CN115844811A - 基于pva-gg的双层非均质微凝胶递送系统及其在制备治疗结肠炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物缓控释载体材料技术领域，具体涉及一种基于PVA‑GG的双层非均质微凝胶递送系统及其在制备治疗结肠炎中的应用。所述基于PVA‑GG的双层非均质微凝胶递送系统：内层以聚乙烯醇（PVA）和瓜尔豆胶（GG）为原料，外层修饰一层SA水凝胶，并以CS在最外层与SA进行聚电解质膜修饰，并以姜黄素Cur为实验药物进行载药。该双层微凝胶里外层基质材料不同，因而可以起到多种功能于一体的递送系统。有助于提高姜黄素的溶解性及吸收性能。该水凝胶可通过口服有效降低胃肠道中Cur抗炎药的突释和过早释放行为。体内药效学实验结果表明，CUR@gels可以有效聚集在结肠部位，缓解炎症状况，减轻小鼠的体重，改善结肠缩短和降低炎症水平。
Description
技术领域
本发明属于药物缓控释载体材料技术领域，具体涉及一种基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统及其在制备治疗结肠炎药物中的应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)病人需要终身用药，为规避长期用药的毒副作用，药物递送的有效性尤为关键。因此构建基于胃肠多种生理及病理复杂环境的程序化响应性递送系统，尽可能地保护药物的同时实现有效递送，提高治疗效果，对于治疗UC疾病具有重要意义。
姜黄素是从姜黄中提取的主要酚类色素，具有许多诱人的药理作用，包括抗氧化、抗炎和抗癌活性，姜黄素在人体内有很好的耐受性，可以使用非常高的剂量(高达12克/天)，因此被美国食品和药物管理局(FDA)认为是安全的(GRAS)。由于姜黄素的水溶性极低(<1μg/ml)，造成口服吸收受损，高代谢率导致其生物利用度低。因此，最近的研究重点是通过新配方提高姜黄素的生物利用度，从而导致了姜黄素的血液水平的整体上升，但持续的时间不足以满足临床发展的需要。
纳米给药系统被深入开发用于姜黄素药物的UC治疗，它们对于提高治疗姜黄素的溶解性，生物利用度及药物代谢动力学具有潜在的价值。然而，纳米微粒尽管具有依靠EPR效应的累积于炎症组织，但是被靶细胞的摄取效率低，难以充分的到达炎症细胞内释放，加上胃肠道复杂环境中的突释和漏释释放问题，依然限制了姜黄素抗炎的有效性。
水凝胶递送系统在环境响应性方面功能卓越。通过材料的选择和结构的设计可实现智能响应性地药物递送。自2008年Ladet S等和ElisseeffJ分别在Nature和Naturematerials对“洋葱状”多膜水凝胶的制备进行了报道以来，针对该类多膜水凝胶的应用开发研究并不多见。通过结构优化，可设计合成多层不同结构的水凝胶体系以适应不同刺激的响应。该非均质材料的多膜水凝胶有望对环境的变化产生不同的响应，从而实现胃肠道复杂环境性的程序性响应，并有望为姜黄素结肠炎症部位特异性地靶向定位输送提供一条新的出路。尽管已有均质材料用于多膜水凝胶的报道，但其结构性能的单一性限制使其在应用领域并不多见。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统及其在制备治疗结肠炎药物中的应用。所述基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统：内层以聚乙烯醇(PVA)和瓜尔豆胶(GG)为原料，外层修饰一层海藻酸钠(SA)水凝胶，并以壳聚糖(CS)在最外层与SA进行聚电解质膜修饰，并以Cur为实验药物进行载药。该双层微凝胶里外层基质材料不同，因而可以起到多种功能于一体的递送系统。SA是一种肠溶性基质材料，外层的SA凝胶基质和聚电解质膜的修饰，可以增加肠道部位定位递送的有效性，并保护Cur在胃及小肠部位的稳定性及提前释放；GG具有显著的粘膜靶向降解的功能；PVA是一种水溶性好，良好生物相容性和可降解性材料，因其优异的理化性质，也是全世界产量最大的合成聚合物之一，PVA内层PVA材料通过冻融法与GG一起形成互穿网络水凝胶，有助于提高姜黄素的溶解性及释药性能。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统PVA-GGgels，所述PVA-GGgels由两层非均质凝胶层构成，聚乙烯醇-瓜尔豆胶-CaCl2三者的混合溶液，在乳化剂(例如液体石蜡、司盘80等)作用下形成乳液，然后将乳液滴加至海藻酸钠溶液中，Ca2+与海藻酸钠进行物理交联，得到外层水凝胶；进一步在外层水凝胶采用壳聚糖与海藻酸钠进行聚电解质膜修饰；被包裹在外层水凝胶内的聚乙烯醇-瓜尔豆胶经冷冻形成内层互穿网状结构的水凝胶，其孔洞孔径为5-10μm。
基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统PVA-GGgels若需要载药的话，在制备水凝胶的过程中将药物加入聚乙烯醇-瓜尔豆胶-CaCl2的混合溶液中，其它步骤不变。
所述PVA-GGgels的制备方法，包括以下步骤：
(1)将10％(w/v)聚乙烯醇溶液和0.5％(w/v)瓜尔豆胶溶液混合，向聚乙烯醇-瓜尔豆胶混合液中加入CaCl2和药物，得到聚乙烯醇-瓜尔豆胶-CaCl2混合溶液；
(2)向步骤(1)得到的聚乙烯醇-瓜尔豆胶-CaCl2混合溶液中加入乳化剂，搅拌，得到乳液；
(3)将步骤(2)得到的乳液缓慢加入至1％(w/v)-5％(w/v)海藻酸钠溶液中，交联完成后，加入去离子水清洗水凝胶表面残留的海藻酸钠；
(4)将步骤(3)得到的水凝胶置于1％(w/v)-5％(w/v)壳聚糖溶液中，交联完成后，用去离子水清洗水凝胶表面残留的壳聚糖；
(5)将步骤(4)得到的水凝胶低温冷冻、解冻循环3次以上后，室温干燥，得到载药的PVA-GGgels。
进一步，步骤(1)：聚乙烯醇溶液和瓜尔豆胶溶液按体积比1:1～5:1混合，CaCl2的加入量与聚乙烯醇-瓜尔豆胶混合液的质量体积之比为(0.1-0.5)g:10mL；
优选的，步骤(1)：聚乙烯醇溶液和瓜尔豆胶溶液按体积比1:1混合，CaCl2与聚乙烯醇-瓜尔豆胶混合液的质量体积之比为0.2g:10mL；
进一步，步骤(2)：所加乳化剂为液体石蜡和司盘80，液体石蜡、司盘80以及步骤(1)得到的聚乙烯醇-瓜尔豆胶-CaCl2混合溶液的体积比为20:(0.5-5):(5-15)，优选的，体积比为20:1:10；
进一步，步骤(3)：按体积比为1:(5-10)将步骤(2)得到的乳液缓慢加入至1％(w/v)-2％(w/v)海藻酸钠溶液中；
优选的，步骤(3)：将步骤(2)得到的乳液滴加至1％(w/v)海藻酸钠溶液中，交联1-5min，优选交联3min；
进一步，步骤(4)：将步骤(3)得到的微凝胶缓慢加入至2％(w/v)壳聚糖溶液中，其中壳聚糖分子量为10万～100万；
优选的，步骤(4)：将步骤(3)得到的水凝胶置于2％(w/v)壳聚糖溶液中，其中壳聚糖分子量为100万，交联30～60min，优选的，交联40min。
进一步，步骤(5)：将步骤(4)得到的水凝胶置于-18℃冷冻、解冻循环3次以上后，室温干燥，得到PVA-GGgels。
一种基于PVA-GG的双层非均质微凝胶载药递送系统，其制备方法包括以下步骤：在上述PVA-GGgels的制备方法的步骤(1)中加入药物，其余步骤不变，制得到基于PVA-GG的双层非均质微凝胶载药递送系统。
进一步，所述药物可以是各种水溶性或者水不溶性的大分子或者小分子抗结肠炎药物。
所述药物为姜黄素(CUR或Cur)，其与聚乙烯醇的质量之比为(0-1):1，优选为(0.5-1):1，制备的装载CUR的PVA-GG双层微凝胶，记为CUR@gels。
上述方法制备的基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统PVA-GGgels在制备治疗结肠炎靶向药物中的应用。
上述方法制备的基于PVA-GG的双层非均质微凝胶载药递送系统CUR@gels在制备治疗结肠炎靶向药物中的应用。
进一步，所述结肠炎为溃疡性结肠炎。
进一步，所述结肠炎是由DSS诱导的。
本发明具有以下优点：
1)本发明构建了基于PVA-GG的双层非均质水凝胶系统。利用胃肠环境pH的变化、时滞效应及GG结肠定位降解的特性，达到姜黄素在结肠部位释放的目的。
2)通过结构优化，可设计合成多层不同结构的水凝胶体系以适应不同刺激的响应。该非均质材料的多膜水凝胶有望对环境的变化产生不同的响应，从而实现胃肠道复杂环境性的程序性响应，并有望为姜黄素结肠炎症部位特异性地靶向定位输送提供一条新的出路。
3)本递送系统的设计进一步减少了药物的非靶点的漏释行为，保证了递送药物的定位释放，又进一步增强药物的持续释放及吸收功能，即多种功能一体化整合，为提高结肠炎口服治疗药物效果奠定基础，同时为炎症肠道靶向递送提供一条新的思路。
4)姜黄素制剂组的口服给药能够有效保护结肠组织，降低结肠组织的炎症水平。
5)CUR@gels可以有效减轻小鼠的体重，结肠缩短和其他炎症症状。
附图说明
附图是用来对本发明的进一步理解，与下面的具体实施方式共同用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。附图中：
图1是CUR@gels对结肠炎的治疗原理图。
图2是不同放大倍数下PVA-GG双层微凝胶样品的扫描电镜图。
图3：a.红外光谱图，b.X射线衍射图谱(PVA-GG gels，PVA，GG，SA，CS)。
图4是CUR@gels的累计释药率曲线(a.不同pH条件下，b.模拟体液)。
图5是通过口服途径灌胃CUR溶液和CUR@gels释放的Cur的体内变化曲线(a.血清，单位：μg/mL，b、c、d.单位组织中Cur的量(b.胃，c.小肠，d.结肠)，单位：μg/g)。
图6：CUR@gels的小鼠体内抗炎实验。(a、b)小鼠体重随时间变化图(a为上午，b为下午)，(c)结肠的照片，(d)结肠长度，单位(cm)，(e)结肠重量比结肠长度，单位(g/cm)，(f)脾脏重量，单位(g)，(g)肾脏重量比体重，单位(g/g)。
图7：小鼠血清和结肠中主要促炎症因子的水平。(a)IL-6，(b)TNF-α。
图8：(a)不同小鼠组别的结肠组织代表性H&E染色图。(ⅰ)健康对照组，(ⅱ)DSS模型组，(ⅲ)姜黄素组，(ⅳ)空白制剂组，(ⅴ)姜黄素制剂组；(b)不同小鼠组别结肠组织的H&E染色图评分。
图9：免疫组织化学分析法测定MPO。(ⅰ)健康对照组，(ⅱ)DSS模型组，(ⅲ)姜黄素组，(ⅳ)空白制剂组，(ⅴ)姜黄素制剂组。
图10：水凝胶的体内生物分布。(a、c)对照组的离体胃肠道和内脏图像。(b、d)口服后不同时间点的水凝胶在GIT和内脏内的生物分布图像。
具体实施方式
为了更清楚地阐述本发明，以下申请人将依照本发明技术方案的实施例对本发明作更进一步的详细说明。
在本发明技术方案的具体实施方式中，所采用的主要试剂及材料介绍如下：
羧甲基纤维素采自阿拉丁试剂有限公司、聚乙烯醇(PVA，醇解度98-99mol％，黏度20-30mPa.s)采自阿拉丁试剂有限公司、瓜尔豆胶(GG)采自阿拉丁试剂有限公司、海藻酸钠(SA)采自阿拉丁试剂有限公司、壳聚糖(CS，分子量为100万)采自浙江金壳药业有限公司、姜黄素(CUR)采自麦克林、液体石蜡采自国药集团化学试剂有限公司、司盘80采自国药集团化学试剂有限公司、浓盐酸(36wt％)采自信阳市化学试剂厂、氢氧化钠采自国药集团化学试剂有限公司、无水氯化钙采自国药集团化学试剂有限公司、硫酸葡聚糖钠盐采自阿拉丁试剂有限公司、乙腈采自TEDIA、甲醇采自SIGMA。
所用水均为去离子水，其他试剂均为常规试剂。
实施例1：PVA-GG双层微凝胶的制备方法
称取2g的PVA分散于20mL去离子水中，95℃加热溶解，得到10％(w/v)PVA溶液，称取0.1g的GG溶于20mL去离子水中，得到0.5％(w/v)GG溶液，取上述溶液各10mL，搅拌均匀后加入0.4g CaCl2，得到三者的混合溶液，向三口烧瓶中加入40mL液体石蜡，2mL司盘80，上述混合溶液，中速机械搅拌20min，得到乳液，将上述乳液缓慢加入400mL 1％SA(w/v)溶液(取4g的SA溶于400mL去离子水中制得)中，搅拌3min，后加入大量的水，静置一段时间后，倒去上层液体，将得到的水凝胶置于100mL 2％(w/v)CS溶液(取4g的CS溶于200mL去离子水中制得)中，搅拌40min，后加入大量的水，静置，将下层凝胶珠置于-18℃冰箱中，冷冻、解冻循环3次后室温干燥，得到PVA-GG双层微凝胶，记为PVA-GGgels。
实施例2：载药的PVA-GG双层微凝胶的制备方法
称取2g的PVA分散于20mL去离子水中，95℃加热溶解，得到10％(w/v)PVA溶液，称取0.1g的GG溶于20mL去离子水中，得到0.5％(w/v)GG溶液，取上述溶液各10mL，搅拌均匀后加入0.4g CaCl2，得到三者的混合溶液，将0.6g姜黄素分散于PVA、GG、CaCl2三者的混合溶液中，向三口烧瓶中加入40mL液体石蜡，2mL司盘80，上述混合溶液，中速机械搅拌20min，得到乳液，将上述乳液缓慢加入400mL 1％(w/v)SA溶液(取4g的SA溶于400mL去离子水中制得)中，搅拌3min，后加入大量的水，静置一段时间后，倒去上层液体，将得到的水凝胶置于100mL 2％(w/v)CS溶液(取4g的CS溶于200mL去离子水中制得)中，搅拌40min，后加入大量的水，静置，将下层凝胶珠置于-18℃冰箱中，冷冻、解冻循环3次后室温干燥，得到装载CUR的PVA-GG双层微凝胶，记为CUR@gels。
测试例1：PVA-GG双层微凝胶的形态特征
为了观察凝胶的内部结构，将新鲜制备的水凝胶样品置于液氮中，用小刀将凝胶分成两份，后冷冻干燥。将冷冻干燥后的凝胶样品喷金，并在大、中、小不同放大倍数下用扫描电镜观察凝胶的内部形貌。图2是不同放大倍数下PVA-GG双层微凝胶样品的扫描电镜图。通过SEM在不同放大倍数下表征了PVA-GG水凝胶的微观结构。从前两幅图中可以清楚的观察到里层与外层之间的界线，明显观察到外层SA与内层PVA、GG结构上的不同，证明水凝胶形成了双层结构。水凝胶内部形成了相互连接的三维网状结构，孔洞直径在5-10μm，有利于水凝胶在胃肠环境中结构的张开，为水凝胶的释药提供了结构基础。
测试例2：PVA-GG双层微凝胶的红外光谱分析
采用溴化钾压片的方法对冷冻干燥后的凝胶样品进行红外光谱分析：将冷冻干燥后的凝胶样品置于红外灯下干燥，取少量溴化钾置于研钵中，再以样品：溴化钾＝1:100的比例加入样品，仔细研磨，将研磨好的样品放入压片装置中，制得透明试样薄片，将此片装于固体样品架上，放入红外光谱仪的样品池中，从4000-800cm-1进行波数扫描，得到红外吸收光谱。
由图3a可知：PVA的红外光谱中，在3398、1436和1094cm-1处的强吸收峰分别是由O-H伸缩振动、CH-OH的弯曲振动和C-O的伸缩振动引起的羟基特征峰，在2938cm-1处的吸收峰是由C-H的对称伸缩振动引起的碳链特征峰。GG的光谱在3431、2925和1155cm-1处显示典型的峰，对应于O-H，C-H和C-O拉伸振动。除此之外，在1015cm-1处的峰是由于GG吡喃糖环的糖苷键所致。SA的红外光谱中，3414cm-1处的吸收峰归属于O-H的伸缩振动峰，2927cm-1处为海藻酸钠大分子六元环上C-H键的伸缩振动峰，1610cm-1和1415cm-1处的吸收峰分别归属于海藻酸的COO-的对称伸缩振动和不对称伸缩振动，1033cm-1对应于拉伸的糖醛酸G链和M链的-C-O振动吸收峰。CS的主要特征峰在3441cm-1处，为N-H的伸缩振动峰，2879cm-1处为C-H的伸缩振动峰，1654cm-1处为N-H的弯曲振动峰，1382cm-1处为C-N的拉伸振动，1080cm-1处为C-O拉伸振动。PVA-GG的红外光谱并没有在原料的基础上出现新的吸收峰。
测试例3：PVA-GG双层微凝胶的X射线衍射分析
将冷冻干燥后的凝胶样品进行X射线衍射分析，扫描速度1°/min，衍射角2Θ范围为4°-50°，由电脑记录整个实验的实验数据，通过Origin作图得到XRD衍射图谱。
从图3b中可以明显看出PVA在2θ为20°、42°的位置存在双衍射峰，为PVA的特征峰，GG在2θ为20°的位置存在一个宽的衍射峰，SA在2θ为13°的位置存在一个小的衍射峰，CS在2θ为21°的位置存在一个明显的衍射峰，说明四者均具有晶体结构，但制备成双层凝胶后，衍射峰消失，说明制备得到的双层微凝胶较原材料的柔韧性更好，呈现无定形状态，利于对药物的保护。
测试例4：CUR@gels的累积释药量测定
将0.01g姜黄素置于100mL容量瓶中，用50v/v％乙醇定容，用移液枪吸取5mL置于50mL容量瓶中，定容，即得到姜黄素母液。吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL姜黄素母液，向母液中加入50v/v％乙醇至2mL，充分震摇后，在波长430nm处进行检测，根据吸光度值与姜黄素浓度得到标准曲线。
称取一定质量室温干燥后的CUR@gels水凝胶于锥形瓶中，向瓶内加入50mLpH＝1.2的模拟胃液(Simulated gastric fluid,SGF)，每次间隔一定时间后取出样品，同时向瓶内补充相同体积的SGF，2h后将漏槽介质改为pH＝6.8的模拟小肠溶液(Simulated smallintestine solution,SSIS)，3h后将漏槽介质改为pH＝7.4的模拟结肠溶液(Simulatedcolonic solution,SCS)，按前述方法取样。样品于430nm波长下进行紫外检测，上述模拟溶液中含0.2％十二烷基硫酸钠。计算不同时间下水凝胶的累积释药率。
其中：模拟胃液、模拟小肠溶液、拟结肠溶液采用浓盐酸、氢氧化钠来配制。
水凝胶的累积释药率测定
按以下公式进行计算：
式中，Cn为第n次取样时的药物浓度，V为单次取样体积，V0为50mL，W为凝胶的载药量。
由图4模拟体液环境下CUR@gels的累计释药率曲线可知：从图4a中可以看出，双层微凝胶在pH1.2的模拟胃液中释放速率较小，且最终释放率较小，而在pH 6.8、7.4的模拟肠液中药物释放较快，最终释放率在60％以上。另外，从结果可以看出，双层微凝胶的释药行为具有明显的pH敏感性。从图4b中可以看出，双层微凝胶在前2h的SGF中，药物释放量仅占总药量的2.5％，将溶出环境换为pH 6.8的模拟小肠溶液时，药物的释放速率增大，3h后将溶出环境改为pH 7.4的模拟肠道溶液时，药物的释放速率较快，最终，34h的药物释放量为总药量的84.6％。
测试例5：PVA-GG双层微凝胶的体内药代动力学研究
选用C57BL/6小鼠(8周龄)作为实验小鼠，将小鼠分为姜黄素溶液组和水凝胶制剂组，按照8g/kg/d，0.6g/mLDSS(硫酸葡聚糖钠盐)给药剂量进行造模，出现便血，腹泻，体重减少等症状，即为造模成功，造模成功后禁食12h，按每只小鼠120mg/kg，灌胃一定浓度的姜黄素溶液或水凝胶制剂(即CUR@gels)，姜黄素溶液浓度为12mg/mL(姜黄素用1％羧甲基纤维素钠(CMCNa)溶液混悬)，水凝胶制剂按0.1g制剂中含17mg姜黄素计算每只小鼠灌胃的制剂的质量，灌胃后，按时间点，0.5、1、2、4、6、8、12、24h，对小鼠进行安乐死，取血，解剖小鼠，取胃、小肠、结肠。将血液样品4摄氏度4000r/min离心10min，取100μL上层血浆，乙酸乙酯提取两次，每次500μL，挥干，涡旋震荡2min，12000r/min离心10min，每次取400μL，合并有机相，使用氮吹仪吹干，加入100μL 50％乙腈复溶，超声4min，涡旋10min，4摄氏度15000r/min离心10min，取80μL加入进样瓶，流动相按乙腈：5％乙酸溶液为74:26于433nm处检测。取100mg组织于2ml EP管中，加入300μL水，剪碎匀浆2min，4摄氏度15000r/min离心10min，取上清液200μL，后续按照血浆样品相同的处理方法进行乙酸乙酯的提取和检测。标准曲线的最大浓度为1μg/mL。
图5是通过口服途径灌胃CUR溶液和CUR@gels释放的Cur的体内变化曲线，实验小鼠口服CUR溶液或CUR@gels样品后，血清、胃、小肠、结肠中CUR的变化曲线如图5所示，并由图5计算了包括最大浓度(Cmax)，达到最大浓度的时间(Tmax)，血药浓度-时间曲线下面积(AUC)，清除率(CL)在内的药代动力学参数(见表1)。CURgroup与CUR@gels的Cmax分别为0.1631±0.0548μg/mL、0.0265±0.0157μg/mL，AUC分别为0.4803±0.1537μg/mL*h、0.2799±0.1151μg/mL*h，从Cmax和AUC的数据可以看出CURgroup明显大于CUR@gels，但是CUR@gels的CL为3.1448±1.7742mg/(μg/mL*h)明显小于CURgroup，并且CUR@gels的Tmax为15.2000±3.5362h，说明CUR@gels能够在进入小鼠体内之后，缓慢释放药物，并在长时间内保持在一定的血药浓度范围(图5a)，胃、小肠、结肠中CUR的变化曲线如图(图5b、c、d)所示，CURgroup能够在短时间内被各个部位吸收，存在一个较大的峰，而CUR@gels释放的姜黄素，能在胃、小肠和结肠部位长时间维持在一定水平。
表1：口服给予小鼠CUR溶液或CUR@gels样品后CUR或CUR@gels的药代动力学参数
测试例6：结肠炎动物模型和结肠炎的治疗
选用C57BL/6小鼠(8周龄)作为实验小鼠，随机分组，小鼠分为阴性对照组(WaterControl)、DSS造模组(DSS Control)、姜黄素组(CUR group)、空白制剂组(Gels)、制剂组(CUR@gels)，每组8只，阴性对照组为不造模，不给药，正常饮食。其余四组为上午8g/kg/d，0.6g/mL DSS(硫酸葡聚糖钠盐)给药剂量进行造模，下午分别灌胃1‰CMCNa(羧甲基纤维素钠)、120mg/kg/d、12mg/mL姜黄素溶液、空白制剂PVA-GGgels、制剂CUR@gels，空白制剂与制剂分散在1‰CMCNa溶液中，按120mg/kg/d，制剂按照0.1g中含17mg姜黄素计算灌胃制剂的质量。每天监测小鼠的体重(上午、下午各一次)和便血情况，并记录。给药五天后，对小鼠进行安乐死，取血，测量结肠长度，称量小鼠脾脏、肾脏、结肠重量，剪取固定部位的结肠，浸泡于组织固定液中，用于后续组织病理学变化(苏木精和伊红(H&E)染色)、MPO免疫组织化学染色。按照ELISA试剂盒中对应的方法，测定血清中促炎症细胞因子(白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α))。疾病活动指数(DAI)评分：在第5天观察大鼠的粪便性状、便血及隐血情况，记录体重变化值。参照小鼠DAI评分表进行综合评分，小鼠个体质量下降率、大便性状和便血情况等指标均单独计分，将各组得分相加后除以3，计算每只小鼠的综合得分，以此评价结肠粘膜的病变程度。
如图6a、6b所示，Water Control的小鼠体重维持不变，CUR@gels和Gels组与WaterControl的体重变化最为接近，表现出明显的体重恢复。结肠缩短是结肠上皮屏障破坏，粘膜损伤和结肠炎组织脱水的共同结果，图6c表明，CUR@gels组在维持小鼠结肠的长度和粪便的完整度方面具有很好的效果，与Water Control组结肠的状态相似，说明CUR@gels能够明显改善小鼠结肠的炎症情况，结肠长度(图6d)和单位长度的结肠重量(图6e)的统计结果也能间接证明这一结果。众所周知，当在生物体内发生炎症反应时，脾脏和肾脏中会积聚大量免疫细胞，从而导致脏器重量增加。与Water Control组相比，DSS对照组、CUR group和Gels组小鼠的脾脏和肾脏重量明显更高，而CUR@gels治疗组的小鼠的脾脏重量与健康对照组没有显著差异(图6f、g)。另外，在整个实验过程中，DSS组死亡了4只小鼠，CUR组死亡了3只小鼠，Gels组死亡了2只小鼠，Water Control组和CUR@gels组都没有小鼠死亡。总之，CUR@gels释放的Cur能够明显改善DSS诱发的结肠炎，并在保护结肠和降低死亡率等方面显示出了独特的优势。从表2、表3DAI评分也可以得到上述结论。
表2：DAI评分情况
表3各组小鼠疾病活动指数(DAI)评分(x±s，n＝8)
注：***P＜0.0001，**P＜0.001，*P＜0.05v.s正常组；△Δ△P＜0.0001，△△P＜0.001，△P＜0.05v.s模型组
炎症的严重程度与促炎症细胞因子的数量有关。如图7a、b所示，如预期的那样，血清中，DSS模型组IL-6、TNF-α的浓度分别为85pg/mL、345pg/mL，健康对照组IL-6、TNF-α的浓度分别为60pg/mL、166pg/mL，与健康对照组相比，DSS模型组中主要促炎症细胞因子(IL-6，TNF-α)的分泌水平显著增加，而制剂组水平与健康对照组的相近。表明CUR@gels能够有效降低血清中促炎症细胞因子的浓度，可以发挥一定的抗炎作用。
如图8所示，实验对结肠部位的H&E染色切片进行了评估。健康对照组的结肠组织没有发炎或破坏的现象，相反，DSS模型组、姜黄素组和空白制剂组的结肠组织显示出明显的炎症现象，包括肠道隐窝坏死，杯状细胞减少，水肿，白细胞浸润增加和粘膜结构不规则。另一方面，姜黄素制剂组的组织炎症水平显著降低，显示出几乎正常的粘膜结构。最后，我们从炎症、病变深度、隐窝破坏、病变范围四个方面对H&E染色切片进行了结肠组织病理学评分(见表4)，评分结果(图8b)显示，姜黄素制剂组与健康对照的评分结果更为接近，炎症水平较低。上述结果表明，姜黄素制剂组的口服给药能够有效保护结肠组织，降低结肠组织的炎症水平。
表4：结肠组织病理学评分表
注：各项计分累积后得分求均值为小鼠结肠组织镜中病理变化的最终评分
MPO主要由活化的中性粒细胞分泌，并且通常用作炎症严重程度的指标。如图9所示，研究得到了阴性对照组(Healthy control group)，DSS模型组(DSS control group)，姜黄素组(CUR group)，空白制剂组(Gels group)和制剂组(CUR@gels group)五组小鼠结肠组织的MPO免疫组织化学切片结果，图中箭头所指的棕褐色物质为MPO，与Healthycontrol group相比，DSS control group中的MPO含量显著提高，而CUR@gels group的切片结果与Healthy control group相似，说明CUR@gels中MPO含量较低，总之，CUR@gels可以有效地降低结肠组织中MPO的含量，有助于保护DSS诱导的小鼠结肠炎。
测试例7：小鼠的离体荧光成像结果
将疏水性荧光染料DiR分散于1mLDMSO中，然后将其与姜黄素一起分散于PVA、GG、CaCl2三者的混合溶液中，按照CUR@gels的制备方法，将DiR包载于CUR@gels水凝胶中，得到DiR@CUR@gels，以研究DiR@CUR@gels的组织分布。选用C57BL/6小鼠作为实验小鼠，按照8g/kg/d，0.6g/mL DSS给药剂量进行造模，造模5天后禁食12h，按每只小鼠120mg/kg，制剂按0.1g制剂中含17mg姜黄素计算每只小鼠灌胃的制剂的质量，将DiR@CUR@gels口服灌胃小鼠，在预定的时间间隔解剖得到GIT和主要器官并进行荧光成像。激发波长为800nm。
为了研究CUR@gels在GIT中的体内生物分布情况，我们将疏水性荧光染料DiR包载于CUR@gels水凝胶中，将DiR@CUR@gels口服灌胃DSS诱导小鼠，在给药0.5、2、4、8、12、18、24和48h后，解剖得到消化道(GIT)和主要器官并进行荧光成像，图10a显示了胃肠道和主要器官的荧光强度。实验图像表明，口服DiR@CUR@gels后，胃肠道的荧光强度逐渐降低，但在24h的时间点，能够在结肠部位检测到明显的荧光信号，口服48h后在GIT中没有检测到荧光信号。同时，心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏没有显著的荧光(图10b)，表明这些器官中没有DiR或DiR@CUR@gels聚积。这些发现表明口服DiR@CUR@gels可以在结肠中大量积累至少24h，这对于发挥其治疗作用是有益的。
Claims (10)
1.一种基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统PVA-GGgels，其特征在于，所述PVA-GGgels由两层非均质水凝胶构成，聚乙烯醇-瓜尔豆胶-CaCl2三者的混合溶液，在乳化剂作用下形成乳液，然后将乳液滴加至海藻酸钠溶液中，Ca2+与海藻酸钠进行物理交联，得到外层水凝胶；进一步在外层水凝胶采用壳聚糖与海藻酸钠进行聚电解质膜修饰；被包裹在外层水凝胶内的聚乙烯醇-瓜尔豆胶经冷冻形成内层互穿网状结构的水凝胶，其孔洞孔径为5-10 μm。
2.根据权利要求1所述的一种基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统PVA-GGgels，其特征在于，所述递送系统PVA-GGgels载药是将药物加入聚乙烯醇-瓜尔豆胶-CaCl2的混合溶液中；所述药物是抗结肠炎药物，优选为姜黄素。
3.权利要求1或2所述的一种基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统PVA-Gggels的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将10w/v%聚乙烯醇溶液和0.5w/v%瓜尔豆胶溶液混合，向聚乙烯醇-瓜尔豆胶混合液中加入CaCl2和药物，得到聚乙烯醇-瓜尔豆胶-CaCl2混合溶液；
（2）向步骤（1）得到的聚乙烯醇-瓜尔豆胶-CaCl2混合溶液中加入乳化剂，搅拌，得到乳液；
（3）将步骤（2）得到的乳液缓慢加入至1w/v%-5w/v%海藻酸钠溶液中，交联完成后，加入去离子水清洗水凝胶表面残留的海藻酸钠；
（4）将步骤（3）得到的水凝胶置于1w/v%-5w/v%壳聚糖溶液中，交联完成后，用去离子水清洗水凝胶表面残留的壳聚糖；
（5）将步骤（4）得到的水凝胶低温冷冻、解冻循环3次以上后，室温干燥，得到载药的PVA-GGgels。
4.根据权利要求3所述的一种基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统PVA-Gggels的制备方法，其特征在于，步骤（3）：将步骤（2）得到的乳液滴加至1w/v%海藻酸钠溶液中进行交联；和/或；
步骤（4）：将步骤（3）得到的水凝胶置于2w/v%壳聚糖溶液中进行交联，其中壳聚糖分子量为10万~100万。
5.根据权利要求3所述的一种基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统PVA-Gggels的制备方法，其特征在于，步骤（1）：聚乙烯醇溶液和瓜尔豆胶溶液按体积比1:1~5:1混合，CaCl2与聚乙烯醇-瓜尔豆胶混合液的质量体积之比为(0.1-0.5)g:10mL；所述药物与聚乙烯醇的质量之比为（0-1）:1；和/或；
步骤（2）：所述乳化剂为液体石蜡和司盘80，所述液体石蜡、司盘80以及步骤（1）得到的聚乙烯醇-瓜尔豆胶-CaCl2混合溶液的体积比为20:(0.5-5): (5-15)。
6.根据权利要求5所述的一种基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统PVA-Gggels的制备方法，其特征在于，步骤（1）：聚乙烯醇溶液和瓜尔豆胶溶液按体积比1:1混合，CaCl2与聚乙烯醇-瓜尔豆胶混合液的质量体积之比为0.2g:10mL；和/或；
步骤（2）：液体石蜡、司盘80以及步骤（1）得到的聚乙烯醇-瓜尔豆胶-CaCl2混合溶液的体积比为20:1: 10。
7.根据权利要求3所述的一种基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统PVA-Gggels的制备方法，其特征在于，步骤（3）：交联时间为1-5min，优选为3min；和/或；
步骤（4）：交联时间为30~60min，优选为40min。
8.根据权利要求3或4所述的一种基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统PVA-Gggels的制备方法，其特征在于，步骤（5）：将步骤（4）得到的水凝胶置于-18ºC冷冻、解冻循环3次以上后，室温干燥，得到载药的PVA-GGgels。
9.权利要求1-2任一所述的基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统PVA-GGgels或权利要求3-8任一所述方法制备的一种基于PVA-GG的双层非均质微凝胶递送系统PVA-GGgels在制备治疗结肠炎靶向药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述结肠炎为溃疡性结肠炎。
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