de um material pré-tratado. Já que a concentração de sólido da calda não poderia ser ajustada a 15% apenas pela solução de lavagem da membrana de separação, água foi adicionada à mesma para suprir a carência. Pelo método descrito no Exemplo de Referência 3 em termos de outras condições, uma solução de celulase recuperada foi obtida e a determinação de atividade foi executada de acordo com o Exemplo de Referência 2. Os resultados são mostrados na Tabela 1 como a atividade relativa. Mesmo quando as soluções de lavagem 1, 2 e 1 + 2 da membrana de separação da membrana de microfiltração e da membrana de ultrafiltração foram usadas, a atividade da solução de celulase recuperada aumentou significativamente e um efeito notável foi obtido especialmente quando a solução de lavagem 2 da membrana de separação da membrana de microfiltração e da membrana de ultrafiltração foi incluída. [TABELA 1]

(EXEMPLO 2) FREQUÊNCIA DA LAVAGEM DA MEMBRANA DE SEPARAÇÃO E EFEITO DE RECUPERAÇÃO DE CELULASE

[058] Após executar repetidamente as etapas 1 a 3 do processo de produção de solução de açúcar do Exemplo de Referência 3 1, 2, 3, 5 ou 10 vezes, a membrana de separação foi lavada da mesma maneira que na etapa 4. Em todos os Exemplos presentes, a solução de lavagem 1 da membrana de separação e a solução de lavagem 2 da membrana de separação foram combinadas e recuperadas respectivamente como a solução de lavagem 1 + 2 da membrana de separação. A solução de lavagem recuperada 1 + 2 da membrana de separação foi usada na etapa 1 da mesma maneira que no Exemplo 1 e uma solução de celulase recuperada foi obtida. A determinação de atividade da solução de celulase recuperada foi executada de acordo com o Exemplo de Referência 2 e os resultados são mostrados na Tabela 2 como a atividade relativa. Houve uma tendência de que quanto mais vezes as etapas 1 a 3 foram repetidas antes de executar a lavagem da membrana de separação, mais a atividade da solução de celulase recuperada aumentou. [TABELA 2]

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[059] A solução de açúcar obtida na presente invenção pode ser usada como uma matéria-prima de açúcar para uma ampla variedade de produtos de fermentação.

Claims

1. MÉTODO PARA PRODUZIR SOLUÇÃO DE AÇÚCAR, pela repetição de um processo de produção de solução de açúcar, caracterizado por compreender as etapas (1) a (4) a seguir, em que uma solução de lavagem obtida na etapa (4) de lavagem de uma membrana de separação após a etapa (3) é usada para a etapa (1) dos processos de produção de solução de açúcar subsequentes: etapa (1): preparar uma calda de uma biomassa que contém celulose pré-tratada; etapa (2): hidrolisar a calda de biomassa que contém celulose pré- tratada na etapa (1) com o uso de uma celulase de fungos filamentosos; etapa (3): submeter o hidrolisado da etapa (2) à separação sólido- líquido em um componente de solução e um resíduo de hidrólise, filtrar o componente de solução através de uma membrana de microfiltração e uma membrana de ultrafiltração com o objetivo de recuperar a celulase de fungos filamentosos como um não permeado e recuperar a solução de açúcar como um permeado; e etapa (4): após repetir as etapas (1) a (3) um ou mais vezes, lavar uma membrana de separação usada na etapa (3) e recuperar uma solução de lavagem contendo um componente de polímero que não é passado através de uma membrana de microfiltração e/ou de ultrafiltração.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa (4), a lavagem das membranas de separação usadas na etapa (3) ser conduzida após a repetição das etapas (1) a (3) por pelo menos cinco vezes.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo componente de solução na etapa (3) ser filtrado através de uma membrana de microfiltração antes de ser filtrado através de uma membrana de ultrafiltração.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela solução de lavagem obtida pela lavagem da membrana de ultrafiltração e/ou membrana de microfiltração na etapa (4) ser usada na etapa (1) do processo de produção de solução de açúcar subsequente.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa (4) ser lavar uma membrana de separação usada na etapa (3) com água de lavagem que contém uma substância alcalina.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela celulase de fungos filamentosos ser derivada de um micro-organismo do gênero Trichoderma.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo pré-tratamento da biomassa que contém celulose na etapa (1) ser o tratamento com ácido sulfúrico diluído.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela solução de lavagem obtida na etapa (4) conter um componente de polímero.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela solução de lavagem na etapa (4) aprimorar a quantidade de uma celulase de fungos filamentosos recuperada na etapa (3) de um processo de produção de solução de açúcar subsequente.