CN110656141B - 一种三七黑斑病防治用多抗霉素的发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种三七黑斑病防治用多抗霉素的发酵工艺，该工艺通过三七黑斑病病原菌为指示菌，筛选出可高效抑制三七黑斑病病原菌的多抗霉素产生菌——金色产色链霉菌，进一步优化培养基组分，添加无机盐对金色产色链霉菌的代谢网络进行扰动，强化目标产物生成途径，促进了产物的生成。同时对多抗霉素发酵工艺进行优化，采用定量补加饴糖，自动控制pH值滴加浓氨水的方法进行补料分批发酵方法，大幅提高了发酵单位及生产产量，降低生产成本。

Description

一种三七黑斑病防治用多抗霉素的发酵工艺
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种三七黑斑病防治用多抗霉素的发酵工艺。
背景技术
多抗霉素（Polyoxin）又名多抗菌素、多氧霉素、多效霉素，是一种用现代生物工程技术生产的肽嘧啶核苷类广谱农用抗生素。多抗霉素具有内吸性和治疗作用及高度的靶标生物选择性，其可专一地作用于多种作物的常见真菌性病害。多抗霉素最突出的是对鞭毛菌、子囊菌、半知菌类等二十五种真菌性病害均有较强的抑制作用。国内外大量田间试验结果表明，多抗霉素对瓜、果、蔬菜的灰霉病、立枯病、白粉病、炭疽病、茎枯病、枯萎病、黑斑病等多种病害防治优良，对水稻纹枯病，大（小）麦白粉病等作物病害也明显效果。对三七黑斑病、草毒灰霉病、苹果斑点落叶病、梨黑斑病、烟草赤星病的防效尤其显著，是这些病害防治的首选杀菌剂。多抗霉素的生物学活性是重要特性，其专门作用于植物病原菌，对人、畜安全，对皮肤和眼睛无刺激性，无药害，不杀伤天敌昆虫，无积累作用，无“三致作用”，安全性极高。多抗霉素还具有添加微量能促进作物生长和防御能力，一般平均增产15-25%。多抗霉素与自然的适应性及相容性较好，施用后降解很快，无残留、不污染环境，不存在交叉耐药性及稳定性强等诸多优点，已成为国内生物农药的一线药物之一。
纵观国内外发展，可以发现，人们虽然对多抗霉素的发酵生产进行了诸多研究，但仍存在原始菌株产多抗霉素能力低下、发酵周期长、中间产物多、高浓度产物和底物抑制、发酵液分离提取复杂等问题。目前，国内报道的发酵法生产多抗霉素产量约为2500µ/ml左右，但发酵时间均在150h左右，且反应体系中多抗霉素类似物等副产物较多，糖的利用率和产物浓度都有待进一步提高。多抗霉素高密度培养方法的研究与开发成为提高目标产物产量、降低生产成本，打破国际市场垄断的关键。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种三七黑斑病防治用多抗霉素的发酵工艺，其通过筛选出高效抑制三七黑斑病病原菌的多抗霉素产生菌金色产色链霉菌，并对其进行培养、发酵和补料分批发酵来提高多抗霉素的生物量，进一步提高多抗霉素产生菌对多抗霉素的发酵水平，提高发酵单位和产量，以降低多抗霉素的生产成本，为生物农药的大规模生产和应用推广提供了一个有效的途径。
更为具体的，本发明采用如下技术方案：一种三七黑斑病防治用多抗霉素的发酵工艺，包括如下步骤：
（1）金色产色链霉菌选育：以三七黑斑病病原菌为指示菌，利用抑菌圈法筛选出金色产色链霉菌；
（2）金色产色链霉菌的培养：将步骤（1）中筛选出的金色产色链霉菌菌株接种于培养基进行培养后，26-28℃培养8-10d后，选取一个生长丰满的菌落斜面，挑取一接种环菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，置于摇床中，转速控制在200±10rpm，26-28℃培养32-36h；
（3）发酵工艺：移取体积比为10-15:100种子液培养基与发酵培养基，接入发酵罐中进行发酵培养，发酵罐体积装液量为60-70%，控制罐压为0.03-0.05Mpa、发酵温度为26-28℃、通气比为1:0.5-0.6、搅拌转速为120-150rpm，发酵时间为30-40h；
（4）补料分批发酵工艺：在发酵过程中，还原糖浓度保持在1.0-2.0%，pH值控制在6.0-6.5，发酵培养120-140h，得到发酵液。
在本发明的优选的实施方式中，步骤（1）中，所述的抑菌圈法为利用具盖玻璃大盘30cm×30cm的双层培养基抑菌圈法。本发明所筛选出金色产色链霉菌为能够高效抑制三七黑斑病病原菌的多抗霉素产生菌。
在本发明的优选的实施方式中，步骤（2）中，所述的培养基为麦芽糖（AR）0.2-0.5%、酵母浸膏（BR）0.3-0.5%、玉米粉（IR）1.0-1.5%、琼脂1.8-2.0%、蒸馏水配制的pH7.0-7.2的平板培养基。
在本发明的优选的实施方式中，步骤（2）中，所述的种子液培养基组分为：低温黄豆饼粉1.5-2.0%、啤酒酵母粉0.4-0.6%、玉米粉1.5-2.0%、NaCl 0.1-0.3%、KH2PO4 0.1-0.3%、CaCO3 0.3-0.5%、a-耐高温淀粉酶1000ppm，pH自然。
在本发明的优选的实施方式中，步骤（3）中，所述的发酵培养基组分为：低温黄豆饼粉2.0-2.5%、啤酒酵母粉0.4-0.6%、鱼粉0.3-0.5%、玉米粉6.0-8.0%、NaCl 0.3-0.5%、KH2PO4 0.1-0.3%、CaCO3 0.3-0.5%、硫酸铵 0.5-1.0%、a-耐高温淀粉酶1000ppm、消泡剂0.01-0.05%，pH自然。
在本发明的优选的实施方式中，采用定量补加饴糖，滴加浓氨水控制pH值的方法进行补料分批发酵。
在本发明的优选的实施方式中，所述的硫酸铵终浓度为0.8%。
在本发明的优选的实施方式中，步骤（3）中，罐压控制在0.03Mpa，罐温控制在26℃。
在本发明的优选的实施方式中，所述的饴糖的质量浓度为45%。
通过本发明还保护采用所述的发酵工艺对金色产色链霉菌进行发酵培养可以获得多抗霉素。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过三七黑斑病病原菌为指示菌，筛选出可高效抑制三七黑斑病病原菌的多抗霉素产生菌——金色产色链霉菌，进一步优化培养基组分，添加无机盐对金色产色链霉菌的代谢网络进行扰动，强化目标产物生成途径，促进了产物的生成。同时对多抗霉素发酵工艺进行优化，采用定量补加饴糖，自动控制pH值滴加浓氨水的方法进行补料分批发酵方法，大幅提高了发酵单位及生产产量，降低生产成本。
通过本发明所提供的选育出的金色产色链霉菌和发酵工艺，可以显著提高发酵液中多抗霉素的含量，一般的，发酵液中多抗霉素的平均效价不低于4000µg/mL，提高了对三七黑斑病防治用，使三七平均增产15-25%。
本发明大大降低多抗霉素制剂生产成本，对农业增产，农民增收具有重大意义。
具体实施方式
下面对本发明的实施案例作详细说明，本实施案例以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的担任过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。
实施例1
本实施例公开了三七黑斑病防治用多抗霉素的菌种选育及发酵工艺的一种具体实施方式如下：
将依三七黑斑病病原菌为指示菌，利用自制具盖玻璃大盘30cm×30cm双层培养基抑菌圈法，筛选出高效抑制三七黑斑病病原菌的多抗霉素产生菌金色产色链霉菌菌株接种于麦芽糖（AR）0.3%、酵母浸膏（BR）0.5%、玉米粉（IR）1.0%、琼脂1.8%、蒸馏水配制，pH7.2的平板培养基，28±1℃培养，9d后选取一个生长丰满的菌落斜面，挑取一接种环菌体，接入装有低温黄豆饼粉2.0%、啤酒酵母粉0.6%、玉米粉2.0%、NaCl 0.3%、KH2PO4 0.1%、CaCO3 0.3%、a-耐高温淀粉酶1000ppm、pH自然的种子液培养基的锥形瓶中，置于转速220rpm、温度28℃的摇床中培养36h，按种子液培养基与发酵培养基体积比为10:100的接种量移取种子液接入低温黄豆饼粉2.5%、啤酒酵母粉0.6%、鱼粉0.5%、玉米粉6.0%、NaCl 0.5%、KH2PO4 0.3%、CaCO3 0.5%、硫酸铵1.0%、a-耐高温淀粉酶1000ppm、消泡剂0.05%、pH自然的发酵培养基中罐压0.03Mpa、发酵温度26℃、通气比1:0.5、搅拌转速150rpm，体积装液量为70%发酵罐中进行发酵培养，发酵30h补加45%的饴糖溶液200kg，滴加23%浓氨水使pH值自动控制6.30，再发酵到70h补加45%的饴糖溶液200kg，滴加23%浓氨水使pH值自动控制6.50，发酵培养到120h得发酵液。用三七黑斑病病原菌为指示菌采用生物抑菌圈法检测多抗霉素发酵效价为3960µg/mL。
实施例2
本实施例与实施例1的不同仅在于调整了发酵配方配比。
将依三七黑斑病病原菌为指示菌，利用自制具盖玻璃大盘30cm×30cm双层培养基抑菌圈法，筛选出高效抑制三七黑斑病病原菌的多抗霉素产生菌金色产色链霉菌菌株接种于麦芽糖（AR）0.3%、酵母浸膏（BR）0.5%、玉米粉（IR）1.0%、琼脂1.8%、蒸馏水配制，pH7.2的平板培养基，28±1℃培养，9d后选取一个生长丰满的菌落斜面，挑取一接种环菌体，接入装有低温黄豆饼粉2.0%、啤酒酵母粉0.6%、玉米粉2.0%、NaCl 0.3%、KH2PO4 0.1%、CaCO3 0.3%、a-耐高温淀粉酶1000ppm、pH自然的种子液培养基的锥形瓶中，置于转速220rpm、温度28℃的摇床中培养36h，按种子液培养基与发酵培养基体积比为10:100的接种量移取种子液接入低温黄豆饼粉2.0%、啤酒酵母粉0.3%、鱼粉0.3%、玉米粉8.0%、NaCl 0.3%、KH2PO4 0.1%、CaCO3 0.3%、硫酸铵0.8%、a-耐高温淀粉酶1000ppm、消泡剂0.01%、pH自然的发酵培养基中罐压0.03Mpa、发酵温度26℃、通气比1:0.5、搅拌转速150rpm，体积装液量为70%发酵罐中进行发酵培养，发酵26h补加45%的饴糖溶液200kg，滴加23%浓氨水使pH值自动控制6.30，再发酵到60h补加45%的饴糖溶液200kg，滴加23%浓氨水使pH值自动控制6.40，发酵培养到120h得发酵液。用三七黑斑病病原菌为指示菌采用生物抑菌圈法检测多抗霉素发酵效价为3680µg/mL。
实施例3
将依三七黑斑病病原菌为指示菌，利用自制具盖玻璃大盘30cm×30cm双层培养基抑菌圈法，筛选出高效抑制三七黑斑病病原菌的多抗霉素产生菌金色产色链霉菌菌株接种于麦芽糖（AR）0.3%、酵母浸膏（BR）0.5%、玉米粉（IR）1.0%、琼脂1.8%、蒸馏水配制，pH7.2的平板培养基，28±1℃培养，9d后选取一个生长丰满的菌落斜面，挑取一接种环菌体，接入装有低温黄豆饼粉1.5%、啤酒酵母粉0.5%、玉米粉2.0%、NaCl 0.3%、KH2PO4 0.2%、CaCO3 0.3%、a-耐高温淀粉酶1000ppm、pH自然的种子液培养基的锥形瓶中，置于转速220rpm、温度28℃的摇床中培养36h，按种子液培养基与发酵培养基体积比为15:100的接种量移取种子液接入低温黄豆饼粉2.0%、啤酒酵母粉0.5%、鱼粉0.5%、玉米粉6.0%、NaCl 0.3%、KH2PO4 0.3%、CaCO3 0.5%、硫酸铵1.0%、a-耐高温淀粉酶1000ppm、消泡剂0.03%、pH自然的发酵培养基中罐压0.03Mpa、发酵温度28℃、通气比1:0.6、搅拌转速140rpm，体积装液量为65%发酵罐中进行发酵培养，发酵32h补加45%的饴糖溶液200kg，滴加23%浓氨水使pH值自动控制6.50，再发酵到65h补加45%的饴糖溶液200kg，滴加23%浓氨水使pH值自动控制6.50，发酵培养到130h得发酵液。用三七黑斑病病原菌为指示菌采用生物抑菌圈法检测多抗霉素发酵效价为4437µg/mL。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种三七黑斑病防治用多抗霉素的发酵工艺，其特征在于，包括如下步骤：
（1）金色产色链霉菌选育：以三七黑斑病病原菌为指示菌，利用抑菌圈法筛选出金色产色链霉菌；
（2）金色产色链霉菌的培养：将步骤（1）中筛选出的金色产色链霉菌菌株接种于培养基进行培养后，26-28℃培养8-10d后，选取一个生长丰满的菌落斜面，挑取一接种环菌体，接入装有种子液培养基的锥形瓶中，置于摇床中，转速控制在200±10rpm，26-28℃培养32-36h；
（3）发酵工艺：按种子液培养基与发酵培养基的体积比为10-15:100移取，接入发酵罐中进行发酵培养，发酵罐体积装液量为60-70%，控制罐压为0.03-0.05Mpa、发酵温度为26-28℃、通气比为1:0.5-0.6、搅拌转速为120-150rpm，发酵时间为30-40h；
（4）补料分批发酵工艺：在发酵过程中，还原糖浓度保持在1.0-2.0%，pH值控制在6.0-6.5，发酵培养120-140h，得到发酵液；
步骤（2）中，所述的培养基为麦芽糖AR 0.2-0.5%、酵母浸膏BR 0.3-0.5%、玉米粉IR1.0-1.5%、琼脂1.8-2.0%、蒸馏水配制的pH7.0-7.2的平板培养基；所述的种子液培养基组分为：低温黄豆饼粉1.5-2.0%、啤酒酵母粉0.4-0.6%、玉米粉1.5-2.0%、NaCl 0.1-0.3%、KH2PO4 0.1-0.3%、CaCO3 0.3-0.5%、a-耐高温淀粉酶1000ppm，pH自然；
步骤（3）中，所述的发酵培养基组分为：低温黄豆饼粉2.0-2.5%、啤酒酵母粉0.4-0.6%、鱼粉0.3-0.5%、玉米粉6.0-8.0%、NaCl 0.3-0.5%、KH2PO4 0.1-0.3%、CaCO3 0.3-0.5%、硫酸铵 0.5-1.0%、a-耐高温淀粉酶1000ppm、消泡剂0.01-0.05%，pH自然；
步骤（3）中，罐压控制在0.03Mpa，罐温控制在26℃；
采用定量补加饴糖，滴加浓氨水控制pH值的方法进行补料分批发酵；所述的饴糖的质量浓度为45%。
2.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤（1）中，所述的抑菌圈法为利用具盖玻璃大盘30cm×30cm的双层培养基抑菌圈法，所筛选出金色产色链霉菌为能够高效抑制三七黑斑病病原菌的多抗霉素产生菌。
3.根据权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，所述的硫酸铵终浓度为0.8%。
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"防治三七黑斑病的多抗霉素发酵生产技术研究";王亮;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 (农业科技辑)》;20210215(第2期);摘要 *

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