KR102150120B1 - 미생물 동결건조 보호용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 콩가루 및 효모 추출물의 혼합물; 또는 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당의 혼합물;을 포함하는 미생물 동결건조 보호용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 콩가루 및 효모 추출물의 혼합물; 또는 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당의 혼합물;로 동결건조된 미생물은 생존율이 우수하고, 인공 위액, 산성 용액 및 인공 답증 조건에서 저항성을 가지며, 저장 안정성이 우수하여 실온 조건에서 장기간 보존할 수 있는 효과를 나타내므로, 미생물 동결건조 보호 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 미생물 동결건조 보호용 조성물에 관한 것이다.
유산균은 당류를 에너지원으로 사용하여 유산을 생성하는 세균으로 사람이나 포유동물의 소화관, 구강 및 질 등에서 발견되며, 각종 발효식품 등 자연계에 널리 분포되어 있다. 유산균은 인류가 가장 오랫동안 광범위하게 활용하고 있는 미생물 중 하나로서, 사람이나 동물의 장에 해로운 물질을 생성하지 않으며 장내에서 부패를 방지하는 순기능을 가진 미생물이다. 특히, 감염에 대한 저항성, 면역 증진 작용 등의 유익한 작용을 하는 것으로 알려져있어 유산균을 포함하는 프로바이오틱스(probiotics) 조성물이 활발히 개발되고 있다. 유산균은 또한 다양한 채소와 과일에서도 발견되는데, 요구르트, 우리나라의 김치나 독일의 사우어크라우트(sauerkraut)와 같은 발효식품에서 그 발효과정에 중요한 역할을 담당하는 것으로 보고되어, 발효 식품의 제조시, 식품의 품질 균일화 및 품질 유지를 위해 우수한 유산균 균주를 분리 선발하여, 식품 제조시 첨가할 수 있는 식품 발효용 미생물 첨가제로서 개발하기 위한 연구가 진행중에 있다.
유산균의 지속적인 안정성 유지를 위한 장기보존 방법으로 현재 분무건조와 동결건조 방법을 사용하고 있으며, 동결건조는 유산균 균체를 냉동 건조시킴으로서 저장하는 방법으로 대부분의 유산균을 효과적으로 장기 보존할 수 있는 방법임이 알려져 있다. 다만, 동결건조 방법은 오염방지, 저장, 간편성의 장점을 가지고 있으나, 동결건조 과정에서 물리적이고 생화학적인 스트레스로 세포의 활성과 생존율에 많은 영향을 미치게 되므로 유산균의 생존율을 최대한 높일 수 있는 방법이 요구되고 있다.
현재 널리 사용되고 있는 동결 보호제로는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 글리세롤과 같은 글리콜, 디메틸술폭시드(DMSO) 등이 있다. 에틸렌 글리콜은 통상 자동차용 부동액으로 사용되고, 프로필렌 글리콜은 아이스크림에서 얼음 형성을 감소시키기 위해 사용되며, 글리세롤과 DMSO는 액화질소 내에서 보존되는 정자와 배아에서 얼음 형성을 감소시키기 위해 수십년 간 사용되어 왔다. 이들 공지의 동결 보호제 중에서 DMSO가 가장 효과적인 것으로 알려져 있으나 생리적으로 독성이 있으며, 주의하지 않는다면 취급자에게 고혈압, 메스꺼움과 구토를 초래하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 동결건조 과정에서 발생할 수 있는 손상으로부터 유산균을 보호하면서 인체에 무해한 새로운 동결 보호제 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 미생물 동결건조 보호용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 미생물 동결건조 보호 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콩가루 및 효모 추출물의 혼합물; 또는 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당의 혼합물;을 포함하는 미생물 동결건조 보호용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 콩가루 및 효모 추출물의 혼합물; 또는 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당의 혼합물;을 미생물과 혼합하여 동결건조하는 단계를 포함하는, 미생물 동결건조 보호 방법을 제공한다.
본 발명의 콩가루 및 효모 추출물의 혼합물; 또는 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당의 혼합물;로 동결건조된 미생물은 생존율이 우수하고, 인공 위액, 산성 용액 및 인공 답증 조건에서 저항성을 가지며, 저장 안정성이 우수하여 실온 조건에서 장기간 보존할 수 있는 효과를 나타내므로, 미생물 동결건조 보호 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아(Weissella cibaria) JW15 균주의 생존율을 나타낸 도이다
(S5: 탈지유 5g; SF5: 콩가루 5g; YE5: 효모 추출물 5g; M5: 말토덱스트린 5g; S10: 탈지유 10g; SF10: 콩가루 10g; YE10: 효모 추출물 10g; M10: 말토덱스트린 10g; SSF: 탈지유 5g 및 콩가루 5g; SY: 탈지유 5g 및 효모 추출물 5g; SM: 탈지유 5g 및 말토덱스트린 5g; SFY: 콩가루 5g 및 효모 추출물 5g; SFM: 콩가루 5g 및 말토덱스트린 5g; YM: 효모 추출물 5g 및 말토덱스트린 5g; OFFO: 귀리 식이섬유 5g 및 프락토올리고당 5 g; con: 무처리군).
도 2는 인공 위액에서 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아 JW15 균주의 생존율을 나타낸 도이다.
도 3은 산성 용액에서 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아 JW15 균주의 생존율을 나타낸 도이다.
도 4는 인공 답즙액에서 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아 JW15 균주의 생존율을 나타낸 도이다.
도 5는 온도 및 시간에 따른 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아 JW15 균주의 생존율을 나타낸 도이다
(A: 음성 대조군(NC); B: SSF 처리; C: SFY 처리; D: OFFO 처리).
도 6은 온도 및 시간에 따른 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아 JW15 균주의 생존율 결과를 토대로 분해성을 나타내는 지표인 반응 속도 상수를 산출한 결과이다
(A: 음성 대조군(NC); B: SSF 처리; C: SFY 처리; D: OFFO 처리).
도 7은 저온에서 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아 JW15 균주의 생존율 및 균수 감소율을 나타낸 도이다.
(S5: 탈지유 5g; SF5: 콩가루 5g; YE5: 효모 추출물 5g; M5: 말토덱스트린 5g; S10: 탈지유 10g; SF10: 콩가루 10g; YE10: 효모 추출물 10g; M10: 말토덱스트린 10g; SSF: 탈지유 5g 및 콩가루 5g; SY: 탈지유 5g 및 효모 추출물 5g; SM: 탈지유 5g 및 말토덱스트린 5g; SFY: 콩가루 5g 및 효모 추출물 5g; SFM: 콩가루 5g 및 말토덱스트린 5g; YM: 효모 추출물 5g 및 말토덱스트린 5g; OFFO: 귀리 식이섬유 5g 및 프락토올리고당 5 g; con: 무처리군).
도 2는 인공 위액에서 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아 JW15 균주의 생존율을 나타낸 도이다.
도 3은 산성 용액에서 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아 JW15 균주의 생존율을 나타낸 도이다.
도 4는 인공 답즙액에서 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아 JW15 균주의 생존율을 나타낸 도이다.
도 5는 온도 및 시간에 따른 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아 JW15 균주의 생존율을 나타낸 도이다
(A: 음성 대조군(NC); B: SSF 처리; C: SFY 처리; D: OFFO 처리).
도 6은 온도 및 시간에 따른 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아 JW15 균주의 생존율 결과를 토대로 분해성을 나타내는 지표인 반응 속도 상수를 산출한 결과이다
(A: 음성 대조군(NC); B: SSF 처리; C: SFY 처리; D: OFFO 처리).
도 7은 저온에서 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아 JW15 균주의 생존율 및 균수 감소율을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 콩가루 및 효모 추출물의 혼합물; 또는 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당의 혼합물;을 포함하는 미생물 동결건조 보호용 조성물을 제공한다.
상기 콩가루, 효모 추출물, 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당은 직접 제조하거나 시판되고 있는 제품을 구입하여 이용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 콩가루는 타투아(Tatua)사의 Tatua HSP349를 구입, 효모 추출물은 랄레만드(Lallemand Inc)사로부터 구입, 귀리 식이섬유는 인터파이버(InterFiber)사로부터 구입, 프락토올리고당은 삼양사로부터 구입하여 사용하였다.
상기 콩가루와 효모 추출물은 1:0.5 내지 1:2의 비율로 혼합될 수 있고, 구체적으로 1:0.7 내지 1:1.5, 더 구체적으로 1:0.7 내지 1:1.2의 비율로 혼합될 수 있다. 또한, 상기 귀리 식이섬유와 프락토올리고당은 1:0.5 내지 1:2의 비율로 혼합될 수 있고, 구체적으로 1:0.7 내지 1:1.5, 더 구체적으로 1:0.7 내지 1:1.2의 비율로 혼합될 수 있다.
본 발명의 미생물 동결건조 보호용 조성물에 있어서, 콩가루 및 효모 추출물의 혼합물은 5 내지 15%(w/v)로 포함할 수 있고, 구체적으로 7 내지 13%, 더 구체적으로 8 내지 12%일 수 있다.
본 발명의 미생물 동결건조 보호용 조성물에 있어서, 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당은 5 내지 15%(w/v)로 포함할 수 있고, 구체적으로 7 내지 13%, 더 구체적으로 8 내지 12%일 수 있다.
본 발명의 조성물은 7 내지 10 log CFU/ml로 현탁되어 있는 미생물에 대해 2 내지 20%(w/v)의 농도로 첨가할 수 있으며, 구체적으로 2 내지 15%, 더 구체적으로 5 내지 12%, 보다 더 구체적으로 8 내지 12%의 농도로 첨가할 수 있다.
상기 미생물은 유산균일 수 있으며, 상기 유산균은 바이셀라(Weissella) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus)속, 비피도박테륨(Bifidobacterium) 속, 락토코커스(Lactococcus)속 및 페디오코커스(Pediococcus) 속으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유산균은 바이셀라 사이바리아(Weissella cibaria)일 수 있고, 구체적으로 상기 유산균은 바이셀라 사이바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(기탁번호 KCAA 91811P)일 수 있다.
상기 콩가루 및 효모 추출물의 혼합물은 동결건조된 미생물을 20 내지 30℃에서 400 내지 500일 동안 보존할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 콩가루 및 효모 추출물의 혼합물은 동결건조된 바이셀라 사이바리아 균주를 실온에서 441일 동안 보존할 수 있다.
상기 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당의 혼합물은 동결건조된 미생물을 20 내지 30℃에서 1,100 내지 1,300일 동안 보존할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당의 혼합물은 동결건조된 바이셀라 사이바리아 균주를 실온에서 1,276일 동안 보존할 수 있다.
본 발명에 따른 미생물 동결건조 보호용 조성물은 종래에 동결건조 보호제로 알려져 있는 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 S5(탈지유 5g), SF5(콩가루 5g), YE5(효모 추출물 5g), M5(말토덱스트린 5g), S10(탈지유 10g), SF10(콩가루 10g), YE10(효모 추출물 10g), M10(말토덱스트린 10g), SSF(탈지유 5g 및 콩가루 5g), SY(탈지유 5g 및 효모 추출물 5g), SM(탈지유 5g 및 말토덱스트린 5g), SFY( 콩가루 5g 및 효모 추출물 5g), SFM(콩가루 5g 및 말토덱스트린 5g), YM(효모 추출물 5g 및 말토덱스트린 5g) 및 OFFO(귀리 식이섬유 5g 및 프락토올리고당 5 g)의 동결건조 보호제를 제조하고, 이를 바이셀라 사이바리아 균주에 각각 첨가하여 동결건조한 결과, 동결건조 보호제를 처리하지 않은 무처리군과 비교하여 생존율이 우수함을 확인하였다 (표 2 및 도 1 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 동결건조 보호제로 동결건조된 바이셀라 사이바리아 균주를 인공 위액, 산성 용액 및 인공 담즙액에서 각각 배양한 결과, 동결건조 보호제를 처리하지 않은 무처리군과 비교하여 생존율이 우수함을 확인하였다 (표 3 내지 5 및 도 2 내지 4 참조).
또한, 본 발명자들은 대량 배양된 바이셀라 사이바리아 균주에 SSF 및 SFY을 각각 첨가하고 동결건조한 결과, 이물과 대장균이 미검출되고 수분 활성도가 0.3 미만, 생균수가 1010 CFU/g 이상인 것으로 나타나, 식품 소재의 기준 규격에 부합함을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 대량 배양된 바이셀라 사이바리아 균주에 SSF, SFY 및 OFFO을 각각 첨가하고 동결건조한 후, 50, 60 및 70℃의 온도에서 가속저장실험을 수행하고, 저온에서 저장실험을 수행한 결과, 동결건조 보호제를 처리하지 않은 무처리군과 비교하여 저장 안정성이 우수함을 확인하였다 (도 5 및 도 7 참조).
또한, 본 발명자들은 대량 배양된 바이셀라 사이바리아 균주에 SFY 및 OFFO을 각각 첨가하고 동결건조한 후, 실온 상태에서의 유통기한을 산출한 결과, 동결건조 보호제를 처리하지 않은 무처리군과 비교하여 저장 안정성이 우수함을 확인하였다 (표 6 및 도 6 참조).
따라서, 본 발명의 콩가루 및 효모 추출물의 혼합물(SFY); 또는 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당의 혼합물(OFFO);로 동결건조된 미생물은 생존율이 우수하고, 인공 위액, 산성 용액 및 인공 답증 조건에서 저항성을 가지며, 저장 안정성이 우수하여 실온 조건에서 장기간 보존할 수 있는 효과를 나타내므로, 미생물 동결건조 보호 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 미생물 동결건조 보호용 조성물을 미생물과 혼합하여 동결건조하는 단계를 포함하는, 미생물 동결건조 보호 방법을 제공한다.
상기 미생물 동결건조 보호용 조성물은 상기 서술한 바와 같다. 일례로, 상기 미생물 동결건조 보호용 조성물은 콩가루 및 효모 추출물의 혼합물; 또는 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당의 혼합물;을 포함한다.
상기 콩가루와 효모 추출물은 1:0.5 내지 1:2의 비율로 혼합될 수 있고, 구체적으로 1:0.7 내지 1:1.5, 더 구체적으로 1:0.7 내지 1:1.2의 비율로 혼합될 수 있다. 또한, 상기 귀리 식이섬유와 프락토올리고당은 1:0.5 내지 1:2의 비율로 혼합될 수 있고, 구체적으로 1:0.7 내지 1:1.5, 더 구체적으로 1:0.7 내지 1:1.2의 비율로 혼합될 수 있다.
본 발명의 미생물 동결건조 보호용 조성물에 있어서, 콩가루 및 효모 추출물의 혼합물은 5 내지 15%(w/v)로 포함할 수 있고, 구체적으로 7 내지 13%, 더 구체적으로 8 내지 12%일 수 있다.
본 발명의 미생물 동결건조 보호용 조성물에 있어서, 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당은 5 내지 15%(w/v)로 포함할 수 있고, 구체적으로 7 내지 13%, 더 구체적으로 8 내지 12%일 수 있다.
상기 미생물은 유산균일 수 있으며, 상기 유산균은 바이셀라(Weissella) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus)속, 비피도박테륨(Bifidobacterium) 속, 락토코커스(Lactococcus)속 및 페디오코커스(Pediococcus) 속으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유산균은 바이셀라 사이바리아(Weissella cibaria)일 수 있고, 구체적으로 상기 유산균은 바이셀라 사이바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(기탁번호 KCAA 91811P)일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
바이셀라
사이바리아
(
Weissella
cibaria
) 균주의 배양
한국농업미생물자원센터에서 분양받은 바이셀라 사이바리아(Weissella cibaria) JW15 균주(KCAA 91811P)를 MRS 배지(Difco, 미국)에 접종하고 37℃에서 100 rpm으로 24시간 동안 배양하였다.
<
실시예
2> 동결건조 보호제 처리된 균주의 제조
바이셀라 사이바리아 균주의 동결건조 보호제로 탈지유(서울우유, 양주, 한국), 콩가루(Tatua HSP349, 모린스빌(Morrinsville), 뉴질랜드), 효모 추출물(Lallemand Inc, Salutaguse Parmitehas AS, 에스토니아), 말토덱스트린(ES 식품원료, 군산, 한국), 귀리 식이섬유(InterFiber, 폴란드) 및 프락토올리고당(삼양사, 한국)을 준비하고, 하기 표 1의 양으로 시료를 준비하였다. 실시예 1에서 배양한 바이셀라 사이바리아 JW15 균주를 4℃에서 3,500 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 펠렛을 수득한 다음, 펠렛 1 g에 0.85%의 멸균 식염수 100 mL를 첨가하여 균질화하였다. 균질화한 세포에 표 1의 동결건조 보호제를 각각 5g 또는 10g 첨가하고 실온에서 1시간 동안 방치한 후, -80℃에서 동결건조하였다.
| 시료명 | 동결건조 보호제 |
| S5 | 탈지유(Skimmed milk) 5 g |
| SF5 | 콩가루(soy flour) 5 g |
| YE5 | 효모 추출물(Yeast extract) 5 g |
| M5 | 말토덱스트린(maltodextrin) 5 g |
| S10 | 탈지유 10 g |
| SF10 | 콩가루 10 g |
| YE10 | 효모 추출물 10 g |
| M10 | 말토덱스트린 10 g |
| SSF | 탈지유 5 g + 콩가루 5 g |
| SY | 탈지유 5 g + 효모 추출물 5 g |
| SM | 탈지유 5 g + 말토덱스트린 5 g |
| SFY | 콩가루 5 g + 효모 추출물 5 g |
| SFM | 콩가루 5 g + 말토덱스트린 5 g |
| YM | 효모 추출물 5 g + 말토덱스트린 5 g |
| OFFO | 귀리 식이섬유(oat fiber) 5 g + 프락토올리고당(fructooligosaccharide) 5 g |
<
실험예
1>
바이셀라
사이바리아
균주의 생존율 측정
실시예 2의 동결건조 보호제 처리된 바이셀라 사이바리아 JW15 균주의 생존능을 확인하기 위해, 동결건조된 균주의 생존율을 측정하였다.
실시예 2의 동결건조된 균주(0.1 g/ml)를 취하여 멸균 생리식염수로 10진 희석하고, 이를 MRS 아가 배지(Difco, 미국)에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배지에 생성된 집락수(log CFU/ml)를 계산하고, 동결건조 전과 비교하여 백분율로 나타내었다. 무처리군으로 동결건조 보호제를 처리하지 않은 바이셀라 사이바리아 균주를 이용하였다.
그 결과, 바이셀라 사이바리아 균주는 표 1의 동결건조 보호제 처리시 70% 이상의 생존율을 보였으며, 특히 SFY에서 100%, SFM에서 99%, YM에서 97%, OFFO에서 93%로 순으로 생존율이 우수한 것으로 확인되었다 (표 2 및 도 1).
| 시료명 | 생존율(%) |
| 무처리군 | 63 |
| S5 | 92 |
| SF5 | 81 |
| YE5 | 85 |
| M5 | 68 |
| S10 | 85 |
| SF10 | 88 |
| YE10 | 90 |
| M10 | 76 |
| SSF | 79 |
| SY | 82 |
| SM | 74 |
| SFY | 100 |
| SFM | 99 |
| YM | 97 |
| OFFO | 93 |
<
실험예
2> 인공 위액 저항성 평가
체내 소화관 조건과 유사한 환경에서 실시예 2의 동결건조된 균주의 생존능을 확인하기 위해, 인공 위액에서의 균주 생존율을 측정하였다.
먼저, pH 3으로 조정된 MRS 배지에 펩신(Sigma, 미국)을 1,000 unit/ml가 되도록 첨가하여 인공 위액을 제조하였다. 제조한 인공 위액 3 ml에 실시예 2의 동결건조된 균주 1 g을 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, MRS 아가 배지에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배지에 생성된 집락수(log CFU/ml)를 계산하고, 인공 위액이 아닌 MRS 배지에서 배양한 실험군과 비교하여 백분율로 나타내었다. 무처리군으로 동결건조 보호제를 처리하지 않은 바이셀라 사이바리아 균주를 이용하였다.
그 결과, 표 1의 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아 균주는 인공 위액 조건에서 70% 이상의 생존율을 나타냈으며, 특히 S10에서 98%, SSF에서 97%의 순으로 생존율이 우수한 것으로 확인되었다 (표 3 및 도 2).
| 시료명 | 생존율(%) |
| 무처리군 | 65 |
| S5 | 93 |
| SF5 | 85 |
| YE5 | 82 |
| M5 | ND |
| S10 | 98 |
| SF10 | 90 |
| YE10 | 91 |
| M10 | ND |
| SSF | 97 |
| SY | 92 |
| SM | 82 |
| SFY | 85 |
| SFM | 79 |
| YM | 77 |
| OFFO | 85 |
<
실험예
3> 산성 용액 저항성 평가
산성 조건에서 동결건조된 균주의 생존능을 확인하기 위해, pH 3으로 조정된 0.05 M 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충액 용액에 실시예 2의 동결건조된 균주 1 g을 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, MRS 아가 배지에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배지에 생성된 집락수(log CFU/ml)를 계산하고, 산성 용액이 아닌 MRS 배지에서 배양한 실험군과 비교하여 백분율로 나타내었다. 무처리군으로 동결건조 보호제를 처리하지 않은 바이셀라 사이바리아 균주를 이용하였다.
그 결과, 표 1의 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아 균주는 산성 용액 조건에서 80% 이상의 생존율을 보였으며, 특히 SSF와 SFY에서 99%, SY에서 98%, SM에서 96%, S10에서 95%의 순으로 생존율이 우수한 것으로 나타났다 (표 4 및 도 3).
| 시료명 | 생존율(%) |
| 무처리군 | 69 |
| S5 | 98 |
| SF5 | 99 |
| YE5 | 97 |
| M5 | 97 |
| S10 | 95 |
| SF10 | 90 |
| YE10 | 90 |
| M10 | ND |
| SSF | 99 |
| SY | 98 |
| SM | 96 |
| SFY | 93 |
| SFM | 99 |
| YM | 92 |
| OFFO | 85 |
<
실험예
3> 인공 담즙 저항성 평가
체내 소화관 조건과 유사한 환경에서 동결건조된 균주의 생존능을 확인하기 위해, 인공 담즙액에서의 균주 생존율을 측정하였다.
먼저, MRS 배지에 황소의 담즙(oxgall, Difco, 미국)을 0.3%가 되도록 첨가하여 인공 담즙액을 제조하였다. 제조한 인공 담즙액 9 ml에 실시예 2의 동결건조된 균주 1 g을 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, MRS 아가 배지에 도말하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배지에 생성된 집락수(log CFU/ml)를 계산하고, 인공 담즙이 아닌 MRS 배지에서 배양한 실험군과 비교하여 백분율로 나타내었다. 무처리군으로 동결건조 보호제를 처리하지 않은 바이셀라 사이바리아 균주를 이용하였다.
그 결과, 표 1의 동결건조 보호제로 처리된 바이셀라 사이바리아 균주는 인공 담즙 조건에서 70% 이상의 생존율을 보였으며, 특히 SFY에서 99%, S10에서 98%, S5와 SF5에서 96%의 순으로 생존율이 우수한 것으로 나타났다 (표 5 및 도 4).
| 시료명 | 생존율(%) |
| 무처리군 | 52 |
| S5 | 96 |
| SF5 | 96 |
| YE5 | 83 |
| M5 | 89 |
| S10 | 98 |
| SF10 | 87 |
| YE10 | 74 |
| M10 | 81 |
| SSF | 90 |
| SY | 76 |
| SM | 77 |
| SFY | 99 |
| SFM | 83 |
| YM | 83 |
| OFFO | 86 |
<
실험예
4> 대량생산 적용 가능성 평가
대량생산된 균주에 SSF, SFY 또는 OFFO를 각각 첨가하고 동결건조하였을 때, 식품 소재의 기준 규격에 적합한지 평가하였다.
먼저, 500 L 발효조에 살균된 배지(함수포도당 5.50%, 소이펩톤 3.00%, 효모 추출물 2.00%, 트윈80 0.01%, 황산마그네슘 0.3% 및 기타 3.00%)를 넣고 바이셀라 사이바리아 JW15 균주를 접종하였다. O.D 값이 2.2-2.5가 되도록 9~12시간 동안 배양하고, 배양액을 13,000 rpm에서 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체에 27%의 용액 상태로 제조한 SSF, SFY 또는 OFFO를 각각 첨가하였다. SSF의 경우, 회수한 균체 대비 S(탈지유) 20%, SF(콩가루) 20%의 양으로 첨가하였고, SFY도 회수한 균체 대비 SF(콩가루) 20%, Y(효모 추출물) 20%의 양으로 첨가하였으며, OFFO도 회수한 균체 대비 OF(귀리 식이섬유) 20%, FO(프락토올리고당) 20%의 양으로 첨가하였다. SSF, SFRY 또는 OFFO를 첨가한 균주를 동결건조기에서 넣고 진공, 25~35℃에서 48~72시간 동안 건조하였다. 건조가 완료된 제품을 분쇄하고 식품 소재의 기준 규격인 이물과 대장균 검출 여부 및 생균수를 평가하였다. 이물과 대장균은 미검출되고, 생균수 1010 CFU/g 이상일 때, 기준 규격에 부합한 것으로 판단한다.
대량생산 시험 결과, 동결건조 보호제를 처리하지 않은 음성 대조군(NC)의 생균수는 5.1×1011 CFU/g, SSF을 처리한 실험군의 생균수는 7.51×1011 CFU/g, SFY를 처리한 실험군의 생균수는 6.6×1011 CFU/g, OFFO를 처리한 실험군의 생균수는 1.0×1012 CFU/g 이었다. 모든 실험군에서 이물과 대장균은 검출되지 않았다. 따라서, 대량생산된 균주에 SSF, SFY 또는 OFFO 동결건조 보호제를 적용하여 제품 제조시, 식품 소재의 기준 규격에 부합하는 것으로 확인되었다.
<
실험예
5> 저장 안정성 평가
<5-1> 가속저장실험 후
생균수
측정
먼저, 실시예 2의 동결건조 보호제 SSF, SFY 및 OFFO를 각각 처리한 점을 제외하고, 실험예 4와 동일한 방법으로 대량배양한 바이셀라 사이바리아 JW15 균주에 동결건조 보호제를 처리하고, 각 균주의 동결건조물을 수득하여 각각 50, 60 및 70℃의 수조에 각각 넣었다. 50℃ 조건에서는 3시간 간격으로 최대 12시간 지점까지 시료를 채취하고, 이를 배지에 도말하여 생균수를 측정하였다. 60℃ 조건에서는 0.5시간 간격으로 최대 2시간까지, 70℃ 조건에서는 0.05, 0.17, 0.25, 0.33 시간 지점에서 시료를 채취하고, 이를 배지에 도말하여 생균수를 측정하였다. 수조에 넣기 전의 집락수(log CFU/ml)를 N0, 수조에 넣어 해당 온도 처리 후의 집락수를 Na로 하여, 노출 온도별로 집락수 차이(Log N0 - Log Na)를 나타내었다.
그 결과, 동결건조 보호제를 처리한 실험군은 동결건조 보호제를 처리하지 않은 음성 대조군(NC)에 비하여 생균수가 오래 지속되는 것으로 나타났다. 특히, OFFO를 처리한 실험군은 동일 조건에서 균주의 생존율이 가장 높은 것으로 나타났다 (도 5).
<5-2> 가속저장실험 후
분해성
측정
실험예 5-1에서 얻은 결과는 저장 기간(t)에 따른 품질 특성의 변화량으로, 이를 키네틱 플롯(kinetic plot)으로 변형시켜 저장 유통시 분해성을 나타내는 지표인 반응속도 상수를 산출하였다.
반응속도 상수(k) = 1/t × (Log N0 - Log Na)
이후, 물질 변화에 대한 온도 의존성을 설명하는 아레니우스 방정식을 활용하여 각 온도별 유통기한을 산출하였다. 유통기한 산출 시, 각 온도별 국내 연간 유통일수(A), 규격 하한선(B), 연간 변화량(C)을 이용하였다. 온도별 국내 연간 유통일수는 10℃의 경우 152일(11월-3월), 15℃는 30일(4월), 20℃는 61일(5월, 10월), 25℃도 61일(6월, 9월), 30℃도 61일(7월, 8월)이고, 규격 하한선은 균수 Log 8 CFU/ml로 설정하였다. 연간 변화량은 각 온도별 국내 연간 예상일수와 각 반응속도 상수를 곱하여 산출하였다.
아레니우스 방정식 Log k = Log k0 - (Ea/R)(1/T)
유통기한 = [(A-B)/C] × 365
그 결과, 동결건조 보호제를 처리한 실험군은 동결건조 보호제를 처리하지 않은 음성 대조군(NC)에 비하여 낮은 k값을 나타냈다. 실온 상태에서의 유통기한을 산출한 결과, 동결건조 보호제를 처리하지 않은 음성 대조군은 157일, SSF는 107일, SFY 441일, OFFO 1276일로, OFFO를 처리한 경우 가장 오랜 기간 동안 보호 효과를 나타내는 것으로 확인되었다 (표 6 및 도 6).
| 온도 (℃) | 음성 대조군 | SSF 처리 | SFY 처리 | OFFO 처리 |
| 50 | 2.453 | 1.781 | 1.415 | 0.835 |
| 60 | 7.458 | 4.577 | 5.791 | 6.154 |
| 70 | 35.477 | 15.709 | 27.842 | 30.821 |
<5-3> 냉장 보관 후 저장 안정성 평가
먼저, 실시예 2의 동결건조 보호제 SSF, SFY 및 OFFO를 각각 처리한 점을 제외하고, 실험예 4와 동일한 방법으로 대량배양한 바이셀라 사이바리아 JW15 균주에 동결건조 보호제를 처리하고, 이를 은박 지퍼백에 밀봉하여 4℃ 냉장고에 9개월 동안 보관한 후, 이를 배지에 도말하여 생균수를 측정하였다.
그 결과, 동결건조 보호제를 처리한 실험군은 동결건조 보호제를 처리하지 않은 음성 대조군(NC)에 비하여 균수 감소율이 낮은 것으로 나타났다. 음성 대조군의 균수 감소율은 33%, SSF는 31%, SFY 18%, OFFO 15%로, SFY와 OFFO는 저온에서의 저장 안정성을 향상시킨 것으로 나타났다 (도 7).
Claims (11)
- 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당의 혼합물;을 포함하는 미생물 동결건조 보호용 조성물로서,
상기 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당은 1:0.5 내지 1:2의 비율로 혼합되고, 상기 미생물은 바이셀라(Weissella) 속 유산균인 것인, 미생물 동결건조 보호용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 유산균은 바이셀라 사이바리아(Weissella cibaria)인, 미생물 동결건조 보호용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 귀리 식이섬유 및 프락토올리고당의 혼합물은 동결건조된 미생물을 20 내지 30℃에서 1,100 내지 1,300일 동안 보존할 수 있는, 미생물 동결건조 보호용 조성물.
- 제1항의 조성물을 미생물과 혼합하여 동결건조하는 단계를 포함하는, 미생물 동결건조 보호 방법으로서,
상기 미생물은 바이셀라(Weissella) 속 유산균인 것인, 미생물 동결건조 보호 방법. - 삭제
- 삭제
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-
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Non-Patent Citations (2)
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| Innovative Food Science and Emerging Technologies 11 (2010) 415-421 |
| International Journal of Food Microbiology 112 (2006) 171-178 |
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| KR20200061786A (ko) | 2020-06-03 |
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