CN101311262A - 一种灰色链霉菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI－92827CGMCC No.2048，通过发酵培养该菌株得到的培养物可用于防治灰霉病(Botrytis cinerea)、瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)、瓜类炭疽病(Colletotrichum lagenarium)和水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae)等多种作物病害。
Description
技术领域
本发明属微生物技术领域，具体涉及一种新的灰色链霉菌及其应用。
背景技术
由于我国境内的地理环境、气候条件千差万别，微生物资源相当地丰富。人们通过在各种不同纬度、海拔以及气候的地域寻找新的微生物菌种。一般地，通过菌株的形态特征、培养特征以及生理生化特征等对微生物菌种进行分类鉴别，同时还常常采用检测微生物菌种的16srDNA的序列来明确该菌种的分类地位。
通过对在全国各地采集得来的微生物菌种进行培养，在得到的代谢产物中寻找各种活性成分，并进而研究开发成各种药物(包括医药、农药、兽药等)。这种技术正在被广泛应用，如用作医用抗生素的青霉素、链霉素等，在农用、兽用方面有防治水稻纹枯病的井冈霉素、防治多种螨虫和夜蛾的阿维菌素等。
发明内容
本申请的发明人在我国上海郊区的土壤中采集并分离到一株菌株，命名为SPRI-90827，经鉴定其为链霉菌属的灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)，通过对其16SrDNA序列的测定发现，该菌株为一株新的菌株；进一步的研究发现，该菌株的发酵液对于多种植物病害具有杀菌活性。
因此，本发明的首要目的就在于提供一种灰色链霉菌SPRI-90827。
本发明的另一个目的在于提供所述灰色链霉菌用于制备农用杀菌剂的应用。
本发明的灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-90827，已于2007年5月16日提交中国普通微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.2048。
经测定，该菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-90827经发酵培养后，可用于制备农用杀菌剂。
根据本发明，所述灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-90827的发酵培养条件如下：
在28℃下通气搅拌培养90-96小时；培养基的重量百分比组成为：葡萄糖2％、淀粉5％、花生饼粉2％、黄豆饼粉1％、蛋白胨0.1％、酵母膏0.4％、氯化钠0.2％、硫酸镁0.5％、硝酸胺0.2％、磷酸氢二钾0.05％。
根据本发明，所述灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-90827经发酵后的发酵液可直接用于制备农用杀菌剂。
根据本发明，所述制备的农用杀菌剂可用于防治灰霉病(Botrytis cinerea)、瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)、瓜类炭疽病(Colletotrichum lagenarium)和水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae)。
附图说明
图1是对灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-90827进化树分析的示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，进一步说明本发明。
本发明的灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-90827已于2007年5月16日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.2048。
以下实施例所涉及的原材料皆可通过市售得到，且涉及到的浓度均为重量浓度。
本发明的灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-90827的形态特征、培养特征、生理生化特征及16SrDNA的序列和菌种分类结果如下：
1、SPRI-90827菌株在大多数培养基上生长良好(见表1)，在高氏培养基上，菌落微绒状，基内菌丝体无横隔，不断裂，气生菌丝体分支，纤细柔曲，生长丰盛。孢子丝较长，右旋螺旋约1环圈，长度15个以上，孢子扁圆型，表面光滑。
表1、培养特征
| 培养基 | 气生菌丝 | 基内菌丝 | 可溶性色素 |
| 高氏一号合成培养基 | 灰白 | 白 | 无 |
| 葡萄糖天门冬素琼脂 | 白 | 白 | 黑褐 |
| 蔗糖硝酸盐琼脂 | 浅棕灰 | 白 | 无 |
| 无机盐淀粉琼脂 | 灰白 | 白 | 无 |
| 燕麦粉琼脂 | 棕灰(偏红) | 浅黄色 | 无 |
| 马铃薯浸汁琼脂 | 白 | 白 | 无 |
| 酵母麦芽汁琼脂 | 荷花白 | 玳瑁黄 | 褐棕 |
| 桑塔斯琼脂 | 褐 | 白 | 黑褐 |
2、菌株SPRI-90827的生理生化特性和碳源利用情况为：明胶液化完全，脱脂牛奶中呈环状深褐色生长，有凝固和胨化，淀粉水解完全，H2S产生阳性，酪氨酸激酶产生阳性。能利用的碳源为：D-葡萄糖、D-甘露醇、D-果糖、L-阿拉伯糖。不能利用纤维素、L-肌醇、蔗糖、D-木糖、L-鼠李糖、棉子糖。
3、菌株SPRI-90827细胞壁含有LL-DAP和甘氨酸，胞壁I型；全细胞糖水解无特征性糖，为C型。
4、本发明所述的菌株SPRI-90827的16srDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
16SrDNA序列的测定委托上海申能博彩生物科技有限公司(上海市漕河泾开发区钦江路333号38号楼一楼，邮编：200233)进行，具体如下：用溶菌酶法从新鲜菌体提取基因组DNA，采用通用引物进行16SrDNA扩增，PCR产物经检测、纯化后直接用Taq Deoxy Terminator Cyele Sequencing Kit测序，电泳及数Applied BiosystemsDNA Sequencer(model377)自动进行。
5、进化树分析：与菌株90827 16SrRNA序列相似性最高的为Streptomyces cellostaticusHamada 1958，相似性达99.31％，但两者51％自展值聚合在一起，这一数值从统计学上无法充分支持两者为同一种，表明可能存在一定的进化差异。且经过查阅资料，发现Streptomyces cellostaticus，制胞链霉菌(产cellostatin)无原始菌种描述情况(伯杰氏手册第八版，1161页)。90827与Streptomyces griseochromogenes 16srRNA相似性达98.65％，两者在进化树中同属一大支。一般16SrDNA序列同源性小于97％，可以认为属于不同种。故SPRI 90827与Streptomyces griseochromogenes应有较近的亲缘关系(见图1)。
此外经比较发现SPRI 90827生理生化性质等指标与Streptomyces griseochromogenes相近，同属灰色类群。
根据形态与化学分类定属原则，菌株SPRI 90827基内菌丝体无横隔，不断裂，气生菌丝体分支，纤细柔曲，生长丰盛。孢子丝较长，右旋螺旋约1环圈，长度15个以上，孢子扁园型，表面光滑。细胞壁化学组份属于I型，属于链霉菌属(Streptomyces)。
根据以上形态观察以及生理生化特征，结合16srDNA进化树分析，认为菌种SPRI90827应为Streptomyces griseochromogenes。
本发明所述的灰色链霉菌培养方法既可为深层液体培养，也可为固体培养。为了有利于工业性的培养，宜将上述生产菌的孢子悬浮液接种到培养基上，并进行通气搅拌。
对培养基中的营养源并无特殊的规定，可使培养基中含有常用于微生物培养的碳源、氮源及其他营养源。其中碳源可为淀粉、糊精、葡萄糖、甘油、蔗糖、甘露醇等，氮源可为肉胨、黄豆饼粉、花生粉、酵母、肉膏、米糠、玉米浆、麦皮、铵盐、尿素、硝酸盐以及其他有机或无机含氮化合物。其他营养源可适当添加一些无机盐类，例如食盐、磷酸盐及钾、钙、锰、铁等金属盐。必要时可添加一些动、植、矿物油等作为消泡剂。
对温度、PH、时间等培养条件并无严格的限制，以适于产生菌的生产为准，并以选择活性组份产量最高的条件为好。例如，培养基的PH范围可为6-8，以接近中性为好；培养温度在20-35℃，通气量以通气比1∶0.3到1比4之间(通气比：指每分钟通过培养液的空气体积与培养液体积之比)。这些培养基的组份、PH、培养温度、通气条件等均应根据实际情况进行适当的调整，以获得最好的效果。
本发明所述的灰色链霉菌经过发酵培养，得到的培养物可用于防治各种作物病害，主要针对因病原真菌引起的植物病害。具体来说，可防治灰霉病(Botrytis cinerea)、瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)、瓜类炭疽病(Colletotrichum lagenarium)、水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae)。
实施例1、灰色链霉菌SPRI-90827的发酵培养
按以下配方配制培养基，然后消毒灭菌：
葡萄糖2％、淀粉5％、花生饼粉2％、黄豆饼粉1％、蛋白胨0.1％、酵母膏0.4％、氯化钠0.2％、硫酸镁0.5％、硝酸胺0.2％、磷酸氢二钾0.05％，pH 7.2。
将生长于高氏斜面的SPRI-90827菌种Streptomyces griseochromogenes CGMCCNo.2048接种于该培养基中，28℃、150rpm摇床培养36-40小时；
以此培养物为种子，以5-20％的比例接种于上述培养基组成的发酵培养液中，28℃通气搅拌培养90-96小时，获得的发酵液备用。
实施例2、灰色链霉菌SPRI-90827的应用
在实施例1所培养得到的培养物中，取适量发酵液用水稀释2-4倍，均匀喷洒在四张真叶期黄瓜苗上，直到叶片上形成水层，并且有多余的液体下滴为止。
待药液干后分别在四张黄瓜叶片中央接种灰霉病病菌、瓜白粉病菌、瓜类炭疽病菌和稻瘟病菌，在20℃下保湿72小时，同时以四组清水作空白对照。检查发病情况，结果如表2所示。
表2、灰色链霉菌SPRI-90827的发酵液对植物病害试验结果
实施例3、灰色链霉菌SPRI-90827的应用
将实施例1所培养得到的培养物过滤后取上清液，均匀喷洒在四张真叶期黄瓜苗上，直到叶片上形成水层，并且有多余的液体下滴为止。
待药液干后分别在四张黄瓜叶片中央接种灰霉病病菌、瓜白粉病菌、瓜类炭疽病菌和稻瘟病菌，在20℃下保湿72小时，同时以四组清水作空白对照。检查发病情况，结果如表3所示。
表3、灰色链霉菌SPRI-90827的发酵液对植物病害试验结果
根据实施例2和实施例3的结果表明，本发明所述的灰色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)SPRI-90827 CGMCC No.2048经过发酵培养，其发酵液中含有杀菌活性物质，对因病原真菌引起的植物病害，如灰霉病(Botrytis cinerea)、瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)、瓜类炭疽病(Colletotrichum lagenarium)、水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae)等均有较好的防治效果，可以进一步开发为一种新型的农用杀菌剂。
序列表
<110>上海市农药研究所
<120>一种灰色链霉菌及其应用
<130>P5071043
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1478
<212>DNA
<213>Streptomyces griseochromogenes
<220>
<221>16SrDNA
<222>(1)..(1478)
<400>1
gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gatgaagccc ttcggggtgg 60
attagtggcg aacgggtgag taacacgtgg gcaatctgcc cttcactctg ggacaagccc 120
tggaaacggg gtctaatacc ggatatcact cctgcaggca tctgcggggg tcgaaagctc 180
cggcggtgaa ggatgagccc gcggcctatc agcttgttgg tgaggtaatg gctcaccaag 240
gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca ctgggactga gacacggccc 300
agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgaaagc ctgatgcagc 360
gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct ctttcagcag ggaagaagcg 420
aaagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480
cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag agctcgtagg cggcttgtca 540
cgtcgggtgt gaaagcccgg ggcttaaccc cgggtctgca ttcgatacgg gctagctaga 600
gtgtggtagg ggagatcgga attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga 660
acaccggtgg cgaaggcgga tctctgggcc attactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg 720
gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acggtgggaa ctaggtgttg 780
gcgacattcc acgtcgtcgg tgccgcagct aacgcattaa gttccccgcc tgcggagtac 840
cggcgcaagg ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaaccagc ggagcatgtg 900
gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatacaccg gaaagcatta 960
gagatagtgc cccccttgtg gtcggtgtac aggtggtgca tggctgtcgt cagctcgtgt 1020
cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgttctgtgt tgccagcatg 1080
cccttcgggg tgatggggac tcacaggaga ccgccggggt caactcggag gaaggtgggg 1140
acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca cacgtgctac aatggccggt 1200
acaatgagct gcgataccgt gaggtggagc gaatctcaaa aagccggtct cagttcggat 1260
tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gagttgctag taatcgcaga tcagcattgc 1320
tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcacga aagttggtaa 1380
cacccgaagc cggtggccca accccttgtg ggagggagtc gtcgaaggtg ggactagcga 1440
ttgggacgaa gtcgtaacaa ggtagccgta ccggaagg 1478
Claims (8)
1、一种灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-92827，其特征在于，该菌株的保藏号为CGMCC No.2048。
2、如权利要求1所述的灰色链霉菌SPRI-90827，其特征在于，该菌株的种子培养条件为：
在28℃下培养36-40小时；培养基重量百分比组成：葡萄糖2％、淀粉5％、花生饼粉2％、黄豆饼粉1％、蛋白胨0.1％、酵母膏0.4％、氯化钠0.2％、硫酸镁0.5％、硝酸胺0.2％、磷酸氢二钾0.05％，PH 7.2。
3、如权利要求1所述的灰色链霉菌SPRI-90827，其特征在于，该菌株的发酵培养条件为：
在28℃下通气搅拌培养90-96小时；培养基重量百分比组成：葡萄糖2％、淀粉5％、花生饼粉2％、黄豆饼粉1％、蛋白胨0.1％、酵母膏0.4％、氯化钠0.2％、硫酸镁0.5％、硝酸胺0.2％、磷酸氢二钾0.05％。
4、如权利要求1所述的灰色链霉菌SPRI-90827，其特征在于，该菌株具有SEQ IDNO：1所示的16SrDNA序列。
5、权利要求1-4中任一项所述的灰色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)SPRI-92827的应用，其特征在于，用于通过发酵生产农用杀菌剂。
6、如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵的条件为：
在28℃下通气搅拌培养90-96小时；培养基重量百分比组成：葡萄糖2％、淀粉5％、花生饼粉2％、黄豆饼粉1％、蛋白胨0.1％、酵母膏0.4％、氯化钠0.2％、硫酸镁0.5％、硝酸胺0.2％、磷酸氢二钾0.05％。
7、如权利要求6所述的应用，其特征在于，以所述灰色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)SPRI-92827的发酵液生产农用杀菌剂。
8、如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述农用杀菌剂用于防治灰霉病(Botrytiscinerea)、瓜白粉病(Sphaerotheca filiginea)、瓜类炭疽病(Colletotrichum lagenarium)和水稻稻瘟病(Pyricularia oryzae)。
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