CN102643764A - 一种链霉菌及多抗菌素代谢调控发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种链霉菌及多抗菌素代谢调控发酵工艺；该方法通过优化培养基组分，添加无机盐对金色产色链霉菌的代谢网络进行扰动，强化目标生成途径，促进了产物的生成。同时对多抗菌素发酵工艺进行优化，采用流加葡萄糖的方法进行补料分批发酵方法，大幅提高了发酵单位及生产产量，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种链霉菌及多抗菌素代谢调控发酵工艺。
背景技术
多抗菌素(Polyoxins)又名多抗霉素、多氧霉素、多效霉素，是一种用现代生物工程技术生产的肽嘧啶核苷类广谱农用抗生素。多抗菌素具有内吸性和治疗作用及高度的靶标生物选择性，其可专一地作用于多种作物的常见真菌性病害。多抗菌素最突出的是对鞭毛菌、子囊菌、半知菌类等二十五种真菌性病害均有较强的抑制作用。国内外大量田间试验结果表明，多抗菌素对瓜、果、蔬菜的灰霉病、立枯病、白粉病、炭疽病、茎枯病、枯萎病、黑斑病等多种病害防治优良，对水稻纹枯病，大(小)麦白粉病等作物病害也明显效果。对草莓灰霉病、苹果斑点落叶病、梨黑斑病、烟草赤星病的防效尤其显著，是这些病害防治的首选杀菌剂。多抗菌素的生物学活性是重要特性，其专门作用于植物病原菌，对人、畜安全，对皮肤和眼睛无刺激性，无药害，不杀伤天敌昆虫，无积累作用，无“三致作用”，安全性极高。多抗菌素还具有添加微量能促进作物生长和防御能力，一般平均增产10～20％。多抗菌素与自然的适应性及相容性较好，施用后降解很快，无残留、不污染环境，不存在交叉耐药性及稳定性强等诸多优点，已成为国内生物农药的一线药物之一。
纵观国内外发展，可以发现，人们虽然对多抗菌素的发酵生产进行了诸多研究，但仍存在原始菌株产多抗菌素能力低下、发酵周期长、中间产物多、高浓度产物和底物抑制、发酵液分离提取复杂等问题。目前，国内报道的发酵法生产多抗菌素产量约为2000μ/mL左右，但发酵时间均在6天左右，且反应体系中多抗菌素类似物等副产物较多，糖的利用率和产物浓度都有待进一步提高。多抗菌素高密度培养方法的研究与开发成为提高目标产物产量、降低生产成本，打破国际市场垄断的关键。
发明内容
本发明的目的是为了提高多抗菌素的发酵水平，提高发酵单位和产量，以降低多抗菌素的生产成本，为生物农药的大规模生产和应用推广提供借鉴而提供了一种链霉菌及多抗菌素代谢调控发酵工艺。其主要是通过补料分批发酵方法来提高多抗菌素的生物量。
本发明的技术方案：一种链霉菌，其分类命名为金色产色链霉菌，菌种的拉丁学名是：streptomyces aureochromogenes，参据的菌株为：NJYHYWG66302，保藏日期是2012年2月14日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.5756。
本发明还提供了一种利用上述的金色产色链霉菌发酵生产多抗菌素的代谢调控发酵工艺，其具体步骤如下：将金色产色链霉菌菌株接种于高氏一号平板培养基，26～28℃培养，48～60个小时后选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，置于摇床中，转速控制在160～220rpm，23～30℃培养36～48h，其中种子液培养基组分为：酵母粉1.5～5.5g/L，玉米粉10～25g/L，黄豆饼粉15～30g/L，葡萄糖15～35g/L，氯化钠3～8g/L，pH保持在6.0～7.2；移取种子液培养基与发酵培养基体积比为7～15∶100的种子液接入发酵罐中进行发酵培养，发酵罐装液量(发酵培养罐的体积与发酵罐的体积比)为30～50％；其发酵培养基组分为：酵母粉1.5～5.5g/L，玉米粉10～25g/L，黄豆饼粉15～30g/L，葡萄糖15～35g/L，氯化钠5～10g/L，碳酸钙10～15g/L，磷酸氢二钾2～4g/L，豆油5～15g/L，无机盐0.2～0.8g/L，pH保持在6.0～7.2；控制罐压和温度，发酵进行55～65小时后，采用流加葡萄糖的方法进行补料分批发酵，使发酵过程中葡萄糖浓度保持在80～120g/L；发酵培养90～120h得发酵液。
优选所述的无机盐为CaCl2、FeSO4或MgSO4。种子液培养基和发酵培养基配制时，优选用氨水或氢氧化钠调节pH，使其保持在6.2～7.2。发酵培养过程中优选罐压控制在0.03～0.06MPa，罐温控制在26～28℃。
优选流加的葡萄糖的浓度为80～200g/L。
CGMCC No.5756菌株具有下述性质：
1、形态特征：
菌株在高氏一号培养基上，菌丝生长好。基丝淡茧黄至污黄，直径约0.5-0.6μm，无隔不断裂；气丝深灰色，直径约0.5-0.6μm；孢子丝紧密螺旋形，3-5圈，每圈6-7个孢子，孢子由横隔分裂而来，呈五边形或四边形，大小0.6-0.8μm。不产生水溶性色素。在电子显微镜下，孢子呈椭形。
2、生理生化特性
金色产色链霉菌CGMCC No.5756菌株的主要生理生化特征见表1：
表1菌株的生理生化特征
注：+++：富集生长；++：适度生长；+：生长；-：不生长
有益效果：
多抗菌素对瓜、果、蔬菜等经济作物觉的灰霉病、黑斑病、白粉病、立枯病等多种作物病害都具有显著的防治效果，目前，国内报道的发酵法生产多抗菌素产量约为1700～1800μ/mL左右，本发明通过对多抗菌素发酵工艺进行优化，主要通过优化培养基组分和发酵工艺，并采用补料培养的方法，简单将多抗菌素的发酵效价提高了30％，且糖的利用率和产物浓度都了进一步提高，生产成本低。该发明大大降低多抗菌素制剂生产成本，对农业增产，农民增收具有重大意义。
保藏信息
上述链霉菌其分类命名为金色产色链霉菌(streptomyces aureochromogenes)，参据的微生物(株)为：NJYHYWG66302，该菌株是本课题组自主筛选并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。其简称为CGMCC，保藏日期是2012年2月14日，登记入册的编号是CGMCC No.5756。
具体实施方式
下面对本发明的实施案例作详细说明，本实施案例以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的担任过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。
实例1：
将金色产色链霉菌CGMCC No.5756菌种接种于高氏一号平板培养基，26℃培养，48个小时后选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，置于摇床中，转速控制在170rpm，23℃培养42h，其种子液培养基组分为：酵母粉5.5g/L，玉米粉15g/L，黄豆饼粉15g/L，葡萄糖35g/L，氯化钠3.5g/L，以氢氧化钠调节pH，使其保持在7.1。移取体积比(种子液培养基/发酵培养基)为11％的种子液接入发酵罐中进行发酵培养，发酵罐装液量(V/V)为30％。其发酵培养基组分为：酵母粉5.5g/L，玉米粉15g/L，黄豆饼粉15g/L，葡萄糖35g/L，氯化钠5g/L，碳酸钙10g/L，磷酸氢二钾2g/L，豆油15g/L，无机盐为CaCl2 0.4g/L，以氢氧化钠调节pH，使其保持在7.1。发酵过程中罐压控制在0.06MPa，罐温控制在在26℃。发酵进行65小时后，采用流加葡萄糖的方法进行补料分批发酵，流加的葡萄糖的浓度为80g/L，使发酵过程中葡萄糖浓度保持在100g/L。发酵培养90h得发酵液。检测多抗菌素发酵效价为2140，较目前国内最高发酵水平高出25.9％。
实例2：
将金色产色链霉菌CGMCC No.5756菌种接种于高氏一号平板培养基，27℃培养，52个小时后选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，置于摇床中，转速控制在200rpm，29℃培养48h，其种子液培养基组分为：酵母粉3.5g/L，玉米粉10g/L，黄豆饼粉26g/L，葡萄糖27g/L，氯化钠5.5g/L，以氢氧化钠调节pH，使其保持在6.2。移取体积比(种子液培养基/发酵培养基)为15％的种子液接入发酵罐中进行发酵培养，发酵罐装液量(V/V)为40％。其发酵培养基组分为：酵母粉3.5g/L，玉米粉10g/L，黄豆饼粉26g/L，葡萄糖27g/L，氯化钠8g/L，碳酸钙12g/L，磷酸氢二钾4g/L，豆油10g/L，无机盐为FeSO4 0.8g/L，以氨水调节pH，使其保持在6.2。发酵过程中罐压控制在0.04MPa，罐温控制在在27℃。发酵进行60小时后，采用流加葡萄糖的方法进行补料分批发酵，流加的葡萄糖的浓度为150g/L，使发酵过程中葡萄糖浓度保持在120g/L。发酵培养110h得发酵液。检测多抗菌素发酵效价为2340，较目前国内最高发酵水平高出约33.7％。
实例3：
将金色产色链霉菌CGMCC No.5756菌种接种于高氏一号平板培养基，28℃培养，60个小时后选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，置于摇床中，转速控制在220rpm，26℃培养36h，其种子液培养基组分为：酵母粉1.7g/L，玉米粉25g/L，黄豆饼粉30g/L，葡萄糖15g/L，氯化钠8g/L，以氢氧化钠调节pH，使其保持在6.8。移取体积比(种子液培养基/发酵培养基)为7％的种子液接入发酵罐中进行发酵培养，发酵罐装液量(V/V)为50％。其发酵培养基组分为：酵母粉1.7g/L，玉米粉25g/L，黄豆饼粉30g/L，葡萄糖15g/L，氯化钠10g/L，碳酸钙15g/L，磷酸氢二钾3g/L，豆油6g/L，无机盐为MgSO4 0.2g/L，以氢氧化钠调节pH，使其保持在6.8。发酵过程中罐压控制在0.03MPa，罐温控制在在28℃，。发酵进行55小时后，采用流加葡萄糖的方法进行补料分批发酵，流加的葡萄糖的浓度为200g/L，使发酵过程中葡萄糖浓度保持在80g/L。发酵培养120h得发酵液。检测多抗菌素发酵效价为2250，较目前国内最高发酵水平高出约28.57％。
Claims (5)
1.一种链霉菌，其分类命名为金色产色链霉菌，菌种的拉丁学名是：streptomyces aureochromogenes，参据的菌株为：NJYHYWG66302，保藏日期是2012年2月14日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No.5756。
2.一种利用如权利要求1所述的金色产色链霉菌发酵生产多抗菌素的代谢调控发酵工艺，其具体步骤如下：将金色产色链霉菌菌株接种于高氏一号平板培养基，26～28℃培养，48～60个小时后选取一个单菌落，挑取菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，置于摇床中，转速控制在160～220rpm，23～30℃培养36～48h，其中种子液培养基组分为：酵母粉1.5～5.5g/L，玉米粉10～25g/L，黄豆饼粉15～30g/L，葡萄糖15～35g/L，氯化钠3～8g/L，pH保持在6.0～7.2；移取种子液培养基与发酵培养基体积比为7～15∶100的种子液接入发酵罐中进行发酵培养，发酵罐体积装液量为30～50％；其发酵培养基组分为：酵母粉1.5～5.5g/L，玉米粉10～25g/L，黄豆饼粉15～30g/L，葡萄糖15～35g/L，氯化钠5～10g/L，碳酸钙10～15g/L，磷酸氢二钾2～4g/L，豆油5～15g/L，无机盐0.2～0.8g/L，pH保持在6.0～7.2；控制罐压和温度，发酵进行55～65小时后，采用流加葡萄糖的方法进行补料分批发酵，使发酵过程中葡萄糖浓度保持在80～120g/L；发酵培养90～120h得发酵液。
3.根据权利要求2所述的代谢调控发酵工艺，其特征在于所述的无机盐为CaCl2、FeSO4或MgSO4。
4.根据权利要求2所述的代谢调控发酵工艺，其特征在于罐压控制在0.03～0.06MPa，罐温控制在26～28℃。
5.根据权利要求2所述的代谢调控发酵工艺，其特征在于流加的葡萄糖的浓度为80～200g/L。
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Application publication date: 20120822 Assignee: Jiangsu Fengyuan Bioengineering Co., Ltd. Assignor: Nanjing University of Technology Contract record no.: 2016320000132 Denomination of invention: Streptomyces and multi-antibiotics metabolic regulation fermentation process Granted publication date: 20130508 License type: Common License Record date: 20160414 |
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