CN115737537A - 一种靶向缓释益生菌的载体水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种靶向缓释益生菌的载体水凝胶及其制备方法和应用，所述载体水凝胶为巯基化修饰的透明质酸和海藻酸钠的交联物。本发明具有的优点是通过让其负载乳酸菌，形成具有定向性释放益生菌的水凝胶，当水凝胶到达肠道感染部位时，沙门氏菌产生的H2S能够还原多糖水凝胶分子中的二硫键使之发生解聚，释放出来的益生菌能够靶向聚集在病灶部位，提高了患处局部益菌群的丰度，增强了生物拮抗作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，尤其涉及一种靶向缓释益生菌的载体水凝胶的制备及其应用。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella)是一种食源性感染最常见的致病菌，其造成的沙门氏菌病是典型的人兽共患病(伤寒或副伤寒)。被沙门氏菌污染的食品，可使人和动物发生食物中毒。沙门氏菌能够长期在宿主的肠道上皮细胞和巨噬细胞中生存，是典型的胞内寄生菌，它可以持续排毒，并呈现隐形感染。沙门氏菌可以对宿主的肠粘膜、上皮细胞造成直接的破坏作用，形成肠道溃疡、出血和坏死等一系列症状，逃逸的病原菌还可以寄生在免疫细胞当中，随着血液和淋巴循环到达其它脏器，继而引发全身的系统感染，如果未得到及时有效的治疗，很容易形成毒血症，造成宿主的死亡。据卫生部门不完全统计，全球每年因感染沙门氏菌导致死亡的人数高达上百万，为此引起的公共卫生安全问题，向预防和治疗都提出了严峻的挑战。沙门氏菌在生长过程中，通过代谢能够产生硫化氢(H2S)分子，硫化氢可以改变细胞内部的稳态，破坏肠道上皮细胞的免疫屏障作用，有助于细菌逃逸，造成感染的蔓延。
肠道益生菌(乳杆菌类、双歧杆菌类等)是一类对宿主有益的活性微生物，它们可以促进机体肠道新陈代谢，抵抗病原菌感染以及增强宿主免疫能力。益生菌可以通过形成菌膜屏障或者促进肠道上皮细胞增殖分化等方式形成有效的保护层，并在肠道病原菌感染和威胁期间起到维持和促进免疫稳态中起积极作用。乳酸菌是人体肠道内主要的益生菌，具有很多重要的生理功能，它们自身及其代谢产物具有较强的抑菌作用。乳酸菌拮抗多种病原微生物生长的主要机制是通过生态位竞争、酸性环境和拮抗代谢产物等方式。乳酸菌可以通过表层蛋白粘附于宿主肠道细胞表面，以其特殊的生态位率先利用营养物质，占据生长优势地位抑制其它微生物的生长；其次乳酸菌可在肠道内发酵大量乳酸、乙酸等酸性物质形成局部酸环境以及分泌一些抗菌物质(乳酸菌素、环二肽、双乙酰)限制了大多有害微生物的生长繁殖。所以，采用益生菌制剂治疗肠道感染是目前国内外亟待解决的问题。
水凝胶既具有一定流体性质又具有良好的粘弹性和生物相容性，其中的高分子链在特定条件下相互交联形成三维网络结构，在溶剂内溶胀而不溶解，可作为药物、营养物质、组织细胞等的包埋载体，透明质酸和海藻酸钠作为单网络凝胶应用时，存在力学性能及稳定性差的缺点，不利于益生菌的包埋，导致益生菌包埋率低，对益生菌的保护力度小。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种益生菌缓释载体水凝胶的制备及其应用，采用化学方法将修饰的透明质酸和海藻酸钠交联形成含有二硫键的水凝胶，负载益生菌(乳酸菌或双歧杆菌)用来治疗沙门氏菌肠道感染。该多糖水凝胶能够定点响应病原菌产生的硫化氢分子，集中释放益生菌。
本发明是通过以下技术方案实现的：提供一种益生菌缓释载体水凝胶，所述载体水凝胶为巯基化修饰的透明质酸和海藻酸钠的交联物。
通过上述技术方案，沙门氏菌的生长过程中，通过代谢能够产生硫化氢(H2S)分子，硫化氢能够改变细胞内部的稳态，破坏肠道上皮细胞的免疫屏障作用，有助于细菌逃逸，造成感染的蔓延。本发明针对沙门氏菌肠道感染的治疗，通过缓释载体水凝胶负载益生菌，形成具有定向性释放益生菌的水凝胶；该水凝胶经口服进入消化道后，其能够保护益生菌免受胃酸和小肠中胆汁酸等消化液的影响。当水凝胶到达肠道感染部位时，基于沙门氏菌产生的硫化氢(H2S)分子能够还原缓释载体水凝胶中的二硫键使之发生解聚，释放出的益生菌能够靶向聚集在病灶部位，提高患处局部益菌群的丰度，增强了生物拮抗作用。
其中，采用巯基化修饰的透明质酸是经酰胺化反应，用半胱氨酸上的氨基修饰透明质酸的羧酸基团；巯基化修饰的海藻酸钠是经酰胺化反应，用半胱胺上的氨基修饰海藻酸钠的羧酸基团；在碱性环境下，巯基能够氧化生成二硫键，使巯基化的透明质酸和海藻酸钠发生交联形成载体水凝胶。
进一步地，所述透明质酸和海藻酸钠的交联物具有如下分子式：
其中，所述M、N为＞0的整数。
进一步地，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌和枯草芽孢杆菌等其中的一种或多种。
提供了一种制备上述的益生菌缓释载体水凝胶的方法，包括以下步骤：
S1、采用半胱氨酸对透明质酸进行巯基化修饰；
对透明质酸溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)、半胱氨酸(Cys)进行酰胺反应，经透析、冷冻干燥得到透明质酸和半胱氨酸的多糖复合物(HA-Cys)；
S2、采用半胱胺对海藻酸钠进行巯基化修饰；
对海藻酸钠溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)、半胱胺(Cym)进行酰胺反应，经透析、冷冻干燥得到海藻酸钠和半胱胺的多糖复合物(ALG-Cym)；
S3、将步骤S1所得多糖复合物(HA-Cys)和步骤S2所得多糖复合物(ALG-Cym)混合后进行交联反应，得到所述载体水凝胶(HA-S-S-ALG)。
具体地，在步骤S1中，所述透明质酸和半胱氨酸的多糖复合物(HA-Cys)的合成路径如下：
首先，0.25 -1g的透明质酸(HA，200kDa)用100mL的去离子水溶解在圆底烧瓶中，加入1-1.2g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.5-0.7g N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)磁力搅拌半个小时后，加入2.5-5g的半胱氨酸(Cys)，反应24h后终止；
然后，将反应混合溶液装入3500Da的透析袋中，用0.1M的氯化钠透析24h后换去离子水透析48h，去除未反应的底物；
最后，将所述透析产物经冷冻冻干，即得到透明质酸和半胱氨酸的多糖复合物HA-Cys。
具体地，在步骤S2中，海藻酸钠和半胱胺的多糖复合物(ALG-Cym)的合成路径如下：
首先，将0.25-1g的海藻酸钠(ALG，500kDa)用100mL的去离子水溶解在圆底烧瓶中，加入0.5-1g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.2-0.5g N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)磁力搅拌半个小时后，加入2-3g的半胱胺(Cym)，反应24h后终止；
然后，将反应混合溶液装入3500Da的透析袋中，用0.1M的氯化钠透析24h后换去离子水透析48h，冻干，得到海藻酸钠和半胱胺的多糖复合物ALG-Cym。
具体地，在步骤S3中，在碱性条件下，将HA-Cys与ALG-Cym按照体积比为2～1:1～2混合，得到所述载体水凝胶HA-S-S-ALG。
提供了一种上述的益生菌缓释载体水凝胶应用于响应沙门氏菌产生的硫化氢分子，采用还原剂二硫苏糖醇(DTT)模拟硫化氢气体分子，并将所述载体水凝胶HA-S-S-ALG置于PBS缓冲溶液中对其响应，使得载体水凝胶HA-S-S-ALG靶向裂解释放益生菌进而治疗沙门氏菌感染。
进一步地，所述PBS缓冲溶液pH值为7.5-8.5。
最后，提供了上述的益生菌缓释载体水凝胶或上述制备方法得到的载体水凝胶在食品、保健品中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明利用益生菌的生物拮抗作用来治疗肠道感染是有效替代抗生素使用的必要手段。直接口服益生菌不但容易被各种消化液所灭活，而且益生菌在肠道经过自身弥散作用，降低了抵达病灶处的有效数量，难以发挥高效的生物治疗作用。本发明采用化学方法将修饰的透明质酸和海藻酸钠交联形成含有二硫键的水凝胶，负载益生菌(乳酸菌)用来治疗沙门氏菌肠道感染，该多糖水凝胶能够定点响应病原菌产生的硫化氢分子，集中释放益生菌。
附图说明
图1为本发明透明质酸-半胱氨酸(HA-Cys)和海藻酸钠-半胱胺(ALG-Cym)的核磁图谱；
图2为本发明多糖水凝胶HA-S-S-ALG在不同浓度DTT下的降解曲线；
图3为本发明多糖水凝胶HA-S-S-ALG中鼠李糖乳杆菌在不同介质中的释放曲线；
图4为本发明多糖水凝胶HA-S-S-ALG在模拟胃液(A)和肠液(B)环境中对鼠李糖乳杆菌的保护作用。
图5为本发明多糖水凝胶HA-S-S-ALG合成路线图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”，此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书，如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面将结合发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的益生菌缓释载体水凝胶，上述载体水凝胶为巯基化修饰的透明质酸和海藻酸钠的交联物；所述透明质酸和海藻酸钠的交联物具有如下分子式：
其中，所述M、N为＞0的整数。
其中，巯基化修饰的透明质酸是经酰胺化反应，用半胱氨酸上的氨基修饰透明质酸的羧酸基团；巯基化修饰的海藻酸钠是经酰胺化反应，用半胱胺上的氨基修饰海藻酸钠的羧酸基团；在碱性环境下，巯基可以氧化生成二硫键，使巯基化的透明质酸和海藻酸钠发生交联形成水凝胶；具体地反应方程式和合成路线如图5所示。
沙门氏菌的生长过程中，通过代谢能够产生硫化氢(H2S)分子，硫化氢能够改变细胞内部的稳态，破坏肠道上皮细胞的免疫屏障作用，有助于细菌逃逸，造成感染的蔓延。本发明针对沙门氏菌肠道感染的治疗，通过益生菌缓释载体水凝胶负载益生菌，形成具有定向性释放益生菌的水凝胶；该水凝胶经口服进入消化道后，其能够保护益生菌免受胃酸和小肠中胆汁酸等消化液的影响。当水凝胶到达肠道感染部位时，基于沙门氏菌产生的硫化氢(H2S)分子能够还原益生菌缓释载体水凝胶中的二硫键使之发生解聚，释放出的益生菌能够靶向聚集在病灶部位，提高患处局部益菌群的丰度，增强了生物拮抗作用。
根据本发明的一个方面，提供了一种益生菌缓释载体水凝胶，所述缓释载体水凝胶负载有治疗沙门氏菌肠道感染的益生菌，且所述缓释载体水凝胶具有用于响应H2S的二硫键；所述二硫键是由巯基化修饰的透明质酸和海藻酸钠共价交联所得；所述益生菌为鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌和枯草芽孢杆菌等其中的一种或多种。
其中透明质酸优选为透明质酸钠盐或钾盐、玻璃酸钠盐或钾盐、玻尿酸钠盐或钾盐；海藻酸钠优选为海藻酸钠盐或钾盐、藻朊酸钠盐或钾盐、藻蛋白酸钠盐或钾盐。
本发明提供的益生菌缓释载体水凝胶综合了各原料众多优良功能和生物活性，不仅不会导致自身的免疫排斥反应，而且负载益生菌的同时克服了单独水凝胶的生物惰性性质，提高益生菌的定植率和存活率，延长存活时间，提高缓释载体水凝胶对益生菌在经过胃肠道时的保护强度。
根据本发明的第二个方面，还提供了制备上述的益生菌缓释载体水凝胶的方法，包括以下步骤：
S1、采用半胱氨酸对透明质酸进行巯基化修饰；
对透明质酸溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)、半胱氨酸(Cys)进行酰胺反应，经透析、冷冻干燥得到透明质酸和半胱氨酸的多糖复合物(HA-Cys)；
S2、采用半胱胺对海藻酸钠进行巯基化修饰；
对海藻酸钠溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)、半胱胺(Cym)进行酰胺反应，经透析、冷冻干燥得到海藻酸钠和半胱胺的多糖复合物(ALG-Cym)；
S3、将步骤S1所得多糖复合物(HA-Cys)和步骤S2所得多糖复合物(ALG-Cym)混合后进行交联反应，得到所述载体水凝胶(HA-S-S-ALG)。该制备方法工艺简单，操作方便，适于大规模生产应用。
需要说明的是，本实施方式中对S1和S2的顺序关系不做限定，即可以先做S1再做S2，或者先做S2再做S1，或者S1和S2同时进行。
本发明所述HA-Cys溶液和所述ALG-Cym溶液体积比为2～1:1～2；
具体地，在步骤S1中，所述透明质酸和半胱氨酸的多糖复合物(HA-Cys)的合成路径如下：
首先，0.25 -1g的透明质酸(HA，200kDa)用100mL的去离子水溶解在圆底烧瓶中，加入1-1.2g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.5-0.7g N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)磁力搅拌半个小时后，加入2.5-5g的半胱氨酸(Cys)，反应24h后终止；
然后，将反应混合溶液装入3500Da的透析袋中，用0.1M的氯化钠透析24h后换去离子水透析48h，去除未反应的底物；
最后，将所述透析产物经冷冻冻干，即得到透明质酸和半胱氨酸的多糖复合物HA-Cys。
具体地，在步骤S2中，海藻酸钠和半胱胺的多糖复合物(ALG-Cym)的合成路径如下：
首先，将0.25-1g的海藻酸钠(ALG，500kDa)用100mL的去离子水溶解在圆底烧瓶中，加入0.5-1g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.2-0.5g N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)磁力搅拌半个小时后，加入2-3g的半胱胺(Cym)，反应24h后终止；
然后，将反应混合溶液装入3500Da的透析袋中，用0.1M的氯化钠透析24h后换去离子水透析48h，冻干，得到海藻酸钠和半胱胺的多糖复合物ALG-Cym。
具体地，在步骤S3中，在碱性条件下，将HA-Cys与ALG-Cym按照体积比为2～1:1～2混合，得到所述载体水凝胶HA-S-S-ALG。
根据本发明的第三个方面，提供了上述的益生菌缓释载体水凝胶应用于响应沙门氏菌产生的硫化氢分子，采用还原剂二硫苏糖醇(DTT)模拟硫化氢气体分子，并将所述载体水凝胶HA-S-S-ALG置于PBS缓冲溶液中对其响应，使得载体水凝胶HA-S-S-ALG靶向裂解释放益生菌进而治疗沙门氏菌感染。
进一步地，所述PBS缓冲溶液pH值为7.5-8.5。
最后，提供了上述的益生菌缓释载体水凝胶或上述制备方法得到的载体水凝胶在食品、保健品中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明对所有原料的来源没有特殊的限制，均为市售即可；优选地，所有原料纯度≥98％。
实施例1
本实施例提供了一种益生菌缓释载体水凝胶，载体水凝胶为巯基化修饰的透明质酸和海藻酸钠的交联物。
其中透明质酸优选为透明质酸钠盐或钾盐、玻璃酸钠盐或钾盐、玻尿酸钠盐或钾盐；海藻酸钠优选为海藻酸钠盐或钾盐、藻朊酸钠盐或钾盐、藻蛋白酸钠盐或钾盐。
一种制备上述的益生菌缓释载体水凝胶的方法，包括以下步骤：
S1、采用半胱氨酸对透明质酸钠盐进行巯基化修饰；
对透明质酸钠盐溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)、半胱氨酸(Cys)进行酰胺反应，经透析、冷冻干燥得到透明质酸和半胱氨酸的多糖复合物(HA-Cys)；
具体地，取用0.5g的透明质酸(HA，200kDa)用100mL的去离子水溶解在圆底烧瓶中，加入0.96g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.68g N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)磁力搅拌半个小时后，加入3.0g的半胱氨酸(Cys)，反应24h后终止；将反应混合溶液装入3500Da的透析袋中，用0.1M的氯化钠透析24h后换去离子水透析48h，去除未反应的底物。透析产物经冷冻冻干，即得到透明质酸和半胱氨酸的多糖复合物HA-Cys(见图1)。
S2、采用半胱胺对海藻酸钠进行巯基化修饰；
对海藻酸钠溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)、半胱胺(Cym)进行酰胺反应，经透析、冷冻干燥得到海藻酸钠和半胱胺的多糖复合物(ALG-Cym)；
具体地，0.5g的海藻酸钠(ALG，500kDa)用100mL的去离子水溶解在圆底烧瓶中，加入0.49g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.29g N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)磁力搅拌半个小时后，加入2.22g的半胱胺(Cym)，反应24h后终止；将反应混合溶液装入3500Da的透析袋中，用0.1M的氯化钠透析24h后换去离子水透析48h，冻干，得到海藻酸钠和半胱胺的多糖复合物ALG-Cym(见图1)。
S3、将步骤S1所得多糖复合物(HA-Cys)和步骤S2所得多糖复合物(ALG-Cym)混合后进行交联反应，得到所述载体水凝胶(HA-S-S-ALG)。
具体地，在pH＝8.0的碱性环境中，取10mg/mL的HA-Cys与20mg/mL的ALG-Cym按照体积比2:1/1:1/1:2进行混合，得到缓释载体水凝胶HA-S-S-ALG。
上述的益生菌缓释载体水凝胶应用于响应沙门氏菌产生的硫化氢分子，即益生菌缓释载体水凝胶对外源性硫化氢的响应：取1mL的多糖水凝胶HA-S-S-ALG置于PBS缓冲溶液当中，加入5mM或10mM的DTT，在37℃的条件下培养一定时间，称取溶液中剩余水凝胶的质量，来评价对硫化氢的响应性。
上述的益生菌缓释载体水凝胶对封装乳酸菌释放性实验：将108CFU的鼠李糖乳杆菌包封到2mL的多糖水凝胶HA-S-S-ALG中，加入5mM或10mM的DTT，在37℃的条件下孵育一定时间，通过菌落计数的方法来评价水凝胶对益生菌的释放情况。
人工胃液(SGF)和肠液(SIF)中益生菌缓释载体水凝胶对乳酸菌的保护作用实验：将鼠李糖乳杆菌浓度调至108CFU/mL，吸取3mL菌液分别加入到10mL的PBS、SGF和SIF溶液中；取封装相同菌落数的多糖水凝胶HA-S-S-ALG，也分别置于PBS、SGF和SIF溶液中，在37℃条件下厌氧孵育4h，孵育结束后，平板计数活菌数量；评价缓释载体水凝胶对益生菌的保护效果。
实施例2
本实施例提供了一种益生菌缓释载体水凝胶，载体水凝胶为巯基化修饰的透明质酸和海藻酸钠的交联物。
其中透明质酸优选为透明质酸钠盐或钾盐、玻璃酸钠盐或钾盐、玻尿酸钠盐或钾盐；海藻酸钠优选为海藻酸钠盐或钾盐、藻朊酸钠盐或钾盐、藻蛋白酸钠盐或钾盐。
一种制备上述的益生菌缓释载体水凝胶的方法，包括以下步骤：
S1、采用半胱氨酸对透明质酸钠盐进行巯基化修饰；
对透明质酸钠盐溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)、半胱氨酸(Cys)进行酰胺反应，经透析、冷冻干燥得到透明质酸和半胱氨酸的多糖复合物(HA-Cys)；
具体地，取用0.8g的透明质酸(HA，200kDa)用100mL的去离子水溶解在圆底烧瓶中，加入0.96g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.68g N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)磁力搅拌半个小时后，加入4.8g的半胱氨酸(Cys)，反应24h后终止；将反应混合溶液装入3500Da的透析袋中，用0.1M的氯化钠透析24h后换去离子水透析48h，去除未反应的底物。透析产物经冷冻冻干，即得到透明质酸和半胱氨酸的多糖复合物HA-Cys(见图1)。
S2、采用半胱胺对海藻酸钠进行巯基化修饰；
对海藻酸钠溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)、半胱胺(Cym)进行酰胺反应，经透析、冷冻干燥得到海藻酸钠和半胱胺的多糖复合物(ALG-Cym)；
具体地，0.8g的海藻酸钠(ALG，500kDa)用100mL的去离子水溶解在圆底烧瓶中，加入0.49g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.29g N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)磁力搅拌半个小时后，加入3.55g的半胱胺(Cym)，反应24h后终止；将反应混合溶液装入3500Da的透析袋中，用0.1M的氯化钠透析24h后换去离子水透析48h，冻干，得到海藻酸钠和半胱胺的多糖复合物ALG-Cym(见图1)。
S3、将步骤S1所得多糖复合物(HA-Cys)和步骤S2所得多糖复合物(ALG-Cym)混合后进行交联反应，得到所述载体水凝胶(HA-S-S-ALG)。
具体地，在pH＝8.0的碱性环境中，取10mg/mL的HA-Cys与20mg/mL的ALG-Cym按照体积比2:1/1:1/1:2进行混合，得到缓释载体水凝胶HA-S-S-ALG。
上述的益生菌缓释载体水凝胶应用于响应沙门氏菌产生的硫化氢分子，即益生菌缓释载体水凝胶对外源性硫化氢的响应：取1mL的多糖水凝胶HA-S-S-ALG置于PBS缓冲溶液当中，加入5mM或10mM的DTT，在37℃的条件下培养一定时间，称取溶液中剩余水凝胶的质量，来评价对硫化氢的响应性。
上述的益生菌缓释载体水凝胶对封装乳酸菌释放性实验：将108CFU的鼠李糖乳杆菌包封到2mL的多糖水凝胶HA-S-S-ALG中，加入5mM或10mM的DTT，在37℃的条件下孵育一定时间，通过菌落计数的方法来评价水凝胶对益生菌的释放情况。
人工胃液(SGF)和肠液(SIF)中益生菌缓释载体水凝胶对乳酸菌的保护作用实验：将鼠李糖乳杆菌浓度调至108CFU/mL，吸取3mL菌液分别加入到10mL的PBS、SGF和SIF溶液中；取封装相同菌落数的多糖水凝胶HA-S-S-ALG，也分别置于PBS、SGF和SIF溶液中，在37℃条件下厌氧孵育4h，孵育结束后，平板计数活菌数量；评价缓释载体水凝胶对益生菌的保护效果。
实施例3
本实施例提供了一种益生菌缓释载体水凝胶，载体水凝胶为巯基化修饰的透明质酸和海藻酸钠的交联物。
其中透明质酸优选为透明质酸钠盐或钾盐、玻璃酸钠盐或钾盐、玻尿酸钠盐或钾盐；海藻酸钠优选为海藻酸钠盐或钾盐、藻朊酸钠盐或钾盐、藻蛋白酸钠盐或钾盐。
一种制备上述的益生菌缓释载体水凝胶的方法，包括以下步骤：
S1、采用半胱氨酸对透明质酸钠盐进行巯基化修饰；
对透明质酸钠盐溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)、半胱氨酸(Cys)进行酰胺反应，经透析、冷冻干燥得到透明质酸和半胱氨酸的多糖复合物(HA-Cys)；
具体地，取用0.3g的透明质酸(HA，200kDa)用100mL的去离子水溶解在圆底烧瓶中，加入0.96g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.68g N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)磁力搅拌半个小时后，加入1.8g的半胱氨酸(Cys)，反应24h后终止；将反应混合溶液装入3500Da的透析袋中，用0.1M的氯化钠透析24h后换去离子水透析48h，去除未反应的底物。透析产物经冷冻冻干，即得到透明质酸和半胱氨酸的多糖复合物HA-Cys(见图1)。
S2、采用半胱胺对海藻酸钠进行巯基化修饰；
对海藻酸钠溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)、半胱胺(Cym)进行酰胺反应，经透析、冷冻干燥得到海藻酸钠和半胱胺的多糖复合物(ALG-Cym)；
具体地，0.3g的海藻酸钠(ALG，500kDa)用100mL的去离子水溶解在圆底烧瓶中，加入0.49g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.29g N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)磁力搅拌半个小时后，加入1.33g的半胱胺(Cym)，反应24h后终止；将反应混合溶液装入3500Da的透析袋中，用0.1M的氯化钠透析24h后换去离子水透析48h，冻干，得到海藻酸钠和半胱胺的多糖复合物ALG-Cym(见图1)。
S3、将步骤S1所得多糖复合物(HA-Cys)和步骤S2所得多糖复合物(ALG-Cym)混合后进行交联反应，得到所述载体水凝胶(HA-S-S-ALG)。
具体地，在pH＝8.0的碱性环境中，取10mg/mL的HA-Cys与20mg/mL的ALG-Cym按照体积比2:1/1:1/1:2进行混合，得到缓释载体水凝胶HA-S-S-ALG。
上述的益生菌缓释载体水凝胶应用于响应沙门氏菌产生的硫化氢分子，即益生菌缓释载体水凝胶对外源性硫化氢的响应：取1mL的多糖水凝胶HA-S-S-ALG置于PBS缓冲溶液当中，加入5mM或10mM的DTT，在37℃的条件下培养一定时间，称取溶液中剩余水凝胶的质量，来评价对硫化氢的响应性。
上述的益生菌缓释载体水凝胶对封装乳酸菌释放性实验：将108CFU的鼠李糖乳杆菌包封到2mL的多糖水凝胶HA-S-S-ALG中，加入5mM或10mM的DTT，在37℃的条件下孵育一定时间，通过菌落计数的方法来评价水凝胶对益生菌的释放情况。
人工胃液(SGF)和肠液(SIF)中益生菌缓释载体水凝胶对乳酸菌的保护作用实验：将鼠李糖乳杆菌浓度调至108CFU/mL，吸取3mL菌液分别加入到10mL的PBS、SGF和SIF溶液中；取封装相同菌落数的多糖水凝胶HA-S-S-ALG，也分别置于PBS、SGF和SIF溶液中，在37℃条件下厌氧孵育4h，孵育结束后，平板计数活菌数量；评价缓释载体水凝胶对益生菌的保护效果。
效果实施例1
针对实施例1的益生菌缓释载体水凝胶对外源性硫化氢的响应：
取W0＝0.5g的多糖水凝胶HA-S-S-ALG分别放置于10mL的空白PBS缓冲溶液中中(pH＝7.2)，加入5mM和10mM DTT的PBS实验组中。将上述三个样品放在37℃的培养箱中培养100min，每隔10min称取溶液中剩余水凝胶的质量Wt，通过Wt/W0×100％来评价对硫化氢的响应性。
我们通过不同浓度的DTT作为还原剂对其降解行为进行考察，具体如下表1：
表1.不同浓度的还原剂对水凝胶质量影响情况
结果如表1和图2所示：随着DTT浓度的增加，多糖水凝胶裂解速度增快，表明其能够在还原剂的作用下发生解聚，具有响应性能力。
综上所述，根据实施例1-3我们结合氢谱得出，实施例1中，多糖衍生物HA-Cys中，半胱氨酸的连接率为12.5％，而在多糖衍生物ALG-Cym中，半胱胺的连接率为11％。实施例2和实施例3中，多糖衍生物的连接率小于10％，因此，实施例1的效果较好。
效果实施例2
针对实施例1的益生菌缓释载体水凝胶对封装乳酸菌释放性实验：
将108CFU的鼠李糖乳杆菌包封到2mL的多糖水凝胶HA-S-S-ALG中，制备三个多糖水凝胶分别放置到50mL的离心管中。实验组缓冲溶液中分别加入5mM和10mM的DTT，对照组为PBS缓冲溶液，在37℃的条件下孵育90min，每隔10min吸取10uL的释放液，通过平板涂布法进行菌落计算，即吸取10uL释放液，通过平板涂布法进行菌落计算，来评价水凝胶对益生菌的释放情况。
我们检测不同浓度的还原剂对水凝胶中负载的鼠李糖乳杆菌释放的影响，如下表2：
表2.不同浓度的还原剂对益生菌的释放情况
通过表2和图3所示实验结果可以看到：只有PBS介质的组别中，在60min后大约只有不到20％的益生菌得到有效的释放，而在释放介质中加入高浓度的DTT(二硫苏糖醇)时，益生菌的释放量达到85％以上。该结果表明DTT能够还原水凝胶中的二硫键，导致水凝胶发生解离，释放出益生菌，进而有效控制释放负载的益生菌。
效果实施例3
人工胃液(SGF)和肠液(SIF)中益生菌缓释载体水凝胶对乳酸菌的保护作用实验：针对实施例1，将鼠李糖乳杆菌浓度调至108CFU/mL，吸取3mL菌液分别加入到10mL的PBS、SGF和SIF溶液中；取封装相同菌落数的多糖水凝胶HA-S-S-ALG，也分别置于PBS、SGF和SIF溶液中，在37℃条件下厌氧孵育4h，孵育结束后，平板计数活菌数量，评价多糖水凝胶对益生菌的保护效果。
结果分析：通过图4A在没有益生菌缓释载体水凝胶保护的情况下，单独游离的鼠李糖乳杆菌在人工胃液中孵育4h后，活菌数量非常稀少，而通过水凝胶包埋益生菌后，在人工胃液中活菌数量和在对照组(PBS)中的差别不大。通过图4B我们可以看到，在人工肠液中，单独游离的乳酸菌数量有所减少(与对照组比减少2个多Log)，而多糖水凝胶包埋后乳酸菌数量基本没变。通过该实验说明益生菌缓释载体水凝胶对益生菌在经过胃肠道时有明显的保护作用。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种靶向缓释益生菌的载体水凝胶，其特征在于，所述载体水凝胶为巯基化修饰的透明质酸和海藻酸钠的交联物。
2.根据权利要求1所述的靶向缓释益生菌的载体水凝胶，其特征在于，所述透明质酸和海藻酸钠的交联物具有如下分子式：
其中，所述M、N为＞0的整数。
3.根据权利要求1或2所述的靶向缓释益生菌的载体水凝胶，其特征在于，所述益生菌为鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌和枯草芽孢杆菌等其中的一种或多种。
4.一种制备权利要求2所述的靶向缓释益生菌的载体水凝胶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采用半胱氨酸对透明质酸进行巯基化修饰；
对透明质酸溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)、半胱氨酸(Cys)进行酰胺反应，经透析、冷冻干燥得到透明质酸和半胱氨酸的多糖复合物(HA-Cys)；
S2、采用半胱胺对海藻酸钠进行巯基化修饰；
对海藻酸钠溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)、半胱胺(Cym)进行酰胺反应，经透析、冷冻干燥得到海藻酸钠和半胱胺的多糖复合物(ALG-Cym)；
S3、将步骤S1所得多糖复合物(HA-Cys)和步骤S2所得多糖复合物(ALG-Cym)混合后进行交联反应，得到所述载体水凝胶(HA-S-S-ALG)。
5.根据权利要求4所述的靶向缓释益生菌的载体水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述透明质酸和半胱氨酸的多糖复合物(HA-Cys)的合成路径如下：
首先，0.25-1g的透明质酸(HA，200kDa)用100mL的去离子水溶解在圆底烧瓶中，加入1-1.2g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.5-0.7g N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)磁力搅拌半个小时后，加入2.5-5g的半胱氨酸(Cys)，反应24h后终止；
然后，将反应混合溶液装入3500Da的透析袋中，用0.1M的氯化钠透析24h后换去离子水透析48h，去除未反应的底物；
最后，将所述透析产物经冷冻冻干，即得到透明质酸和半胱氨酸的多糖复合物HA-Cys。
6.根据权利要求4所述的靶向缓释益生菌的载体水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，海藻酸钠和半胱胺的多糖复合物(ALG-Cym)的合成路径如下：
首先，将0.25-1g的海藻酸钠(ALG，500kDa)用100mL的去离子水溶解在圆底烧瓶中，加入0.5-1g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.2-0.5g N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)磁力搅拌半个小时后，加入2-3g的半胱胺(Cym)，反应24h后终止；
然后，将反应混合溶液装入3500Da的透析袋中，用0.1M的氯化钠透析24h后换去离子水透析48h，冻干，得到海藻酸钠和半胱胺的多糖复合物ALG-Cym。
7.根据权利要求4所述的靶向缓释益生菌的载体水凝胶的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，在碱性条件下，将HA-Cys与ALG-Cym按照体积比为2～1:1～2混合，得到所述载体水凝胶HA-S-S-ALG。
8.一种权利要求1-2任一项所述的靶向缓释益生菌的载体水凝胶应用于响应沙门氏菌产生的硫化氢分子，其特征在于，采用还原剂二硫苏糖醇(DTT)模拟硫化氢气体分子，并将所述载体水凝胶HA-S-S-ALG置于PBS缓冲溶液中对其响应，使得载体水凝胶HA-S-S-ALG靶向裂解释放益生菌进而治疗沙门氏菌感染。
9.根据权利要求8所述的靶向缓释益生菌的载体水凝胶应用于响应沙门氏菌产生的硫化氢分子，其特征在于，所述PBS缓冲溶液pH值为7.5-8.5。
10.根据权利要求1-2任一项所述的靶向缓释益生菌的载体水凝胶或权利要求4-7任一项所述制备方法得到的载体水凝胶在食品、保健品中的应用。
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