KR20150082241A - pH 제어된 효모 증식 - Google Patents

pH 제어된 효모 증식 Download PDF

Info

Publication number
KR20150082241A
KR20150082241A KR1020157011023A KR20157011023A KR20150082241A KR 20150082241 A KR20150082241 A KR 20150082241A KR 1020157011023 A KR1020157011023 A KR 1020157011023A KR 20157011023 A KR20157011023 A KR 20157011023A KR 20150082241 A KR20150082241 A KR 20150082241A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
yeast
reactor
fed
hydrolyzate
batch
Prior art date
Application number
KR1020157011023A
Other languages
English (en)
Inventor
브뤼에윈 한스 마리뉘스 찰스 요하네스 더
파울 클라센
Original Assignee
디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. filed Critical 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Publication of KR20150082241A publication Critical patent/KR20150082241A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/22—Processes using, or culture media containing, cellulose or hydrolysates thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 a) 반응기를 탄소원 및 초기 효모 군집으로 충전시키는 단계, b) 임의적으로 초기 효모 군집을 반응기에서 회분식 방식으로 성장시키는 단계, c) 반응기중의 pH를 측정하는 단계, d) 반응기중의 pH를 예정된 값으로 설정하는 속도로 리그노셀룰로스성 가수분해물을 반응기에 유가식 방식으로 첨가하는 단계, 및 e) 충분한 증식 이후, 효모를 반응기로부터 단리하는 단계를 포함하는, 효모를 반응기에서 성장시키는 효모의 호기성 증식 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 증식 방법에 따라 증식된 효모, 및 6탄당 및 5탄당을 포함하는 당분이 증식된 효모에 의해 발효 생성물로 혐기성으로 발효되는 발효 생성물의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

pH 제어된 효모 증식{pH CONTROLLED YEAST PROPAGATION}
본 발명은 효모의 증식 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 효모를 리그노셀룰로스성(lignocellulosic) 가수분해물 상에서 증식시키는 증식 방법에 관한 것이다.
현재, 연료 및 기본 화학물질의 생산을 위한 공급원으로서 리그노셀룰로스성 물질을 사용하도록 제안된 방법들이 존재한다. 이러한 방법들은 리그노셀룰로스성 공급원료로부터 이들 생성물을 상업적으로 실행가능하게 생산하는 것을 목적으로 한다.
이러한 방법들에서, 리그노셀룰로스성 물질은 예를 들면 전처리되고, 이어서 가수분해될 수 있고, 후속적으로 6탄당 및/또는 5탄당 당분을 포함하는 생성된 가수분해물은 효모에 의해 발효 생성물로 전환될 수 있다. 이들 방법은 대규모의 통합된 생물처리 설비(IBF: Integrated Bioprocess Facility)에서 실행될 수 있다. 효모 발효는 대체적으로 IBF의 발효 부분에서 혐기성 조건하에 수행된다.
충분한 효모를 발효기에 공급할 수 있기 위해, 효모는 IBF에서 증식되거나 또는 그 외의 장소에서 증식되고 IBF로 운송된다. 증식은 대체적으로 호기성 조건하에 수행된다.
독일 특허 제300662호로부터, 증식이 매우 희석된 브로스(broth)에 의해 시작되고 이어서 희석되지 않은 브로스가 천천히 첨가되는 효모의 호기성 증식 방법이 공지되어 있다. 브로스를 느리게 첨가하는 방법의 부분은 본원에서 공정의 유가식(fed-batch) 상으로 지칭된다. 유가식 상을 포함하는 전체 방법은 본원에서 유가식 방법으로 지칭된다. 공지된 유가식 방법의 이점은 에탄올의 과도한 형성이 방지되고 희석된 회분식(batch) 방법에서에 비해 더 높은 브로스 농도가 사용될 수 있다는 것이다.
콜라라스(Kollaras, A.) 등의 문헌[Ethanol Producer Magazine, August 2012, page 52-54]으로부터, 자일로스 함유 스틸리지(stillage) 상에서의 효모[사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)]의 호기성 증식이 공지되어 있고, 여기에 "빵 효모가 성장되는 것과 유사한 침지된 호기성 증식기내에서, 사카로마이세스 세레비지아 MBG 3248은 아세트산, 락트산, 에탄올, 글리세롤, 잔류하는 6탄당 당분 및 자일로스를 총 이용가능한 탄소 1 g(그램) 당 0.35 g 효모의 관찰된 수율로 효모 바이오매스(biomass)로 전환시켰다"라고 기재되어 있다. 이러한 공지된 방법의 단점은, 자일로스가 풍부한 스틸리지가 바이오매스 형성을 위해 사용되므로, 과량의 효모(129,000 톤의 공급 효모)가 생산된다는 것이다. 공급 효모에서 전환되는 자일로스는 IBF에서 발효 생성물을 생산하기 위해 더 잘 사용될 수 있다. 산성 리그노셀룰로스성 가수분해물 상에서의 모든 현재까지 공지된 증식 방법에 대한 단점은 효모 성장이 아세트산 및/또는 당분 분해 생성물에 의해 저해된다는 것이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 가수분해물은 존재하여 IBF로부터 이용가능할 수 있으며, 종래의 증식 탄소원에 비해 더 저렴하고, 따라서 원하는 탄소원일 수 있다.
본 발명의 목적은 리그노셀룰로스성 가수분해물이 탄소원으로서 사용될 수 있는 증식 방법을 제공하는 것이다. 추가의 목적은 안정한 방식으로 조작될 수 있는 증식 방법을 제공하는 것이다. 또 다른 목적은 증식 혼합물의 일부가 증식의 다음 라운드(round)를 위해 사용되는, 다수의 주기로 수행될 수 있는 증식 방법을 제공하는 것이다. 이들 목적중 하나 이상은 본 발명에 따라 달성된다.
본 발명에 따라서,
a) 반응기를 탄소원 및 초기 효모 군집(yeast population)으로 충전시키는 단계,
b) 임의적으로 초기 효모 군집을 반응기에서 회분식 방식으로 성장시키는 단계,
c) 반응기중의 pH를 측정하는 단계,
d) 반응기중의 pH를 예정된 값으로 설정하는 속도로 리그노셀룰로스성 가수분해물을 반응기에 유가식 방식으로 첨가하면서 증식시키는 단계, 및
e) 충분한 증식 이후, 효모를 반응기로부터 단리하는 단계
를 포함하는, 효모를 반응기에서 성장시키는 효모의 호기성 증식 방법이 제공된다.
본 발명에 따라서, 리그노셀룰로스성 가수분해물이 탄소원으로서 사용될 수 있고, 안정한 방식으로 다수의 주기로 조작될 수 있으며, 효모의 과도한 생산을 방지하는 증식 방법이 수득된다.
본 발명에 따른 증식의 추가의 이점은, 리그노셀룰로스성 가수분해물의 에탄올 발효시 효모의 성능이 가수분해물 상에서 본 발명에 따라서 증식되지 않은 효모에 비해 증가되는 방식으로 효모가 가수분해물 상에서 하나 이상의 주기로 증식하는 동안 적응한다는 것이다.
또한, 본 발명은
- 상기 증식 방법에 따라 생산된 효모, 및
- 상기 증식 방법에 따른 효모를 사용하는 발효 생성물의 제조 방법, 특별히 여기서 발효 생성물이 에탄올인 제조 방법을 제공한다.
도 1: 시간(시간)에 대한 효모 증식 동안의 당분 소비 및 에탄올 생산. 속이 찬 사각형은 당분 농도(g/ℓ)의 측정값이다. 개방 원형은 에탄올 농도(g/ℓ)이다.
도 2: 시간(시간)에 대한 바이오매스 형성 및 저해제 농도. 삼각형은 저해제 농도(g/ℓ)를 지시하고; 실선은 아세트산 농도를 나타낸다. 실선으로 연결된 개방 원형은 OD700으로부터 계산된 바이오매스(효모) 농도(건조 바이오매스로서)(g/ℓ)를 지시한다. 글리세롤 농도는 점선으로 연결된 개방 원형으로서 지시된다.
도 3: 시간(시간)에 대한 증식기 매개변수. 산소 농도(p02(%)) -·-, pH - - 및 온도(℃) ―.
도 4: 효모 성장. 시간(시간)에 대한 (ln 질량(x))로 제시된다. 곡선의 직선 부분은 기하급수적 성장을 지시한다.
도 5: 당분 소비 및 에탄올 생산.
도 6: 바이오매스 형성 및 저해.
도 7: 발효기 매개변수.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위 전반에 걸쳐, "포함하다" 및 "포함되다"라는 단어 및 "포함하고", "포함하는", "포함되고" 및 "포함되는"과 같은 변형어는 포괄적으로 해석되어야 한다. 즉, 이들 단어는 문맥상 허용되는 경우 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소 또는 정수가 포함될 수 있음을 전달하고자 한다.
본원에서 반응기, 증식기 또는 발효기는 증식이 실행될 수 있는 반응기를 위해 사용될 수 있다. 증식은 본원에서 효모 군집을 증식시킬 목적을 갖는 호기성 발효이다. 에탄올 발효는 본원에서 에탄올을 생산할 목적을 갖는 발효에 관한 것이고, 대체적으로 혐기성으로 수행된다. 에탄올 발효가 일어나는 반응기는 본원에서 에탄올 발효기 또는 에탄올 반응기이다.
본 발명에 따라서, 효모가 반응기에서 성장되는 효모의 호기성 증식은 하기 단계들을 포함한다:
a) 반응기를 탄소원 및 초기 효모 군집으로 충전시키는 단계,
b) 임의적으로 초기 효모 군집을 반응기에서 회분식 방식으로 성장시키는 단계,
c) 반응기중의 pH를 측정하는 단계,
d) pH를 예정된 값으로 유지시키는 속도로 리그노셀룰로스성 가수분해물을 반응기에 유가식 방식으로 첨가하면서 증식시키는 단계, 및
e) 충분한 증식 이후, 효모를 반응기로부터 단리하는 단계.
이러한 방법에서 단계 a), b) 및 e)는 종래의 방식으로 수행될 수 있지만, 이들 단계의 몇몇 매개변수는 이후 보다 상세히 기재되는 바와 같이 구체적으로 공지된 종래의 방법에서와는 상이할 수 있다. 단계 a)에서 임의의 적합한 탄소원이 사용될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 단계 a)에서, 탄소원은 희석된 리그노셀룰로스성 가수분해물, 더욱 구체적으로 물에 2배 이상 희석된 리그노셀룰로스성 가수분해물이다.
단계 c)에서, 증식 반응기(또한 본원에 증식기로도 지칭됨)중의 pH의 측정은 임의의 종래의 pH 측정 기기, 예컨대 산업용으로 사용되는 pH 탐침기 또는 산업용으로 사용되는 pH 제어기(controller)에 의해 수행될 수 있다. pH 값은 리그노셀룰로스성 가수분해물의 공급의 시작, 즉 증식의 유가식 상의 시작을 일으키기 위해 사용된다. 단계 c)에서 pH 탐침기 또는 제어기로부터의 신호는 리그노셀룰로스성 가수분해물을 위한 공급 라인에 연결되는 계량 밸브를 열기 위해 사용될 수 있다.
단계 d)의 유가식 상에서, pH 탐침기 신호 또는 pH 제어기 신호는, pH가 예정된 밸브에서 반응기중의 pH로 설정되는 방식으로, 계량 밸브를 통한 반응기로의 리그노셀룰로스성 가수분해물의 제어된 공급 속도를 제공하기 위해 사용된다. 예정된 밸브는 단일 pH 밸브일 수 있거나, 또는 pH 프로파일(profile)이 설정된다면 시간에 따라 바뀔 수 있다. 하나의 실시태양에서 pH 예정된 밸브는 실질적으로 일정하다. 이러한 실시태양에서, 유가식 상에서 증식기중의 pH는 pH 4 내지 pH 10 또는 pH 4 내지 pH 7이다. 하나의 실시태양에서, 리그노셀룰로스성 가수분해물은, 증식기중의 혼합물의 pH가 증식기내로 공급되는 리그노셀룰로스성 가수분해물의 pH에 비해 더 높게 유지되는 속도로 공급된다.
리그노셀룰로스성 가수분해물은 산성일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 리그노셀룰로스성 가수분해물은 유기산을 포함한다. 리그노셀룰로스성 가수분해물에서 가능한 유기산의 예는 아세트산 및 폼산이다. 하나의 실시태양에서 유기산은 아세트산이다. 산성 리그노셀룰로스성 가수분해물은, 산이 사용되는 전처리로부터의 흔한 생성물이고, 이는 아세트산의 형성을 초래한다.
따라서 단계 d)에서 유가식 증식 동안 탄소원 및 임의적으로 다른 구성성분들, 예컨대 인산, 암모니아 및 무기물은 pH 제어된 속도로 증식기중의 효모에 공급된다. 이러한 속도는 번식을 최대화하기에 충분히 높은 동시에 알코올의 생산을 방지하기에 충분히 낮은 당분 및 영양분을 효모에 공급하도록 고안되고, 공급물로부터의 모든 또는 대부분의 아세트산 및/또는 다른 산성 저해제가 소비된다.
하나의 실시태양에서, 효모는 리그노셀룰로스성 가수분해물에서 자일로스를, 실질적으로 모든 자일로스를 소비한다.
하나의 실시태양에서, 이 방법에서 염기는 반응기중의 혼합물에 첨가될 필요가 없다. 하나의 실시태양에서, 증식 동안 아세트산 농도(g/ℓ)는 0.5 g/ℓ 이하, 바람직하게는 0.2 g/ℓ 이하이다.
하나의 실시태양에서, 증식은 5 세대 이상의 효모 군집의 성장이 실현될 때까지 수행된다. 하나의 실시태양에서 증식은 초기 효모 군집에 비하여 5 내지 6 세대의 효모 군집의 성장이 실현될 때까지 수행된다. 하나의 실시태양에서 증식의 회분식 상은 2 세대의 효모 군집의 성장까지 수행되고 유가식 상은 3 세대 이상까지 수행된다. 본원에서 성장 세대는 중량(g)을 기준으로 하는 효모 바이오매스의 배증(doubling)을 의미한다.
회분식 배양에서의 기하급수적 성장
1 세대에 대한 정의는 효모 바이오매스의 배증이다. 바이오매스의 양의 배증은 하기 수학식 1에 의해 제공되는 소정의 시간에서의 Cx(바이오매스 농도)로 설명될 수 있다:
Figure pct00001
배증 시간(Td: 시간) 또는 세대 시간(Tg: 시간)은 Cx(t) = 2*Cx(0)를 대체함으로써 식으로부터 유도될 수 있다:
Figure pct00002
상기 식에서,
μ = 비성장 속도(specific growth rate)(g 바이오매스/g 바이오매스/h 또는 1/h).
바이오매스 성장 속도는 다양한 수단에 의해 측정될 수 있다: 바이오매스 양의 증가는 다음중 임의의 방법 또는 적절한 대체 방법을 사용하여 배양물의 중량 또는 부피 단위 당 세포의 양을 결정함으로써 분석될 수 있다:
⊙ 혼탁도,
⊙ 배양물의 가시광 스펙트럼(일반적 범위: 600 nm 내지 700 nm)에서의 광학 밀도,
⊙ 원심분리후의 펠릿(pellet) 부피,
⊙ 105℃에서 일정한 중량으로 건조시킨 후의 건조 중량 함량,
⊙ 부피당 세포 계수(현미경적으로),
⊙ 고체 한천 배지 상에 플레이팅하고 단일 세포로부터 플레이트 상에서 콜로니를 성장시킨 후의 콜로니 형성 단위(Colony Forming Unit)(CFU/㎖).
다르게는 다음과 같은 폐쇄형 반응기 시스템에서 측정된 대사 활성으로부터 바이오매스의 양을 유도할 수 있다:
⊙ 이산화탄소 생산 속도(CPR 이산화탄소 생산 속도 또는 CER 이산화탄소 발생 속도; 일반적으로 밀리몰 C02/ℓ/시간으로 표시됨),
⊙ 산소 소비 속도(OUR 산소 섭취 속도 밀리몰 02/ℓ.시간),
⊙ 기질 섭취 속도(rs = 기질 섭취 속도 g/ℓ.시간; 글루코스, 자일로스, 아라비노스 또는 암모니아의 섭취 속도).
Ln(Cx) 또는 LN(CPR), LN(OUR) 또는 LN(rs)가 기하급수적 성장 실험에서 시간에 대해 그래프화될 경우(영양분에 대한 제한이 없고, 독성 생성물도 형성되지 않음), 직선이 수득되고 기울기는 비성장 속도 μ이다. μ 및 수학식 2에 의해 배증 시간을 계산할 수 있고, 성장 시간에 의해 배증 양 또는 세대 수를 계산할 수 있다.
비기하급수적 성장
비기하급수적 성장 실험, 예를 들어 일정한 공급 또는 연속 발효에 의한 유가식 발효에서, 세대의 양은 하기 수학식 3을 계산하고 총 CFU(= CFU/㎖ * 생산된 배양액의 ㎖ 수)의 건조 성분 함량(g)중 효모 바이오매스의 총 질량, 또는 OD*부피를 수득함으로써 결정된다:
Figure pct00003
Mx의 두 배 증가는 1 세대를 의미한다.
비기하급수적 성장의 원리는 또한 상기 기재된 바와 같은 기하급수적 성장 시스템에 적용가능하다.
단계 e)에서 충분한 증식 이후, 효모는 반응기로부터 단리되거나, 또는 전체 브로스로서 에탄올 발효 반응기에 공급될 수 있다. 이들 단계는 종래의 방식으로 실행될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 증식된 효모의 일부는 증식기로 재순환된다.
효모 군집
초기 효모 군집은 적절한 크기를 가져야 하고, 이는 증식 반응기의 크기 및 반응기중의 탄소원의 이용가능한 양에 좌우된다. 하나의 실시태양에서 초기 효모 군집은 적절한 효모 균주의 순수 배양관 또는 동결된 바이알(vial)로부터 기원될 수 있다. 순수 배양관 또는 동결된 바이알은 예비-순수 배양 탱크, 저압 용기를 위한 접종원으로서 사용될 수 있고, 여기서 종균(seed)은 엄격한 멸균 조건하에 배지중에 성장된다. 성장 이후, 이러한 용기의 내용물은 더 큰 순수 배양 반응기로 옮겨지고, 여기서 증식은 다시 멸균 조건하에 약간의 통기하에 수행된다. 순수 배양 용기로부터, 성장 세포는 일련의 연속적인 종균 및 반-종균(semi-seed) 증식기로 옮겨진다. 이들 초기 단계는 회분식 발효로서 수행된다.
하나의 실시태양에서 효모는 유기산을 대사시킬 수 있고, 바람직하게는 아세트산을 대사시킬 수 있다. 본 발명자들은, 효모, 특별히 사카로마이세스 세레비지아가, 당분 및 다른 탄소원이 고갈될 경우에만 아세트산 및 존재할 경우 다른 유기산을 낮은 농도로, 예컨대 예를 들어 5 g/ℓ 이하, 4g/ℓ 이하, 3 g/ℓ 이하, 2g/ℓ 이하, 1 g/ℓ 이하, 또는 0.5 g/ℓ 이하로 소비할 수 있음을 발견하였다.
증식 방법에서 초기 효모 군집으로서 사용되는 효모는 (유전자 조작된) 효모일 수 있다. 유전자 조작은 이후 더 상세히 설명된다. 효모는 본원에서 진핵 미생물로서 규정되고, 주로 단세포 형태로 성장하는 하위부류 유마이코티나(Eumycotina)의 모든 종을 포함한다[알렉소풀로스(Alexopoulos, C. J.)의 문헌 "1962, In : Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc., New York"].
효모는 단세포 엽상체의 출아에 의해 성장할 수 있거나, 유기체의 핵분열에 의해 성장할 수 있다. 효모로서 바람직한 효모는 사카로마이세스, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 한세눌라(Hansenula), 클로엑케라(Kloeckera), 슈와니오마이세스(Schwanniomyces), 및 야로위아(Yarrowia) 속에 속한다. 바람직하게는 효모는 혐기성 발효, 더 바람직하게는 혐기성 알코올성 발효를 가능하게 하는 효모이다. 한 실시태양에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지아이다.
하나의 실시태양에서, 효모는 산업용 효모이다. 산업용 효모 세포는 다음과 같이 정의될 수 있다. 산업 공정에서 효모 세포가 살아있는 환경은 실험실의 환경과 상당히 상이하다. 산업용 효모 세포는 공정 동안 달라질 수 있는 복합적 환경 조건하에 잘 수행할 수 있어야 한다. 이러한 변수로는 영양 공급원, pH, 에탄올 농도, 온도, 산소 농도 등에서의 변화가 포함되고, 이들은 함께 사카로마이세스 세레비지아의 세포 성장 및 에탄올 생산에 잠재적인 영향을 갖는다. 불리한 산업 조건하에, 내환경성 균주는 강건한 성장 및 생산을 허용해야 한다. 산업용 효모 균주는 일반적으로 이들이 사용되는 적용분야, 예컨대 제빵 산업, 양조 산업, 와인 제조 및 에탄올 산업에서 초래될 수 있는 환경 조건에서의 이들 변화에 대해 더 강건하다. 산업용 효모(사카로마이세스 세레비지아)의 예는 에탄올 레드(Ethanol Red: 등록상표)[페르멘티스(Fermentis)], 페르미올(Fermiol: 등록상표)(DSM) 및 써모사크(Thermosacc: 등록상표)[랄레만드(Lallemand)]이다. 하나의 실시태양에서 효모는 저해제 내성이다. 저해제 내성 효모 세포는, 예컨대 카다(Kadar) 등의 문헌[Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847-858]에 예시된 물질을 함유하는 저해제 상에서 성장하는데 대하여 균주를 선별함으로써 선택될 수 있고, 여기서 저해제 내성 사카로마이세스 세레비지아 균주 ATCC 26602가 선택되었다. RN1016은 DSM(네덜란드 베르겐 오프 줌)으로부터의 자일로스 및 글루코스 발효 사카로마이세스 세레비지아 균주이다.
하나의 실시태양에서 효모는 6탄당(C6) 당분 및 5탄당(C5) 당분을 전환시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서 효모는 적어도 하나의 C6 당분 및 적어도 하나의 C5 당분을 혐기성으로 발효시킬 수 있다. 예를 들면, 효모는 글루코스에 더하여 L-아라비노스 및 자일로스를 혐기성으로 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 효모는 L-아라비노스를 L-리불로스 및/또는 자일룰로스 5-포스페이트 및/또는 원하는 발효 생성물, 예를 들면 에탄올로 전환시킬 수 있다. L-아라비노스로부터 에탄올을 생산할 수 있는 유기체, 예를 들면 사카로마이세스 세레비지아 균주는 적합한 공급원으로부터의 araA(L-아라비노스 이소머라아제), araB(L-리불로글리옥살레이트) 및 araD(L-리불로스-5-P4-에피머라아제) 유전자를 도입하도록 숙주 세포를 변형시킴으로써 생산될 수 있다. 이러한 유전자는 아라비노스를 사용할 수 있도록 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 제공된 이러한 접근법은 국제특허출원공개 제WO 2003/095627호에 기재되어 있다. 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)으로부터의 araA, araB 및 araD 유전자가 사용될 수 있고, 국제특허출원공개 제WO 2008/041840호에 개시되어 있다. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 araA 유전자 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 araB 및 araD 유전자가 사용될 수 있고, EP 제1499708호에 개시되어 있다. 또 다른 실시태양에서, araA, araB 및 araD 유전자는, 국제특허출원공개 제WO 2009/011591호에 개시된 바와 같이, 클라비박터(Clavibacter), 아르트로박터(Arthrobacter) 및/또는 그라멜라(Gramella) 속중 적어도 하나, 특별히 클라비박터 미키가넨시스(Clavibacter michiganensis), 아르트로박터 아우레센스(Arthrobacter aurescens), 및/또는 그라멜라 포르세티(Gramella forsetii)중 하나로부터 유래될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 효모는 자일로스 이소머라아제 유전자의 하나 이상의 복사물 및/또는 자일로스 환원효소 및/또는 자일리톨 탈수소효소의 하나 이상의 복사물을 포함할 수도 있다.
효모는 효모가 자일로스를 발효시키도록 허용하는 하나 이상의 유전자 변형을 포함할 수 있다. 유전자 변형의 예는 하나 이상의 xylA-유전자, XYL1 유전자 및 XYL2 유전자 및/또는 XKS1-유전자의 도입; 알도스 환원효소(GRE3) 유전자의 결실; 세포에서 5탄당 포스페이트 경로를 통한 플럭스의 증가를 허용하는 PPP-유전자 TAL1, TKL1, RPE1 및 RKI1의 과발현이다. 유전자 조작된 효모의 예는 EP 제 1468093호 및/또는 국제특허출원공개 제WO 2006/009434호에 기재되어 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 이러한 효모는 c-공급원 이용에 특정 선호도를 나타내고; 먼저 글루코스가 수용되어 효모 바이오매스 및 공-생성물, 가장 현저하게는 EtOH로 전환된다[크랩트리(Crabtree) 효과에 기인함]. 글루코스 농도가 감소함에 따라, 5탄당(자일로스)이 소비되고, 이때 EtOH 생산은 당분해 플럭스의 감소에 기인하여 중단된다(더이상의 과도한 대사작용은 발생하지 않음). 자일로스 이용의 후기 상 동안, 이전에 생산된 EtOH, 뿐만 아니라 아세트산은 대사되고, 후자는 발효 브로스의 pH를 상승시킨다. 희석되지 않은 산성 가수분해물을 공급함으로써, pH는 이러한 pH 기울기를 따라 특정 지점에서 고정되어, 공급-상 동안 아세트산 농도를 회분식 상 및 희석되지 않은 가수분해물 공급 둘 다에서에 비해 더 낮게 효과적으로 유지시킨다.
pH 증가를 초래하는 아세트산의 소비가 자일로스 및 EtOH 둘 다의 소비 이후 발생되거나 또는 적어도 부분적으로 이와 중첩되므로, 이러한 공급 전략을 사용하는 증식 방법은 의도적으로 및 필연적으로 5탄당 농도가 고갈되거나 적어도 매우 감소된 브로스를 생성한다. 이들 5탄당은 또한 효모 바이오매스로 전환되어, 브로스중 총 효모 바이오매스 농도를 증가시킴으로써, 보다 작은 설비의 통기된 발효 부피를 허용한다[카펙스(capex)]. 이는 근본적으로 국제특허출원공개 제WO 2011/022840호[기어트만(Geertman)]와 상이한데, 여기서는 자일로스/글루코스 비의 강화가 6탄당을 전환시킴으로써 추구되는 반면 5탄당 전환은 최소화시킨다. 이러한 근본적 차이를 추가로 예시하기 위해, 후자의 전략과 조합하여 상기 기재된 균주를 사용하면, 5탄당 전환은 이러한 균주에서 5탄당 섭취와 매우 중첩되므로, 아세트산 전환에 의한 해독작용이 매우 제한되거나 존재하지 않게 될 것이다. 기재된 공급 전략이 아세트산 농도의 제거 및 적어도 최소화(및 이에 따른 증식된 효모의 저해)를 목적으로 하므로, 이는 온-라인(on-line) EtOH 측정에 의한 희석되지 않은 가수분해물의 공급을 제어/제한하는데에 이점을 갖고[페터슨(Petersson) 등의 문헌(2006), 안드레아스(Andreas) 등의 문헌(2007)], 여기서 후자에서 희석되지 않은 가수분해물은 브로스중의 아세트산을 효모가 대사하기 이전에 공급되고, 따라서 이러한 아세트산은 연속적으로 소비되지 않아서 해독 효과가 부족하고, 특별히 산업용 가수분해물에서 통상적인 아세트산 농도(≥5 g/ℓ)에서 효모의 성장 저해를 여전히 심각하게 겪게된다. 통합된 생물처리 설비에서, 증식된 효모의 발효 생성물은 본원에서 임의의 유용한 생성물일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 이는 에탄올, n-부탄올, 이소부탄올, 락트산, 3-하이드록시-프로피온산, 아크릴산, 아세트산, 석신산, 푸마르산, 말산, 이타콘산, 말레산, 시트르산, 아디프산, 아미노산, 예컨대 라이신, 메티오닌, 트립토판, 트레오닌, 및 아스파르트산, 1,3-프로판-디올, 에틸렌, 글리세롤, β-락탐 항생물질 또는 세팔로스포린(cephalosporin), 비타민, 약제, 동물 사료 보충물, 특수 화학물질, 화학 공급원료, 플라스틱, 용매, 연료, 예컨대 바이오연료 또는 바이오가스 또는 유기 중합체, 및 산업용 효소, 예컨대 단백질분해효소, 셀룰라아제, 아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제, 리파아제, 리아제, 옥시도환원효소, 전달효소 또는 자일라나아제로 구성된 군에서 선택된 생성물이다. 예를 들면 발효 생성물은 선행 기술의 세포 제조 방법 및 발효 공정을 수행하여 본 발명에 따른 증식된 효모에 의해 생성될 수 있지만, 이러한 예는 본원에서 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. n-부탄올은 국제특허출원공개 제WO 2008/121701호 또는 제WO 2008/086124호에 기재된 바와 같은 세포에 의해 생산될 수 있고; 젖산은 US 제2011053231호 또는 US 제2010137551호에 기재된 바와 같은 세포에 의해 생산될 수 있으며; 3-하이드록시-프로피온산은 국제특허출원공개 제WO 2010/010291호에 기재된 바와 같은 세포에 의해 생산될 수 있고; 아크릴산은 국제특허출원공개 제WO 2009/153047호에 기재된 바와 같은 세포에 의해 생산될 수 있다.
통합된 생물처리 설비에서 발효 생성물을 회수하기 위해, 현존하는 기술이 사용된다. 상이한 발효 생성물에 대해, 상이한 회수 공정이 적절하다. 에탄올을 수성 혼합물로부터 회수하는 현존하는 방법은 흔히 분별화 및 흡착 기법을 사용한다. 예를 들면, 맥주는 여전히 발효된 생성물(이는 수성 혼합물에 에탄올을 함유함)을 가공하기 위해 사용되어 풍부한 에탄올-함유 혼합물을 생산하고, 이는 이어서 분별화된다(예를 들어, 분별 증류 또는 다른 유사 기법). 그런 다음, 가장 높은 농도의 에탄올을 포함하는 분별물은 흡착제를 통해 통과되어, 전부는 아니지만, 대부분의 잔여수를 에탄올로부터 제거한다.
증식
증식은 본원에서 초기 효모 군집의 증가를 유도하는 효모 성장의 임의의 과정이다. 증식의 주요 목적은 살아있는 유기체로서 효모의 천연 번식 능력을 사용하여 효모 군집을 증가시키는 것이다. 증식을 위한 다른 이유들이 존재할 수 있고, 예를 들어, 건조 효모가 사용되는 경우, 증식은 효모가 성장하기 이전에 효모를 재수화시키고 조건화하기 위해 사용된다. 신선한 효모는, 활성의 건조된 효모인지 습윤 케이크인지와 무관하게, 증식을 직접적으로 시작하기 위해 첨가될 수 있다.
증식의 조건은 최적의 효모 생산 및 후속적인 발효, 예컨대 리그노셀룰로스성 가수분해물의 에탄올로의 발효를 위해 중요하다. 이들은 적절한 탄소원, 통기, 온도 및 영양분 첨가를 포함한다. 증식을 위한 탱크 크기는 일반적으로 (리그노셀룰로스성 가수분해물의 에탄올로의) 발효기 크기의 2% 내지 5%이다.
우선, 효모는 탄소 공급원을 필요로 한다. 탄소 공급원은 본원에서 유가식 상의 리그노셀룰로스성 가수분해물에 존재한다. 탄소원은 세포벽 생합성 및 단백질과 에너지 생산을 위해 필요하다.
회분식 상의 경우, 탄소원은 희석된 리그노셀룰로스성 가수분해물일 수 있다. 희석(물에 의함)되는 것이 유리한데, 그 이유는 효모가 희석되지 않은 리그노셀룰로스 상에서 증식한다면, 이는 흔히 너무 높은 수준의 저해제를 함유하여 효모에 대해 독성이기 때문이다. 이는, 증식이 매우 느리게 진행되어 가능한 세대의 수가 기껏해야 약 2 세대이고, 증식된 효모가 불량한 발효 행동을 가질 것임을 의미한다. 희석 배수는 당분야의 숙련가에 의해 당분 함량 및 리그노셀룰로스성 가수분해물의 저해제 수준에 기초하여 결정될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 탄소원은 물에 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상 또는 또는 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배 또는 20배 희석된 리그노셀룰로스성 가수분해물이다. 회분식 상에서, 또한 희석된 리그노셀룰로스성 가수분해물 이외의 다른 탄소 공급원이 사용될 수 있다. 탄소원은 당분의 임의의 형태, 예를 들어 글루코스일 수 있고, 당분은 임의의 형태, 예컨대 결정화되거나 덜 순수한 형태, 예를 들어 당밀로 존재할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 회분식 상에서, 당분 수준은 증식이 시작될 때 2%(중량/중량) 또는 그 바로 위로 목표화될 수 있다. 이러한 농도는 크랩트리 효과를 초래하는 농도에 비해 더 높으므로, 따라서 에탄올이 생산되고(실시예 1, 도 1 참조), 여기서 초기에 에탄올 농도가 증가한다. 그러나, 본 발명자들은 이러한 에탄올이 후속적으로, 당분 및 글리세롤이 고갈된 후, 효모에 의해 소비되는 것을 발견하였다. 추가로, 본 발명자들은 에탄올 및 아세트산 및 다른 산이 이어서 소비되는 것을 발견하였다(실시예 1, 도 2 참조). 아세트산 및/또는 다른 산이 소비된 이후, 증식기중의 pH는 상승할 것이다. 이러한 pH 상승이 본 발명에서 사용된다.
탄소 공급원에 더하여, 리그노셀룰로스성 가수분해물에서 천연적으로 제공되는 것 이상의 추가의 영양분이 성장을 최적화하기 위해 첨가될 수 있다. 예를 들어 우레아 형태의 질소가 가장 종종 300 ppm(밀리온 당 부) 내지 500 ppm 이상으로 사용된다. 암모니아가 또한 효모를 위한 우수한 질소 공급원이지만, 이는 재수화동안 효모에 저해성일 수 있다. 추가의 질소를 첨가하지 못하면 부진한 효모 성장을 초래하여, 비정상적으로 낮은 효모 계수 또는 더 느린 대사작용을 일으킬 수 있다. 마그네슘 및 아연과 같은 추가적 구성성분들은 추가의 이점을 위해 때때로 첨가된다.
증식은 호기성 과정이고, 이에 따라 증식 탱크는 용해된 산소의 특정 수준을 유지하도록 적절히 통기된다. 적절한 통기는 탱크 충전시 및 재순환 동안 증식 믹스내로 공기를 밀어넣는 증식 탱크내로 진입되는 배관 상에 설치된 공기 유도기에 의해 통상적으로 달성된다. 용해된 산소를 보유하는 증식 믹스를 위한 용량은 첨가된 공기의 양 및 믹스의 점조도(consistency)의 함수이고, 이는 물이 종종 50:50 내지 90:10의 매쉬(mash) 대 물의 비로 첨가되기 때문이다. "농후한" 증식 믹스(80:20 이상의 매쉬 대 물의 비)는 종종 용해된 산소를 보유하기 위해 저하된 용량을 보충하도록 압축된 공기의 첨가를 필요로 한다. 증식 믹스중 용해된 산소의 양은 또한 기포 크기의 함수이므로, 몇몇 에탄올 플랜트는 공기 유도기에 비해 더 작은 기포를 생산하는 스파저(sparger)를 통해 공기를 첨가한다. 더 적은 글루코스와 함께, 적절한 통기가 호기성 호흡을 촉진시키기 위해 중요하고, 이는 발효의 비교적 혐기성 환경과는 상이하다. 부적절한 통기 또는 높은 글루코스 농도에 대한 하나의 징후는 증식 탱크에서의 증가된 에탄올 생산이다.
일반적으로 증식 동안, 효모는 성장 및 대사작용에 편리한 온도를 필요로 하고, 예를 들어 증식 반응기중의 온도는 25 내지 40℃이다. 일반적으로 더 낮은 온도는 더 느린 대사작용 및 감소된 번식을 초래하는 반면, 더 높은 온도는 스트레스 화합물의 생산 및 감소된 번식을 초래할 수 있다. 하나의 실시태양에서 증식 탱크는 실내에 있고, 높은 여름 온도 또는 낮은 겨울 온도의 공격으로부터 보호되어, 30 내지 35℃ 범위내의 최적 온도를 유지시키는 것은 대체적으로 문제가 되지 않는다.
또 다른 통상의 문제는 효모를 증식기에 첨가하기 이전에 얼마나 오랫동안 효모를 증식시키냐는 것이다. 증식 시간은 플랜트마다 상이하지만, 가장 종종 6 내지 및 100 시간의 범위이다. 효모가 기하급수적 성장 상에 도달하는데 걸리는 시간이 하나의 지표일 수 있다. 더 긴 증식 주기는 주기는, 영양분의 고갈 및 부산물, 예컨대 아세트산의 축적에 기인하여 효모가 정지 상 또는 감퇴 단계에 들어갈 수 있게 하는데, 이는 증식기에서 효모 성능의 후속적인 지연을 초래할 수 있다.
더 짧은 증식 주기는, 우선 증식을 위한 일차적 이유중 하나인 효모의 적절한 배증 또는 번식을 위한 시간을 허용하지 않는다. 증식을 위한 최적 적하 시간을 결정함은, 상기 기재된 조건하의 성장을 도표화하고, 후속적인 정지상 및 신속한 감퇴 상으로 진입하는 시간에 대하여 효모가 기하급수적 성장에 도달되는 시간을 결정함을 포함할 것이다.
세균 또는 야생 효모 오염은 증식 동안 거의 문제가 되지 않는데, 효모 증식 탱크가 발효 탱크에 비해 더 작고 더 쉽게 세정될 수 있기 때문이다. 세정 이외에도, 항균 제품이 원치않는 미생물의 성장을 방지하기 위해 첨가될 수 있다.
요약하면, 효모 증식은 연료 에탄올 생산 공정의 통합적 부분이다. 전술된 지침을 따름으로써, 증식은 최적화되고 발효중의 문제는 최소화될 수 있다.
유가식 증식 동안 탄소원 및 임의적으로 인산, 암모니아 및 무기물과 같은 다른 구성성분들은 제어된 속도로 증식기중의 효모에 공급된다. 이러한 속도는 번식을 최대화하고 알코올의 생산을 방지하기에 충분한 당분 및 영양분을 효모에 공급하도록 고안된다. 하나의 실시태양에서, 유가식 반응기내로 공급되는 리그노셀룰로스성 가수분해물의 속도는 0.10 h-1 이하 또는 0.01 h-1 내지 0.10 h-1이다.
하나의 실시태양에서, 유가식 발효는 완벽한 멸균상태가 아니다. 이들 발효기(증식기)에 요구되는 큰 부피의 공기의 멸균성을 보장하기 위해 또는 많은 배관, 펌프 및 원심분리기를 통한 모든 수송 동안 멸균 조건을 달성하기 위해 가압된 탱크를 사용하는 것은 경제적이지 않다. 장비의 과도한 세정, 배관 및 탱크의 스티밍(steaming) 및 공기의 여과는 가능한한 무균 조건을 확보하기 위해 실행된다.
반-종균 증식의 종료시, 용기의 내용물은 효모를 소비된 가수분해물로부터 분리시키는 일련의 분리기로 펌핑된다. 다르게는 전체 증식기 브로스는 펌핑되고, 임의적으로 완충액 탱크에서 저장된 후 상업용 증식기로 첨가될 수 있다.
상업용 증식은 대형 발효기(증식기)에서 실행될 수 있고, 작업 부피는 50,000 갤런 이상이다. 상업용 증식을 시작하기 위해, 물 1 부피(설정된 물로 지칭됨)가 증식기내로 펌핑된다. 그런 다음, 피칭(pitching)으로서 지칭된 공정에서, 세미-공급 증식으로부터 또는 저장 탱크로부터의 효모가 발효기내로 수송된다. 종균 효모의 첨가 이후, 통기, 냉각 및 영양분 첨가가 시작되어 발효를 개시한다. 발효가 시작될 때, 액체 종균 효모 및 추가의 물은 발효기 부피의 대략 1/3 내지 1/2만을 차지할 것이다. 발효 과정 동안 영양분의 일정한 첨가에 의해 발효기는 그의 최종 부피에 도달된다. 영양분 첨가 속도는 발효 전체를 통해 증가되는데, 이는 더 많은 영양분이 세포 집단을 증가시키는 성장을 지지하기 위해 공급되어야 하기 때문이다. 효모 세포의 수는 이러한 증식 동안 약 1 내지 2배, 2 내지 3배, 3 내지 4배, 4 내지 5배, 5 내지 6배, 5 내지 7배 또는 5 내지 8배 증가한다.
공기는 용기의 바닥에 위치된 일련의 천공된 관을 통해 발효기(증식기)에 제공된다. 공기흐름 속도는 1 분 당 발효기 1 부피에 대해 공기 약 1 부피이다. 대량의 열이 효모 성장동안 발생되고, 냉각은 내부 냉각 코일에 의해, 또는 브로스로서도 공지된 발효 액체를 외부 열 교환기를 통해 펌핑함으로써 달성된다. 영양분의 첨가, 및 pH, 온도 및 공기흐름의 조절은 전체 생산 공정동안 컴퓨터 시스템에 의해 주의깊게 모니터링되고 제어된다.
발효의 종료시, 발효기 브로스는 노즐형 원심분리기에 의해 분리되고, 물로 세척되고, 다시 원심분리되어 대략 18%의 고형분 농도를 갖는 효모 크림을 수득한다. 효모 크림은 약 45℉로 냉각되고 별도의 냉장처리된 스테인레스 스틸 크림 탱크에 저장될 수 있거나, 또는 통합된 생물처리 설비의 주요 발효에 직접 사용될 수 있다. 다르게는 크림 효모는 탱커 트럭(tanker truck)내로 직접적으로 적재되고 적절한 크림 효모 취급 시스템을 구비한 소비자에게 전달될 수 있다. 다르게는, 효모 크림은 플레이트 및 프레임 필터 프레스(frame filter press)에 펌핑되고 30 내지 32%의 효모 고형분 함량을 갖는 케이크-유사 점조도로 탈수될 수 있다. 이러한 프레스 케이크 효모는 조각들로 부숴지고, 팔레트(pallet) 상에 적층된 50-파운드의 백(bag)에 포장된다. 효모는 가압 및 포장 조작 동안 뜨거워지고, 부숴진 효모가 든 백은 일정 기간 동안 냉장고에서 냉각되어야 하고, 적절히 통풍되고 팔레트가 냉각 공기에 접근되도록 위치되어야 한다. 팔레트로 운반된 부숴진 효모가 든 백은 이어서 냉장 트럭을 통해 소비자에게 분배된다.
다르게는 IBF에서, 전체 증식기 브로스는 펌핑되고, 임의적으로 완충액 탱크에서 저장된 후 IBF중의 에탄올 발효 용기에 첨가된다.
리그노셀룰로스 가수분해물
리그노셀룰로스성 가수분해물은 본원에서 임의의 가수분해된 리그노셀룰로스이다. 리그노셀룰로스는 본원에서 바이오매스이다. 이는 본원에서 바이오매스의 헤미셀룰로스 부분 및 헤미셀룰로스를 포함한다. 또한 리그노셀룰로스는 바이오매스의 리그노셀룰로스성 단편을 포함한다. 적합한 리그노셀룰로스성 물질은 하기 목록에서 발견될 수 있다: 과일 당액, 수풀, 제분 폐기물(mill waste), 도심 폐재(urban wood waste), 도시 폐기물(municipal waste), 벌목 폐기물, 산림 간벌, 단기-회전 목재 작물, 산업용 폐기물, 밀집, 귀리짚, 벼짚, 보리짚, 호밀짚, 아마대, 콩 껍질, 왕겨, 벼짚, 옥수수 글루텐 사료, 귀리 껍질, 사탕수수, 옥수수 대, 옥수수 줄기, 옥수수 심, 옥수수 껍질, 수수속 풀, 억새, 단수수, 카놀라 줄기, 대두 줄기, 대초원 목초, 포아풀과 식물, 강아지풀; 사탕무 펄프, 시트러스 과일 펄프, 씨 껍질, 셀룰로스성 동물 폐기물, 잔디 깎은 잔해, 목화, 해조류, 나무, 연질목재, 경질목재, 포플러, 솔, 관목, 목초, 밀, 밀짚, 사탕수수 바가스(bagasse), 옥수수, 옥수수 껍질, 옥수수 홉(hob), 옥수수 알, 알맹이로부터의 섬유, 곡물의 습식 또는 건식 제분으로부터의 생성물 및 부산물, 도시 고형 폐기물, 폐지, 정원 쓰레기, 초본(herbaceous) 물질, 농사 잔여물, 삼림관리 잔여물, 도시 고형 폐기물, 폐지, 펄프, 제지 잔여물, 가지, 덤불, 줄기, 옥수수, 옥수수 껍질, 에너지 작물, 숲, 과일, 꽃, 곡물, 목초, 초본 작물, 잎, 나무껍질, 솔잎, 통나무, 뿌리, 묘목, 관목, 수수속 풀, 나무, 야채, 과일 껍질, 덩쿨, 사탕무 펄프, 밀 미들링(middling), 귀리 껍질, 경질 또는 연질 목재, 농사 과정으로부터 생성된 유기 폐기물질, 삼림 목재 폐기물, 또는 이의 임의의 둘 이상의 조합물.
리그노셀룰로스로부터 유래된 몇몇 적합한 당분 조성 및 이들의 가수분해물의 당분 조성에 대한 개요가 표 1에 제공된다. 열거된 리그노셀룰로스는: 옥수수 심, 옥수수 섬유, 왕겨, 멜론 껍질, 사탕무 펄프, 밀짚, 사탕수수 바가스, 목재, 목초 및 올리브 프레싱(olive pressing)이 포함된다.
하기 실시예는 본 발명을 예시한다.
실시예
실시예 1
실시예 1에서, 리그노셀룰로스성 가수분해물로서, 효소적으로 가수분해된 전처리된 옥수수 대(17% 건조 성분 함량)를 사용하였다. 가수분해물의 조성은 표 1에 제공된다.
리그노셀룰로스성 가수분해물의 조성[HPLC(H-칼럼) 분석]
글루코스 (g/ℓ) 69.8
자일로스 (g/ℓ) 43.4
글리세롤 (g/ℓ) 0.2
폼산 (g/ℓ) 0.2
아세트산 (g/ℓ) 5.1
에탄올 (g/ℓ) 0
HMF (g/ℓ) 0.19
푸르푸랄 (g/ℓ) 0.98
아라비노스 (g/ℓ) 5.2
발효 매개변수
유가식 증식 반응기(1500 ㎖)를 709 g의 5배 희석된 리그노셀룰로스성 가수분해물로 충전시켰다. 0.2 g/ℓ의 MgS04, 1.1 g/ℓ의 (NH4)2S04, 4.5 g/ℓ의 우레아, 4 ㎖/ℓ의 비타민 용액 및 4 ㎖/ℓ의 미량 원소[베르듀인(Verduyn) 등의 문헌(1992)에서와 같음, 하기 참조]를 첨가하였다. pH를 NH40H에 의해 5로 조정하였다. 유가식 반응기의 온도를 32℃로 제어하였다. 용해된 산소 수준을 교반 캐스캐이드(cascade)(200 내지 700 rpm 사이에서 제어됨)와 조합하여 3 vvm(최종 부피)에서 통기에 의해 9% 이상으로 유지시켰다. 증식 실험의 시작 부피는 700 ㎖였다. 브로스의 pH를 추가의 전체(희석되지 않음) 셀룰로스성 가수분해물의 첨가에 의해 6.8로 제어하였다. 증식 실험의 최종 부피는 1190 ㎖였다.
증식
유가식 반응기를 700 ㎖의 5배 희석된 가수분해물(탈염수중)로 충전시키고 0.35 g/ℓ(건조 효모 바이오매스)의 RN1016으로 접종하였다.
증식 발효의 결과는 도 1 내지 4에 도시된다.
도 1로부터 24 시간 이후 대부분의 아세트산을 포함한 모든 탄소원(∼0.03 g/ℓ가 잔류)이 소비되었음을 알 수 있는데, 후자는 pH를 5(시작)에서 6.8로 증가시켰고(이때 pH 제어(공급물)이 개시됨), 이는 가수분해물 공급물의 증가된 양을 첨가함으로써 pH를 6.8로 일정하게 유지시켰다. 효모 바이오매스 농도는 소비된 당분에 대하여 0.42 g*g-1의 바이오매스 수율에 상응하는 0.06 hr-1 내지 대략 28 g/ℓ-1의 최대 성장 속도로 증가하였다. 도 2로부터, 효모 증식이 약 72 시간까지 진행됨을 알 수 있다. 도 3은 pH 프로파일을 제공하고, 36 시간에서부터 리그노셀룰로스성 가수분해물을 첨가함으로써 pH가 실질적으로 일정하게 유지됨을 볼 수 있다. 도 3에서 알 수 있듯이, 24 시간으로부터 약 50 시간까지 기하급수적 성장이 초래된다.
실시예로부터 리그노셀룰로스성 가수분해물 상에서의 증식이 가능하고 안정하게 실행될 수 있음을 알 수 있다. 리그노셀룰로스성 가수분해물이 사용되므로, 생산된 효모의 양은 임의의 목적하는 양으로 존재할 수 있어서, 과도한 효모가 생산되지 않는다. 추가로 증식된 효모는 재순환되고 증식의 새로운 배치에 사용된다.
실시예 2
실시예 2에서, 리그노셀룰로스성 가수분해물로서, 효소적으로 가수분해된 전처리된 옥수수 대(17% 건조 성분 함량)를 사용하였다. 가수분해물의 조성은 표 2에 제공된다.
리그노셀룰로스성 가수분해물의 조성[HPLC(H-칼럼) 분석]
글루코스 (g/ℓ) 68.2
자일로스 (g/ℓ) 44.8
글리세롤 (g/ℓ) 0.0
폼산 (g/ℓ) 0.3
아세트산 (g/ℓ) 5.2
에탄올 (g/ℓ) 0
HMF (g/ℓ) 0.18
푸르푸랄 (g/ℓ) 1.02
아라비노스 (g/ℓ) 5.2
발효 매개변수
유가식 증식 반응기(1500 ㎖)를 709 g의 5배 희석된 리그노셀룰로스성 가수분해물로 충전시켰다. 0.2 g/ℓ의 MgS04, 1.1 g/ℓ의 KH2P04, 4.5 g/ℓ의 우레아, 4 ㎖/ℓ의 비타민 용액 및 4 ㎖/ℓ의 미량 원소[베르듀인(Verduyn) 등의 문헌(1992)에서와 같음, 하기 참고]를 첨가하였다. 가수분해물의 pH(4.3)는 효소 가수분해 후 조정되지 않았다. 유가식 반응기의 온도를 32℃로 제어하였다. 용해된 산소 수준을 교반 캐스캐이드(200 내지 700 rpm 사이에서 제어됨)와 조합하여 3 vvm(최종 부피)에서 통기에 의해 9% 이상으로 유지시켰다. 증식 실험의 시작 부피는 600 ㎖였다. 브로스의 pH를 추가의 전체(희석되지 않음) 셀룰로스성 가수분해물의 첨가에 의해 4.2로 제어하였다. 증식 실험의 최종 부피는 1600 ㎖였다.
증식
유가식 반응기를 700 ㎖의 5배 희석된 가수분해물(탈염수중)로 충전시키고 0.39 g/ℓ(건조 효모 바이오매스)의 RN1016으로 접종하였다.
증식 발효의 결과는 도 5 내지 7에 도시된다.
도 5 및 6으로부터 16 시간 이후 대부분의 아세트산을 포함한 모든 탄소원(∼0.1 g/ℓ가 잔류)이 소비되었음을 알 수 있는데, 후자는 pH를 3.7(브로스 pH는 글루코스-상에서 4.3(시작)에서 3.7로 감소함)에서 4.2로 증가시켰고(이때 pH 제어(공급)이 개시됨), 이는 가수분해물 공급물의 증가된 양을 첨가함으로써 pH를 4.2로 일정하게 유지시켰다. 초기 과공급에 의해 24 시간에서 침지가 초래되었고, 이후 시스템은 회복되고; pH는 다시 증가하고, 공급은 pH를 4.2에서 잘 유지시켰다. 도 6은 또한 효모 증식이 약 124 시간까지 진행되고, 아세트산이 매우 낮게(≤ 0.2 g/ℓ) 유지됨을 보여준다. 도 7은 pH 프로파일을 제공하고, 28 시간에서부터 리그노셀룰로스성 가수분해물을 첨가함으로써 pH가 실질적으로 일정하게 유지됨을 볼 수 있다.
실시예로부터 리그노셀룰로스성 가수분해물 상에서의 증식이 pH(4.2)에서 가능하게 제어됨을 알 수 있고, 이는 pH(4.3)에서 희석되지 않은 가수분해물을 공급하는 동안 산업적으로 흔한 오염(락트산/아세트산) 박테리아의 성장을 제한하는 수단으로서 산업용 규모로 바람직하다. 이러한 가수분해물 pH는 효소적 가수분해 이후 기대되는 4.0 내지 4.5의 범위이다. 이러한 pH에서의 가수분해물 공급은 증식 이전에 염기를 첨가할 필요를 없애고 이에 따라 효모 증식 비용을 낮춘다.
일반적인 증식 방법에서, 희석되지 않은 가수분해물을 공급하면서 아세트산의 pKa(4.76) 미만으로 조작하면 아세트산에 의한 심각한 성장 저해를 초래하여, 높은 세포 유지 에너지 비용에 기인하여 공정을 비경제적으로 만들고, 그 결과 낮은 바이오매스 수율, 및 긴 체류 시간의 필요성을 초래하며, 이들 둘에 의해 더 큰 통기된 발효기(카펙스)를 필요로 하게 된다.
참고문헌
베르듀인(Verduyn, C.), 포스트마(E. Postma), 쉐퍼스(W. A. Scheffers), 및 반 디즈켄(J. P. Van Dijken)의 문헌[1992. "효모에서 대사 플럭스에 미치는 벤조산의 효과; 호흡 및 알코올 발효의 조절에 대한 연속-배양 연구(Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts: a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation)". Yeast 8: 501-517];
페터슨(Petersson, A.) 등의 문헌["리그노셀룰로스성 가수분해물 상에서의 사카로마이세스 세레비지아의 유가식 배양(Fed batch cultivation of Saccharomyces cervisiae on lignocellulosic hydrolysate)". Biotechn. Letters 29,(2) 219-225 (2006)];
안드레아스(Andreas, R.) 등의 문헌["가문비나무 가수분해물 상에서의 효모의 제어된 파일럿 개발 단위-규모의 유가식 배양(Controlled poliot development unit-scale fed-batch cultivation of yeast on spruce hydrolysate)", Biotechn. progress. 23(2), 351-358 (2007)].

Claims (20)

  1. a) 반응기를 탄소원 및 초기 효모 군집(yeast population)으로 충전시키는 단계,
    b) 임의적으로 초기 효모 군집을 반응기에서 회분식(batch) 방식으로 성장시키는 단계,
    c) 반응기중의 pH를 측정하는 단계,
    d) 반응기중의 pH를 예정된 값으로 설정하는 속도로 리그노셀룰로스성(lignocellulosic) 가수분해물을 반응기에 유가식(fed-batch) 방식으로 첨가하는 단계, 및
    e) 충분한 증식 이후, 효모를 반응기로부터 단리하는 단계
    를 포함하는, 효모를 반응기에서 성장시키는 효모의 호기성 증식 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    탄소원이 희석된 리그노셀룰로스성 가수분해물인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    효모가 리그노셀룰로스성 가수분해물에서 자일로스를, 바람직하게는 실질적으로 모든 자일로스를 소비하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
    공정 동안 반응기중의 혼합물에 염기를 첨가할 필요가 없는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
    아세트산 농도(g/ℓ)가 0.5 g/ℓ 이하, 바람직하게는 0.2 g/ℓ 이하인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서,
    리그노셀룰로스성 가수분해물이 유기산을 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    유기산이 아세트산인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
    효모가 유기산을 대사시킬 수 있고, 바람직하게는 아세트산을 대사시킬 수 있는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서,
    충분한 리그노셀룰로스성 가수분해물을 첨가함으로써 유가식 방식의 유가식 반응기중의 혼합물의 pH를 실질적으로 일정하게 유지시키는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서,
    유가식 반응기중의 아세트산의 농도가 30 g/ℓ 이하인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서,
    유가식 반응기내로 공급되는 리그노셀룰로스성 가수분해물의 속도가 0.10 h-1 이하인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서,
    유가식 반응기내로 공급되는 리그노셀룰로스성 가수분해물의 속도가 0.01 h-1 내지 0.10 h-1인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서,
    유가식 방식의 반응기중의 pH가 pH 4 내지 pH 10, 바람직하게는 pH 4 내지 pH 7인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서,
    효모가 1종 이상의 C6 당분 및 1종 이상의 C5 당분을 혐기성으로 발효시킬 수 있는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서,
    5 세대 이상의 효모 군집의 성장이 실현될 때까지 증식을 수행하는 방법.
  16. 제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서,
    3 세대 이상의 효모 군집의 성장이 실현될 때까지 증식을 수행하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    초기 효모 군집과 비교하여 5 내지 6 세대를 위한 효모 군집의 성장이 실현될 때까지 증식을 수행하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 증식되는 효모.
  19. 6탄당 및 5탄당을 포함하는 당분 혼합물을 제18항에 따른 효모에 의해 발효 생성물로 혐기성으로 발효시키는, 발효 생성물의 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    발효 생성물이 에탄올인 방법.
KR1020157011023A 2012-11-07 2013-11-01 pH 제어된 효모 증식 KR20150082241A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12191660.5 2012-11-07
EP12191660 2012-11-07
PCT/EP2013/072871 WO2014072232A1 (en) 2012-11-07 2013-11-01 pH CONTROLLED YEAST PROPAGATION

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150082241A true KR20150082241A (ko) 2015-07-15

Family

ID=47143725

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157011023A KR20150082241A (ko) 2012-11-07 2013-11-01 pH 제어된 효모 증식

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20150252319A1 (ko)
EP (1) EP2917334A1 (ko)
KR (1) KR20150082241A (ko)
CN (1) CN104769099A (ko)
AR (1) AR093398A1 (ko)
BR (1) BR112015010139A2 (ko)
IN (1) IN2015DN03292A (ko)
WO (1) WO2014072232A1 (ko)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112015030015B8 (pt) * 2013-05-28 2023-01-10 Poet Res Incorporated Método e sistema para propagação de etanologênio para uso na produção de um produto de fermentação compreendendo etanol de biomassa
DK3234161T3 (da) * 2014-12-19 2021-05-31 Dsm Ip Assets Bv Fremgangsmåde til fermentering med forbedret omdannelse af glycerol og eddikesyre
FR3036709B1 (fr) * 2015-05-29 2019-06-07 Lesaffre Et Compagnie Propagation de levures simultanee a la saccharification
PL3208340T3 (pl) * 2016-02-22 2020-07-13 Versalis S.P.A. Sposób namnażania drożdży zdolnych do fermentowania glukozy i ksylozy
HUE044785T2 (hu) * 2016-02-22 2019-11-28 Versalis Spa Eljárás glükóz és xilóz fermentálására képes élesztõ szaporítására
WO2018097844A1 (en) * 2016-11-23 2018-05-31 Shell Oil Company Methods, systems, and compositions for propagation of a fermentation microorganism
US11559038B2 (en) * 2017-02-03 2023-01-24 Delaval Holding Ab Monitoring device, sensor device and respective methods performed thereby for monitoring animals
WO2018183498A1 (en) * 2017-03-28 2018-10-04 Domtar Paper Company, Llc Propagation of yeast for removal of sugars from spent sulfite liquor
CN107095266B (zh) * 2017-05-12 2020-10-02 天津科技大学 麦香添加剂及其制备方法
US10858674B2 (en) * 2017-12-14 2020-12-08 Poet Research, Inc. Methods and systems for propagating microorganisms on stillage compositions
GB2584286A (en) * 2019-05-27 2020-12-02 Dandonnellytek Ltd A process for fed-batch yeast propagation
GB2610309B (en) * 2019-05-27 2023-09-13 Dandonnellytek Ltd A process for fed-batch yeast propagation
IT202100031070A1 (it) 2021-12-10 2023-06-10 Versalis Spa Procedimento per l’idratazione di lieviti in forma disidratata.
WO2023122805A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Vestaron Corporation Sorbitol driven selection pressure method

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE300662C (ko)
DE60325457D1 (de) 2002-01-23 2009-02-05 Royal Nedalco B V Fermentation von pentosezuckern
SE0202090D0 (sv) 2002-05-08 2002-07-04 Forskarpatent I Syd Ab A modifierd yeast consuming L-arabinose
ATE367436T1 (de) 2002-05-30 2007-08-15 Natureworks Llc Verfahren und materialien zur produktion von d- milchsäure in hefe
CN101914462B (zh) 2004-07-16 2013-04-24 Dsm知识产权资产有限公司 发酵木糖的真核细胞的代谢工程
EP2069476B1 (en) 2006-10-02 2016-08-10 DSM IP Assets B.V. Metabolic engineering of arabinose- fermenting yeast cells
WO2008086124A1 (en) 2007-01-03 2008-07-17 Vialogy Llc Multi parallax exploitation for omni-directional imaging electronic eye
WO2008121701A1 (en) 2007-03-30 2008-10-09 Cargill Inc. Metabolic engineering of yeasts for the production of 1-butanol
CA2693365A1 (en) 2007-07-19 2009-01-22 Royal Nedalco B.V. Novel arabinose-fermenting eukaryotic cells
EP2311969B1 (en) 2008-02-04 2013-04-10 Toray Industries, Inc. Method of producing lactic acid by continuous fermentation
DE102008029302B4 (de) 2008-06-19 2016-08-11 Insilico Biotechnology Ag Biotechnologische Herstellung von Acrylsäure
AR071515A1 (es) * 2008-06-27 2010-06-23 Microbiogen Pty Ltd Metodo para producir biomasa de levadura saccharomyces, en particular etanol
FR2934264B1 (fr) 2008-07-22 2012-07-20 Arkema France Fabrication d'esters de vinyle a partir de matieres renouvelables, esters de vinyle obtenus et utilisations
US20120231514A1 (en) * 2009-08-31 2012-09-13 Iogen Energy Corporation Fermentation method to produce a lignocellulose-based sugar stream with enriched pentose content

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014072232A1 (en) 2014-05-15
AR093398A1 (es) 2015-06-03
EP2917334A1 (en) 2015-09-16
US20150252319A1 (en) 2015-09-10
BR112015010139A2 (pt) 2017-07-11
IN2015DN03292A (ko) 2015-10-09
CN104769099A (zh) 2015-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20150082241A (ko) pH 제어된 효모 증식
Tesfaw et al. Current trends in bioethanol production by Saccharomyces cerevisiae: substrate, inhibitor reduction, growth variables, coculture, and immobilization
Charoensopharat et al. Ethanol production from Jerusalem artichoke tubers at high temperature by newly isolated thermotolerant inulin-utilizing yeast Kluyveromyces marxianus using consolidated bioprocessing
US20150072390A1 (en) System for fermentation of biomass for the production of ethanol
US11667935B2 (en) Fermentation process for improved glycerol and acetic acid conversion
Akponah et al. Optimization of bio-ethanol production from cassava effluent using Saccharomyces cerevisiae
CA2822441C (en) Use of a nitrogen-free peroxygen-releasing compound to reduce growth of contaminant microorganisms in ethanol fermentation
CA2719280A1 (en) Novel ethanol-producing yeast
US8679803B2 (en) Glucose conversion to ethanol via yeast cultures and bicarbonate ions
WO2016188813A1 (en) Acetate consuming yeast cell
Basso et al. Clash of kingdoms: how do bacterial contaminants thrive in and interact with yeasts during ethanol production
Brandberg et al. The impact of severe nitrogen limitation and microaerobic conditions on extended continuous cultivations of Saccharomyces cerevisiae with cell recirculation
Díaz-Montaño Continuous agave juice fermentation for producing bioethanol
US20160032327A1 (en) Process for culturing deinococcus bacteria
AU2011349224B2 (en) Use of synergistic formulations containing peroxide and quaternary ammonium reduce growth of contaminant microorganisms in ethanol fermentation
Aryal Bioethanol Production in Kveik Yeast: Testing Usefulness of Farmhouse Brewing Yeast for Industrial use.
Hawaz et al. Bioethanol production from sugarcane molasses by co-fermentation of Saccharomyces cerevisiae isolate TA2 and Wickerhamomyces anomalus isolate HCJ2F-19
Timothy et al. Production of bioethanol—a review of factors affecting ethanol yield
Chaudhari et al. Bioethanol: a critical appraisal
Ceccato-Antonini Ethanolic Fermentation in Brazil: Characteristics and Peculiarities
Levandovskiy et al. Gradient-continuous yeast cultivation for the alcohol production from molasses
Chongkhong Integration of Ensiled Corncob to Diluted Molasses as Carbon and Microbial Sources for Ethanol Production
WO2014107515A1 (en) Methods for improved ethanol production
Pleasanton et al. i, United States Patent (10) Patent No.: US 8.759051 B2

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid