CN116139069B - 负载多孔淀粉的双层非均质微凝胶递送系统及其在制备治疗结肠炎药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物缓控释载体材料技术领域，构建了一种双层非均质水凝胶系统，内层以下列某一种高分子材料瓜尔豆胶（GG）、羟丙甲基纤维素（HPMC）、羧甲基纤维素（CMC）、甲基纤维素（MC）、乙基纤维素（EC）、壳聚糖（CS）、透明质酸（HA）、明胶（GE）与低酯果胶（LMP）为凝胶材料，外层修饰一层海藻酸钠（SA）水凝胶，最后通过CS在最外层与SA进行聚电解质膜修饰，以Cur为模型药物，并以多孔淀粉（PS）作为内层释药行为的调节材料。该微凝胶体系内外层基质材料不同，因而可以起到多种功能于一体，提高了姜黄素的溶解性及释药性能。该水凝胶可通过口服有效降低胃肠道中Cur的突释和过早释放行为，并有效聚集在结肠，为提高结肠炎的治疗效果奠定基础。

Description

负载多孔淀粉的双层非均质微凝胶递送系统及其在制备治疗 结肠炎药物中的应用
技术领域
本发明属于药物缓释载体材料技术领域，具体涉及一种负载多孔淀粉的双层非均质微凝胶递送系统及其在制备治疗结肠炎药物中的应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(UC)的发病率在世界范围内居高不下，一旦生病，就难以治愈，病人需要终身用药，为规避长期用药的毒副作用，药物递送的有效性尤为关键。因此构建基于胃肠道多种生理及病理复杂环境的程序化响应性递送系统，尽可能地保护药物的同时实现有效递送，提高治疗效果，对治疗UC疾病具有重要意义。
姜黄素(Cur)是从姜黄属植物的根茎中提取的一种疏水性多酚化合物，具有多种生物活性，包括抗炎、抗动脉粥样硬化、抗增殖、抗氧化、抗癌和抗转移作用，且在人体内有很好的耐受性，可以使用非常高的剂量(高达12克/天)，被美国食品药品监督管理局(FDA)认定为“安全”。然而，姜黄素具有溶解性差(水溶性极低<1μg/ml)，代谢快，生物利用度低，水中不稳定，光不稳定等缺陷，这些限制了它作为一种有效的治疗剂的使用。因此，最近的研究重点是通过新剂型提高姜黄素的生物利用度，将药物精准递送至病灶组织并缓慢释放。
水凝胶递送系统在环境响应性方面功能卓越。通过材料的选择和结构的设计可实现智能响应性地药物递送。自2008年Ladet S等和ElisseeffJ分别在Nature和Naturematerials对“洋葱状”多膜水凝胶的制备进行了报道以来，针对该类多膜水凝胶的应用开发研究并不多见。通过结构优化，可设计合成多层不同结构的水凝胶体系以适应不同刺激的响应。该非均质材料的多膜水凝胶有望对环境的变化产生不同的响应，从而实现在胃肠道复杂环境性的程序性响应，并有望为药物在结肠炎症部位特异性地靶向定位输送提供一条新的思路。尽管已有均质材料用于多膜水凝胶的报道，但其结构性能的单一性限制使其在应用领域并不多见。
发明内容
在本工作中，我们构建了多种载多孔淀粉的双层非均质水凝胶系统，内层以具有结肠降解行为的高分子材料如瓜尔豆胶(GG)、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、壳聚糖、透明质酸、明胶等与不同型号的低酯果胶(LMP)为内层凝胶材料，外层修饰一层海藻酸钠(SA)水凝胶，最后通过不同分子量CS在最外层与SA进行聚电解质膜修饰，并以Cur为模型药物。多孔淀粉(PS)由于大量的孔隙结构和凹陷从表面延伸到中心，导致其具有较大的比容积和比表面积，因此表现出较强的吸附能力，Cur以无定型或极细小的微晶态吸附在多孔淀粉孔道内，有助于提高Cur的溶解性和生物利用度。而双层微凝胶内外层基质材料不同，加上由于多孔淀粉的复合，达到集微粒材料与凝胶材料于一体，因而可以起到多种功能于一体的递送系统。SA是一种肠溶性基质材料，外层的SA凝胶基质由于聚电解质膜的修饰，可以进一步增加肠道部位定位递送的有效性，并保护Cur在胃及小肠部位的稳定性及避免提前释放；瓜尔豆胶(GG)等多糖类高分子材料具有显著的结肠靶向降解的功能；低酯果胶LMP作为一种只能被结肠部位的酶特别是果胶酶降解的高分子材料，有助于进一步提高药物的结肠靶向效果以及吸收性能。
本发明是通过以下技术方案实现的：
载药或负载载药多孔淀粉的双层非均质微凝胶递送系统，由两层非均质水凝胶构成，其制备方法包括以下步骤：
(1)将1％(w/v)-2％(w/v)低酯果胶溶液和1％(w/v)-3％(w/v)多糖溶液混合，向混合所得低酯果胶-多糖溶液中加入药物或载药多孔淀粉和CaCl2粉末，混合均匀，Ca2+与低酯果胶LMP进行物理交联，形成内层水凝胶；
(2)向(1)体系中加入乳化剂，高速剪切形成微乳液，将所得微乳液缓慢滴加到1％(w/v)-10％(w/v)海藻酸钠溶液中，Ca2+与SA进行物理交联，形成外层水凝胶；
(3)将(2)所得双层水凝胶置于1％(w/v)-10％(w/v)壳聚糖溶液中，交联，洗涤，干燥。
进一步，步骤(1)所述低酯果胶为苹果低酯果胶、柑橘低酯果胶等。
进一步，步骤(1)所述多糖为具有结肠靶向降解功能的高分子材料，如瓜尔豆胶(GG)、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、壳聚糖、透明质酸、明胶等。
优选的，步骤(1)所述低酯果胶为苹果低酯果胶或柑橘低酯果胶，所述多糖为瓜尔豆胶(GG)、羟丙甲基纤维素。
进一步，步骤(1)所述载药多孔淀粉的制备方法为：将药物和多孔淀粉溶解到无水乙醇中密闭搅拌0.5-2h，离心，干燥；其中，药物与多孔淀粉的质量比为(2-6):(2-15)。
进一步，步骤(1)所述药物可以是各种水溶性或者水不溶性的大分子或者小分子抗结肠炎药物；优选的，所述药物为姜黄素Cur，所得载药多孔淀粉记作CPS。所加药物或载药多孔淀粉中药物的质量与低脂果胶-多糖混合溶液的质量体积之比为(0.25～0.5)g:10mL。
进一步，步骤(1)中，低酯果胶溶液与多糖溶液体积比为1:1，CaCl2粉末与低脂果胶-多糖混合溶液的质量体积之比为0.25g:10mL。
优选的，步骤(1)低酯果胶溶液浓度为1％(w/v)，多糖溶液浓度为2％(w/v)。
进一步，步骤(2)所用乳化剂为液体石蜡和司盘80，按低酯果胶-多糖溶液、液体石蜡、司盘80体积比为(5-20):(10-30):(1-2)，优选按体积比10:20:1取液体石蜡、司盘80加入(1)体系中，在高速剪切机下以8000rpm-12000rpm均质2-10min得到微乳液。
进一步，步骤(2)交联时间为1-10min。
进一步，步骤(2)中，微乳液与海藻酸钠溶液的体积比为1:(15-25)。
进一步，步骤(3)壳聚糖的分子量为10万～100万，优选为100万。
进一步，步骤(3)交联时间为30-60min。
优选的，步骤(2)还包括后处理步骤，交联完成后，用去离子水清洗水凝胶表面残留的海藻酸钠。
优选的，步骤(3)还包括后处理步骤，交联完成后，用去离子水清洗水凝胶表面残留的壳聚糖。
优选的，一种载药或负载载药多孔淀粉的双层非均质微凝胶递送系统，其制备方法包括以下步骤：在搅拌下将药物或载药多孔淀粉和CaCl2粉末加入到GG、LMP的混合溶液，Ca2+与LMP进行物理交联，形成内层水凝胶；在乳化剂(例如液体石蜡、司盘80等)作用下形成乳液，然后将乳液滴加至SA溶液中，Ca2+与SA进行物理交联，形成外层水凝胶；进一步在外层水凝胶以CS与SA进行聚电解质膜修饰。
上述载药或负载载药多孔淀粉的双层非均质微凝胶递送系统在制备治疗结肠炎靶向药物中的应用。
上述载药或负载载药多孔淀粉的双层非均质微凝胶递送系统在制备治疗由DSS诱导的结肠炎靶向药物中的应用。
本发明具有以下优点：
1)本发明构建了多种载药或负载载药多孔淀粉的双层非均质水凝胶系统。利用胃肠环境pH的变化、时滞效应和各种高分子材料在结肠黏附和酶降解的综合效应，达到姜黄素在结肠部位靶向释放的目的。
2)通过结构优化，可设计合成多层不同结构的水凝胶体系以适应不同刺激的响应。该非均质材料的多膜水凝胶有望对胃肠道环境的变化产生不同的响应，兼具有结肠酶降解功能，有望为姜黄素结肠炎症部位特异性地靶向定位输送提供一条新的出路。
3)多孔淀粉的引入，有助于调节姜黄素的溶出和释药行为。
4)负载姜黄素的双层微凝胶样品组和负载载姜黄素多孔淀粉的双层微凝胶样品组口服给药均能够有效保护结肠组织，降低结肠组织的炎症水平。
5)负载姜黄素双层微凝胶样品组和负载载姜黄素多孔淀粉的双层微凝胶样品组口服给药可以有效减轻小鼠的体重，结肠缩短和其他炎症症状。
6)负载姜黄素双层微凝胶样品组和负载载姜黄素多孔淀粉的双层微凝胶样品组口服给药均能增加肠道菌群的丰富度，达到更好的治疗效果。
附图说明
附图是用来对本发明的进一步理解，与下面的具体实施方式共同用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。附图中：
图1是：CPS@microgels治疗溃疡性结肠炎的机制图。
图2是：CPS的红外光谱图。
图3是：CPS的热重分析。
图4是：CPS的累积释药曲线。
图5是：GG-LMP、GG-ALMP在不同倍镜下的的SEM图。
图6是：a.实施例1制备的GG-LMP双层凝胶红外光谱图，b.实施例3制备的GG-ALMP双层凝胶红外光谱图。
图7是：(a)GG-LMP的TGA曲线图；(b)GG-LMP的DTG曲线图；(c)GG-ALMP的TGA曲线图；(d)GG-ALMP的DTG曲线图。
图8是：不同分子量壳聚糖制备的GG-LMP、GG-ALMP双层凝胶溶胀曲线图。
图9是：a.GG-LMP双层凝胶降解曲线图，b.GG-ALMP双层凝胶降解曲线图。
图10是：(a)GG-LMP凝胶溶液流变扫频测试；(b)GG-LMP双层非均质凝胶交联过程扫频测试；(c)GG-LMP双层非均质凝胶交联过程时间扫描测试；(d)GG-ALMP凝胶溶液流变扫频测试；(e)GG-ALMP双层非均质凝胶交联过程扫频测试；(f)GG-ALMP双层非均质凝胶交联过程时间扫描测试。
图11是：a.不同浓度GL-Cur、GL-CPS的累计释药率曲线，b.GL-Cur、GL-CPS、GAL-Cur、GAL-CPS、GOL-Cur、GOL-CPS、HL-Cur、HL-CPS的累积释药曲线。
图12是：a.GG-LMP双层凝胶细胞毒性图，b.GG-ALMP双层凝胶细胞毒性图。
图13：小鼠体内抗炎实验结果图。(a)上午小鼠体重变化图；(b)下午小鼠体重变化图；(c)各组结肠照片；(d)各组结肠长度；(e)结肠重量/结肠长度比；(f)脾重/体重比。(**P＜0.01，*P＜0.05v.sDSS模型组)。
图14：(a)各组小鼠的结肠组织H&E染色图。(ⅰ)正常对照组，(ⅱ)DSS模型组，(ⅲ)空白制剂组，(ⅳ)姜黄素组，(ⅴ)GL-Cur组，(ⅵ)GL-CPS组，(ⅶ)GAL-Cur组，(ⅷ)GAL-CPS组；(b)各组小鼠结肠组织的H&E染色评分图(标尺：100μm)
图15：免疫组织化学染色测定MPO图。(ⅰ)正常对照组，(ⅱ)DSS模型组，(ⅲ)空白制剂组，(ⅳ)Cur组，(ⅴ)GL-Cur组，(ⅵ)GL-CPS组，(ⅶ)GAL-Cur组，(ⅷ)GAL-CPS组(标尺：100μm)。
图16：各组小鼠的结肠组织中巨噬细胞的免疫荧光染色图像。蓝色，DAPI细胞核染色；红色，巨噬细胞F4/80染色。白色箭头表示巨噬细胞浸润(标尺：100μm)
图17：小鼠结肠中主要促炎症因子的水平。(a)TNF-α标准曲线图；(b)IL-6标准曲线图；(c)结肠组织TNF-α水平含量；(d)结肠组织IL-6水平含量。(**P＜0.01，*P＜0.05v.sDSS模型组)
图18：各组双层微凝胶的体内生物分布图。(a)对照组的离体胃肠道图像，口服后不同时间点各组在胃肠道生物分布图像(b、DiR，c、GL-DiR，d、GL-DPS，e、GAL-DiR，f、GAL-DPS)。
图19：各组双层微凝胶的体内生物分布图。(a)对照组的离体内脏图像。口服后不同时间点各组在内脏的生物分布图像(b、DiR，c、GL-DiR，d、GL-DPS，e、GAL-DiR，f、GAL-DPS)。
图20：(a)各组肠道菌群在门水平的相对丰度；(b)厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)比率；(c)proteobacteria的相对丰度；(d)verrucomicrobia的相对丰度(数据呈现平均值和SD，n＝3，P*<0.05，P**<0.01，P***<0.01v.s.DSS control)。
图21：(a)各组肠道菌群OTU水平；(b)各组在OTU水平的Veen图。
图22：(a)ACE index；(b)Chao index；(c)Shannon index；(d)Simpson index(数据呈现平均值和SD，n＝3，P*<0.05，P**<0.01，P***<0.01v.s.DSS control)。
图23：(a)稀释性曲线；(b)Shannon稀释性曲线。
具体实施方式
为了更清楚地阐述本发明，以下申请人将依照本发明技术方案的实施例对本发明作更进一步的详细说明。
在本发明技术方案的具体实施方式中，所采用的主要试剂及材料介绍如下：
瓜尔豆胶采自阿拉丁试剂有限公司、羟丙基甲基纤维素(HPMCⅠ型，4000mPa.s)采自阿拉丁试剂有限公司、海藻酸钠(200±20mPa.s)采自阿拉丁试剂有限公司、苹果低酯果胶(LMP，酯化度28％、酰胺化度20％)来自山东安德利集团、苹果低酯果胶(ALMP，酯化度35％、总半乳糖醛酸88％)、柑橘低酯果胶(OLMP，酯化度22％、酰胺化度23％)来自砀山海升果胶有限公司、壳聚糖(脱乙酰度90.3％，100万分子量)采自浙江金壳药业有限公司、壳聚糖(脱乙酰度86.1％，10万分子量)采自浙江金壳药业有限公司、多孔淀粉采自辽宁立达生物科技有限公司(食品级，辽宁立达生物科技有限公司,酶法制备)、姜黄素(Cur)采自麦克林、DMEM培养液、0.25％胰蛋白酶、青-链霉素溶液、胎牛血清和二甲基亚砜(DMSO)均为美国Gibco公司、液体石蜡采自国药集团化学试剂有限公司、司盘80采自国药集团化学试剂有限公司、浓盐酸采自信阳市化学试剂厂、氢氧化钠采自国药集团化学试剂有限公司、无水氯化钙采自国药集团化学试剂有限公司、无水乙醇采自国药集团化学试剂有限公司、硫酸葡聚糖钠盐采自阿拉丁试剂有限公司。
所用水均为去离子水，其他试剂均为常规试剂。
以下实施例中：壳聚糖均用1v/v％醋酸溶解。
姜黄素多孔淀粉(CPS)的制备方法为：在室温搅拌下，将100mg的Cur溶于20mL的无水乙醇中，再向所得姜黄素乙醇溶液中加入40mg的多孔淀粉密封搅拌1h后，将悬浮液以8000rpm的速度离心10分钟。沉淀物在50℃干燥即得，记作CPS，CPS载药量为53.95％，即1g姜黄素多孔淀粉中含有0.5395g姜黄素。
实施例1：载药GL-Cur、GL-CPS双层微凝胶的制备方法
载药GL-Cur双层微凝胶的制备方法：将2％(w/v，本申请文件中w/v＝g/mL，其他处不赘述)的瓜尔豆胶(GG)和1％(w/v)的苹果低酯果胶(LMP)按体积比1:1混合后，取10mL在搅拌状态下加入0.25g姜黄素，混匀后缓慢加入0.25g的CaCl2粉末，混合均匀后缓慢滴入含5％司盘80的液体石蜡(20mL)中通过高速剪切机10000rpm剪切5分钟，制备成微乳后，缓慢滴到500mL 1％(w/v)的海藻酸钠溶液中，搅拌10分钟后用大量水冲洗沉淀，再放入1％(w/v)100万分子量壳聚糖溶液中搅拌1h，用大量水冲洗沉淀，下层凝胶珠加入少量无水乙醇洗涤后，烘干得双层微凝胶。
载药GL-CPS双层微凝胶的制备：其制备方法同载药GL-Cur双层微凝胶的制备方法相同，仅将姜黄素替换成0.5g姜黄素多孔淀粉。
需要说明的是：空白GL双层微凝胶(GG-LMP)的制备方法与对应载药的双层微凝胶的制备方法相同，区别仅在于不加入药剂。10万分子量壳聚糖的空白GL双层微凝胶(GG-LMP)的制备方法与对应载药的双层微凝胶的制备方法相同，区别在于不加入药剂和替换100万分子量壳聚糖为10万分子量壳聚糖。
注：测试例中未作特别说明的，空白GL双层微凝胶、载药GL-Cur双层微凝胶、载药GL-CPS双层微凝胶均采用的是100万分子量壳聚糖修饰。
以本实施例1制备的载药GL-CPS(即CPS@microgels)为代表治疗溃疡性结肠炎的机制如图1所示。
实施例2：载药GL-Cur、GL-CPS双层微凝胶的制备方法
载药GL-Cur双层微凝胶的制备方法：将1％(w/v)的瓜尔豆胶(GG)和1％(w/v)的苹果低酯果胶(LMP)按体积比1:1混合后，取10mL在搅拌状态下加入0.25g姜黄素，混匀后缓慢加入0.25g的CaCl2粉末，混合均匀后缓慢滴入含5％司盘80的液体石蜡(20mL)中通过高速剪切机10000rpm剪切5分钟，制备成微乳后，缓慢滴到500mL 1％(w/v)的海藻酸钠溶液中，搅拌10分钟后用大量水冲洗沉淀，再放入1％(w/v)100万分子量壳聚糖溶液中搅拌1h，用大量水冲洗沉淀，下层凝胶珠加入少量无水乙醇洗涤后烘干得双层微凝胶。
载药GL-CPS双层微凝胶的制备：其制备方法同载药GL-Cur双层微凝胶的制备方法相同，仅将姜黄素替换成0.5g姜黄素多孔淀粉。
需要说明的是：空白GL双层微凝胶(GG-LMP)的制备方法与对应载药的双层微凝胶的制备方法相同，区别仅在于不加入药剂。
实施例3：载药GAL-Cur、GAL-CPS双层微凝胶的制备方法
载药GAL-Cur双层微凝胶的制备方法：将2％(w/v)的瓜尔豆胶(GG)和1％(w/v)的苹果低酯果胶(ALMP)按体积比1:1混合后，取10mL在搅拌状态下加入0.25g姜黄素，混匀后缓慢加入0.25g的CaCl2粉末，混合均匀后缓慢滴入含5％司盘80的液体石蜡(20mL)中通过高速剪切机10000rpm剪切5分钟，制备成微乳后，缓慢滴到500mL 1％(w/v)的海藻酸钠溶液中，搅拌10分钟后用大量水冲洗沉淀，再放入1％(w/v)100万分子量壳聚糖溶液中搅拌1h，用大量水冲洗沉淀，下层凝胶珠加入少量无水乙醇洗涤后烘干得双层微凝胶。
载药GAL-CPS双层微凝胶的制备：其制备方法同载药GAL-Cur双层微凝胶的制备方法相同，仅将姜黄素替换成0.5g姜黄素多孔淀粉。
需要说明的是：空白GAL双层微凝胶(GG-ALMP)的制备方法与对应载药的双层微凝胶的制备方法相同，区别仅在于不加入药剂。10万分子量壳聚糖的空白GAL双层微凝胶(GG-ALMP)的制备方法与对应载药的双层微凝胶的制备方法相同，区别在于不加入药剂和替换100万分子量壳聚糖为10万分子量壳聚糖。
注：测试例中未作特别说明的，空白GAL双层微凝胶、载药GAL-Cur双层微凝胶、载药GAL-CPS双层微凝胶均采用的是100万分子量壳聚糖修饰。
实施例4：载药GOL-Cur、GOL-CPS双层微凝胶的制备方法
载药GOL-Cur双层微凝胶的制备方法：将2％(w/v)的瓜尔豆胶(GG)和1％(w/v)的柑橘低酯果胶(OLMP)按体积比1:1混合后，取10mL在搅拌状态下加入0.25g姜黄素，混匀后缓慢加入0.25g的CaCl2粉末，混合均匀后缓慢滴入含5％司盘80的液体石蜡(20mL)中通过高速剪切机10000rpm剪切5分钟，制备成微乳后，缓慢滴到500mL 1％(w/v)的海藻酸钠溶液中搅拌10分钟后用大量水冲洗沉淀，再放入1％(w/v)100万分子量壳聚糖溶液中搅拌1h，用大量水冲洗沉淀，下层凝胶珠加入少量无水乙醇洗涤后烘干得双层微凝胶。
载药GOL-CPS双层微凝胶的制备：其制备方法同载药GOL-Cur双层微凝胶的制备方法相同，仅将姜黄素替换成0.5g姜黄素多孔淀粉。
需要说明的是：空白GOL双层微凝胶(GG-OLMP)的制备方法与对应载药的双层微凝胶的制备方法相同，区别仅在于不加入药剂。
实施例5：载药HL-Cur、HL-CPS双层微凝胶的制备方法
载药HL-Cur双层微凝胶的制备方法：将4％(w/v)的羟丙基甲基纤维素(HPMC)和1％(w/v)的苹果低酯果胶(LMP)按体积比1:1混合后，取10mL在搅拌状态下加入0.25g姜黄素，混匀后缓慢加入0.25g的CaCl2粉末，混合均匀后缓慢滴入含5％司盘80的液体石蜡(20mL)中通过高速剪切机10000rpm剪切5分钟，制备成微乳后，缓慢滴到500mL 1％(w/v)的海藻酸钠溶液中搅拌10分钟后用大量水冲洗沉淀，再放入1％(w/v)100万分子量壳聚糖溶液中搅拌1h，用大量水冲洗沉淀，下层凝胶珠加入少量无水乙醇洗涤后烘干得双层微凝胶。
载药HL-CPS双层微凝胶的制备：其制备方法同载药HL-Cur双层微凝胶的制备方法相同，仅将姜黄素替换成0.5g姜黄素多孔淀粉。
需要说明的是：空白HL双层微凝胶(HPMC-LMP)的制备方法与对应载药的双层微凝胶的制备方法相同，区别仅在于不加入药剂。
测试例1：姜黄素多孔淀粉的红外光谱分析
采用溴化钾压片的方法对样品进行红外光谱分析，将干燥后的姜黄素多孔淀粉(CPS)样品、多孔淀粉(PS)、姜黄素(Cur)分别与溴化钾混合(1:100)，研磨均匀后进行傅里叶红外光谱分析。光谱范围在4000-400cm-1、扫描速度128cm/s、分辨率为2cm-1，记录实验数据。
为了解姜黄素与多孔淀粉之间可能存在的相互作用，对吸附前后的物质进行了FTIR表征。图2是CPS的红外光谱图。从图2可以看出，姜黄素大约在3517cm-1处的特征吸收峰是由苯环上的-OH伸缩振动引起的，而约1627cm-1处是由C＝O和C＝C振动的混合振动引起的特征吸收峰引起的，1510cm-1处由C-O和C-C振动引起的，1429cm-1处由烯烃C-H弯曲振动引起的，1277cm-1处由芳烃C-O拉伸振动引起的。对比姜黄素和多孔淀粉的特征光谱，CPS大约在3517cm-1处的姜黄素-OH拉伸峰消失，约3414cm-1处淀粉-OH拉伸宽峰增大，而在约1628cm-1和约1509cm-1和1280cm-1处检测到与姜黄素相关的弱峰，峰值信号在1024cm-1对应于C-O-C葡萄糖单位振动。另外，淀粉的复杂指纹信号轻微移动到较高的波数，这归因于与姜黄素的相互作用。在先前的研究中，氢键被认为是酚类化合物与聚合物壁材料之间的主要相互作用，姜黄素的羟基和葡萄糖单位的羟基可能参与氢键的形成。由此表明，多孔淀粉与姜黄素的相互作用主要是化学吸附引起的，姜黄素主要被吸附在孔道内；尽管吸附了姜黄素，多孔淀粉的表面化学结构没有发生显著变化。
测试例2：姜黄素多孔淀粉的热重分析
通过TGA对CPS样品、多孔淀粉、姜黄素进行检测。检测温度范围：40-500℃，升温速率为10℃/min。
通过TG对姜黄素、多孔淀粉、姜黄素多孔淀粉进行热力学分析。图3是CPS的热重分析。如图3(a)TGA曲线所示：姜黄素在前300℃质量损失不明显，在300℃后化学键断裂才开始迅速失重。多孔淀粉和载药多孔淀粉失重主要是两个阶段，40-100℃是吸附水的损失引起的；在250℃后两者由于热分解都迅速失重，多孔淀粉已经热分解80％，而载药多孔淀粉热分解了65％。从图3(b)DTG曲线可见：多孔淀粉的最大热分解温度为305℃，姜黄素多孔淀粉的最大质量损失速度更慢，两者表明载药后的多孔淀粉热稳定性增加，满足在高温条件下潜在应用的价值。
测试例3：姜黄素多孔淀粉的平衡溶解度研究
在模拟胃液(SGF，pH1.2)和模拟肠液(SIF，pH 7.4)中检测Cur和CPS的饱和溶解度。将100mg(过量的)CPS样品放入含有5mL溶出介质(模拟胃液或模拟肠液)的带盖小瓶中，并在37℃、100rpm的转速保持48h。将悬浮液以10000rpm离心10min。用乙醇稀释上清液，采用UV法在430nm处测量吸光度计算药物浓度。上清液中的药物浓度表明Cur的饱和溶解度。
表1Cur和CPS在不同模拟液中的平衡溶解度
Cur和CPS在模拟胃液SGF中的平衡溶解度为13.81μg/mL和29.87μg/mL，Cur和CPS在模拟肠液SIF中的平衡溶解度为22.69μg/mL和46.35μg/mL，将姜黄素溶解于有机溶剂乙醇后与多孔淀粉混合，可以防止姜黄素聚集使其以无定形或细小的微晶存在于多孔淀粉的孔隙，因此CPS在SGF、SIF中的平衡溶解度显著提高。
测试例4：姜黄素多孔淀粉的累积释放曲线
为了进一步确定CPS在体外的释放行为，试验了Cur和CPS在模拟胃肠液中的释放行为。精密称取10mgCur原料药和10mg CPS(CPS载药量53.95％，10毫克CPS含有姜黄素5.395mg)分散在1mLpH7.4的PBS缓冲溶液(0.01mol/L)中再放入透析袋(MW3500)中，前2h置于50mL SGF中，在37℃水浴恒温振荡器中以100rpm透析，然后将透析液更换为SIF，在前4h的透析过程中，每隔0.5h，吸取2mL透析液并补充2mL相应模拟液，4h后在SIF中继续透析，采用UV法在430nm处测量透析液的吸光度，根据Cur在相应胃肠道模拟液中的浓度代入公式计算药物累计释放率，并绘制释药曲线。每个实验一式三份。累积释药率按下式进行计算：
式中，Qn为累积释药率，Cn为第n次取样时的药物浓度，V为单次取样体积，V0为50mL，W为CPS中的总药量。
图4是CPS的累积释药曲线。图4结果表明，CPS因平衡溶解度提高在SGF和SIF溶液中释放更快，而大部分姜黄素被吸附在多孔淀粉的孔隙中，能够起到缓慢释放药物的作用。
测试例5：双层微凝胶的扫描电镜分析
利用扫描电子显微镜对冷冻干燥后的凝胶样品的形貌进行了研究。样品经喷金处理后在10kV的加速电压下在不同倍数下观察其微观形态。
通过SEM在不同倍数下表征了GG-LMP(实施例1制备的)、GG-ALMP(实施例3制备的)双层微凝胶微观结构。图5是GG-LMP、GG-ALMP在不同倍镜下的的SEM图。从图5可以清楚的观察到内外层之间的界线，可以明显观察到外凝胶层与内凝胶层结构上的不同，证实水凝胶形成了双层结构。微凝胶内外层均为相互连接的三维网状结构，有利于水凝胶在胃肠环境中结构的张开，为双层凝胶的释药提供了结构基础。
测试例6：双层微凝胶的红外光谱分析
采用溴化钾压片的方法对冷冻干燥后的凝胶样品进行红外光谱分析：将冷冻干燥后的双层微凝胶样品置于红外灯下干燥，取少量溴化钾置于研钵中，再以样品：溴化钾＝1:100的比例加入样品，仔细研磨，将研磨好的样品放入压片装置中，制得透明试样薄片，将此片装于固体样品架上，放入红外光谱仪的样品池中，从4000-800cm-1进行波数扫描，得到红外吸收光谱。
图6(a)、(b)分别为GG-LMP(实施例1制备的)、GG-ALMP(实施例3制备的)双层非均质凝胶的红外光谱图，在GG的红外光谱图中3419cm-1、2925cm-1处显示典型的峰，对应于OH-和C-H拉伸振动峰。除此之外，1632cm-1的是C＝O振动峰，在1030cm-1处的峰是由于GG吡喃糖环的糖苷键所致。在SA的红外光谱图中3419cm-1是OH-的伸缩振动峰，1602cm-1是-COO-的反对称伸缩振动峰，1419cm-1是-COO-的对称伸缩振动峰，1034cm-1是C-O拉伸振动峰。在CS的红外光谱图中3441cm-1处为N-H的伸缩振动峰，2890cm-1处为C-H的伸缩振动峰，1610cm-1处为N-H的弯曲振动峰，1390cm-1处为C-N的拉伸振动，1080cm-1处为C-O拉伸振动。在LMP中3396cm-1左右处是OH-和-NH2的伸缩振动峰。2930cm-1处是-CH的伸缩振动峰，1643cm-1的是C＝O振动峰；1422cm-1左右处是C-H弯曲振动峰，1053cm-1处是R-O-R和环C-C伸缩振动峰。在ALMP中3407cm-1左右处是OH-和-NH2的伸缩振动峰。2933cm-1左右处是-CH的伸缩振动峰，1633cm-1的是C＝O振动峰；1410cm-1左右处是C-H弯曲振动峰，1052cm-1处是R-O-R和环C-C伸缩振动峰。图6(a)、(b)显示GG-LMP、GG-ALMP双层非均质凝胶红外光谱仅出现峰强度变化和峰发生偏移并未在原料基础上出现新的吸收特征峰。
测试例7：双层微凝胶的热重分析
运用TGA对双层凝胶冻干样品进行检测。检测温度范围：40-500℃，升温速率为10℃/min。
GG-LMP(实施例1制备的)、GG-ALMP(实施例3制备的)双层非均质凝胶的TGA曲线和DTG曲线如图7所示，图7(a)、(c)TGA曲线表明GG-LMP、GG-ALMP双层非均质凝胶的热分解过程由两部分构成，低温处是吸附水的损失引起的，当温度到达200℃后由于化学键断裂热分解变快。图7(b)、(d)DTG曲线表明GG-LMP、GG-ALMP双层非均质凝胶的最大质量损失速度明显慢于大部分原料，两者表明热稳定性增加。
测试例8：双层凝胶的溶胀性能测试
分别称取0.1g以10万分子量壳聚糖分子量和100万分子量壳聚糖聚电解质膜修饰的GG-LMP(实施例1制备的)、GG-ALMP(实施例3制备的)凝胶，前2h放置于pH＝1.2的模拟胃液(SGF)中，后3h置于pH＝6.8的模拟小肠溶液(Simulated small intestine solution,SSIS)中，5h后置于pH＝7.4的模拟结肠溶液(Simulated colonic solution,SCS)中，每半小时称一次质量，按下式计算溶胀率。
式中：SR：凝胶在t时刻的溶胀率；W0：实验前凝胶的干重；Wt：凝胶在缓冲溶液中溶胀t时间后的湿重。
图8为以10万分子量和100万分子量壳聚糖进行聚电解质膜修饰的GG-LMP、GG-ALMP双层非均质凝胶在模拟胃肠液中的溶胀曲线图，可以看出GG-LMP、GG-ALMP双层非均质凝胶在SGF中溶胀率很低，可以说明GG-LMP、GG-ALMP双层非均质凝胶对碱性环境更为敏感，与前面药物释放情况一致。对于GG-LMP、GG-ALMP双层非均质凝胶，以10万分子量壳聚糖进行聚电解质膜修饰的溶胀度更高且在更短的时间内达到最大溶胀度。同时也会因此导致药物更快释放。以10万分子量壳聚糖进行聚电解质膜修饰的GG-LMP双层非均质凝胶的最大溶胀度能达到48.22，以100万分子量壳聚糖进行聚电解质膜修饰的GG-LMP双层非均质凝胶的最大溶胀度能达到45.3，以10万分子量壳聚糖进行聚电解质膜修饰的而GG-ALMP双层非均质凝胶的溶胀度能达到44.16，以100万分子量壳聚糖进行聚电解质膜修饰的而GG-ALMP双层非均质凝胶的溶胀度只能达到35.7。由于LMP、ALMP这两种低酯果胶的酯化度、酰胺化度以及半乳糖醛酸含量不一样，所制备出的双层非均质凝胶的溶胀程度不一样。
测试例9：双层凝胶体外降解研究
化学降解：通过将20mgGG-LMP(实施例1制备的)、20mg GG-ALMP(实施例3制备的)双层微凝胶分别置于不同pH的模拟体液(pH＝1.2的模拟胃液、pH＝6.8的模拟小肠溶液、pH＝7.4的模拟结肠溶液)中，在37℃的条件下进行测定，并在一定时间节点从缓冲液中分离出凝胶，然后将它们冷冻干燥并再次称重，测定微凝胶的化学降解率。通过下列公式计算微凝胶的降解行为：
Weight loss＝(W0-W1)/W0×100％
其中W0是初始微凝胶质量，W1是降解后的微凝胶质量。
酶降解法：称取20mg GG-LMP(实施例1制备的)、20mg GG-ALMP(实施例3制备的)双层微凝胶，分别置于含0.5U/mL葡聚糖酶，5U/mL胰蛋白酶的pH7.4的结肠酶模拟液在37℃的条件下进行测定，在一定时间节点，将微凝胶与缓冲溶液分离，冷冻干燥并称重，按照上列公式计算凝胶失重情况。
结肠酶模拟液(pH7.4)：KH2PO46.8 g，0.1mol/LNaOH 395mL，50mg葡聚糖酶，500mg胰蛋白酶，1000mL容量瓶定容。
图9(a)、(b)分别是GG-LMP、GG-ALMP双层非均质凝胶的化学降解和酶降解情况，可以看出GG-LMP、GG-ALMP双层非均质凝胶具有良好的生物降解性。在化学降解中，GG-LMP、GG-ALMP双层非均质凝胶在pH 6.8和pH 7.4下降解率均高于pH 1.2，说明GG-LMP、GG-ALMP双层微凝胶对碱性环境更加敏感，与前面药物释放情况和溶胀曲线一致，具有结肠靶向性，药物能更多的在结肠部位释放。在酶降解中，由于GG-LMP、GG-ALMP双层非均质凝胶的骨架为多糖材料，在酶的作用下相对更容易降解，所以酶降解率高于化学降解率，更符合GG-LMP、GG-ALMP双层非均质凝胶在人体胃肠道的降解过程。与前面一致，由于这两种低酯果胶的酯化度、酰胺化度以及半乳糖醛酸含量不一样，所制备出的双层非均质凝胶的降解速率有差异，但与药物释放情况和溶胀曲线一致，GG-LMP双层非均质微凝胶的药物释放更多，溶胀度更大，降解率更高。
测试例10：双层凝胶流变性能测试
按照实施例1和实施例3的制备方法制备GG-LMP、GG-ALMP凝胶，研究交联剂CaCl2的加入与否对凝胶流变性能的影响。在溶液混合均匀后，立即用胶头滴管将混合溶液滴加至旋转流变仪的平板上，板的直径为35mm，间隙设置为1mm，温度为25±0.1℃，在扫频测试中，我们使用频率为1.0Hz，应变率为1.0％，在0.1-100Hz的频率范围内测量了弹性模量(G')，粘滞模量(G”)；在时间测试中，我们使用频率为1.0Hz，应变率为1.0％，在0-600s的时间范围内测量了G'，G”。
流变学是对水凝胶粘弹性的研究。图10：(a)GG-LMP凝胶溶液流变扫频测试；(b)GG-LMP双层非均质凝胶交联过程扫频测试；(c)GG-LMP双层非均质凝胶交联过程时间扫描测试；(d)GG-ALMP凝胶溶液流变扫频测试；(e)GG-ALMP双层非均质凝胶交联过程扫频测试；(f)GG-ALMP双层非均质凝胶交联过程时间扫描测试。如图10(a)、(d)所示在GG-LMP凝胶溶液、GG-ALMP凝胶溶液的弹性模量G'低于粘滞模量G”，此时处于溶胶状态；当加入交联剂CaCl2，后如图10(b)、(e)所示GG-LMP双层非均质凝胶、GG-ALMP双层非均质凝胶的弹性模量G'远远大于粘滞模量G”，证明溶胶已经转换成凝胶；由时间扫描图10(c)、(f)所示GG-LMP凝胶溶液、GG-ALMP凝胶溶液在很短的时间就交联形成凝胶。
测试例11：双层微凝胶的体外药物释放研究
分别称取10mg载姜黄素的双层微凝层和10mg载姜黄素多孔淀粉的双层微凝胶分别放置在100mLpH7.4的PBS缓冲溶液(即结肠模拟液)中震荡24h后通过高速剪切机(FSH-2A)以10000r/min高速剪切10min。取上清液通过紫外分光光度仪(AOE UV-1600)在430nm处测定溶液的OD值。凝胶的载药量可由以下公式计算得到：
LE＝We/Wm×100％
式中，LE为载药量，We为包封于凝胶内的药物质量，Wm为载药凝胶的总质量
采用不同pH的模拟体液(pH＝1.2的模拟胃液、pH＝6.8的模拟小肠溶液、pH＝7.4的模拟结肠溶液)，研究了载药双层微凝胶在体外的药物释放行为。称取10mg室温干燥后的载姜黄素和载姜黄素多孔淀粉的双层微凝胶分别置于锥形瓶中，向瓶内加入50mL含0.2％SDS的SGF，在特定时间点间隔从介质中取出2mL溶液，并向释放介质中重新添加2mL新鲜的对应缓冲溶液，以保持总的释放介质的体积不变；2h后更换成SSIS，5h后换成SCS，分别在对应的点取样。采用紫外分光光度仪(AOE UV-1600)在430nm处测量介质的吸光度带入标曲得到药量，以释放介质中的药量与载药双层微凝胶的总载药量之比作为累积释药率。重复三次实验取平均值计算。
式中，Cn为第n次取样时的药物浓度，V为单次取样体积，V0为50mL，W为凝胶的载药量。
表2姜黄素的标准曲线方程
表3各组制剂载药量
从表3可见载姜黄素多孔淀粉的非均质双层凝胶的载药量高于直接载药的非均质双层凝胶。图11是各组载药双层微凝胶的累计释药率曲线。从图11(a)所示当GG的浓度变大其结构更稳定，凝胶的孔隙更小，药物释放更慢；由于姜黄素多孔淀粉的平衡溶解度变大，载姜黄素多孔淀粉的双层非均质凝胶的释药更快。图11(b)所示是表3中实施例1、实施例3、实施例4和实施例5示出的八组载药制剂的累积释放情况，结果显示不同材料制备的双层非均质凝胶结构具有差异导致释药情况也不同。
测试例12：双层凝胶体外细胞毒性
空白制剂的细胞毒性评价采用MTT法检测。RAW264.7细胞(源自中国典型培养物保藏中心，鼠源)以1×105个细胞/孔的密度接种在96孔板中。在DMEM培养基中，将细胞培养板置于37℃下含有5％CO2的条件下培养24h。培养完成后，移除培养基，加入pH7.4的PBS缓冲液(0.01mol/L)冲洗三次后，分别添加100μL以基础培养基稀释的不同浓度(100、200、300、400、500μg/mL)的空白载体GG-LMP溶液(实施例1制备的)和GG-ALMP溶液(实施例3制备的)，在此条件下继续培养24h后，移除培养液，添加90μLDMEM培养基和10μLMTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h；完全移除培养基，加入150μL的DMSO，放置在室温下，待紫色结晶全部溶解，震荡培养板使均匀染色。使用酶联免疫检测仪(Bio-Rad 680)检测490nm处的OD值来计算细胞的存活率。通过与对照孔以及空白孔比较，计算得到存活率。对照组细胞仅用不含小牛血清的细胞培养基培养，不加入样品，空白孔仅加入100μLPBS缓冲溶液。(试验组吸光度OD值减去空白孔OD值)与(对照孔OD值减去空白孔OD值)之比定义为细胞存活率。所有数据以实验的平均标准偏差报告，使用5个重复进行。p<0.05被认为具有统计学意义。
(式中Asample为试验组OD值，Ablank为空白孔OD值，Acontrol为对照孔OD值)
通过MTT法测定了空白GG-LMP、GG-ALMP双层非均质凝胶对RAW264.7的杀伤力，图12是GG-LMP和GG-ALMP双层凝胶细胞毒性图。如图12(a)、(b)所示空白GG-LMP(a)、GG-ALMP(b)双层非均质凝胶在浓度范围为100-500μg/mL时，RAW264.7细胞的存活率均高于95％，可以说明是在较宽的浓度范围内所制备的空白GG-LMP、GG-ALMP双层非均质凝胶对细胞没有明显的毒性，具有优异的生物相容性。
测试例13：结肠炎动物模型和结肠炎的治疗
选用C57BL/6小鼠作为实验小鼠，小鼠分为正常组、DSS造模组、游离Cur(120mg/kg)组、空白制剂组(实施例1制备的GL组，简称为Gels组)、GL-CPS组(实施例1)、GL-Cur组(实施例1)、GAL-CPS(实施例3)组、GAL-Cur组(实施例3)，每组7只，正常组不造模，不给药，其余各组按8g/kg/d的剂量上午灌胃0.6g/mL的DSS，下午分别灌胃0.5％的CMC-Na溶液，姜黄素、空白制剂与各组制剂分散在0.5％CMC-Na溶液按照120mg/kg/d标准灌胃12mg/mL的姜黄素溶液、按照120mg/kg/d标准灌胃12mg/mL的空白制剂，按120mg/kg/d，GL-Cur按照0.1g中含9.36mg姜黄素计算灌胃制剂的质量，按120mg/kg/d，GL-CPS按照0.1g中含14.25mg姜黄素计算灌胃制剂的质量按120mg/kg/d，GAL-Cur按照0.1g中含11.43mg姜黄素计算灌胃制剂的质量按120mg/kg/d，GAL-CPS按照0.1g中含15.37mg姜黄素计算灌胃制剂的质量。每天监测小鼠的体重(上午、下午各一次)和便血情况，并记录。给药5天后，对小鼠进行安乐死，取血，称量小鼠脾脏、结肠重量，测量结肠长度，剪取固定部位的结肠，浸泡于组织固定液中，用于后续组织病理学变化(苏木精和伊红(H&E)染色)、MPO免疫组织化学染色、巨噬细胞免疫荧光染色。按照ELISA试剂盒中对应的方法，测定血清中促炎症细胞因子(白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α))的量。疾病活动指数(DAI)评分：在第5天观察大鼠的粪便性状、便血及隐血情况，记录体重变化值。参照小鼠DAI评分表进行综合评分，将各组得分相加后除以3，计算每只小鼠的综合得分，以此评价结肠粘膜的病变程度。
表4DAI评分标准
表5结肠组织病理学评分标准
注：各项计分累积后得分求均值为小鼠结肠组织镜中病理变化的最终评分
表6各组小鼠疾病活动指数(DAI)评分(x±s，n＝7)
注：***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05v.s正常组；△△△P＜0.001，△△P＜0.01，△P＜0.05v.sDSS模型组
表7炎症因子TNF-α、IL-6的拟合方程
小鼠体重变化、粪便性状、便血情况和结肠损伤情况等能反应小鼠结肠的严重程度。以DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠为模型，考察了四种非均质凝胶复合给药系统的抗炎效果。图13为小鼠体内抗炎实验结果图。在整个实验过程中DSS模型组在实验第四天死亡一只其余组无死亡情况。最初，我们对各组进行了DAI评分，从表6可见DSS模型组和空白制剂组的DAI分数最高，各个给药组的评分都有所下降；然后我们评估了口服给予不同样品的小鼠体重变化情况，这是评估结肠炎的主要指标，如图13(a)、(b)所示，正常组的小鼠体重波动范围都很小，DSS模型组和空白制剂组的体重下降很明显，证明炎症很严重，而各个给药组其体重下降都有一定减缓；图11(c)为各组小鼠的结肠照片；结肠缩短是结肠上皮屏障破坏，粘膜损伤和结肠炎组织脱水的共同结果，DSS模型组和空白制剂组能明显看见结肠缩短以及粪便不成型；各个给药组在维持小鼠结肠的长度和粪便的完整度方面具有一定程度的效果，而GL-Cur、GL-CPS、GAL-Cur、GAL-CPS与正常组结肠的状态相似，说明能够明显改善小鼠结肠的炎症情况，结肠长度(图13(d))和单位结肠重量(图13(e))的结果也能间接证明这一结果。当在生物体内发生炎症反应时，脾脏和肾脏中会积聚大量免疫细胞，从而导致脏器重量增加。与正常组相比，DSS模型组的脾重/体重比更高，炎症更明显；而各个给药组的脾重/体重比与正常组没有显著差异(图13(f))。其中这四种剂型，以GL-CPS、GAL-Cur的效果最佳。总之，以载姜黄素多孔淀粉的双层非均质凝胶释放的Cur能够明显改善DSS诱发的结肠炎，并在保护结肠和降低死亡率等方面显示出了独特的优势。
为进一步考察各组结肠黏膜的炎症状况，我们对结肠部位的H&E染色切片进行了评估。图14为各组小鼠的结肠组织H&E染色图及H&E染色评分图。如图14(a)所示，正常组的H&E染色图片呈现正常的组织结构，肠粘膜内层由垂直的肠隐窝组成。DSS造模组和空白制剂组能明显看到结肠黏膜完整性极差、断裂、裂解、分离、水肿明显，还伴有肠道隐窝广泛坏死，肠上皮空泡状的杯状细胞减少，黏膜下基层中出现大量的炎性细胞浸润。而各个给药组结肠黏膜明显改善，黏膜屏障功能恢复明显。此外从炎症、病变深度、隐窝破坏、病变范围四个方面对H&E染色切片进行了结肠组织病理学评分(见表5)，评分结果图14(b)显示，各个给药组都与DSS造模组有显著性差异，GL-CPS组和GAL-Cur组与正常组的评分结果更接近，炎症水平更低。上述结果表明，双层微凝胶负载姜黄素或姜黄素多孔淀粉的口服给药能够有效保护结肠组织，减轻结肠组织的炎症水平。
髓过氧化物酶(MPO)是由活化的中性粒细胞、单核细胞以及某些组织的巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶，可作为小鼠炎症严重程度的评价指标。图15是免疫组织化学染色测定MPO图。通过对比各组小鼠结肠组织的MPO免疫组织化学切片结果，图15中箭头所指的棕褐色物质为MPO，DSS模型组和空白制剂组能明显看到部分细胞被MPO浸润呈现棕褐色的强阳性且整个切片的细胞呈现弱阳性的淡黄色，Cur组的MPO含量有一定程度降低，各个制剂组的MPO染色图与正常对照组最为接近，说明以双层微凝胶负载CPS和Cur能有效降低结肠组织中的MPO含量，减轻小鼠的炎症。
F4/80是一种细胞表面糖蛋白，在巨噬细胞的成熟和活化过程中F4/80蛋白的表达发生明显变化。图16是各组小鼠的结肠组织中巨噬细胞的免疫荧光染色图像。如图16所示，通过DAPI对结肠组织的细胞核进行染色呈现蓝色荧光，通过F4/80对巨噬细胞染色以研究巨噬细胞浸润与结肠炎严重程度之间的关系。巨噬细胞在炎症部位产生促炎细胞因子有IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等，被认为与结肠炎的发病机理有关。实验结果表明，与正常对照组相比，DSS模型组和空白制剂组的结肠组织中巨噬细胞浸润情况明显增加，给药组与DSS模型组的对比结果表明，Cur组能明显改善了结肠组织中巨噬细胞的浸润情况，其余四个制剂组表现出更强的效果，进一步证实了以双层微凝胶负载CPS和Cur对结肠炎的治疗表现出更优异的作用。
图17(a)、(b)所示分别表示炎症因子TNF-α的标准曲线图和IL-6的标准曲线图。表7为炎症因子TNF-α、IL-6的拟合方程。图17(c)、(d)为各组在结肠组织中的TNF-α水平含量和IL-6水平含量。炎症的严重程度与促炎症细胞因子的数量有关。在结肠组织中，DSS模型组和空白制剂组的TNF-α、IL-6的浓度最高，达到700pg/mL和460pg/mL；正常对照组TNF-α、IL-6的浓度分别为347pg/mL、254pg/mL，与正常对照组相比，DSS模型组中TNF-α、IL-6的分泌水平显著增加，而各个给药制剂组都与DSS模型组TNF-α水平含量有差异，而GL-CPS和GAL-Cur组与正常对照组炎症因子水平含量相近。表明各组载药制剂都有一定效果能够有效降低血清中促炎症细胞因子的浓度，可以发挥一定的抗炎作用，而GL-CPS和GAL-Cur组的效果最好。
测试例14：小鼠离体器官荧光成像
将荧光染料DiR分散于DMSO中，按照实施例1、实施例3的方法，同药物一并包载于双层微凝胶中，以研究双层微凝胶在组织中的分布情况。选用C57BL/6小鼠作为实验小鼠，各组按8g/kg/d的剂量上午灌胃0.6g/mL的DSS造模，造模成功后以DiR荧光染料20ug/只进行灌胃，在预定的时间间隔解剖得到胃肠道和主要器官进行荧光成像。激发波长为800nm。
将游离的DiR、GL-DiR、GL-DPS、GAL-DiR、GAL-DPS口服灌胃小鼠后，在预定的时间间隔解剖得到整个胃肠道和主要器官，进行荧光成像。图18为各组双层微凝胶的体内生物分布图。图18所示为各组给药0.5、1、2、4、6、8、12、24h后胃肠道的荧光强度变化。当口服游离DiR后在胃肠道分布较快，随着时间流逝荧光强度衰弱，游离DiR迅速从体内消除，6h后只能看到较弱的荧光，在给药12h后荧光消失，而GL-DiR、GL-DPS、GAL-DPS在给药24h后在结肠处仍然能看到荧光并且GL-DPS(图18d)的荧光依旧比较明显。图19为各组双层微凝胶的体内生物分布图。如图19所示，在各组离体器官中游离DiR组在0.5h和1h能看到肝脏有较弱的荧光。其余组在任意时间点心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏没有显著的荧光。表明制备得到的双层微凝胶具有优异的结肠靶向功能，将药物包载在其中能够发挥更好的疗效。
测试例15：肠道菌群分析
最后一天处死小鼠前收集小鼠的粪便，保存于-80℃。样品的DNA提取及16S rDNA测序由百迈客生物科技有限公司负责。根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用IlluminaNovaseq6000进行16S rDNA测序。
肠道微生物群体稳态在维持肠粘膜屏障完整性方面起着至关重要的作用。采用16S rRNA分析法对小鼠肠道微生物进行了研究。图20为各组肠道菌群的丰富度和多样性分析。图20(a)为小鼠肠道菌群门水平物种分布柱状图，按物种丰度厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobiota)、变形杆菌门(Proteobacteria)占主导地位。其中厚壁菌门和拟杆菌门是所有组别的优势菌门，是肠道内普遍存在的主要菌群。与其他组相比，DSS control组和Gels组明显改变了小鼠肠道的菌群组成，Firmicutes、Verrucomicrobiota、Proteobacteria明显增加而Bacteroidetes明显减少。Firmicutes/Bacteroidetes的比值(F/B)是与抗炎呈正相关的关键参数，如图20(b)所示：DSS control和Gels的F/B值明显高于治疗组，这就表明DSS的处理造成了小鼠肠道菌群的结构失衡。5个给药组F/B值较DSS control明显降低(P<0.01)。Verrucomicrobiota、Proteobacteria在肠道显著富集(图20c，20d)导致肠上皮细胞受损黏蛋白聚合物网络降解，肠道完整性受损；Proteobacteria门下的许多细菌都是致病菌，会诱导穿透粘膜层和受损的粘膜屏障。
就物种多样性而言，Black control组物种丰度最高含有更多的(操作分类单元)OTUnumbers，DSS control组的操作单元明显减少，给药组的OTUnumbers有所增加(图21a)。选用Venn图(图21b)对8组样本的小鼠肠道菌群中重叠的和独有的物种进行分析。8组样品含有153个重叠的物种，DSS control组和Gels组具有更少的独特物种。小鼠肠道的菌群组成发生了改变。
α多样性可以用来表示一个特定生态系统内的多样性，反映微生物群落的物种丰度、多样性以及覆盖度。Ace指数和Chao指数用来衡量物种丰度即物种数量的多少。Shannon指数和Simpson指数用于衡量物种多样性。如图(22a、22b)所示，与其他组相比，DSScontrol组肠道微生物α多样性(Ace指数和Chao指数)显著降低(p<0.05)。与其他组相比，DSS control组和Gels组Shannon指数和Simpson指数也有所降低(图22c、22d)。在稀释曲线(Rarefaction curve)中(图23a)由于测序数量的增多造成OTU的数量也会有所增加，但是曲线的上升趋势会逐渐减小直到平坦，这就表明了测序数据量的合理。Shannon稀释性曲线(图23b)迅速增加后一直处于平缓的状态，表示该实验中样品的测序数量充分，可以反映样品中绝大部分微生物的多样性信息。在两者曲线中DSS control组和Gels组处于最下方表明两组的物种丰度、多样性更少。以GL-Cur、GL-CPS、GAL-Cur、GAL-CPS为载体在递送Cur治疗结肠炎的过程中能增加肠道菌群的物种丰富度，减少Verrucomicrobiota、Proteobacteria等致病菌的含量，达到更加有效治疗UC的协同效果。

Claims (6)

1.载药或负载载药多孔淀粉的双层非均质微凝胶递送系统，其特征在于，由两层非均质水凝胶构成，其制备方法包括以下步骤：
（1）将1w/v%-2w/v%低酯果胶溶液和1w/v%-3w/v%多糖溶液混合，向混合所得低酯果胶-多糖溶液中加入药物或载药多孔淀粉和CaCl2粉末，混合均匀，Ca2+与低酯果胶LMP进行物理交联，形成内层水凝胶；
（2）向（1）体系中加入乳化剂，高速剪切形成微乳液，将所得微乳液缓慢滴加到1w/v%-10w/v%海藻酸钠溶液中，Ca2+与SA进行物理交联，形成外层水凝胶；
（3）将（2）所得双层水凝胶置于1w/v%-10w/v%壳聚糖溶液中，交联，洗涤，干燥；
步骤（1）中，所述低酯果胶为苹果低酯果胶或柑橘低酯果胶，所述多糖为瓜尔豆胶，低酯果胶溶液与多糖溶液体积比为1:1，CaCl2粉末与低脂果胶-多糖混合溶液的质量体积之比为0.25g:10mL；
步骤（1）所述药物为抗结肠炎药物；
步骤（2）所用乳化剂为液体石蜡和司盘80；
按低酯果胶-多糖混合溶液、液体石蜡、司盘80体积比为（5-20）:（10-30）:（1-2）取液体石蜡、司盘80加入（1）体系中，在高速剪切机下以8000 rpm-12000rpm均质2-10 min得到微乳。
2.根据权利要求1所述的载药或负载载药多孔淀粉的双层非均质微凝胶递送系统，其特征在于，步骤（1）所述载药多孔淀粉的制备方法为：将药物和多孔淀粉溶解到无水乙醇中密闭搅拌0.5-2 h，离心，干燥；其中，药物与多孔淀粉的质量比为（2-6）:（2-15）。
3.根据权利要求1或2所述的载药或负载载药多孔淀粉的双层非均质微凝胶递送系统，其特征在于，步骤（2）交联时间为1-10 min。
4.根据权利要求1或2所述的载药或负载载药多孔淀粉的双层非均质微凝胶递送系统，其特征在于，步骤（3）壳聚糖的分子量为10万~100万；和/或；
步骤（3）交联时间为30-60 min。
5.权利要求1~4任一所述的载药或负载载药多孔淀粉的双层非均质微凝胶递送系统在制备治疗结肠炎靶向药物中的应用。
6.权利要求1~4任一所述的载药或负载载药多孔淀粉的双层非均质微凝胶递送系统在制备治疗由DSS诱导的结肠炎靶向药物中的应用。
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