IT202100031070A1 - Procedimento per l’idratazione di lieviti in forma disidratata. - Google Patents
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Description
PROCEDIMENTO PER L?IDRATAZIONE DI LIEVITI IN FORMA DISIDRATATA
La presente invenzione riguarda un procedimento per l?idratazione di lieviti in forma disidratata.
Pi? in particolare, la presente invenzione riguarda un procedimento per l?idratazione di un lievito in forma disidratata, comprendente: preparare un mezzo di idratazione comprendente estratto di lievito in soluzione acquosa, ad una specifica concentrazione; aggiungere un lievito in forma disidratata a detto mezzo di idratazione ad una specifica concentrazione; detto procedimento essendo condotto a specifiche condizioni di temperatura e di tempo.
Il lievito reidratato cos? ottenuto pu? essere vantaggiosamente utilizzato in processi fermentativi che consentono la produzione di biocarburanti (?biofuels?) utilizzabili in motori diesel o aviazione quali, ad esempio, etanolo, alcoli lineari o ramificati a diverso peso molecolare, oppure di prodotti biochimici (?biochemicals?) quali, ad esempio, etanolo, glicerolo, esteri dell?acido acetico (ad esempio, acetato di etile), arabinitolo, acido lattico, acido succinico, oli microbici (bio-oli), oppure di lievito da propagazione, in particolare in processi fermentativi attuati in presenza di idrolizzati derivanti da biomasse lignocellulosiche.
Di conseguenza, la presente invenzione riguarda altres? un procedimento di fermentazione per la produzione di biocarburanti (?biofuels?) o di prodotti biochimici (?biochemicals?) comprendente almeno un lievito derivante dal suddetto procedimento di idratazione.
La realizzazione di processi per la produzione di biocarburanti (?biofuels?) o di prodotti biochimici (?biochemicals?) da fonti rinnovabili, ? di grande interesse per lo sviluppo di processi ?green?, in particolare nel caso in cui detti processi sfruttino fonti rinnovabili non in competizione con il settore dell?alimentazione quali, ad esempio, le biomasse lignocellulosiche.
Una delle maggiori criticit? che pesano sullo sviluppo di detti processi ?green? a livello industriale, ? dovuta al fatto che gli idrolizzati derivanti dall?idrolisi di biomasse lignocellulosiche hanno un elevato contenuto di composti tossici quali, ad esempio, furfurale (F), 5-idrossimetilfurfurale (HMF), acidi organici (ad esempio, acido formico, acido acetico), composti fenolici derivanti dalla lignina (ad esempio, vanillina, siringaldeide), che possono agire da inibitori della crescita dei microorganismi usualmente utilizzati nella fermentazione quali, ad esempio, i lieviti, e causare una lunga fase di adattamento (?fase lag?), necessaria ai microrganismi per adeguarsi alle condizioni di crescita sfavorevoli.
A causa di detta lunga fase di adattamento (?fase lag?) pu? essere necessario un consumo di microorganismo (ad esempio, lievito) pi? elevato, oppure l?utilizzo di ?setup? impiantisci complessi dovuti al fatto che pu? essere necessario condurre il procedimento in modalit? ?fed-batch?, oppure tempi pi? lunghi di propagazione, oppure l?utilizzo di pi? propagatori, allo scopo di rispettare le tempistiche della fermentazione. Possono altres? essere necessarie diluizioni o detossificazione delle correnti in entrata all?impianto di fermentazione. Inoltre, la presenza di una lunga fase di adattamento (?fase lag?), pu? esporre la coltura del microorganismo ad un rischio di contaminazione.
La fase di adattamento (?fase lag?), ? definita come un periodo temporaneo di non replicazione di una popolazione microbica, in cui le cellule del microorganismo si adattano al nuovo ambiente prima di iniziare la crescita vera e propria: durante detta fase, le cellule del microorganismo non sono dormienti ma metabolicamente attive, anche se non si osserva alcuna duplicazione cellulare. Detta fase di adattamento (?fase lag?) pu? includere, ad esempio, la riparazione dei danni subiti dalle macromolecole durante la conservazione del microorganismo e la sintesi di componenti cellulari necessari alla crescita dello stesso, allo sfruttamento dei nutrienti presenti nel terreno di coltura a disposizione e, eventualmente, alla protezione dai composti tossici presenti. Molti fattori possono influenzare la durata della fase di adattamento (?fase lag?), tra cui l?entit? dell?inoculo del microorganismo, la storia fisiologica delle cellule del microorganismo e le caratteristiche chimico-fisiche dell?ambiente di origine del microorganismo e del nuovo terreno di coltura.
Ad esempio, nel caso di utilizzo di idrolizzati derivanti da biomasse lignocellulosiche nella fermentazione, se la concentrazione di inibitori, singolarmente o in sinergia, si avvicina alla soglia di tolleranza del microrganismo (ad esempio, lievito), pu? essere necessaria una lunga fase di adattamento (?fase lag?) all?inizio dello stadio di propagazione del microorganismo, legata alla necessit? di adattarsi alle condizioni tossiche del nuovo terreno di coltura e di sintetizzare gli enzimi indispensabili per la detossificazione. Detta fase di adattamento (?fase lag?) ? ancora pi? impattante se si utilizza un lievito in forma disidratata, che si trova in una condizione di maggiore sensibilit?.
Una fase di adattamento (?fase lag?) particolarmente lunga (alcune ore) pu? impattare significativamente sulla durata complessiva di propagazione del microorganismo, che ? di per s? uno stadio di breve durata (massimo 30 ore): questo pu? richiedere, a seconda delle esigenze impiantistiche, come sopra riportato, la presenza di un maggior numero di propagatori o un consumo di lievito pi? elevato per rispettare i tempi della fermentazione. Inoltre, come sopra riportato, la permanenza nel terreno di coltura nelle condizioni ottimali di propagazione di un microorganismo non in attiva crescita, espone la coltura al rischio di contaminazioni biologiche, soprattutto su scala industriale: detta contaminazione pu? avvenire anche quando la fase di adattamento (?fase lag?) si manifesta nello stadio di fermentazione, in caso di inoculo diretto (?direct pitching?).
Su scala di laboratorio, la principale strategia di rivitalizzazione di un microrganismo disidratato (o congelato) consiste nell?impiego di un pre-inoculo: a tale scopo, il microrganismo viene inoculato a bassa concentrazione in un terreno ricco di nutrienti quali, ad esempio, fonti di azoto organico, vitamine, microelementi, fonti di carbonio, incubato in condizioni adeguate e lasciato crescere fino ad una concentrazione sufficiente ad inoculare la propagazione vera e propria (8 ore - 24 ore), che viene condotta nel terreno di coltura di interesse, o la fermentazione. Tuttavia, nella produzione di biocarburanti (?biofuels?) o di prodotti biochimici (?biochemicals?) su scala industriale, il suddetto metodo ? difficilmente percorribile, perch? richiede grossi volumi di terreno di coltura, significative quantit? di nutrienti ad alto costo (ad esempio, peptone, estratto di lievito) e condizioni di crescita controllate, con impatti significativi sui costi di processo.
Generalmente, la reidratazione dei lieviti in forma disidratata su scala industriale viene condotta secondo le indicazioni del fornitore del lievito, che prevedono l?idratazione ad alta concentrazione in piccoli volumi di acqua (non demineralizzata) o di soluzione fisiologica (ad esempio, NaCl 0,9% in peso), alla temperatura ottimale per il lievito in oggetto (20?C - 45?C), per brevi periodi di tempo (< 1 ora): il lievito cos? reidratato pu? essere inoculato direttamente in fermentazione (?direct pitching?) o propagato tramite una fase di propagazione.
Per ridurre la fase di adattamento (?fase lag?) dovuta alla presenza di inibitori, su scala industriale possono essere impiegate strategie alternative quali, ad esempio, la detossificazione preliminare dell?idrolizzato derivante da biomasse lignocellulosiche con varie tecniche, oppure l?impiego di processi di propagazione alternativi con diluizione o parziale sostituzione dell?idrolizzato con altre fonti di carbonio: tuttavia, entrambe le soluzioni, aumentano la complessit? del processo e possono, in taluni casi, impattare sulla concentrazione finale del lievito.
In letteratura sono presenti numerose strategie per migliorare le prestazioni di lieviti, o la loro propagazione, anche su zuccheri di seconda generazione quali, ad esempio, zuccheri contenuti negli idrolizzati derivanti da biomasse lignocellulosiche, che includono anche tecniche di idratazione avanzate.
Ad esempio, il brevetto statunitense US 9,340,767 ? relativo ad un metodo di propagazione di uno o pi? organismi in un terreno di coltura che utilizza una fonte di carbonio che include xilosio [ad esempio, sciroppo di xilosio derivante dal pretrattamento di materia prima (?feedstock?) lignocellulosica] e/o una fonte di nutrienti che include un distillato (?stillage component?) (ad esempio, un distillato derivante dal processo di fermentazione da mais a etanolo). Detti organismi includono quelli in grado di convertire uno o pi? zuccheri monosaccaridi in alcool tramite fermentazione, ad esempio, lieviti.
Preferibilmente, viene utilizzato un ceppo geneticamente modificato di Saccharomyces cerevisiae. Il suddetto metodo ? detto essere in grado di migliorare la propagazione, in quanto lo xilosio non innesca il cosiddetto ?effetto Crabtree?, che sposta il metabolismo verso la produzione di etanolo anche in presenza di ossigeno. Al termine della propagazione, il lievito viene inoculato alla fermentazione.
La domanda di brevetto statunitense US 2015/0252319 ? relativa ad un procedimento per la propagazione aerobica di lievito in cui il lievito viene cresciuto in un reattore, comprendente i seguenti stadi: a) alimentare il reattore con una fonte di carbonio ed una iniziale popolazione di lievito; b) opzionalmente crescere l?iniziale popolazione di lievito nel reattore in modalit? ?fed batch?; c) misurare il pH nel reattore; d) aggiungere l?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica nel reattore in modalit? ?fed batch? ad una velocit? tale da fissare il pH nel reattore ad un valore predeterminato; e e) dopo una sufficiente propagazione isolare il lievito dal reattore. Preferibilmente, viene utilizzato un ceppo geneticamente modificato di Saccharomyces cerevisiae e l?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica viene diluito con acqua.
La domanda di brevetto internazionale WO 2017/144389 ? relativa ad un procedimento di propagazione di un lievito in grado di fermentare il glucosio e lo xilosio contenuti in un idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica, detto procedimento comprendendo la propagazione del lievito per almeno due cicli di propagazione. Il primo ciclo di propagazione comprende le fasi di: mettere in contatto il lievito ad una densit? di lievito iniziale con un primo mezzo di coltivazione comprendente una prima porzione dell?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica; e consentire al lievito di propagarsi per creare un primo brodo di fermentazione comprendente acqua e un primo lievito propagato, in cui almeno il 50% del glucosio e meno del 20% dello xilosio nel primo terreno di coltivazione vengono consumati nel primo ciclo di propagazione. Il secondo ciclo comprende le fasi di: separare il primo brodo di fermentazione in almeno una prima porzione prelevata e una prima porzione residua, in cui sia la prima porzione residua che la prima porzione prelevata comprendono parte del primo lievito propagato; mettere in contatto la prima porzione residua con un secondo terreno di coltivazione comprendente una seconda porzione dell?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica; e consentire al lievito di propagarsi per creare un secondo brodo di fermentazione comprendente acqua e un secondo lievito propagato, in cui almeno il 50% del glucosio e meno del 20% dello xilosio nel secondo terreno di coltivazione vengono consumati nel secondo ciclo di propagazione.
Nei brevetti e nelle domande di brevetto sopra riportate non viene per? affrontato il problema della idratazione del lievito in forma disidratata utilizzato.
Procedimenti di idratazione di lieviti sono noti nell?arte.
Ad esempio, e altri, in ?Journal of The Institute of Brewing? (2014), Vol. 120, pag. 71-76, riportano specificatamente l?idratazione di lieviti a partire dalla forma disidratata. In particolare, ? riportato l?effetto di diversi additivi sulla vitalit? del lievito reidratato e sulle sue prestazioni in fermentazione, utilizzando tre ceppi commerciali di lieviti Saccharomyces cerevisiae impiegati nella produzione di vini. Le fermentazioni vengono direttamente inoculate (?direct pitching?) e vengono impiegati un terreno di coltura di laboratorio e un mosto di uva, entrambi non tossici. Vengono testati i seguenti additivi: lievito disidratato inattivato (0 g/L - 1 g/L), ammonio (0 mM -1,2 mM), ergosterolo (0 mM - 0,5 mM), acido ascorbico (0 mM - 3,0 mM) e magnesio (0 mM - 25 mM). La reidratazione ? condotta a 40?C, per 30 minuti, in un terreno di coltura contenente 5% di saccarosio. In particolare, il lievito disidratato, assimilabile all?estratto di lievito, si mostra parzialmente efficace in un solo ceppo, aumentando la concentrazione cellulare di fine fermentazione e l?etanolo prodotto a 48 ore di fermentazione, mentre non ha effetto sulla vitalit? cellullare.
in ?American Journal of Enology and Viticulture? (2004), Vol. 55, Issue 4, pag. 363-370, riportano l?idratazione di un ceppo commerciale di lievito Saccharomyces cerevisiae impiegato nella produzione di vini, a partire da un substrato non tossico. In particolare, si mostra che l?aggiunta di un integratore commerciale di vitamine e minerali (contenente pantotenato, biotina, magnesio, zinco e manganese), associato ad un inoculo di lievito sufficientemente elevato, contribuisce ad incrementare la crescita dello stesso e la produzione di etanolo tramite inoculazione diretta in fermentazione (?direct pitching?).
e altri, in ?International Journal of Food Microbiology? (2008), Vol. 126, Issues 1-2, pag. 116-122, riportano la possibilit? di migliorare la vitalit? e l?attivit? di un ceppo vinario di lievito Saccharomyce cerevisiae mediante l?impiego di additivi durante l?idratazione, che avviene nelle condizioni suggerite dal fornitore (37?C, per 30 minuti, in un piccolo volume di acqua). A tale scopo, vengono testati una variet? di additivi (fonti di carbonio e azoto, ioni metallici, ossidanti e antiossidanti, composti che promuovono la fluidit? delle membrane), tra cui solo il magnesio sembra avere un effetto positivo sul recupero dell?attivit? cellulare.
e altri, in ?Archives of Biochemistry and Biophysics? (1956), Vol. 63, Issue 1, pag. 131-143, descrivono l?importanza di una temperatura adeguata nella reidratazione di lievito Saccharomyces cerevisiae utilizzato per la panificazione, evidenziando come temperature troppo basse possono abbassare la vitalit? dei lieviti reidratati con acqua distillata.
in ?Journal of the Institute of Brewing? (2001), Vol. 17, Issue 3, pag. 377-382, riportano l?effetto della temperatura e del tempo di idratazione, prendendo in considerazione la vitalit? di tre ceppi di lieviti disidratati attivi (ADY - ?Active Dry Yeast?) commerciali utilizzati nella fermentazione della birra. L?idratazione viene condotta come raccomandato dal produttore del lievito (acqua non demineralizzata, per massimo 1 ora) ad una temperatura di 25?C o 30?C: la vitalit? massima ? raggiunta dopo 15 minuti - 30 minuti di idratazione e, generalmente, ad una temperatura di 30?C, nonostante quest?ultimo parametro sia dipendente dal ceppo in esame.
in ?Process Biochemistry? (2005), Vol. 40(6), pag.
2205-2213, riportano la possibilit? di ridurre la fase di adattamento (?fase lag?) del lievito Saccharomyces cerevisiae in fermentazione in presenza di un idrolizzato di mais (zuccheri di prima generazione non tossici). In particolare, viene utilizzata la tecnica dell?acclimatamento, ovvero un pre-inoculo in un terreno molto simile a quello di fermentazione. La strategia consente di ridurre significativamente la fase di adattamento (?fase lag?) del lievito, senza per? portare benefici ai tempi di fermentazione (che, al contrario, si allungano). Si riporta, inoltre, come l?idratazione del lievito effettuata in un terreno ricco di nutrienti (peptone 10 g/L), per 20 minuti, non mostri alcun effetto sulla durata della fase di adattamento (?fase lag?) rispetto al controllo [inoculo diretto in fermentazione (?direct pitching?) di lievito disidratato].
La domanda di brevetto statunitense US 2004/0213889 descrive un metodo di idratazione di ceppi di lievito Saccharomyces cervevisiae utilizzati per la produzione di vini o altre bevande alcoliche, condotta in presenza di lievito inattivato o suoi derivati. Il lievito viene inoculato direttamente in fermentazione (?direct pitching?) di mosti non tossici e l?idratazione viene attuata utilizzando un terreno di idratazione comprendente estratto di lievito a concentrazioni molto alte (100 g/L - 200 g/L) sciolto in un substrato acquoso, preferibilmente zuccherino. Il lievito viene reidratato nel suddetto terreno per un breve periodo (20 minuti - 40 minuti), ad una temperatura di 30?C - 40?C. Il suddetto metodo permette di aumentare la velocit? di consumo degli zuccheri nelle ultime ore della fermentazione, riducendone significativamente il tempo complessivo.
La maggior parte dell?arte nota sopra riportata ? relativa alla produzione di bevande alcoliche, per le quali vengono utilizzati substrati non tossici: pertanto, non si riscontra la necessit? di affrontare la fase di adattamento (?fase lag?) dovuta alla presenza di inibitori e la detossificazione del terreno di fermentazione. Oppure, si affronta la fase di adattamento (?fase lag?) ma in presenza di idrolizzati da zuccheri di prima generazione (ad esempio, idrolizzati di mais) non tossici. Oppure, il problema della scarsa crescita o della fase di adattamento (?fase lag?) viene affrontato e risolto mediante la modifica del protocollo di crescita del lievito, utilizzando metodologie efficaci ma complesse dal punto di vista tecnologico (ad esempio, impiego di una corrente di solo xilosio, propagazione in modalit? ?fed-batch?), che richiedono ?set-up? impiantistici particolari per la loro realizzazione su scala industriale.
La Richiedente si ? quindi posta il problema di trovare un procedimento per l?idratazione di lieviti in forma disidratata che consenta di ridurre la fase di adattamento (?fase lag?) in processi fermentativi attuati in presenza di idrolizzati derivanti da biomasse lignocellulosiche, ovvero di idrolizzati contenenti composti tossici che, come sopra riportato, possono influire negativamente sulla fermentazione.
La Richiedente ha ora trovato un procedimento per l?idratazione di un lievito in forma disidratata, semplice e facilmente realizzabile su scala industriale, comprendente: preparare un mezzo di idratazione comprendente estratto di lievito in soluzione acquosa, ad una specifica concentrazione; aggiungere lievito in forma disidratata a detto mezzo di idratazione ad una specifica concentrazione; detto procedimento essendo condotto a specifiche condizioni di temperatura e di tempo.
Il suddetto procedimento di idratazione permette di migliorare l?efficienza di idratazione dei lieviti in forma disidratata, riducendo significativamente la durata della fase di adattamento (?fase lag?) durante la fase di propagazione, o di fermentazione in caso di inoculo diretto (?direct pitching?), in presenza di idrolizzati derivanti da biomasse lignocellulosiche ad alto contenuto di composti tossici (ad esempio, acido acetico in quantit? ? 2 g/L, acido formico in quantit? ? 0,2 g/L, 5-idrossimetilfurfurale (HMF) in quantit? ? 0,1 g/L, furfurale (F) in quantit? ? 0,04 g/L, singolarmente o in combinazione tra loro). In particolare, il suddetto procedimento di idratazione permette di:
- ridurre il tempo complessivo di propagazione del lievito;
- raggiungere concentrazioni cellulari maggiori nel brodo di fermentazione; - ridurre il rischio di contaminazione della coltura di lievito;
- propagare il lievito efficacemente anche su terreni di coltura caratterizzati da un alto contenuto di composti tossici senza necessit? di diluizioni degli stessi.
Il lievito reidratato cos? ottenuto pu? essere vantaggiosamente utilizzato in processi fermentativi che consentono la produzione di biocarburanti (?biofuels?) utilizzabili in motori diesel o aviazione quali, ad esempio, etanolo, alcoli lineari o ramificati a diverso peso molecolare, oppure di prodotti biochimici (?biochemicals?) quali, ad esempio, etanolo, glicerolo, esteri dell?acido acetico (ad esempio, acetato di etile), arabinitolo, acido lattico, acido succinico, oli microbici (bio-oli), oppure di lievito da propagazione, in particolare in processi fermentativi attuati in presenza di idrolizzati derivanti da biomasse lignocellulosiche.
Costituisce pertanto oggetto della presente invenzione un procedimento per l?idratazione di un lievito in forma disidratata, comprendente:
- preparare un mezzo di idratazione comprendente estratto di lievito in soluzione acquosa, ad una concentrazione compresa tra 1 g/L e 50 g/L, preferibilmente compresa tra 5 g/L e 20 g/L, pi? preferibilmente compresa tra 8 g/L e 15 g/L;
- aggiungere un lievito in forma disidratata a detto mezzo di idratazione ad una concentrazione compresa tra 10 g/L e 200 g/L, preferibilmente compresa tra 12 g/L e 100 g/L, pi? preferibilmente compresa tra 15 g/L e 50 g/L;
detto procedimento essendo condotto ad una temperatura compresa tra 25?C e 40?C, preferibilmente compresa 30?C e 35?C, per un tempo compreso tra 30 minuti e 8 ore, preferibilmente compreso tra 1 ora e 7 ore, pi? preferibilmente compreso tra 1,5 ore e 6,5 ore.
Allo scopo della presente descrizione e delle rivendicazioni che seguono, le definizioni degli intervalli numerici comprendono sempre gli estremi a meno di diversa specificazione.
Allo scopo della presente descrizione e delle rivendicazioni che seguono, il termine ?comprendente? include anche i termini ?che consiste essenzialmente di? o ?che consiste di?.
Il suddetto procedimento pu? essere utilizzato per l?idratazione di qualsiasi lievito in forma disidratata successivamente utilizzato in processi fermentativi che consentono la produzione di biocarburanti (?biofuels?) utilizzabili in motori diesel o aviazione quali, ad esempio, etanolo, alcoli lineari o ramificati a diverso peso molecolare, oppure di prodotti biochimici (?biochemicals?) quali, ad esempio, etanolo, glicerolo, esteri dell?acido acetico (ad esempio, acetato di etile), arabinitolo, acido lattico, acido succinico, oli microbici (bio-oli), oppure di lievito da propagazione, in particolare in processi fermentativi attuati in presenza di idrolizzati derivanti da biomasse lignocellulosiche.
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto lievito in forma disidratata pu? essere scelto, ad esempio, tra lieviti appartenenti ai generi: Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Debaromyces, Nadsonia, Lipomyces, Torulopsis, Kloeckera, Pichia, Schizosaccharomyces, Trigonopsis, Brettanomyces, Cryptococcus, Trichosporon, Aureobasidium, Lipomyces, Phaffia, Rhodotorula, Rhodosporidium, Yarrowia, Schwanniomyces. Preferibilmente, detto lievito in forma disidratata ? scelto tra lieviti appartenenti al genere Saccharomyces, pi? preferibilmente tra ceppi di Saccharomyces cerevisiae, sia ?wild type?, sia geneticamente modificati.
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detta soluzione acquosa pu? comprendere altri nutrienti quali, ad esempio, idrolizzati proteici (ad esempio, peptone) in quantit? compresa tra 1 g/L e 40 g/L, preferibilmente compresa tra 15 g/L e 25 g/L, zuccheri (ad esempio, glucosio, xilosio, saccarosio) in quantit? compresa tra 1 g/L e 40 g/L, preferibilmente compresa tra 15 g/L e 25 g/L.
Al termine del procedimento di idratazione, il lievito reidratato ottenuto pu? essere sottoposto ad uno stadio di propagazione, oppure pu? essere direttamente inoculato in fermentazione (?direct pitching?), in presenza di idrolizzati derivanti da biomasse lignocellulosiche, allo scopo di produrre biocarburanti (?biofuels?) utilizzabili in motori diesel o aviazione quali, ad esempio, etanolo, alcoli lineari o ramificati a diverso peso molecolare, oppure prodotti biochimici (?biochemicals?) quali, ad esempio, etanolo, glicerolo, esteri dell?acido acetico (ad esempio, acetato di etile), arabinitolo, acido lattico, acido succinico, oli microbici (bio-oli), oppure lievito da propagazione.
? quindi un ulteriore oggetto della presente invenzione un procedimento di fermentazione per la produzione di biocarburanti (?biofuels?), o di prodotti biochimici (?biochemicals?), comprendente i seguenti stadi:
(a) idratare un lievito in forma disidratata ottenendo un lievito reidratato;
(b) opzionalmente, propagare il lievito reidratato ottenuto nello stadio (a), in presenza di un terreno di coltura comprendente un idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica;
(c) alimentare il lievito ottenuto nello stadio (a) o nello stadio (b) ad un dispositivo di fermentazione in presenza di un terreno di coltura comprendente un idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica;
(d) al termine della fermentazione recuperare i biocarburanti (?biofuels?) o i prodotti biochimici (?biochemicals?) ottenuti;
caratterizzato dal fatto che lo stadio (a) viene condotto in accordo con il procedimento oggetto della presente invenzione.
Nel suddetto procedimento, sia nell?eventuale stadio (b) (propagazione), sia nello stadio (c) (fermentazione), la principale fonte di carbonio ? l?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica. A tale scopo possono essere utilizzate diverse biomasse lignocellulosiche: una descrizione dettagliata delle biomasse lignocellulosiche che possono essere vantaggiosamente utilizzate nel suddetto procedimento pu? essere trovata, ad esempio, nella domanda di brevetto internazionale WO 2015/028156, qui incorporata come riferimento.
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detta biomassa lignocellulosica pu? essere scelta, ad esempio, tra: - vegetali espressamente coltivati per uso energetico quali, ad esempio, miscanto, panico (Panicum virgatum), canna comune (Arundo donax); - vegetali non espressamente coltivati per uso energetico quali, ad esempio, sorgo (ad esempio, fibre da sorgo);
- scarti, residui e rifiuti di prodotti derivanti dall?agricoltura quali, ad esempio, guayule, mais (ad esempio, stocchi di mais, tutoli di mais), soia, cotone, lino, colza (?rapeseed?), grano (ad esempio, paglia di grano), riso (ad esempio, paglia di riso, pula di riso, lolla di riso), canna da zucchero (ad esempio, paglia di canna da zucchero, bagassa di canna da zucchero), palma (ad esempio, ?palm leafs?, ?palm trunks?, ?palm mibrids?, ?palm empty fruit bunches?);
- scarti, residui e rifiuti di prodotti derivanti dalla forestazione, dalla silvicoltura, o dalla lavorazione del legno quali, ad esempio, pioppo, ontano, betulla;
- scarti dei prodotti agro-alimentari destinati all?alimentazione umana o alla zootecnia;
- residui, non trattati chimicamente, dell?industria della carta;
- rifiuti provenienti dalla raccolta differenziata dei rifiuti solidi urbani (ad esempio, rifiuti urbani di origine vegetale, carta);
- alghe quali, ad esempio microalghe o macroalghe, in particolare macroalghe.
In accordo con una forma di realizzazione particolarmente preferita della presente invenzione, detta biomassa lignocellulosica pu? essere scelta, ad esempio, tra: vegetali espressamente coltivati per uso energetico quali, ad esempio, miscanto, panico (Panicum virgatum), canna comune (Arundo donax); vegetali non espressamente coltivati per uso energetico quali, ad esempio, sorgo (ad esempio, fibre da sorgo); scarti, residui e rifiuti di prodotti derivanti dall?agricoltura quali, ad esempio, guayule, mais (ad esempio, stocchi di mais, tutoli di mais), soia, cotone, lino, colza (?rapeseed?), grano (ad esempio, paglia di grano), riso (ad esempio, paglia di riso, pula di riso, lolla di riso), canna da zucchero (ad esempio, paglia di canna da zucchero, bagassa di canna da zucchero), palma (ad esempio, ?palm leafs?, ?palm trunks?, ?palm mibrids?, ?palm empty fruit bunches?); scarti, residui e rifiuti di prodotti derivanti dalla forestazione, dalla silvicoltura, o dalla lavorazione del legno quali, ad esempio, pioppo, ontano, betulla.
Facoltativamente, nei suddetti stadi (b) e (c), al terreno di coltura, oltre all?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica, possono essere aggiunte altre fonti di carbonio quali, ad esempio, melassa, zuccheri sintetici: tuttavia, gli zuccheri monomerici derivanti dall?idrolisi della biomassa lignocellulosica sono, preferibilmente, almeno l?80% in peso, pi? preferibilmente almeno il 90% in peso, ancora pi? preferibilmente almeno il 95% in peso, delle fonti di carbonio totali utilizzate nei suddetti stadi (b) e (c).
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? la sola fonte di carbonio utilizzato nei suddetti stadi (b) e (c).
Allo scopo della presente invenzione, l?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica pu? essere ottenuto secondo uno qualsiasi dei metodi di idrolisi noti nell?arte.
Preferibilmente, l?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica pu? essere ottenuto mediante un processo comprendente i seguenti stadi: (i) un pretrattamento della biomassa lignocellulosica di partenza per produrre una biomassa lignocellulosica pretrattata (pretrattato) allo scopo di aumentare l?accessibilit? degli zuccheri polimerici e oligomerici in essa contenuti alla successiva azione degli enzimi; e (ii) sottoporre la biomassa lignocellulosica pretrattata ottenuta nello stadio (i) ad idrolisi enzimatica allo scopo di idrolizzare gli zuccheri polimerici e oligomerici a zuccheri monomerici (zuccheri a cinque e a sei atomi di carbonio, principalmente, glucosio e xilosio).
Preferibilmente, lo stadio (i) di pretrattamento comprende il trattamento idrotermico della biomassa lignocellulosica di partenza con acqua, in fase vapore, in un reattore pressurizzato, e la successiva esplosione con vapore (?steam explosion?) della biomassa lignocellulosica dopo trattamento idrotermico attuata rilasciando rapidamente la pressione applicata alla biomassa lignocellulosica.
Preferibilmente, prima dello stadio (i) di pretrattamento, la biomassa lignocellulosica di partenza pu? essere sottoposta ad uno stadio (i?) di imbibizione con acqua (?soaking?) allo scopo di rimuovere una parte di composti non lignocellulosici contenuti nella biomassa lignocellulosica di partenza quali, ad esempio, sali inorganici, cere, acidi organici. Durante detto stadio (i?) di imbibizione con acqua (?soaking?), possono essere altres? rimossi i contaminanti esterni quali, ad esempio, polvere, pietre, residui di raccolta.
Maggiori dettagli relativi a detto stadio (i) di pretrattamento e a detto stadio (i?) di imbibizione con acqua (?soaking?), possono essere trovati, ad esempio, nel brevetto europeo EP 3,241,907, qui incorporato come riferimento.
Facoltativamente, detto stadio (i) di pretrattamento pu? essere condotto in due stadi come descritto, ad esempio, nel brevetto europeo EP 2,414,531, qui incorporato come riferimento.
Il suddetto stadio (ii) di idrolisi enzimatica pu? essere condotto mettendo in contatto una sospensione acquosa (?slurry?) di biomassa lignocellulosica ottenuta nello stadio (i), con un enzima o una miscela (?cocktail?) di enzimi, operando in condizioni in grado di promuovere detta idrolisi enzimatica.
Allo scopo di ottenere detta sospensione acquosa (?slurry?), alla biomassa lignocellulosica pretrattata ottenuta nello stadio (i), pu? essere aggiunta acqua, eventualmente acqua da ricircolo, oppure pu? essere aggiunta una soluzione acquosa contenente zuccheri (ad esempio, una soluzione acquosa contenente zuccheri proveniente dall?idrolisi enzimatica), in quantit? tale da ottenere una sospensione (?slurry?) comprendente una quantit? di biomassa pretrattata (peso secco) preferibilmente compresa tra il 10% in peso e il 25% in peso, rispetto al peso totale di detta sospensione acquosa (?slurry?).
Preferibilmente, il suddetto stadio (ii) di idrolisi enzimatica pu? essere condotto ad un pH compreso tra 4,5 e 5,3 ad una temperatura compresa tra 45?C e 65?C, e per un tempo compreso tra 24 ore e 120 ore, sotto agitazione.
Il suddetto stadio (ii) di idrolisi enzimatica pu? comprendere uno o pi? stadi.
Al termine di detto stadio (ii) di idrolisi, si ottiene una miscela comprendente un residuo solido (i.e. fase solida) comprendente biomassa lignocellulosica pretrattata non solubilizzata (i.e. solidi insolubili, principalmente lignina) e un idrolizzato da biomassa lignocellulosica (i.e. fase acquosa) comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio.
Opzionalmente, tutto o almeno una parte di detto residuo solido (i.e. fase solida) comprendente biomassa lignocellulosica pretrattata non solubilizzata (i.e. solidi insolubili, principalmente lignina), pu? essere rimosso/a dalla suddetta miscela secondo tecniche note nell?arte quali, ad esempio, decantazione, centrifugazione, o pressatura, o loro combinazione.
In una forma di realizzazione preferita della presente invenzione non viene praticata alcuna rimozione di detto residuo solido (i.e. fase solida) comprendente biomassa lignocellulosica pretrattata non solubilizzata (i.e. solidi insolubili, principalmente lignina) e, di conseguenza, l?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica utilizzato negli stadi (b) e (c) del suddetto procedimento, ? la suddetta miscela comprendente un residuo solido (i.e. fase solida) comprendente biomassa lignocellulosica pretrattata non solubilizzata (i.e. solidi insolubili, principalmente lignina) e un idrolizzato da biomassa lignocellulosica (i.e. fase acquosa) comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio.
Preferibilmente, allo scopo della presente invenzione, l?idrolisi enzimatica della biomassa lignocellulosica pu? essere condotta operando come descritto, ad esempio, nella domanda di brevetto internazionale WO 2010/113130, qui incorporata come riferimento.
I processi di idrolisi enzimatica sopra riportati sono da considerarsi forme di realizzazione esemplificative e preferite allo scopo di ottenere l?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica e non limitative della presente invenzione.
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? una miscela comprendente un residuo solido (i.e. fase solida) comprendente biomassa lignocellulosica pretrattata non solubilizzata (i.e. solidi insolubili, principalmente lignina) e un idrolizzato da biomassa lignocellulosica (i.e. fase acquosa) comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio, detta miscela avente un contenuto di solidi totali (solubili insolubili) compreso tra il 5% in peso e il 30% in peso, preferibilmente compreso tra il 10% in peso e il 20% in peso, rispetto al peso totale di detta miscela.
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? una miscela comprendente un residuo solido (i.e. fase solida) comprendente biomassa lignocellulosica pretrattata non solubilizzata (i.e. solidi insolubili, principalmente lignina) e un idrolizzato da biomassa lignocellulosica (i.e. fase acquosa) comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio, detta fase acquosa avente un contenuto di glucosio compreso tra 20 g/L e 100 g/L, preferibilmente compreso tra 30 g/L e 70 g/L, pi? preferibilmente compreso tra 40 g/L e 60 g/L.
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? una miscela comprendente un residuo solido (i.e. fase solida) comprendente biomassa lignocellulosica pretrattata non solubilizzata (i.e. solidi insolubili, principalmente lignina) e un idrolizzato da biomassa lignocellulosica (i.e. fase acquosa) comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio, detta fase acquosa avente un contenuto di xilosio compreso tra 10 g/L e 40 g/L, preferibilmente compreso tra 15 g/L e 30 g/L, pi? preferibilmente compreso tra 18 g/L e 25 g/L.
Detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica comprende, inoltre, composti tossici quali, ad esempio, acido acetico, acido formico, 5-idrossimetilfurfurale (HMF), furfurale (F) che, come detto sopra, possono agire da inibitori della crescita dei microorganismi usualmente utilizzati nella fermentazione.
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? una miscela comprendente un residuo solido (i.e. fase solida) comprendente biomassa lignocellulosica pretrattata non solubilizzata (i.e. solidi insolubili, principalmente lignina) e un idrolizzato da biomassa lignocellulosica (i.e. fase acquosa) comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio, detta fase acquosa avente un contenuto di acido acetico compreso tra 2 g/L e 8 g/L, preferibilmente compreso tra 2,5 g/L e 7,5 g/L; e/o acido formico compreso tra 0,2 g/L e 2 g/L, preferibilmente compreso tra 0,3 g/L e 1,8 g/L; e/o 5-idrossimetilfurfurale (HMF) compreso tra 0,1 g/L e 1 g/L, preferibilmente compreso tra 0,2 g/L e 0,8 g/L; e/o furfurale (F) compreso tra 0,04 g/L e 1 g/L, preferibilmente compreso tra 0,05 g/L e 0,8 g/L.
In accordo con una ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? la fase acquosa comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio derivante dall?idrolisi della biomassa lignocellulosica, detta fase acquosa avente un contenuto di glucosio compreso tra 20 g/L e 100 g/L, preferibilmente compreso tra 30 g/L e 70 g/L, pi? preferibilmente tra 40 g/L a 60 g/L.
In accordo con una ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? la fase acquosa comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio derivante dall?idrolisi della biomassa lignocellulosica, detta fase acquosa avente un contenuto di xilosio compreso tra 10 g/L e 40 g/L, preferibilmente compreso tra 15 g/L e 30 g/L, pi? preferibilmente compreso tra 18 g/L e 25 g/L.
In accordo con una ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? la fase acquosa comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio derivante dall?idrolisi della biomassa lignocellulosica, detta fase acquosa avente un contenuto di acido acetico compreso tra 2 g/L e 8 g/L, preferibilmente compreso tra 2,5 g/L e 7,5 g/L; e/o acido formico compreso tra 0,2 g/L e 2 g/L, preferibilmente compreso tra 0,3 g/L e 1,8 g/L; e/o 5-idrossimetilfurfurale (HMF) compreso tra 0,1 g/L e 1 g/L, preferibilmente compreso tra 0,2 g/L e 0,8 g/L; e/o furfurale (F) compreso tra 0,04 g/L e 1 g/L, preferibilmente compreso tra 0,05 g/L e 0,8 g/L.
Inoltre, detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica pu? contenere contaminanti biologici, come avviene tipicamente nei processi su scala industriale, generalmente condotti in ambienti non sterili. Detti contaminanti biologici sono organismi microbici diversi dal lievito che si vuole propagare e/o sottoporre a fermentazione secondo il procedimento in accordo con la presente invenzione, e la cui presenza generalmente influisce negativamente sulla resa dello stesso, in quanto parte degli zuccheri monomerici vengono consumati da detti organismi microbici e non sono pi? disponibili alla crescita del lievito desiderato. Detti contaminanti biologici possono comprendere batteri e/o funghi, nonch? lieviti diversi dal lievito desiderato.
Allo scopo di evitare la contaminazione dovuta a detti contaminanti biologici nella propagazione e/o nella fermentazione, detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica, i mezzi di propagazione e/o fermentazione e tutte le ulteriori attrezzature coinvolte nel processo, possono essere sottoposti a sterilizzazione tramite metodi noti nell?arte quali, ad esempio, aggiunta di uno o pi? agenti antibatterici (ad esempio, antibiotici o altri agenti asettici), procedure di sterilizzazione (ad esempio, pastorizzazione), applicazione di agenti fisici (ad esempio, calore, luce, radiazioni), prima, o durante le fasi di propagazione e/o fermentazione. Per ?sterilizzazione? si intende qui la riduzione della densit? dei contaminanti biologici di un fattore almeno pari a 100.
? tuttavia da notare che, preferibilmente, allo scopo del procedimento oggetto della presente invenzione, l?uso di agenti antibatterici e delle procedure di sterilizzazione, che introduce costi aggiuntivi ed ? di difficile applicazione a livello industriale, viene evitato.
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione detto stadio (b) pu? essere condotto ad una temperatura compresa tra 20?C e 45?C, preferibilmente compresa tra 25?C e 35?C.
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto stadio (b) pu? essere condotto per un tempo compreso tra 4 ore e 30 ore, preferibilmente compreso tra 8 ore e 24 ore.
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto stadio (b) pu? essere condotto ad un pH compreso tra 4 e 8, preferibilmente compreso tra 4,5 e 7. Allo scopo di mantenere il pH negli intervalli desiderati, pu? essere aggiunta al terreno di coltura utilizzato in detto stadio (b) una soluzione acquosa di almeno una base inorganica quale, ad esempio, idrossido di sodio, idrossido di potassio, idrossido di calcio, idrossido di magnesio, o loro miscele, preferibilmente idrossido di sodio; oppure una soluzione acquosa di almeno un acido inorganico quale, ad esempio, acido fosforico, acido solforico, acido 2-(N-morfolino)etano solfonico (MES), acido cloridrico, o loro miscele; in quantit? tale da ottenere il pH desiderato. Preferibilmente, pu? essere aggiunta una soluzione acquosa di acido solforico.
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto stadio (b) pu? essere condotto ad una portata di aria compresa tra 1 vvh e 120 vvh, preferibilmente compresa tra 5 vvh e 30 vvh (volume di aria che fluisce per volume di terreno di coltura).
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, in detto stadio (b), al terreno di coltura, oltre all?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica, possono essere aggiunti vari nutrienti quali, ad esempio, fonti di azoto (ad esempio, urea), fosfato di potassio, magnesio, sali, vitamine, microelementi.
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto stadio (c) pu? essere condotto ad una temperatura compresa tra 20?C e 45?C, preferibilmente compresa tra 25?C e 35?C.
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto stadio (c) pu? essere condotto per un tempo compreso tra 24 ore e 140 ore, preferibilmente compreso tra 40 ore e 120 ore.
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto stadio (c) pu? essere condotto ad un pH compreso tra 4 e 8, preferibilmente compreso tra 4,5 e 7. Allo scopo di mantenere il pH negli intervalli desiderati, pu? essere aggiunta al terreno di coltura utilizzato in detto stadio (c) una soluzione acquosa di almeno una base inorganica quale, ad esempio, idrossido di sodio, idrossido di potassio, idrossido di calcio, idrossido di magnesio, o loro miscele, preferibilmente idrossido di sodio; oppure una soluzione acquosa di almeno un acido inorganico quale, ad esempio, acido fosforico, acido solforico, acido 2-(N-morfolino)etano solfonico (MES), acido cloridrico, o loro miscele; in quantit? tale da ottenere il pH desiderato.
Preferibilmente, pu? essere aggiunta una soluzione acquosa di acido solforico. In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto stadio (c) pu? essere condotto in assenza aria.
In accordo con una ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione, detto stadio (c) pu? essere condotto ad una portata di aria compresa tra 1 vvh e 120 vvh, preferibilmente compresa tra 10 vvh e 60 vvh (volume di aria che fluisce per volume di terreno di coltura per ora).
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, in detto stadio (c), al terreno di coltura, oltre all?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica, possono essere aggiunti vari nutrienti quali, ad esempio, fonti di azoto (ad esempio, urea), fosfato di potassio, magnesio, sali, vitamine, microelementi.
In accordo con una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, detto stadio (c) ? una fermentazione in ?batch?, o a coltura discontinua (?fed-batch fermentation?), o a coltura continua, preferibilmente in ?batch?.
Detto stadio (d) pu? essere condotto secondo procedimenti noti nell?arte quali, ad esempio, distillazione, centrifugazione, estrazione.
Allo scopo di meglio comprendere la presente invenzione e per mettere in pratica la stessa, di seguito si riportano alcuni esempi illustrativi e non limitativi della stessa.
ESEMPIO 1
Analisi dell?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica
Allo scopo ? stata utilizzata come idrolizzato una miscela derivante dall?idrolisi enzimatica di sfogliato di pioppo bianco comprendente una fase acquosa comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio e una fase solida comprendente solidi insolubili in quantit? pari al 6,5% in peso rispetto al peso totale di detta miscela.
Il contenuto di solidi insolubili ? stato determinato in accordo con lo standard NREL riportato nel Technical Report NREL/TP-510-42627: ?Determination of Insoluble Solids in Pretreated Biomass Material?, Laboratory Analytical Procedure (LAP) (Issue Date: 03/21/2008) disponibile al seguente sito Internet: https://www.nrel.gov/docs/gen/fy08/42627.pdf.
Il contenuto di solidi totali (solubili insolubili) ? stato determinato in accordo con lo standard NREL riportato nel Technical Report NREL/TP-510-42621 ?Determination of Total Solids in Biomass and Total Dissolved Solids in Liquid Process Samples?, Laboratory Analytical Procedure (LAP) (Issue Date: 03/31/2008) disponibile al seguente sito Internet: https://www.nrel.gov/docs/gen/fy08/42621.pdf.
La composizione di detta fase acquosa ? stata determinata in accordo con lo standard NREL riportato nel Technical Report NREL/TP-510-42623 ?Determination of Sugars, Byproducts, and Degradation Products in Liquid Fraction Process Samples?, Laboratory Analytical Procedure (LAP) (Issue Date: 12/08/2006) disponibile al seguente sito Internet: https://www.nrel.gov/docs/gen/fy08/42623.pdf.
Tabella 1
Come detto sopra, l?acido acetico, l?acido formico, il 5-idrossimetilfurfurale (HMF), il furfurale (F), sono composti tossici che agiscono da inibitori della crescita del lievito Saccharomyces cerevisiae utilizzato nei successi esempi di propagazione mentre, l?acido lattico ? prodotto dalla contaminazione batterica. Non sono stati, comunque, aggiunti antibiotici.
ESEMPIO 2 (comparativo)
Propagazione di lievito Saccharomyces cerevisiae su idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica con idratazione senza nutrienti
Il ceppo commerciale di lievito Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red<? >yeast - Leaf by LeSaffre), conservato in forma disidratata, ? stato reidratato secondo le indicazioni del produttore: 30 minuti in soluzione fisiologica (NaCl 0,9% in peso, in quantit? pari a 5 volte il peso del lievito) ad una temperatura di 32?C, sotto agitazione (100 rpm), in una provetta da 50 ml.
Successivamente, il lievito ? stato inoculato in un bioreattore da 1 litro, ad una concentrazione di 0,25 g/L, nell?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ottenuto da sfogliato di pioppo bianco descritto nell?Esempio 1 previamente centrifugato a 6000 rpm, per 15 minuti, allo scopo di eliminare la fase solida. All?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? stata aggiunta urea ad una concentrazione di 1,5 g/L.
La propagazione ? stata condotta a 32?C, pH 5,3, aerazione 10 vvh, in modalit? ?batch?, in un reattore da 1 L di volume massimo al riempimento del 66%, ad una agitazione fissa di 500 rpm.
La gemmazione cellulare ? stata osservata dopo 4 ore dall?inoculo, mentre l?incremento della concentrazione cellulare (crescita cellulare) ? iniziato a 6 ore. Dopo 18 ore di propagazione, ? stata misurata una concentrazione cellulare di 1,5 g/L (fattore di moltiplicazione 6x).
La gemmazione cellulare ? stata osservata mediante microscopio con camera Burker.
La crescita cellulare durante la fermentazione ? stata misurata mediante conta al microscopio con camera Burker e mediante determinazione del peso secco della biomassa cellulare in stufa, a 105?C.
In Figura 1 ? riportata la curva della gemmazione cellulare (in ordinata ? riportata la % di cellule gemmate; in ascissa il tempo in ore).
In Figura 2 ? riportata la curva della fase di adattamento (?fase lag?) (in ordinata ? riportata la concentrazione di cellule espressa in g/L; in ascissa il tempo in ore).
In Figura 3 ? riportata la concentrazione cellulare a fine propagazione (in ordinata ? riportata la concentrazione di cellule espressa in g/L; in ascissa il numero dell?esempio e, dove necessario, la lettera che individua il campione). ESEMPIO 3 (comparativo)
Propagazione di lievito Saccharomyces cerevisiae su idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica, con diversi tempi di idratazione, senza nutrienti Il ceppo commerciale di lievito Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red<? >yeast - Leaf by LeSaffre), conservato in forma disidratata, ? stato reidratato, per 6 ore (Campione A), e per 2 ore (Campione B), in soluzione fisiologica (NaCl 0,9% in peso) ad una concentrazione di 16 g/L (peso del lievito rispetto al volume di idratazione), ad una temperatura di 32?C, sotto agitazione (200 rpm), in una beuta da 100 ml.
Successivamente, il lievito ? stato inoculato in un bioreattore da 1 litro, ad una concentrazione di 0,25 g/L, nell?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ottenuto da sfogliato di pioppo bianco descritto nell?Esempio 1 previamente centrifugato a 6000 rpm, per 15 minuti, allo scopo di eliminare la fase solida. All?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? stata aggiunta urea ad una concentrazione di 1,5 g/L.
La propagazione ? stata condotta a 32?C, pH 5,3, aerazione 10 vvh, in modalit? ?batch?, in un reattore da 1 L di volume massimo al riempimento del 66%, ad una agitazione fissa di 500 rpm.
Nel Campione B (idratazione di 2 ore), la gemmazione cellulare ? stata osservata dopo 4 ore dall?inoculo, mentre l?incremento della concentrazione cellulare (crescita cellulare) ? iniziato a 6 ore.
Dopo 18 ore di propagazione ? stata misurata una concentrazione cellulare pari a:
- Campione A: 1,7 g/L (fattore di moltiplicazione 6x);
- Campione B: 1,5 g/L (fattore di moltiplicazione 6,5x).
In Figura 1 ? riportata la curva della gemmazione cellulare per il Campione B (Es. 2B) (in ordinata ? riportata la % di cellule gemmate; in ascissa il tempo in ore).
In Figura 2 ? riportata la curva della fase di adattamento (?fase lag?) per il Campione B (Es. 3B) (in ordinata ? riportata la concentrazione di cellule espressa in g/L; in ascissa il tempo in ore).
In Figura 3 ? riportata la concentrazione cellulare a fine propagazione per il Campione A (Es. 3A) e per il Campione B (Es. 3B) (in ordinata ? riportata la concentrazione di cellule espressa in g/L; in ascissa il numero dell?esempio e, dove necessario, la lettera che individua il campione).
ESEMPIO 4 (invenzione)
Propagazione di lievito Saccharomyces cerevisiae su idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica, con idratazione in presenza di nutrienti
Il ceppo commerciale di lievito Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red<? >yeast - Leaf by LeSaffre), conservato in forma disidratata, ? stato reidratato, in diverse soluzioni acquose e a tempi diversi come sotto riportato, ad una concentrazione di 16 g/L (peso del lievito rispetto al volume di idratazione), ad una temperatura di 32?C, sotto agitazione (200 rpm), in una beuta da 100 ml.
Sono state impiegate le seguenti soluzioni acquose e i seguenti tempi: - Campione C: estratto di lievito 10 g/L peptone 20 g/L glucosio 20 g/L;
6 ore;
Campione D: estratto di lievito 10 g/L peptone 20 g/L glucosio 20 g/L; 2 ore;
Campione E: estratto di lievito 10 g/L; 6 ore;
Campione F: estratto di lievito 10 g/L; 2 ore.
Successivamente, il lievito ? stato inoculato in un bioreattore da 1 litro, ad una concentrazione di 0,25 g/L, nell?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ottenuto da sfogliato di pioppo bianco descritto nell?Esempio 1 previamente centrifugato a 6000 rpm, per 15 minuti, allo scopo di eliminare la fase solida. All?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? stata aggiunta urea ad una concentrazione di 1,5 g/L.
La propagazione ? stata condotta a 32?C, pH 5,3, aerazione 10 vvh, in modalit? ?batch?, in un reattore da 1 L di volume massimo al riempimento del 66%, ad una agitazione fissa di 500 rpm.
In tutti i campioni la gemmazione cellulare era gi? evidente al momento dell?inoculo, mentre l?incremento della concentrazione cellulare (crescita cellulare) ? iniziata a 2 ore.
Dopo 18 ore di propagazione ? stata misurata una concentrazione cellulare pari a:
- Campione C: 2,7 g/L (fattore di moltiplicazione 11x);
- Campione D: 2,5 g/L (fattore di moltiplicazione 10x);
- Campione E: 2,5 g/L (fattore di moltiplicazione 10x);
- Campione F: 2,5 g/L (fattore di moltiplicazione 10x).
In Figura 1 ? riportata la curva della gemmazione cellulare per il Campione D (Es. 4D) (in ordinata ? riportata la % di cellule gemmate; in ascissa il tempo in ore).
In Figura 2 ? riportata la curva della fase di adattamento (?fase lag?) per il Campione D (Es. 4D) (in ordinata ? riportata la concentrazione di cellule espressa in g/L; in ascissa il tempo in ore).
In Figura 3 ? riportata la concentrazione cellulare a fine propagazione per il Campione C (Es. 4C), per il Campione D (Es. 4D), per il Campione E (Es. 4E), per il Campione F (Es. 4F) (in ordinata ? riportata la concentrazione di cellule espressa in g/L; in ascissa il numero dell?esempio e, dove necessario, la lettera che individua il campione).
ESEMPIO 5 (comparativo)
Propagazione di lievito Saccharomyces cerevisiae su idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica, con idratazione senza nutrienti e propagazione in presenza di nutrienti
Il ceppo commerciale di lievito Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red<? >yeast - Leaf by LeSaffre), conservato in forma disidratata, ? stato reidratato secondo le indicazioni del produttore: 30 minuti in soluzione fisiologica (NaCl 0,9% in peso, in quantit? pari a 5 volte il peso del lievito), ad una temperatura di 32?C, sotto agitazione (100 rpm), in una provetta da 50 ml.
Successivamente, il lievito ? stato inoculato in un bioreattore da 1 litro, ad una concentrazione di 0,25 g/L, nell?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ottenuto da sfogliato di pioppo bianco descritto nell?Esempio 1 previamente centrifugato a 6000 rpm, per 15 minuti, allo scopo di eliminare la fase solida. All?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? stata aggiunta urea ad una concentrazione di 1,5 g/L e estratto di lievito nella stessa quantit? che risulterebbe dall?idratazione descritta nell?Esempio 3 sopra riportato (concentrazione risultante 0,15 g/L).
La propagazione ? stata condotta a 32?C, pH 5,3, aerazione 10 vvh, in modalit? ?batch?, in un reattore da 1 L di volume massimo al riempimento del 66%, ad una agitazione fissa di 500 rpm.
La gemmazione cellulare ? stata osservata dopo 4 ore dall?inoculo, mentre l?incremento della concentrazione cellulare (crescita cellulare) ? iniziato a 6 ore. Dopo 18 ore di propagazione ? stata misurata una concentrazione cellulare pari 1,9 g/L (fattore di moltiplicazione 7,5x).
In Figura 3 ? riportata la concentrazione cellulare a fine propagazione (in ordinata ? riportata la concentrazione di cellule espressa in g/L; in ascissa il numero dell?esempio e, dove necessario, la lettera che individua il campione). ESEMPIO 6 (invenzione)
Propagazione di lievito Saccharomyces cerevisiae su idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica, con idratazione in presenza di nutrienti
Il ceppo commerciale di lievito Saccharomyces cerevisiae (Ethanol Red<? >yeast - Leaf by LeSaffre), conservato in forma disidratata, ? stato reidratato in una soluzione acquosa comprendente estratto di lievito ad una concentrazione d 10 g/L, per 2 ore, ad una concentrazione di 16 g/L (peso del lievito rispetto al volume di idratazione), ad una temperatura di 32?C, sotto blanda agitazione (200 rpm), in una beuta da 100 ml.
Successivamente, il lievito ? stato inoculato in un bioreattore da 1 litro, ad una concentrazione di 0,25 g/L, nell?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ottenuto da sfogliato di pioppo bianco descritto nell?Esempio 1, non sottoposta alla rimozione della fase solida. All?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? stata aggiunta urea ad una concentrazione di 1,5 g/L e estratto di lievito nella stessa quantit? che risulterebbe dall?idratazione descritta nell?Esempio 3 sopra riportato (concentrazione risultante 0,15 g/L).
La propagazione ? stata condotta a 32?C, pH 5,3, aerazione 10 vvh, in modalit? ?batch?, in un reattore da 1 L di volume massimo al riempimento del 66%, ad una agitazione fissa di 500 rpm.
La gemmazione cellulare ? stata osservata dopo 4 ore dall?inoculo, mentre l?incremento della concentrazione cellulare (crescita cellulare) ? iniziato a 6 ore. Dopo 24 ore di propagazione ? stata misurata una concentrazione cellulare pari 2,4 g/L (fattore di moltiplicazione 9,5x).
Non essendo possibile misurare direttamente il peso secco cellulare a causa della presenza dei solidi insolubili nell?idrolizzato lignocellulosico, la concentrazione cellulare ? stata misurata mediante conta delle cellule al microscopio con camera di Burker. Il relativo peso secco cellulare ? stato calcolato mediante una retta di taratura, che correla numero di cellule e peso secco, costruita in un terreno di coltura identico privato dei solidi insolubili.
In Figura 3 ? riportata la concentrazione cellulare a fine propagazione (in ordinata ? riportata la concentrazione di cellule espressa in g/L; in ascissa il numero dell?esempio e, dove necessario, la lettera che individua il campione).
Claims (16)
1. Procedimento per l?idratazione di un lievito in forma disidratata, comprendente:
- preparare un mezzo di idratazione comprendente estratto di lievito in soluzione acquosa, ad una concentrazione compresa tra 1 g/L e 50 g/L, preferibilmente compresa tra 5 g/L e 20 g/L, pi? preferibilmente compresa tra 8 g/L e 15 g/L;
- aggiungere un lievito in forma disidratata a detto mezzo di idratazione ad una concentrazione compresa tra 10 g/L e 200 g/L, preferibilmente compresa tra 12 g/L e 100 g/L, pi? preferibilmente compresa tra 15 g/L e 50 g/L;
detto procedimento essendo condotto ad una temperatura compresa tra 25?C e 40?C, preferibilmente compresa 30?C e 35?C, per un tempo compreso tra 30 minuti e 8 ore, preferibilmente compreso tra 1 ora e 7 ore, pi? preferibilmente compreso tra 1,5 ore e 6,5 ore.
2. Procedimento per l?idratazione di un lievito in forma disidratata in accordo con la rivendicazione 1, in cui detto lievito in forma disidratata ? scelto tra lieviti appartenenti ai generi: Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Debaromyces, Nadsonia, Lipomyces, Torulopsis, Kloeckera, Pichia, Schizosaccharomyces, Trigonopsis, Brettanomyces, Cryptococcus, Trichosporon, Aureobasidium, Lipomyces, Phaffia, Rhodotorula, Rhodosporidium, Yarrowia, Schwanniomyces; preferibilmente tra lieviti appartenenti al genere Saccharomyces; pi? preferibilmente tra ceppi di Saccharomyces cerevisiae, sia ?wild type?, sia geneticamente modificati.
3. Procedimento per l?idratazione di un lievito in forma disidratata in accordo con la rivendicazione 1 o 2, in cui detta soluzione acquosa comprende altri nutrienti quali idrolizzati proteici (quale peptone) in quantit? compresa tra 1 g/L e 40 g/L, preferibilmente compresa tra 15 g/L e 25 g/L, zuccheri (quali glucosio, xilosio, saccarosio) in quantit? compresa tra 1 g/L e 40 g/L, preferibilmente compresa tra 15 g/L e 25 g/L.
4. Procedimento di fermentazione per la produzione di biocarburanti (?biofuels?), o di prodotti biochimici (?biochemicals?), comprendente i seguenti stadi:
(a) idratare un lievito in forma disidratata ottenendo un lievito reidratato;
(b) opzionalmente, propagare il lievito reidratato ottenuto nello stadio (a), in presenza di un terreno di coltura comprendente un idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica;
(c) alimentare il lievito ottenuto nello stadio (a) o nello stadio (b) ad un dispositivo di fermentazione in presenza di un terreno di coltura comprendente un idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica;
(d) al termine della fermentazione recuperare i biocarburanti (?biofuels?) o i prodotti biochimici (?biochemicals?) ottenuti;
caratterizzato dal fatto che lo stadio (a) viene condotto in accordo con il procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3.
5. Procedimento di fermentazione per la produzione di biocarburanti (?biofuels?), o di prodotti biochimici (?biochemicals?) in accordo con la rivendicazione 4, in cui detta biomassa lignocellulosica ? scelta tra:
- vegetali espressamente coltivati per uso energetico quali miscanto, panico (Panicum virgatum), canna comune (Arundo donax);
- vegetali non espressamente coltivati per uso energetico quali sorgo (quali fibre da sorgo);
- scarti, residui e rifiuti di prodotti derivanti dall?agricoltura quali guayule, mais (quali stocchi di mais, tutoli di mais), soia, cotone, lino, colza (?rapeseed?), grano (quale paglia di grano), riso (quali paglia di riso, pula di riso, lolla di riso), canna da zucchero (quali paglia di canna da zucchero, bagassa di canna da zucchero), palma (quali ?palm leafs?, ?palm trunks?, ?palm mibrids?, ?palm empty fruit bunches?);
- scarti, residui e rifiuti di prodotti derivanti dalla forestazione, dalla silvicoltura, o dalla lavorazione del legno quali pioppo, ontano, betulla; - scarti dei prodotti agro-alimentari destinati all?alimentazione umana o alla zootecnia;
- residui, non trattati chimicamente, dell?industria della carta;
- rifiuti provenienti dalla raccolta differenziata dei rifiuti solidi urbani (come rifiuti urbani di origine vegetale, carta);
- alghe quali microalghe o macroalghe, in particolare macroalghe.
6. Procedimento di fermentazione per la produzione di biocarburanti (?biofuels?), o di prodotti biochimici (?biochemicals?) in accordo con la rivendicazione 5, in cui detta biomassa lignocellulosica ? scelta tra: vegetali espressamente coltivati per uso energetico quali miscanto, panico (Panicum virgatum), canna comune (Arundo donax); vegetali non espressamente coltivati per uso energetico quali sorgo (quali fibre da sorgo); scarti, residui e rifiuti di prodotti derivanti dall?agricoltura quali guayule, mais (quali stocchi di mais, tutoli di mais), soia, cotone, lino, colza (?rapeseed?), grano (quali paglia di grano), riso (quali paglia di riso, pula di riso, lolla di riso), canna da zucchero (quali paglia di canna da zucchero, bagassa di canna da zucchero), palma (quali ?palm leafs?, ?palm trunks?, ?palm mibrids?, ?palm empty fruit bunches?), scarti, residui e rifiuti di prodotti derivanti dalla forestazione, dalla silvicoltura, o dalla lavorazione del legno quali pioppo, ontano, betulla.
7. Procedimento di fermentazione per la produzione di biocarburanti (?biofuels?), o di prodotti biochimici (?biochemicals?) in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 6, in cui detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? la sola fonte di carbonio utilizzato nei suddetti stadi (b) e (c).
8. Procedimento di fermentazione per la produzione di biocarburanti (?biofuels?), o di prodotti biochimici (?biochemicals?) in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 7, in cui detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? una miscela comprendente un residuo solido (i.e. fase solida) comprendente biomassa lignocellulosica pretrattata non solubilizzata (i.e. solidi insolubili, principalmente lignina) e un idrolizzato da biomassa lignocellulosica (i.e. fase acquosa) comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio, detta miscela avente un contenuto di solidi totali (solubili insolubili) compreso tra il 5% in peso e il 30% in peso, preferibilmente compresa tra il 10% in peso e il 20% in peso, rispetto al peso totale di detta miscela.
9. Procedimento di fermentazione per la produzione di biocarburanti (?biofuels?), o di prodotti biochimici (?biochemicals?) in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 8, in cui detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? una miscela comprendente un residuo solido (i.e. fase solida) comprendente biomassa lignocellulosica pretrattata non solubilizzata (i.e. solidi insolubili, principalmente lignina) e un idrolizzato da biomassa lignocellulosica (i.e. fase acquosa) comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio, detta fase acquosa avente un contenuto di glucosio compreso tra 20 g/L e 100 g/L, preferibilmente compreso tra 30 g/L e 70 g/L, pi? preferibilmente tra 40 g/L a 60 g/L.
10. Procedimento di fermentazione per la produzione di biocarburanti (?biofuels?), o di prodotti biochimici (?biochemicals?) in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 9, in cui detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? una miscela comprendente un residuo solido (i.e. fase solida) comprendente biomassa lignocellulosica pretrattata non solubilizzata (i.e. solidi insolubili, principalmente lignina) e un idrolizzato da biomassa lignocellulosica (i.e. fase acquosa) comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio, detta fase acquosa avente un contenuto di xilosio compreso tra 10 g/L e 40 g/L, preferibilmente compreso tra 15 g/L e 30 g/L, pi? preferibilmente compreso tra 18 g/L e 25 g/L.
11. Procedimento di fermentazione per la produzione di biocarburanti (?biofuels?), o di prodotti biochimici (?biochemicals?) in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 10, in cui detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? una miscela comprendente un residuo solido (i.e. fase solida) comprendente biomassa lignocellulosica pretrattata non solubilizzata (i.e. solidi insolubili, principalmente lignina) e un idrolizzato da biomassa lignocellulosica (i.e. fase acquosa) comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio, detta fase acquosa avente un contenuto di acido acetico compreso tra 2 g/L e 8 g/L, preferibilmente compreso tra 2,5 g/L e 7,5 g/L; e/o acido formico compreso tra 0,2 g/L e 2 g/L, preferibilmente compreso tra 0,3 g/L e 1,8 g/L; e/o 5-idrossimetilfurfurale (HMF) compreso tra 0,1 g/L e 1 g/L, preferibilmente compreso tra 0,2 g/L e 0,8 g/L; e/o furfurale (F) compreso tra 0,04 g/L e 1 g/L, preferibilmente compreso tra 0,05 g/L e 0,8 g/L.
12. Procedimento di fermentazione per la produzione di biocarburanti (?biofuels?), o di prodotti biochimici (?biochemicals?) in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 7, in cui detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? la fase acquosa comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio derivante dall?idrolisi della biomassa lignocellulosica, detta fase acquosa avente un contenuto di glucosio compreso tra 20 g/L e 100 g/L, preferibilmente compreso tra 30 g/L e 70 g/L, pi? preferibilmente tra 40 g/L a 60 g/L.
13. Procedimento di fermentazione per la produzione di biocarburanti (?biofuels?), o di prodotti biochimici (?biochemicals?) in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 7, in cui detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? la fase acquosa comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio derivante dall?idrolisi della biomassa lignocellulosica, detta fase acquosa avente un contenuto di xilosio compreso tra 10 g/L e 40 g/L, preferibilmente compreso tra 15 g/L e 30 g/L, pi? preferibilmente compreso tra 18 g/L e 25 g/L.
14. Procedimento di fermentazione per la produzione di biocarburanti (?biofuels?), o di prodotti biochimici (?biochemicals?) in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 7, in cui detto idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica ? la fase acquosa comprendente acqua e zuccheri monomerici a cinque e sei atomi di carbonio, principalmente glucosio e xilosio derivante dall?idrolisi della biomassa lignocellulosica, detta fase acquosa avente un contenuto di acido acetico compreso tra 2 g/L e 8 g/L, preferibilmente compreso tra 2,5 g/L e 7,5 g/L; e/o acido formico compreso tra 0,2 g/L e 2 g/L, preferibilmente compreso tra 0,3 g/L e 1,8 g/L; e/o 5-idrossimetilfurfurale (HMF) compreso tra 0,1 g/L e 1 g/L, preferibilmente compreso tra 0,2 g/L e 0,8 g/L; e/o furfurale (F) compreso tra 0,04 g/L e 1 g/L, preferibilmente compreso tra 0,05 g/L e 0,8 g/L.
15. Procedimento di fermentazione per la produzione di biocarburanti (?biofuels?), o di prodotti biochimici (?biochemicals?) in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 14, in cui detto stadio (b) ? condotto:
- ad una temperatura compresa tra 20?C e 45?C, preferibilmente compresa tra 25?C e 35?C; e/o
- per un tempo compreso tra 4 ore e 30 ore, preferibilmente compreso tra 8 ore e 24 ore; e/o
- ad un pH compreso tra 4 e 8, preferibilmente compreso tra 4,5 e 7; e/o - ad una portata di aria compresa tra 1 vvh e 120 vvh, preferibilmente compresa tra 5 vvh e 30 vvh (volume di aria che fluisce per volume di terreno di coltura); e/o
- in un terreno di coltura in cui, oltre all?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica, sono aggiunti vari nutrienti quali fonti di azoto (quale urea), fosfato di potassio, magnesio, sali, vitamine, microelementi.
16. Procedimento di fermentazione per la produzione di biocarburanti (?biofuels?), o di prodotti biochimici (?biochemicals?) in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 15, in cui detto stadio (c) ? condotto:
- ad una temperatura compresa tra 20?C e 45?C, preferibilmente compresa tra 25?C e 35?C; e/o
- per un tempo compreso tra 24 ore e 140 ore, preferibilmente compreso tra 40 ore e 120 ore; e/o
- ad un pH compreso tra 4 e 8, preferibilmente compreso tra 4,5 e 7; e/o - in assenza aria; oppure ad una portata di aria compresa tra 1 vvh e 120 vvh, preferibilmente compresa tra 10 vvh e 60 vvh (volume di aria che fluisce per volume di terreno di coltura per ora); e/o
- in un terreno di coltura in cui, oltre all?idrolizzato derivante da biomassa lignocellulosica, sono essere aggiunti vari nutrienti quali fonti di azoto (quale urea), fosfato di potassio, magnesio, sali, vitamine, microelementi; e/o
- per fermentazione in ?batch?, o a coltura discontinua (?fed-batch fermentation?), o a coltura continua, preferibilmente in ?batch?.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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