CN105647999A - 一种提高多抗霉素产量的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高多抗霉素产量的发酵方法，包括如下步骤：(1)配置培养基，将培养基消毒，灭菌；(2)在培养基中接种链霉菌株，发酵培养；(3)对发酵产物进行过滤，取滤液，即得。所述培养基含有终浓度为8～12g/L的玉米淀粉、18～22g/L的豆饼粉、5～8g/L的酵母粉、5～7g/L的氯化钠、1～1.2g/L的硫酸铵、1.5～2g/L的碳酸钙以及终浓度为50～150mg/L的5-甲基-脲嘧啶。将培养基在121～130℃高温下消毒，灭菌30～35min；在培养基中接种链霉菌株，在28～30℃下发酵70～72h；培养基中的固形物投加量为1075g时，得到富含多抗霉素的滤液16400mL，所述滤液含有10％的多抗霉素。测定该滤液的生物效价，可达到32000ppm，远远高于现有方法所得的滤液效价结果10000ug/ml。此发酵方法对提高多抗霉素产量的作用显著。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种提高多抗霉素产量的发酵方法。
背景技术
多抗霉素与几丁质合成酶的天然合成底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-N-acetylglucosamine，N-GlcAc)结构相类似，所以多抗霉素作为几丁质合成酶的强烈竞争性抑制剂，会抑制真菌细胞壁主要成分几丁质的生物合成，因此其对真菌生长具有抑制作用。
多抗霉素的分子结构式
现有技术对于多抗霉素的生产方法多采用微生物发酵法，之前是用金色产色链霉菌4·896野生型原种，上罐发酵二十几批，发酵单位不高，而且不稳定。现有的生产方法普遍存在多抗霉素产率过低的缺陷，且到目前为止未找到合适的解决方案，有鉴于此，提出本发明一种提高多抗霉素产量的发酵方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高多抗霉素产量的发酵方法，包括如下步骤：
(1)配置培养基，将培养基消毒，灭掉杂菌；
(2)在培养基中接种链霉菌株，发酵培养；
(3)对发酵产物进行过滤，取滤液，即得。
其中，本发明所述培养基含有终浓度为8～12g/L的玉米淀粉、18～22g/L的豆饼粉、5～8g/L的酵母粉、5～7g/L的氯化钠、1～1.2g/L的硫酸铵和1.5～2g/L的碳酸钙。
上述培养基可依据实际需求加入一些其他可用的营养成分，但本发明优选仅以上述组份作为所述菌株的培养基成分，即可满足菌株发酵过程中的营养需求。
此外，为了进一步提高多抗霉素产量，本发明在所述培养基中进一步加入了终浓度为50～150mg/L的5-甲基-脲嘧啶；优选终浓度为80mg/L。
本发明意外向发酵培养基中加入5-甲基-脲嘧啶后能够起到提高多抗霉素产量。经过大量实验确定了培养基的组份配比，以及5-甲基-脲嘧啶的合适添加量，进一步确保对多抗霉素的增产作用。
本发明所述链霉菌株为常规的链霉菌株，可以市售得到，也可以从烟草中分离得到，分离方法为本领域人员常规使用的方法。也可以以文献一株高产木聚糖酶的枝链霉菌的分离鉴定及产酶(微生物学通报JUN20,2010,37(6):791-797作者李秀婷*孙宝国宋焕禄吕跃钢佘元莉宋红霞(北京工商大学化学与环境工程学院北京100048))中披露的方法得到。
更具体而言，本发明所述的方法，步骤(1)中，将培养基在121～130℃高温下消毒，灭菌30～35min。
在上述条件下，能够彻底灭除杂菌，否则会有杂菌生长，或存在一些细菌的休眠体的残留。
本发明所述的方法，步骤(2)中，将链霉菌株接种在培养基中，放置在28～30℃、220rpm下发酵培养70～72h。
其中，接种量可依据实际情况而定，具体为本领域技术人员所掌握，本发明优选所述接种量为4～5vol％。
本发明所述的方法，步骤(3)中，对发酵产物过滤，取滤液，该滤液即为富含多抗霉素的终产物。
采用目前现有发酵方法产多抗霉素，发酵完成后对发酵产物过滤，取滤液，检测该滤液(富含多抗霉素)的生物效价，一般在10000ug/ml。本发明通过对发酵方法进行改进，能够显著提高发酵产物滤液中的多抗霉素含量，经检测，滤液的效价普遍高于25000ug/ml，可达到32000ug/ml，实现了对多抗霉素产量的显著提高。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例公开了发酵多抗霉素的一种具体实施方式，包括如下步骤：
(1)配置培养基，将培养基消毒，灭菌；
以培养基中的固形物投加量为1075g计，配置含有终浓度为10g/L的玉米淀粉、20g/L的豆饼粉、5g/L的酵母粉、5g/L的氯化钠、1g/L的硫酸铵和2g/L的碳酸钙以及终浓度为80mg/L的5-甲基-脲嘧啶的培养基。
将所述培养基在121～130℃高温下消毒，灭菌30～35min。
(2)将链霉菌株接种在培养基中，发酵培养。
所述链霉菌株的接种量为5vol％。控制在28～30℃下发酵70～72h。
(2)对发酵产物过滤，取滤液，即得。
对发酵产物过滤，得到多抗霉素的滤液为16400mL，该滤液即为富含多抗霉素的终产物。所述滤液含有10％的多抗霉素。测定该滤液的生物效价，为32000ppm。
实施例2
本实施例与实施例1的不同仅在于：
所述培养基含有终浓度为8g/L的玉米淀粉、18g/L的豆饼粉、5g/L的酵母粉、5g/L的氯化钠、1g/L的硫酸铵和1.5g/L的碳酸钙和终浓度为50mg/L的5-甲基-脲嘧啶。
所述链霉菌株的接种量为4vol％。
培养基中的固形物投加量为1075g，得到富含多抗霉素的滤液15600mL，所述滤液含有7.6％的多抗霉素。测定该滤液的生物效价，为28000ppm。
实施例3
本实施例与实施例1的不同仅在于：
所述培养基含有终浓度为12g/L的玉米淀粉、22g/L的豆饼粉、8g/L的酵母粉、7g/L的氯化钠、1.2g/L的硫酸铵和2g/L的碳酸钙和终浓度为150mg/L的5-甲基-脲嘧啶。
所述链霉菌株的接种量为4.5vol％。
培养基中的固形物投加量为1078g，得到富含多抗霉素的滤液15300mL，所述滤液含有4.3％的多抗霉素。测定该滤液的生物效价，为27000ppm。
远远高于现有方法所得的滤液效价结果10000ug/ml。说明本发明通过对发酵方法的改进实现了所得产物中多抗霉素含量的显著提高。
对比实验1测定添加各活性成份对多抗霉素产量的影响
其中，对照组即空白组，在实施例1的基础上，培养基中不加入5-甲基-脲嘧啶；
5-甲基-脲嘧啶组是指实施例1。
胸腺嘧啶组是指与实施例1相比，区别点仅在于将其中的5-甲基-脲嘧啶替换为胸腺嘧啶，终浓度与5-甲基-脲嘧啶相同；
二氢胸腺嘧啶组是指与实施例1相比，区别点仅在于将其中的5-甲基-脲嘧啶替换为胸腺嘧啶，终浓度与5-甲基-脲嘧啶相同。
在以上述实验对象的培养基中按与实施例1相同的方法接种链霉菌株，以相同的发酵方法及发酵产物分离方法获得滤液，并同时以各组所得滤液为检测对象确定其生物效果，结果见表1。
表1
| 对照组 | 胸腺嘧啶 | 5-甲基-脲嘧啶 | 二氢胸腺嘧啶 | |
| 效价ug/ml | 24800 | 23000 | 32000 | 22800 |
依据表1的数据可知，在培养基中加入终浓度为80mg/L的5-甲基-脲嘧啶后，所得滤液的效价结果高于加入同样浓度胸腺嘧啶和二氢胸腺嘧啶所得滤液的生物效价，证明本发明通过改进培养基的组成，确实实现了多抗霉素产量的提高。
对比实验2培养基中活性成份5-甲基脲嘧啶的加入量对多抗霉素产量的影响
试验方法同对比试验1，区别仅在于调整了培养基中5-甲基脲嘧啶的终浓度，将各组所得发酵产物滤液作生物效价检测，结果见表2：
表2
| 5-甲基脲嘧啶终浓度 | 滤液效价ug/ml | 多抗霉素含量 |
| 对照组(未加5-甲基脲嘧啶) | 24800 | 4.3％ |
| 5-甲基脲嘧啶50mg/L | 25800 | 5.6％ |
| 5-甲基脲嘧啶80mg/L | 32000 | 10％ |
| 5-甲基脲嘧啶120mg/L | 28800 | 8.4％ |
| 5-甲基脲嘧啶150mg/L | 27000 | 7.6％ |
| 5-甲基脲嘧啶200mg/L | 22500 | 3.1％ |
上述结果表明，当向培养基中加入5-甲基脲嘧啶的终浓度为80mg/L时，其提高多抗霉素产量的作用显著。加入量较少时，其提高多抗霉素产量的作用不大；而如果活性成份加入量过大，反而会抵制链霉菌株的代谢，多抗霉素的产量会降低。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种提高多抗霉素产量的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配置培养基，将培养基消毒，灭菌；
(2)在培养基中接种链霉菌株，发酵培养；
(3)对发酵产物过滤，取滤液，即得。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于：所述培养基含有终浓度为8～12g/L的玉米淀粉、18～22g/L的豆饼粉、5～8g/L的酵母粉、5～7g/L的氯化钠、1～1.2g/L的硫酸铵和1.5～2g/L的碳酸钙。
3.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于：所述培养基中还加入了终浓度为50～150mg/L的5-甲基-脲嘧啶；优选终浓度为80mg/L。
4.根据权利要求1～3所述的发酵方法，其特征在于：步骤(1)中，将所述培养基在121～130℃高温下消毒，灭菌30～35min。
5.根据权利要求1～4所述的发酵方法，其特征在于：步骤(2)中，将菌株在培养基中发酵培养，在28～30℃下发酵70～72h。
6.根据权利要求1～5所述的发酵方法，其特征在于：步骤(2)中，所述链霉菌株的接种量为4～5vol％。
7.根据权利要求1～6所述的发酵方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)配置培养基，将培养基消毒，灭菌；
配置总体积为50L的培养基，所述培养基含有终浓度为10g/L的玉米淀粉、20g/L的豆饼粉、5g/L的酵母粉、5g/L的氯化钠、1g/L的硫酸铵和2g/L的碳酸钙以及终浓度为80mg/L的5-甲基-脲嘧啶，将所述培养基在121～130℃高温下消毒，灭菌30～35min；
(2)在培养基中接种链霉菌株，接种量为4～5vol％，在28～30℃下发酵70～72h；
(3)对发酵产物过滤，取滤液，即得。
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