CN116392599A - 双层水凝胶肠道递送载体及其应用 - Google Patents

双层水凝胶肠道递送载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了双层水凝胶肠道递送载体及其应用，属于载体递送技术领域。所述双层水凝胶肠道递送载体由以下成分组成：交联的水凝胶基质，植入水凝胶基质内的载体基质，载体基质用于包封待递送的活性物质；所述水凝胶基质为羧基修饰的壳聚糖与氧化双醛多糖交联形成的CMCS‑PSDs；所述载体基质为羧甲基纤维素。所述双层水凝胶肠道递送载体在制备定向递送至肠道的制剂中的应用。本发明还公开了一种益生菌制剂，由双层水凝胶肠道递送载体和待递送的益生菌组成，益生菌包封在载体基质中。本发明还公开了益生菌制剂的制备方法。本发明的双层水凝胶肠道递送载体可以保护活性物质，使其顺利到达肠道，本发明对研究活性物质的定向递送具有重要意义。

Description

双层水凝胶肠道递送载体及其应用
技术领域
本发明涉及双层水凝胶肠道递送载体及其应用，属于载体递送技术领域。
背景技术
益生菌，是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。免疫力低下者、消化不良者、便秘患者、腹泻患者、肠道功能逐渐减弱的中老年人、化疗或者放射治疗的肿瘤患者、肝硬化以及腹腔炎患者等均需要补充益生菌。为使益生菌顺利通过胃到达肠道，有必要建立一种适合递送益生菌的包封体系。益生菌是具有繁殖能力的活体，相比于小分子药物，包埋有难度。
水凝胶因其独特的三维网络结构，能为活细胞提供一个可以注入营养素的水环境，允许细胞生长和感知。同时，也可以防止环境对细胞的危害。此外，水凝胶与天然细胞外基质相似，具有良好的生物安全性、生物相容性和生物降解性。因此，水凝胶可作为封装活性物质的理想材料。
羧基修饰的壳聚糖(CMCS)是壳聚糖的重要衍生物，保留了壳聚糖良好的生物相容性、生物降解性和安全性。此外，CMCS包含了阳离子和阴离子电荷，是具有pH响应性的两性聚电解质。CMCS上的羧基可以用于感应外界pH。CMCS上含有的活性氨基，可提供共价交联，形成稳定水凝胶。因此，CMCS可作为水凝胶保护载体的理想材料。氧化双醛多糖(PSDs)可作为安全交联剂，交联CMCS可形成稳定的凝胶。但是，壳聚糖具有抗菌活性，壳聚糖及其衍生物不能直接用于益生菌的递送。
羧甲基纤维素(CarboxymethylCellulose,CMC)，属阴离子型纤维素醚类，外观为白色或微黄色絮状纤维粉末或白色粉末，无臭无味，无毒；易溶于冷水或热水，形成具有一定粘度的透明溶液。溶液为中性或微碱性，不溶于乙醇、乙醚、异丙醇、丙酮等有机溶剂，可溶于含水60％的乙醇或丙酮溶液。有吸湿性，对光热稳定，粘度随温度升高而降低，溶液在pH值2～10稳定，pH低于2有固体析出，pH值高于10粘度降低。CMC可作为粘合剂、增稠剂、悬浮剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、上浆剂等。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种适合于益生菌的双层水凝胶肠道递送载体，为pH响应性的水凝胶载体，不受胃液的影响，可顺利将益生菌递送至肠道。本发明还提供了双层水凝胶肠道递送载体在制备定向递送至肠道的制剂中的应用。本发明还提供了一种益生菌制剂。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种双层水凝胶肠道递送载体，由以下成分组成：交联的水凝胶基质，植入水凝胶基质内的载体基质，所述载体基质用于包封待递送的活性物质；
所述水凝胶基质，为羧基修饰的壳聚糖与氧化双醛多糖交联形成的CMCS-PSDs；
所述载体基质为羧甲基纤维素。
进一步地，所述氧化双醛多糖选自氧化海藻酸钠(ADA)。
进一步地，所述活性物质选自益生菌；更进一步地，所述益生菌选自植物乳杆菌(LP)、枯草芽孢杆菌(BS)等。
进一步地，所述CMCS是通过以下方法制备得到的：将20g壳聚糖溶于150mL异丙醇中，加入50mL的浓度为13.3mol/L的NaOH溶液，在60℃下溶胀碱化1h；然后加入100g的一氯乙酸(一氯乙酸溶于异丙醇中，30min内滴加完)，60℃下反应4h；80％乙醇溶液(体积百分数)洗涤，真空干燥，得到CMCS。
进一步地，所述PSDs是通过以下方法制备得到的：向多糖溶液中加入适量高碘酸钠(NaIO4)，在30℃下反应12h；添加乙二醇以淬灭多余的高碘酸钠，猝灭反应2h；去离子水透析反应物72h，透析液冷冻干燥，得到PSDs。所述多糖溶液的浓度为2％。所述多糖溶液的溶质选自玉米淀粉、马铃薯淀粉、果胶、葡聚糖、海藻酸钠中的任意一种。所述高碘酸钠的加入量为1.4％。
所述双层水凝胶肠道递送载体在制备定向递送至肠道的制剂中的应用。进一步地，所述制剂为益生菌制剂。
一种益生菌制剂，由双层水凝胶肠道递送载体和待递送的益生菌组成，益生菌包封在载体基质中。
进一步地，所述益生菌选自植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌等。
所述益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)益生菌菌液离心分离得沉淀物，将沉淀物分散到羟甲基纤维素溶液中，所述羟甲基纤维素溶液的浓度为2.0％～3.0％，优选2.5％；
(2)加入PSDs溶液，混匀，得混合物；所述PSDs溶液的浓度为1.0％～3.0％，优选2.0％；所述羟甲基纤维素溶液与PSDs溶液的体积比为1:0.8～1.2，优选1:1；
(3)使用注射器和泵将上述混合物滴加到CMCS溶液中，即得；所述CMCS溶液的浓度为2.0％～5.0％，优选3.0％；所述混合物与CMCS溶液的体积比为1:0.8～1.2，优选1:1。
进一步地，所述步骤(1)中，益生菌菌液的浓度为1.0×107～1.0×109CFU/ml，优选1.0×108CFU/ml。
进一步地，所述步骤(1)中，益生菌菌液与羟甲基纤维素溶液的体积比为1.8～2.2:1，优选2:1。
本发明的双层水凝胶肠道递送载体，以NaIO4为氧化剂氧化天然多糖制备PSDs交联剂，PSDs与CMCS进行交联形成CMCS-PSDs水凝胶，即CMCS上的氨基与PSDs的醛基之间发生席夫碱反应(-C＝N-)。此外，CMCS和PSDs链上含有大量-COOH、-OH、-NH3等官能团，大分子之间能够形成物理交联(氢键作用、静电作用等)。因此，CMCS和PSDs可以形成动态共价反应(化学交联)和非共价交联(物理交联)的双交联网络结构，稳定性更好(酸性条件下会破坏多糖的物理相互作用，但不会破坏席夫碱共价键)。
本发明的双层水凝胶肠道递送载体、益生菌制剂，是由维持整体结构的羧甲基壳聚糖外层和包裹益生菌并将其与羧甲基壳聚糖外层分离的羧甲基纤维素内层组成的双层系统，可保护益生菌使其顺利到达肠道：在胃中，外层分子通过表面的亲水基团迅速吸收周围水分形成“高分子-水分子”屏障，防止胃液渗入，同时，共价键和氢键通过协同作用形成的致密高分子网络可以防止益生菌释出，从而有效保护益生菌；到达肠道之后，部分氢键通过环境响应性转换成静电斥力，分别在外层和内层迅速形成微米级孔隙并逐步分解，实现益生菌的快速精准释放。
本发明的双层水凝胶肠道递送载体，可以保护活性物质(尤其是益生菌)，使其顺利到达肠道，使活性物质可以更好地在机体内发挥有益作用，本发明对研究活性物质的定向递送具有重要意义。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：释放率结果示意图。
图2：存活率结果示意图。
图3：流失计数的结果示意图。
图4：释放率结果示意图。
图5：释放率结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
本发明中涉及的百分数，若无特别说明，均指质量体积百分数，单位g/ml。
本发明所采用的壳聚糖，购买于麦克林，货号：C804726壳聚糖，脱乙酰度≥95％，粘度100～200mpa.s。
实施例1益生菌制剂的制备
步骤如下：
(1)将20g壳聚糖溶于150mL异丙醇中，加入50mL的浓度为13.3mol/L的NaOH溶液，在60℃下溶胀碱化1h；然后加入100g的一氯乙酸(30min内滴加完)，60℃下反应4h；80％乙醇溶液(体积百分数)洗涤，真空干燥，得到CMCS。
(2)向1000ml多糖溶液(溶质为海藻酸钠，浓度2％)中加入14g高碘酸钠，在30℃下反应12h；添加10ml乙二醇以淬灭多余的高碘酸钠，猝灭反应2h；去离子水透析反应物72h，透析液冷冻干燥，得到PSDs。
(3)取10ml益生菌菌液(植物乳杆菌的悬浮液，浓度1.0×108CFU/ml)，离心(3000rpm/min，10min)得沉淀物，将沉淀物分散到5ml羟甲基纤维素溶液中，羟甲基纤维素溶液的浓度为2.5％；
(4)加入5mlPSDs溶液，混匀，得混合物；PSDs溶液的浓度为2.0％；
(5)使用注射器和泵(流速为20mL/h)将上述混合物滴加到10mlCMCS溶液(浓度为3.0％)中，得载有植物乳杆菌的双层水凝胶肠道递送载体(CMCS-ADA-CMC保护的植物乳杆菌，SCHM)，重量计为G。
用同样的方法，制备得到载有枯草芽孢杆菌的双层水凝胶肠道递送载体，与上述制备方法的不同之处在于：步骤(3)中的益生菌菌液为枯草芽孢杆菌的悬浮液，浓度1.0×108CFU/ml。
用同样的方法，制备得到空白载体，即不载益生菌的双层水凝胶肠道递送载体，与上述制备方法的不同之处在于：步骤(3)中不向羟甲基纤维素溶液中加入沉淀物。
实验1双层水凝胶肠道递送载体的释放率、存活率的检测
将1g胃蛋白酶加入到1L超纯水中，pH值调节至1.2，制备模拟胃液(SGF)。
将1g胰酶加入到1L磷酸二氢钾缓冲液(浓度0.05M)中，pH值调节至7.4，制备模拟肠液(SIF)。
(一)载有植物乳杆菌的双层水凝胶肠道递送载体
(1)释放率的检测
将实施例1制备的CMCS-ADA-CMC保护的植物乳杆菌(SCHM)在模拟胃液模拟消化(将1/10G的SCHM加入到10ml的模拟胃液中)2h，离心分离(3000rpm/min，10min)，转入模拟肠液中模拟消化4h。在模拟消化过程中，以0.5h的间隔取出溶液(200μL)进行OD600的测定。
结果如图1所示。由1可见，SCHM在SGF中模拟消化2h的释放率仅为3.38％。在SIF中完全溶胀，载体破碎，LP几乎得到全部释放，在SIF中模拟消化4h的释放率为90.02％。
(2)存活率的检测
为了探究载体对益生菌的保护作用，观察LP在模拟胃肠道内的存活。将1ml游离的益生菌LP(UEP)(植物乳杆菌的悬浮液，浓度1.0×108CFU/ml)和1/10G的SCHM分别加入到10ml的模拟胃液中，模拟消化2h。然后转入到肠液中模拟消化2h。平板计数，每隔0.5h取样，离心(3000rpm/min，10min)，弃掉上清，洗涤沉淀，复溶；取出溶液(100μL)铺在MRS琼脂上，于37℃孵育48h，计数。流式细胞仪，使用活细菌/死细菌双染试剂盒对模拟消化后的菌液进行染色，用流式细胞仪对LP进行计数。
结果如图2、图3所示。
由图2可知，游离的UEP在SGF中模拟消化1h，其存活率仅为3.24％；在SGF中模拟消化2h，其存活率降低到0.43％；将其转移到SIF中继续消化2h，LP的存活率为0.42％。结果表明，经过2h的SGF模拟消化，UEP几乎全部失活。
SCHM在SGF中模拟消化1h，其存活率高达89.53％，远大于UEP的3.24％；在SGF中模拟消化2h，其存活率为85.47％；将其转移到SIF中继续消化2h，SCHM的存活率为85.81％。结果表明，SCHM能显著提高LP模拟消化后的存活率，能显著保护LP不受SGF的影响。
图3的流式计数结果与涂板计数结果一致。
结论：本发明的双层水凝胶肠道递送载体能够保护益生菌不受胃酸影响，使其顺利达到肠道后释放。
(二)载有枯草芽孢杆菌的双层水凝胶肠道递送载体
释放率、存活率的检测方法同上。结果如图4、图5所示。
由图4可知，载体保护的BS(PBS)在SGF中模拟消化2h的释放率仅为3.91％。在SIF中，其释放率为86.50％。
由图5可知，游离的BS(FBS)经过体外消化后，其存活率仅为0.28％。PBS经过体外消化，其存活率高达93.6％。结果表明，PBS能显著保护BS不受SGF的影响。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种双层水凝胶肠道递送载体，其特征在于，由以下成分组成：交联的水凝胶基质，植入水凝胶基质内的载体基质，所述载体基质用于包封待递送的活性物质；
所述水凝胶基质，为羧基修饰的壳聚糖与氧化双醛多糖交联形成的CMCS-PSDs；
所述载体基质为羧甲基纤维素。
2.根据权利要求1所述的双层水凝胶肠道递送载体，其特征在于：所述活性物质选自益生菌；所述益生菌选自植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求1所述的双层水凝胶肠道递送载体，其特征在于，所述CMCS是通过以下方法制备得到的：将20g壳聚糖溶于150mL异丙醇中，加入50mL的浓度为13.3mol/L的NaOH溶液，在60℃下溶胀碱化1h；然后加入100g的一氯乙酸，60℃下反应4h；80％乙醇溶液洗涤，真空干燥，得到CMCS。
4.根据权利要求1所述的双层水凝胶肠道递送载体，其特征在于，所述PSDs是通过以下方法制备得到的：向多糖溶液中加入高碘酸钠，在30℃下反应12h；添加乙二醇以淬灭多余的高碘酸钠，猝灭反应2h；去离子水透析反应物72h，透析液冷冻干燥，得到PSDs；所述多糖溶液的溶质选自玉米淀粉、马铃薯淀粉、果胶、葡聚糖、海藻酸钠中的任意一种。
5.权利要求1～4中任一项所述的双层水凝胶肠道递送载体在制备定向递送至肠道的制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述制剂为益生菌制剂。
7.一种益生菌制剂，由权利要求1～4中任一项所述的双层水凝胶肠道递送载体和待递送的益生菌组成，益生菌包封在载体基质中。
8.根据权利要求7所述的益生菌制剂，其特征在于：所述益生菌选自植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌。
9.权利要求7或8所述的益生菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)益生菌菌液离心分离得沉淀物，将沉淀物分散到羟甲基纤维素溶液中，所述羟甲基纤维素溶液的浓度为2.0％～3.0％；
(2)加入PSDs溶液，混匀，得混合物；所述PSDs溶液的浓度为1.0％～3.0％；所述羟甲基纤维素溶液与PSDs溶液的体积比为1:0.8～1.2；
(3)将上述混合物滴加到CMCS溶液中，即得；所述CMCS溶液的浓度为2.0％～5.0％；所述混合物与CMCS溶液的体积比为1:0.8～1.2。
10.根据权利要求9所述的益生菌制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，益生菌菌液的浓度为1.0×107～1.0×109CFU/ml；益生菌菌液与羟甲基纤维素溶液的体积比为1.8～2.2:1。
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