CN114656548A - 一种降血压肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种降血压肽及其制备方法和应用。本发明所述玉米来源的降血压肽的制备方法，包括以下步骤：S1、超声预处理玉米醇溶蛋白；S2、在异丙醇‑水体系中酶解预处理后的玉米醇溶蛋白，获得酶解产物；S3、分离纯化、冷冻干燥所述酶解产物获得降血压肽。本发明采用超声波结合双醇相条件酶解玉米醇溶蛋白，获得了含有更多疏水氨基酸含量的酶解物，临床降压试验表明，所述酶解物对ACE具有高抑制活性，降压效果优异，效果优于现有传统工艺制备的降压肽。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种降血压肽及其制备方法和应用。
背景技术
血管紧张素转换酶(Angiotensin I-Converting Enzyme,ACE)在肾-血管紧张素系统中对调节血压具有重要的生理功能，ACE可作用于底物血管紧张素，使血管收缩，血压升高，而通过抑制ACE的活性，阻止血管紧张素的生成和激肽降解的减少能够达到治疗高血压的作用。
Miyoshi等报道了玉米醇溶蛋白酶解得到的Leu-Pro-Pro具有良好的ACE抑制活性，效果与临床合成药物卡托普利相当。通常将玉米醇溶蛋白经酶解、超滤、分离纯化后能够获得具有降压功能的玉米肽，如在中国专利申请CN101798587A中，发明人以去掉玉米黄色素的玉米蛋白粉作为底物，采用碱性蛋白酶进行水解获得降血压肽粗品，然后经板框过滤、微孔膜过滤得到具有降压活性的水解产物；如在中国专利申请CN102453741A中，发明人采用一个连续化处理的酶膜反应系统，对玉米黄粉进行连续酶解，并筛选了特定分子量的水解产物，获得了具有较高ACE抑制活性的玉米降血压肽。但是目前，并未有针对如何获得含有高含量疏水氨基酸的玉米醇溶蛋白酶解产物方面的研究，同时，对疏水性氨基酸含量与ACE抑制活性之间的关系也未见相关研究报道。
发明内容
发明人在前期研究中发现，疏水氨基酸的含量越多的水解产物表现出更优异的ACE抑制活性，在此前提下，本发明提供了一种来源于玉米的降压肽的制备方法及其应用，用于解决传统工艺制备的玉米降压肽中疏水氨基酸含量低的技术问题，试验证明，通过本发明工艺获得的降压肽具备高ACE抑制活性，降压临床效果良好。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：一种玉米来源的降血压肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、超声预处理玉米醇溶蛋白；
S2、在异丙醇-水体系中酶解预处理后的玉米醇溶蛋白，获得酶解产物；
S3、分离纯化、冷冻干燥所述酶解产物获得降血压肽。
进一步地，所述步骤S1中：超声预处理过程中：超声频率为28～40kHz，超声功率为60～100W，超声时间为30～60min。超声预处理中的空化效应能够使玉米醇溶蛋白中的疏水氨基酸暴露在蛋白表面，在后期酶解时，容易被蛋白酶释放。但超声处理过程中的功率不适宜太高，超过限定的超声功率范围容易使得蛋白质中的氨基酸被破坏，而同时控制超声处理在额定的超声频率范围内，可以取得更好的预处理效果。
进一步地，步骤S2中，所述异丙醇-水体系中，异丙醇的体积分数为50～70％(v/v)。
进一步地，步骤S2中，体系中还含有低浓度的乙醇。发明人在试验过程中惊人地发现，基于相同的水解度的前提下，与以水为溶剂酶解相比，在异丙醇-乙醇-水体系下酶解获得酶解产物中游离性疏水性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、色氨酸和脯氨酸等)含量有明显增加，而通过进一步的降压临床试验表明，这种含有更多的疏水性氨基酸含量的酶解产物具有相对更优异的降压效果。与其他醇类相比，在50～70％异丙醇-10～20％乙醇-水体系酶解获得的酶解产物中疏水氨基酸含量最高。
进一步地，体系中所述乙醇的体积分数为10～20％(v/v)。体系中乙醇溶液浓度不能过高，因为玉米醇溶蛋白在高体积分数的乙醇溶液中较多地以球状颗粒结构存在，且颗粒之间存在聚集的趋向，而这种状态不利于酶与蛋白质的充分接触。
进一步地，所述酶解过程中采用的酶为胃蛋白酶。相比碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶等，胃蛋白酶对醇类具有较好的耐受性，且胃蛋白酶能够优选切断由亮氨酸、色氨酸等疏水氨基酸形成的肽键，且结合超声波处理能够使胃蛋白酶更容易接触到酶切位点。
进一步地，所述酶解过程中：底物浓度为1～5w/v％，优选为为1w/v％、1.5w/v％、2w/v％、2.5w/v％、3w/v％、3.5w/v％、4w/v％和5w/v％；更优选为1.5w/v％、3w/v％和5w/v％。
进一步地，所述酶解过程中：pH为8.0～10.0，pH优选为8.0、8.5和9.0。
进一步地，所述酶解过程中：酶解温度为45～55℃，更进一步地，酶解温度优选为45℃、50℃或52℃。
进一步地，所述酶解过程中：加酶量为1～5w/v％，优选为1w/v％、1.5w/v％、2w/v％、2.5w/v％、3w/v％、3.5w/v％、4w/v％和5w/v％。
进一步地，所述酶解过程中：酶解时间为1～3h，优选为1h、1.5h、2h、2.5h或3h。
进一步地，所述分离纯化具体操作为：使用截留分子量为5000Da的超滤膜过滤，获得分子量＜5000Da的酶解产物；试验发现，分子量超过5000Da的水解产物对ACE抑制活性较低，故选择分子量＜5000Da的，具备最强的抑制ACE活性，降压效果最好。
本发明另一目的在于提供一种所述的制备方法制备得到的降血压肽。
本发明另一目的在于提供所述的制备方法制备得到的降血压肽在制备降血压药物中的用途。所述降压肽在所述降压药物中可作为唯一的治疗成分存在，也可以与现有常规降压药联合使用。
本发明具有以下有益效果：
本发明采用超声波结合双醇相条件酶解玉米醇溶蛋白，获得了含有更多疏水氨基酸含量的酶解物，临床降压试验表明，所述酶解物对ACE具有高抑制活性，降压效果优异，效果优于现有传统工艺制备的降压肽。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
试验例一、不同溶剂体系对酶解产物抑制ACE活性的影响
1试验方法
1.1玉米醇溶蛋白酶解产物制备：
1.1.1超声波预处理：按1:100的比例往玉米醇溶蛋白中加入去离子水，密封后置于26℃的超声池中，控制超声频率为28kHz，超声功率为60W，超声波处理50min。
1.1.2酶解：取经超声处理后的玉米醇溶蛋白于一系列三角瓶中，分别加入不同组成的醇-水溶液，于55℃下震荡使其溶解后，加入胃蛋白酶进行酶解，酶解条件：底物质量浓度3w/v％，pH为8.5，加酶量1.5w/v％，酶解温度45℃，定时记录碱液消耗量，计算DH值，酶解结束后于85℃水浴中灭酶5min，冷却后，离心，上清液使用截留分子量为5000Da的超滤膜过滤，浓缩，冷冻干燥，获得分子量＜5000Da的一系列酶解度为23％左右的酶解产物，各酶解产物稀释10倍后用于测定其ACE抑制活性。水解度测定采用pH-stat法，水解度(DH)计算公式如式1。
式中，B：NaOH的消耗量，mL；h：单位质量蛋白质被水解的肽键量，mmol/g；Nb：NaOH浓度，mmol/mL；Mp：被水解蛋白的质量，g；α：α-NH2在蛋白质中的平均解离度，试验条件下维0.985；htot：单位质量蛋白质中肽键的重量，mmol/g，对于玉米醇溶蛋白，取经验值htot为7.35mmol/g。
1.2氨基酸种类及组成分析：采用高效液相色谱仪和氨基酸分析柱对各酶解产物的氨基酸组成和含量进行分析，结果如表2所示。
1.3ACE抑制活性测定：采用FAPGG作为ACE的底物，按下表1添加各反应组分，在波长为340nm下用酶标仪测定各酶解产物的ACE抑制率。设空白孔的初始吸光度为X1，样品孔的初始吸光度为Y1，在37℃下反应30min后，再次测定波长为340nm下的吸光度，反应后空白孔的吸光度为X2，样品孔的吸光度为Y2，每个样品平行测定5组，抑制率计算公式如下式2所示：
式中，ΔA空白＝X1-X2；ΔA样品＝Y1-Y2。
表1：
注：FAPGG:取3.994gFAPGG加基质缓冲液定容至10ml，溶解混合，于4℃下避光静置；基质缓冲液：取HEPES1.91g，NaCl1.755g，双蒸馏水溶解后，用NaOH调节pH值为8.3，补充双蒸馏水至100ml，即得。
2结果与分析
2.1不同酶解体系对酶解产物氨基酸组成及含量的影响
表2：
注：疏水氨基酸为：色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸和蛋氨酸。
由上表2可看出，与在单醇相中制备的酶解产物相比，在双醇相中制备的酶解产物的疏水性氨基酸含量明显增多，而在60v/v％异丙醇-10v/v％乙醇-水体系获得的水解产物中疏水性氨基酸最高，与60v/v％异丙醇-水相酶解产物相比提高了45.58％。
表3：ACE活性抑制率
结合表2和表3分析可知，疏水氨基酸含量与ACE抑制率存在正相关的关系，疏水氨基酸含量越高的酶解产物表现出更高的ACE抑制活性。
实施例1、玉米降压肽制备
S1、超声预处理玉米醇溶蛋白：按1:100的比例往玉米醇溶蛋白中加入去离子水，密封后置于26℃的超声池中，控制超声频率为28kHz，超声功率为60W，超声时间为50min；
S2、在异丙醇-水体系中酶解预处理后的玉米醇溶蛋白，获得酶解产物：取经超声处理后的玉米醇溶蛋白，加入60v/v％异丙醇-10v/v％乙醇-水体系中，于55℃下震荡使其溶解后，加入胃蛋白酶进行酶解，酶解条件：底物质量浓度3w/v％，pH为8.5，加酶量1.5w/v％，酶解温度45℃，酶解1.5h；
S3、分离纯化、冷冻干燥所述酶解产物获得降血压肽：酶解结束于85℃水浴中灭酶5min，冷却后，离心，上清液使用截留分子量为5000Da的超滤膜过滤，获得分子量＜5000Da的酶解产物，浓缩，冷冻干燥即得。
实施例2、玉米降压肽制备
S1、超声预处理玉米醇溶蛋白：按1:120的比例往玉米醇溶蛋白中加入去离子水，密封后置于26℃的超声池中，控制超声频率为40kHz，超声功率为60W，超声时间为30min；
S2、在异丙醇-水体系中酶解预处理后的玉米醇溶蛋白，获得酶解产物：取经超声处理后的玉米醇溶蛋白，加入50v/v％异丙醇-12v/v％乙醇-水体系中，于55℃下震荡使其溶解后，加入胃蛋白酶进行酶解，酶解条件：底物质量浓度1.5w/v％，pH为8.0，加酶量2w/v％，酶解温度50℃，酶解2h；
S3、分离纯化、冷冻干燥所述酶解产物获得降血压肽：酶解结束于85℃水浴中灭酶5min，冷却后，离心，上清液使用截留分子量为5000Da的超滤膜过滤，获得分子量＜5000Da的酶解产物，浓缩，冷冻干燥即得。
实施例3、玉米降压肽制备
S1、超声预处理玉米醇溶蛋白：按1:150的比例往玉米醇溶蛋白中加入去离子水，密封后置于26℃的超声池中，控制超声频率为32kHz，超声功率为80W，超声时间为45min；
S2、在异丙醇-水体系中酶解预处理后的玉米醇溶蛋白，获得酶解产物：取经超声处理后的玉米醇溶蛋白，加入70v/v％异丙醇-10v/v％乙醇-水体系中，于55℃下震荡使其溶解后，加入胃蛋白酶进行酶解，酶解条件：底物质量浓度5％w/v，pH为9.0，加酶量1％w/v，酶解温度52℃，酶解3h；
S3、分离纯化、冷冻干燥所述酶解产物获得降血压肽：酶解结束于85℃水浴中灭酶5min，冷却后，离心，上清液使用截留分子量为5000Da的超滤膜过滤，获得分子量＜5000Da的酶解产物，浓缩，冷冻干燥即得。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种玉米来源的降血压肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、超声预处理玉米醇溶蛋白；
S2、在异丙醇-水体系中酶解预处理后的玉米醇溶蛋白，获得酶解产物；
S3、分离纯化、冷冻干燥所述酶解产物获得降血压肽。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中：超声预处理过程中：超声频率为28～40kHz，超声功率为60～100W，超声时间为30～60min。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述异丙醇-水体系中，异丙醇的体积分数为50～70％。
4.如权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，体系中还含有低浓度的乙醇。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，体系中所述乙醇的体积分数为10～20％。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解过程中采用的酶为胃蛋白酶。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酶解过程中：底物浓度为1～5w/v％，pH为8.0～10.0，酶解温度为45～55℃，加酶量为1～5w/v％，酶解时间为1～3h。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化具体操作为：使用截留分子量为5000Da的超滤膜过滤，获得分子量＜5000Da的酶解产物。
9.如权利要求1～8任一所述的制备方法制备得到的降血压肽。
10.如权利要求1～8任一所述的制备方法制备得到的降血压肽在制备降血压药物中的用途。
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