CN112655828A - 一种奶牛饲料添加剂及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种奶牛饲料添加剂及其制备方法、应用，其中的奶牛饲料添加剂，包括姜黄素、姜黄挥发油及枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌浓度1×10⁷cfu/mL～1×10¹²cfu/mL；解决现有奶牛使用药物饲料添加剂防治奶牛乳房炎等疾病以致产生广泛耐药性，奶牛乳汁抗生素残留的问题。

Description

一种奶牛饲料添加剂及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及一种混合型饲料添加剂，具体的是一种调节奶牛免疫功能的饲料添加剂。

背景技术

目前在奶牛养殖业中，奶牛乳房炎仍严重影响奶牛健康和经济效益。长期大量使用抗生素治疗奶牛乳房炎，会直接导致细菌产生广泛耐药性，奶牛乳汁抗生素残留，严重影响人类健康。且在动物养殖领域，已全面禁止促生长药物饲料添加剂，饲料禁抗，养殖减抗势在必行。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种奶牛饲料添加剂及其制备方法、应用，解决现有奶牛使用药物饲料添加剂防治奶牛乳房炎等疾病以致产生广泛耐药性，奶牛乳汁抗生素残留的问题。

第一方面，一种奶牛饲料添加剂，其特征在于，包括：姜黄素、姜黄挥发油及枯草芽孢杆菌。

优选地，所述枯草芽孢杆菌浓度1×10⁷cfu/mL～1×10¹²cfu/mL。

优选地，所述姜黄挥发油的制备方法是：将姜黄室通过水蒸气蒸馏法进行提取。

优选地，所述水蒸气蒸馏法提取前将姜黄室温浸泡蒸馏水24h～48h，提取过程中，当馏出液澄清透明时，停止蒸馏，干燥，时间为3h～9h。

优选地，所述姜黄素的制备方法，是采用乙醇对姜黄进行提取获得提取液，然后对所述提取液进行浓缩并醇沉获得。

优选地，所述乙醇提取方法是，采用75％～95％乙醇对姜黄进行提取，1h～2h/次，2～5次；过滤，所述提取液经100～150目不锈钢网过滤入贮罐，合并三次滤液；浓缩；用75％～95％乙醇进行所述醇沉，时长：6～24_h，温度：8～12℃。

优选地，所述枯草芽孢杆菌制备方法，是将枯草芽孢杆菌菌种(CMCCB62501)接种到固体营养琼脂培养基中，37℃倒置培养24h，挑取边缘褶皱的较大的单个菌落于营养肉汤中，37℃培养24h。在菌落生长对数期时，用酶标仪测定在600nm OD值下的菌密度制成所需浓度，以悬浮液保存方式存放在4℃冰箱。

第二方面，所述奶牛饲料添加剂的制备方法，是将姜黄挥发油与姜黄素混合，然后将所述姜黄挥发油与所述姜黄素的混合物中加入所述枯草芽孢杆菌制得。

优选地，所述混合物的制备方法是：

将所述姜黄挥发油与所述姜黄素混合后加入辅料，其中，姜黄挥发油与姜黄素的重量百分含量为50％～95％，然后收膏、制粒、干燥过筛、灭菌、包装。

第三方面，一种奶牛饲料添加剂在提高奶牛免疫能力中的应用。

优选地，所述免疫能力是预防疾病的能力、维持奶牛的奶产量和奶品质的能力、奶牛的体液免疫力和细胞免疫力的一种或几种。

第四方面，一种奶牛饲料添加剂的使用方法，包括：

将奶牛饲料添加剂与日粮混合均匀后进行饲喂，每头牛饲喂奶牛饲料添加剂为100～500g，颈夹关闭30min，确保所述奶牛完全采食后，放开牛颈夹，自由活动，自由饮水，每日1次，28d。

优选地，每头牛饲喂奶牛饲料添加剂为200。

本申请奶牛饲料添加剂组成的单一成分的功能如下：

姜黄气香特异，味微辛、苦，性温。杀黏，防腐，解毒，愈伤，敛疮。药效学研究表明姜黄主要具有影响心血管系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统、神经系统，抗肿瘤，抗炎和调节免疫，抗疲劳，影响代谢，抗瘢痕，抗生育，抗病原微生物，保肝、利胆，降血脂，抗凝血等作用。主治白喉，炭疽，痈疽，尿黄，尿浊，膀胱热，梅毒，淋病，痔疮。姜黄挥发油和姜黄水浸出液二者均有广谱抗真菌的作用，姜黄挥发油对13种常见真菌的MIC抑菌浓度测定范围为1.5％～0.8％，姜黄水浸出液MIC抑菌浓度范围为2.5％～0.16％。

枯草芽孢杆菌，革兰氏阳性需氧杆状菌，可产荚膜，周生鞭毛；芽孢呈椭圆或圆柱状；菌落粗糙，不透明。具有极强抗逆性、易于存活、普遍存在、无致病性、不宜产生抗药性、生长迅速、代谢产物多样、可调节肠道微生态平衡、提高畜禽消化能力、增强饲料利用率、刺激畜禽免疫器官、提高免疫能力、产生维生素等改善畜禽品质作用。应用于发酵工艺，提高畜禽生产性能，防治疾病，净化养殖环境。

本申请的奶牛饲料添加剂为新型无毒无抗饲料添加剂，通过改善肠道菌群、维持激素稳态、提高免疫力等作用，对机体进行调理，提高奶牛产奶量和乳品质，减少疾病发生率。且毒性小、成本低。

本发明的有益效果：

本发明的奶牛饲料添加剂，通过对奶牛免疫功能的调理作用，提高奶牛的免疫能力，维持奶牛激素稳态，改善奶牛肠道菌群结构等，使奶牛发病率降低，进而提高产奶量和乳品质。

附图说明

图1是Rank-Abundance曲线；

图2是样品稀释曲线；

图3是Venn图；

图4是奶牛饲料添加剂对奶牛直肠微生物Alpha多样性的影响Shannon指数分析；计算图4所述指标时，基于97％一致性阈值下的Alpha diversity分析指数。各组间相比较比较，0.01＜P≤0.05标记为*，0.001＜P≤0.01标记为**，P≤0.001标记为***；

图5是奶牛饲料添加剂对奶牛直肠微生物Alpha多样性的影响Simpson指数分析；计算图5所述指标时，基于97％一致性阈值下的Alpha diversity分析指数。各组间相比较比较，0.01＜P≤0.05标记为*，0.001＜P≤0.01标记为**，P≤0.001标记为***；

图6是奶牛饲料添加剂对奶牛直肠微生物Alpha多样性的影响Coverage指数分析；计算图5所述指标时，基于97％一致性阈值下的Alpha diversity分析指数。各组间相比较比较，0.01＜P≤0.05标记为*，0.001＜P≤0.01标记为**，P≤0.001标记为***；

图7是奶牛饲料添加剂对奶牛直肠微生物Alpha多样性的影响Sobs指数分析；计算图5所述指标时，基于97％一致性阈值下的Alphadiversity分析指数。各组间相比较比较，0.01＜P≤0.05标记为*，0.001＜P≤0.01标记为**，P≤0.001标记为***；

图8是奶牛饲料添加剂对KB组与JGJG组门水平奶牛直肠微生物的影响；

图9是奶牛饲料添加剂对KB组与JZJZ组门水平奶牛直肠微生物的影响；

图10是奶牛饲料添加剂对KB组与KZ组门水平奶牛直肠微生物的影响；

图11是奶牛饲料添加剂对KB组与JZ组门水平奶牛直肠微生物的影响；

图12是奶牛饲料添加剂对KB组与HPDT组门水平奶牛直肠微生物的影响；

图13是科水平系统进化树；图中，左边为系统发生进化树，进化树中每条树枝代表一类物种，根据物种所属的高级分类学水平对树枝进行着色，树枝长度为两个物种间的进化距离，即物种的差异程度；右边柱状图展示的是物种在不同分组中的的Reads占比。

具体实施方式

实施例：奶牛饲料添加剂的制备

1、姜黄素和姜黄挥发油制备

(1)姜黄挥发油制备：是将姜黄打碎过80目筛制，姜黄室温浸泡蒸馏水24h，采用水蒸气蒸馏法进行提取，当馏出液澄清透明时，停止蒸馏，干燥，时间约为6h。

(2)姜黄素的制备：采用95％乙醇对姜黄进行提取，1.5h/次，3次；过滤，提取液经120目不锈钢网过滤入贮罐，合并三次滤液；浓缩；用95％乙醇进行醇沉，时长：12h，温度：10℃；回收乙醇；

2、将姜黄挥发油与姜黄素按重量比为1∶10进行混合后加入辅料(糊精和蔗糖)，姜黄挥发油与姜黄素的纯度75％，收膏；制粒；干燥过筛；灭菌；包装。

3、奶牛饲料添加剂制备：将步骤2得到的混合物中加入枯草芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌为浓度2×10⁹cfu/mL。

实验例：具体对奶牛饲料添加剂对奶牛免疫能力产生的影响进行详细说明：

1姜黄素与枯草芽孢杆菌对小鼠体内抗菌保护率试验

1.1试验材料

1.1.1试验试剂

姜黄，购自内蒙古天立药业有限公司；营养琼脂培养基、营养肉汤培养基，购自广东环凯微生物有限公司；乙醇，购自山东丰仓化工有限公司；DMSO(二甲基亚砜)，购自北京酷来搏科有限公司。

1.1.2试验菌株

枯草芽孢杆菌菌种(CMCCB62501)，购自武汉淼灵质粒平台；致病性S.aureus由内蒙古农业大学动物科学学院牛生产实验室提供，来自内蒙古自治区海拉尔市谢尔塔拉第一牧场，患乳房炎的荷斯坦奶牛牛奶中分离，并经分离、纯化、鉴定、保存。

1.1.3试验仪器

立式压力蒸汽灭菌锅(LDZM-40KCS型，上海申安医疗器械厂)；超净工作台(SW-CJ-2D型，苏州博莱尔净化设备有限公司)；恒温培养箱(JC-SPJ-480，济南精诚实验仪器有限公司)；酶标仪(Synergy HT，上海迭戈生物科技有限公司)。

1.1.4试验动物

昆明系小鼠170只，雌雄各半，体重20±2g(内蒙古大学实验动物中心)。

1.2实验方法

1.2.1奶牛饲料添加剂制备参见上述姜黄挥发油和姜黄素制备方法，枯草芽孢杆菌制备方法，试验每组10只小鼠，雌雄各半。连续灌胃7d，每天2次。在给药第4d后停留1h，各试验组小鼠随机腹腔注射0.2ml 80％MLD的S.aureus菌悬液，观察并记录各组感染后72h内的死亡情况，计算保护率。

1.2.2环丙沙星用生理盐水灌服，姜黄素按各组给药含量用含2％DMSO(二甲基亚砜)的生理盐水-DMSO配制后灌服，各组每次灌服0.2ml。

1.2.3给药方案

表1 姜黄素和枯草芽孢杆菌对小鼠体内抗菌保护率给药方案

1.3结果分析

由表2可知，单一给药时，姜黄素高剂量组，枯草芽孢杆菌高剂量组存活率较高，但低于阳性对照组。联合给药时，姜高菌高剂量组存活率高于其他各组，与阳性对照组相同。表明姜黄素和枯草芽孢杆菌联合给药对小鼠体内抑菌效果最好，最优剂量为姜黄素200mg/kg+枯草芽孢杆菌2×10⁹cfu/mL。

表2 姜黄素和枯草芽孢杆菌对小鼠体内抗菌保护率

2奶牛饲料添加剂对奶牛肠道菌群的影响

2.1试验材料

2.1.1试验药物

姜黄素；枯草芽孢杆菌菌悬液；黄芪多糖，购自汝州济生康生物技术有限公司。

2.1.2试验试剂

DNA抽提试剂盒、PCR试剂盒、建库试剂盒、测序试剂，购自上海美吉生物医药科技有限公司；琼脂糖，购自biowest AxyPrep DNA Gel Extraction Kit FastPfu，购自Axygen；Polymerase，购自TransGen。

2.1.3试验仪器

移液器(Eppendorf N13462C型，Eppendorf公司)；小型离心机(ABSON MiFly-6，合肥艾本森科学仪器有限公司)；高速台式冷冻离心机(Eppendorf 5424型，Eppendorf公司)；酶标仪(BioTek ELx800型，Biotek公司)；旋涡混合器(QL-901型，海门其林贝尔仪器制造有限公司)；超微量分光光度计(NanoDrop2000型，Thermo Fisher Scientific公司)；MP研磨仪(FastPrep-24 5G型，MP公司)。

2.1.4试验动物

内蒙古鄂尔多斯达拉特旗骑士牧场随机选取90头、二胎次、泌乳时间为200～220d，身体健康的泌乳中后期荷斯坦奶牛。

2.2试验方法

2.2.1试验设计

采用单因素试验设计，将90头奶牛按添加剂添加量随机分成9组，每组10个重复，预饲期7d，试验期28d。饲喂方案见表3。

表3 奶牛饲料添加剂的饲喂方案

2.2.2饲养管理

奶牛基础日粮配方和营养水平见表4，试验奶牛饲养在同一牛舍，每天饲喂添加剂一次，饲喂时，关闭牛颈夹，确认试验奶牛编号，将奶牛饲料添加剂与少量日粮混合均匀后，逐一饲喂，颈夹关闭30min，确保牛完全采食后，放开牛颈夹，自由活动，自由饮水。

表4 日粮组成和营养水平

注：(1)预混料每千克提供：维生素A280KIU，维生素D50KIU，维生素E1200mg，铜500mg，锰600mg，锌2200mg，镁3000mg，硒10mg，钴14mg，碘40mg。

(2)泌乳净能为计算值，其余为实测值。

2.2.3样品采集

在试验期第7d，奶牛挤奶和采食前，采集奶牛直肠粪样，置于冻存管中，-80℃保存。样品分为九组，每组4个重复，共36个样品。样品标记分别为空白对照组(KB)、黄芪多糖对照组(HQDT)、枯草芽孢杆菌中剂量组(KZ)、姜黄素高剂量组(JG)、姜黄素中剂量组(JZ)、姜黄素低剂量组(JD)、姜高菌高剂量组(JGJG)、姜中菌中剂量组(JZJZ)、姜低菌低剂量组(JDJD)。将样品保存在干冰中送到上海美吉生物医药科技有限公司，利用Illumina公司的Miseq PE300平台对16S rDNA的V3～V4区进行双端进行测序。

2.2.4样品处理

总DNA提取和检测，PCR扩增及产物鉴定、纯化、定量，构建PE文库及Illumina测序，由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

2.2.5生物信息学分析

使用FLASH软件和Trimmomatic软件根据overlap关系对原始测序序列进行拼接、质控和过滤并得到有效序列。使用UPARSE和RDP classifier软件根据97％的相似度区分样本对序列进行可操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)聚类和物种分类学分析。基于OTU聚类分析结果，可以对OTU进行多种多样性指数分析，以及对测序深度的检测；基于分类学信息，可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。在上述分析的基础上，可以对多样本的群落组成和系统发育信息进行多元分析和差异显著性检验等一系列深入的统计学和可视化分析。

2.2.6数据统计与分析

采用美吉生物云对数据进行整理，采用Excel对原始数据进行整理，采用SPSS17.0统计分析软件进行均值比较和单因素ANOVA分析，用Duncan氏法进行多重比较，试验数据用平均值(X±SD)和均方误差(Standard error of leasts quares，SEM)表示。

2.3结果与分析

2.3.1奶牛直肠粪便测序数据

选择97％相似度的OTU分类学水平，利用mothur计算，R语言工具制作相应图表。稀释曲线平缓说明本次测序数据量充足，可以进行后续检测(见图1-3)。通过对16S rDNA的V3～V4区进行双端测序，共获得1742891条有效序列，有效碱基数为719797584bp，平均长度为412.99bp。在OTU水平上进行OUT物种分类学统计，样本菌群分布在16个纲，23个目，44个科，92个属，552个种。由图1可知，下降曲线较为平滑，表明样品物种多样性较高。

2.3.2奶牛饲料添加剂对奶牛直肠微生物Alpha多样性的影响

对样本进行Alpha多样性指数分析以得到群落中物种的丰度、覆盖度和多样性等信息，再通过T检验分析样品组别中是否有差异显著性。由图4所示，在Shannon指数中，JGJG组与KB组差异极显著(P＜0.01)。由图5所示，在Simpson指数中，JGJG组与HPDT组差异极显著(P＜0.01)。由图6所示，在Coverage指数中，JGJG组与KB组差异显著(P＜0.05)。由图7所示，在Sobs指数中，KB组与JGJG组差异极显著(P＜0.01)；HPDT组与JGJG组差异显著(P＜0.05)。Shannon指数，Simpson指数反映物种多样性，Coverage指数反映物种覆盖度，Sobs指数反映物种丰度。由此表明姜黄素和枯草芽孢杆菌奶牛饲料添加剂对物种多样性，覆盖度，丰度均有影响，对丰度影响较大。

2.3.3奶牛饲料添加剂对门水平奶牛直肠微生物的影响

由表5可知，各组优势菌门相似，为厚壁菌门和拟杆菌门，占77％以上。由图8可知，JGJG组和KB组两两比较，Bacteroidetes拟杆菌门和Proteobacteria变形菌门差异显著(P＜0.05)；由图9、10、11、12可知，KB组分别和HPDT组，KZ组，JG组，JZJZ两两比较，Proteobacteria变形菌门差异显著(P＜0.05)，表明一定剂量的姜黄素和枯草芽孢杆菌奶牛饲料添加剂会变形菌门丰度。

表5 奶牛直肠微生物门水平丰度

2.3.4直肠微生物进化分析

通过科水平上序列间碱基的差异分析和根据最大似然法构建进化树，分类水平丰度在前15的物种，使用R语言作图绘制进化树。如图13可知，分类水平丰度在前15的物种分布在厚壁菌门，拟杆菌门，螺旋体门，放线菌门。在每组中，瘤胃菌科广泛存在，且随着添加剂剂量增加而相对增加。Rikenellaceae_RC9_gut_group，norank_Muribaculaceae聚为一支，支持率为72％，Bacteroides，Prevotellaceae_UCG-003聚为一支，支持率为87％，四者以100％支持率聚为一支，归为拟杆菌门。Roseburia，Coprococcus_3聚为一支，支持率为88％，再与unclassified_Lachnospiraceae聚为一支，支持率为71％，再与Blautia聚为一支，支持率为93％，归为厚壁菌门。Paeniclostridium，Romboutsia聚为一支，支持率为98％，归为厚壁菌门。

3姜黄素和枯草芽孢杆菌奶牛饲料添加剂对奶牛免疫指标的影响

3.1试验材料

3.1.1试验药物

姜黄素；枯草芽孢杆菌菌悬液；黄芪多糖，购自汝州济生康生物技术有限公司。

3.1.2试验试剂

磷酸盐缓冲液，购自上海经科化学科技有限公司；溶血素，购自北京索莱宝科技有限公司；鼠抗牛淋巴细胞荧光标记单克隆抗体CD4⁺T-FITC、CD8⁺T-FITC、CD21⁺B-FITC、CD14⁺单核细胞-FITC，购自北京欣博盛生物科技有限公司。ELISA试剂盒，购自上海宝曼生物科技有限公司。

3.1.3试验仪器

高速冷冻离心机(3K15型，德国Sigma公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；漩涡振荡器(上海智诚分析仪器制造公司)；低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；酶标仪(Synergy HT，上海迭戈生物科技有限公司)。

3.1.4试验动物

参见上述奶牛饲料添加剂对奶牛肠道菌群的影响实验用试验动物。

3.2试验方法

3.2.1试验设计、饲养管理

参见上述奶牛饲料添加剂对奶牛肠道菌群的影响实验用试验设计和饲养管理。

3.2.2奶牛饲料添加剂对奶牛免疫指标的影响

在试验期7d、28d，奶牛挤奶和采食前，对其进行尾跟静脉采血，每头取抗凝血2ml，分别取200μL全血加入流式细胞管中，加入按10∶1比例与超纯水稀释的2ml溶血素，悬浮振荡，静置15min，2000g离心5min，弃上清液；对沉淀加2ml PBS清洗，悬浮振荡，静置15min，2000g离心5min，弃上清液；加500ml PBS涡旋振荡使细胞悬浮制成细胞悬浮液，调整细胞浓度为1×10⁶个/μL；分别加入鼠抗牛淋巴细胞荧光标记单克隆抗体CD4⁺T-FITC、CD8⁺T-FITC、CD21⁺B-FITC、CD14⁺单核细胞-FITC，4℃避光标记孵育30min，加2mL PBS，2000g离心5min，弃上清；沉淀中加500μL PBS，悬浮振荡，流式细胞仪检测其中CD4⁺T、CD8⁺T、CD21⁺B、CD14⁺单核细胞所占百分数。

在试验期7d、28d，奶牛挤奶和采食前，对其进行尾跟静脉采血，每次采集3ml，采集后室温静置6h，待血细胞充分凝结后析出血清，3500r/min离心5min，分离血清，-20℃保存。用ELISA检测试剂盒，按照说明书检测血清中CD3、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，γ干扰素(IFN-γ)、NAGase(酶N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶)、IgG(免疫球蛋白G)的含量，使用酶标仪测出样品及标准品在OD450nm处的吸光值，根据标准品的浓度及对应OD值得出标准曲线的回归曲线，计算各样本中上述细胞因子的相应浓度。

3.2.3数据分析

采用Excel对原始数据进行整理，采用SPSS 17.0统计分析软件进行均值比较和单因素ANOVA分析，用Duncan氏法进行多重比较，试验数据用平均值(X±SD)和均方误差表示。

3.3结果与分析

3.3.1奶牛饲料添加剂对奶牛CD4⁺T淋巴细胞及其亚群的影响

CD4⁺在同时间点不同组间比较：饲喂7d时，枯草芽孢杆菌中剂量组、姜黄提取物高剂量组、姜高菌高剂量组显著高于空白对照组(P＜0.05)，姜高菌高剂量组最高；饲喂28d时，枯草芽孢杆菌中剂量组、姜黄提取物高剂量组、姜高菌高剂量、姜中菌中剂量组显著高于空白对照组(P＜0.05)，姜高菌高剂量组最高；其他组差异不显著(P＞0.05)。

CD4⁺在不同时间点同组间比较：姜黄提取物高剂量组、姜中菌中剂量组饲喂7d时显著高于饲喂28d时(P＜0.05)；姜高菌高剂量组饲喂7d时极显著高于饲喂28d时(P＜0.01)；其他组差异不显著(P＞0.05)。

表6 奶牛饲料添加剂对奶牛CD4⁺T的影响

注：数据右上角标注小写字母表示同列之间的比较，大写字母表示同行之间的比较，标注相同字母差异不显著(P＞0.05)；标注不相同字母，相邻字母差异显著(P＜0.05)，相间字母差异极显著(P＜0.01).以下同。

3.3.2奶牛饲料添加剂对奶牛CD8⁺T淋巴细胞及其亚群的影响

CD8⁺在同时间点不同组间比较：饲喂7d时，枯草芽孢杆菌中剂量组、姜黄提取物高剂量组、姜中菌中剂量组、姜高菌高剂量组显著低于空白对照组(P＜0.05)；姜高菌高剂量组最低。饲喂28d时，枯草芽孢杆菌中剂量组显著低于空白对照组(P＜0.05)；姜黄提取物高剂量组、姜高菌高剂量组极著低于空白对照组(P＜0.01)，姜高菌高剂量组最低；其他组差异不显著(P＞0.05)。

CD8⁺在不同时间点同组间比较：姜黄提取物低剂量组、姜低菌低剂量组7d时显著低于饲喂28d时(P＜0.05)；其他组差异不显著(P＞0.05)。

表7 奶牛饲料添加剂对奶牛CD8⁺T的影响

3.3.3奶牛饲料添加剂对奶牛CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞及其亚群的影响

CD4⁺/CD8⁺在同时间点不同组间比较：饲喂7d时，枯草芽孢杆菌中剂量组著高于空白对照组(P＜0.05)；姜黄提取物高剂量组、姜高菌高剂量组极显著高于空白对照组(P＜0.01)，姜高菌高剂量组最高；饲喂28d时，黄芪多糖对照组、姜黄提取物高剂量组著高于空白对照组(P＜0.05)；姜高菌高剂量组极显著高于空白对照组(P＜0.01)；其他组差异不显著(P＞0.05)。

CD4⁺T/CD8⁺T在不同时间点同组间比较：各组件无显著性差异(P＞0.05)。

表8 奶牛饲料添加剂对奶牛CD4⁺/CD8⁺T的影响

3.3.4奶牛饲料添加剂对奶牛CD21⁺B淋巴细胞及其亚群的影响

CD21⁺在同时间点不同组间比较：饲喂7d时，姜黄提取物高剂量组、姜高菌高剂量组显著高于空白对照组(P＜0.05)；饲喂28d时，枯草芽孢杆菌中剂量组、姜黄提取物高剂量组、姜中菌中剂量组显著高于空白对照组(P＜0.05)，姜高菌高剂量组、黄芪多糖对照组极显著高于空白对照组(P＜0.01)；其他组差异不显著(P＞0.05)。

CD21⁺在不同时间点同组间比较：姜黄提取物高剂量组、姜中菌中剂量组饲喂7d时显著高于饲喂28d时(P＜0.05)；黄芪多糖对照组饲喂7d时极显著高于饲喂28d时(P＜0.01)；其他组差异不显著(P＞0.05)。

表9 奶牛饲料添加剂对奶牛CD21⁺的影响

3.3.5奶牛饲料添加剂对奶牛CD14⁺单核细胞及其亚群的影响

CD14⁺在同时间点不同组间比较：空白对照组、姜黄提取物低剂量组极显著高于其他各组(P＜0.01)，姜高菌高剂量组最低；饲喂28d时，空白对照组极显著高于其他各组(P＜0.01)，姜高菌高剂量组最低；其他组差异不显著(P＞0.05)。

CD14⁺在不同时间点同组间比较：各组件无显著性差异(P＞0.05)。

表10 奶牛饲料添加剂对奶牛CD14⁺的影响

3.3.6奶牛饲料添加剂对奶牛血清中CD3含量的影响

CD3含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时，姜黄素高剂量组、姜中菌中剂量组显著高于空白对照组(P＜0.05)；姜高菌高剂量组极显著高于空白对照组(P＜0.01)；饲喂28d时，姜高菌高剂量组显著高于空白对照组(P＜0.05)；其他组差异不显著(P＞0.05)。

CD3含量在不同时间点同组间比较：各组件无显著性差异(P＞0.05)。

表11 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中CD3含量的影响 ng/L

3.3.7奶牛饲料添加剂对奶牛血清中IL-1含量的影响

IL-1含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时，黄芪多糖对照组、姜黄素高剂量组、姜高菌高剂量组显著低于空白对照组(P＜0.05)；姜高菌高剂量组最低。饲喂28d时，黄芪多糖对照组、姜黄素高剂量组、姜高菌高剂量组、姜中菌中剂量组显著低于空白对照组(P＜0.05)姜高菌高剂量组最低；其他组差异不显著(P＞0.05)。

IL-1含量在不同时间点同组间比较：各组件差异不显著(P＞0.05)。

表12 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中IL-1含量的影响 ng/mL

3.3.8奶牛饲料添加剂对奶牛血清中IL-6含量的影响

IL-6含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时，黄芪多糖对照组、姜黄素高剂量组、姜高菌高剂量组显著低于空白对照组(P＜0.05)；姜高菌高剂量组最低。饲喂28d时，黄芪多糖对照组、姜黄素高剂量组、姜黄素中剂量组、姜高菌高剂量组显著低于空白对照组(P＜0.05)，姜高菌高剂量组最低；其他组差异不显著(P＞0.05)。

IL-6含量在不同时间点同组间比较：各组件差异不显著(P＞0.05)。

表13 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中IL-6含量的影响 ng/mL

3.3.9奶牛饲料添加剂对奶牛血清中IL-8含量的影响

IL-8含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d、28d时，黄芪多糖对照组、姜黄素高剂量组、姜高菌高剂量组奶牛血清中的IL-8含量显著低于空白对照组(P＜0.05)，姜高菌高剂量组最低；其他组差异不显著(P＞0.05)。

IL-8含量在不同时间点同组间比较：各组件差异不显著(P＞0.05)。

表14 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中IL-8含量的影响 ng/mL

3.3.10奶牛饲料添加剂对奶牛血清中TNF-α含量的影响

TNF-α含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时，奶牛血清中TNF-α含量黄芪多糖对照组、姜高菌高剂量组显著低于空白对照组(P＜0.05)，黄芪多糖对照组最低；饲喂28d时，黄芪多糖对照组、姜黄素高剂量组、姜高菌高剂量组显著低于空白对照组(P＜0.05)，黄芪多糖对照组最低；其他组差异不显著(P＞0.05)。

TNF-α含量在不同时间点同组间比较：各组件差异不显著(P＞0.05)。

表15 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中TNF-α含量的影响 ng/mL

3.3.11奶牛饲料添加剂对奶牛血清中IL-2含量的影响

IL-2含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d、28d时，黄芪多糖对照组、姜黄素高剂量组、姜高菌高剂量组奶牛血清中的IL-2含量显著高于空白对照组(P＜0.05)；黄芪多糖对照组最高，其他组奶牛血清中的IL-2含量与空白对照组差异不显著(P＞0.05)。

IL-2含量在不同时间点同组间比较：各组件差异不显著(P＞0.05)。

表16 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中IL-2含量的影响ng/mL

3.3.12奶牛饲料添加剂对奶牛血清中IL-10含量的影响

IL-10含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时，黄芪多糖对照组、姜高菌高剂量组奶牛血清中的IL-10含量显著高于空白对照组(P＜0.05)，姜高菌高剂量组最高；饲喂28d时，黄芪多糖对照组、姜黄素高剂量组、姜高菌高剂量组奶牛血清中的IL-10含量显著高于空白对照组(P＜0.05)，姜高菌高剂量组最高；其他组与对照组差异不显著(P＞0.05)。

IL-10含量在不同时间点同组间比较：各组件差异不显著(P＞0.05)。

表17 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中IL-10含量的影响 ng/mL

3.3.13奶牛饲料添加剂对奶牛血清中IFN-γ含量的影响

IFN-γ含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d、28d时，黄芪多糖对照组、姜黄素高剂量组、姜高菌高剂量组奶牛血清中的IFN-γ含量显著高于空白对照组(P＜0.05)；其他组与空白对照组相比差异不显著(P＞0.05)。

IFN-γ含量在不同时间点同组间比较：各组件无显著性差异(P＞0.05)。

表18 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中IFN-γ含量的影响 ng/mL

3.3.14奶牛饲料添加剂对奶牛血清中IgG含量的影响

IgG含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d和28d时，奶牛血清中IgG含量姜黄素中剂量组、姜中菌中剂量组、姜低菌低剂量组显著高于空白对照组(P＜0.05)；姜黄素高剂量组、姜高菌高剂量组极显著高于空白对照组(P＜0.01)；姜高菌高剂量组最高，其他组差异不显著(P＞0.05)。

IgG含量在不同时间点同组间比较：各组件差异不显著(P＞0.05)。

表19 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中IgG含量的影响 g/L

3.3.15奶牛饲料添加剂对奶牛血清中NAGase含量的影响

NAGase含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时，奶牛血清中NAGase含量姜黄素高剂量组、姜高菌高剂量组显著低于空白对照组(P＜0.05)；饲喂28d时，姜高菌高剂量组显著低于空白对照组(P＜0.05)；其他组差异不显著(P＞0.05)。

NAGase含量在不同时间点同组间比较：各组件差异不显著(P＞0.05)。

表20 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中NAGase含量的影响 u/mL

4奶牛饲料添加剂对奶牛血清中相关激素含量的影响

4.1试验材料

4.1.1试验药物、试验试剂、试验仪器、试验动物

参见上述奶牛饲料添加剂对奶牛肠道菌群的影响试验材料。

4.2试验方法

4.2.1试验设计、饲养管理

参见上述奶牛饲料添加剂对奶牛肠道菌群的影响试验设计及饲养管理。

4.2.2姜黄素和枯草芽孢杆菌奶牛饲料添加剂对奶牛血清中相关激素含量的影响

检测血清中催乳素(PRL)、生长激素(GH)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(Cor)、肾上腺素(E)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、促甲状腺激素(TSH)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)含量。

4.3结果与分析

4.3.1奶牛饲料添加剂对奶牛血清中PRL含量的影响

PRL含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时和28d时，奶牛血清中PRL含量差异不显著(P＞0.05)。

PRL含量在不同时间点同组间比较：各组件差异不显著(P＞0.05)。

表21 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中PRL含量的影响 pg/mL

4.3.2奶牛饲料添加剂对奶牛血清中GH含量的影响

GH含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时和28d时，奶牛血清中GH含量差异不显著(P＞0.05)。

GH含量在不同时间点同组间比较：各组件差异不显著(P＞0.05)。

表22 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中GH含量的影响 ng/mL

4.3.3奶牛饲料添加剂对奶牛血清中CRH含量的影响

CRH含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时和28d时，奶牛血清中CRH含量差异不显著(P＞0.05)。

CRH含量在不同时间点同组间比较：各组件差异不显著(P＞0.05)。

表23 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中CRH含量的影响 ng/mL

4.3.4奶牛饲料添加剂对奶牛血清中ATCH含量的影响

ATCH含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时和28d时，奶牛血清中ATCH含量差异不显著(P＞0.05)。

ATCH含量在不同时间点同组间比较：各组件差异不显著(P＞0.05)。

表24 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中ATCH含量的影响 pg/mL

4.3.5奶牛饲料添加剂对奶牛血清中COR含量的影响

COR含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时和28d时，奶牛血清中COR含量差异不显著(P＞0.05)。

COR含量在不同时间点同组间比较：各组间差异不显著(P＞0.05)。

表25 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中COR含量的影响 ng/mL

4.3.6奶牛饲料添加剂对奶牛血清中E含量的影响

E含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时和28d时，奶牛血清中E含量差异不显著(P＞0.05)。

E含量在不同时间点同组间比较：各组间差异不显著(P＞0.05)。

表26 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中E含量的影响 ng/L

4.3.7奶牛饲料添加剂对奶牛血清中TRH含量的影响

TRH含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时和28d时，奶牛血清中TRH含量差异不显著(P＞0.05)。

TRH含量在不同时间点同组间比较：各组间差异不显著(P＞0.05)。

表27 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中TRH含量的影响 pg/mL

4.3.8奶牛饲料添加剂对奶牛血清中TSH含量的影响

TSH含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时和28d时，奶牛血清中TSH含量差异不显著(P＞0.05)。

TSH含量在不同时间点同组间比较：各组件差异不显著(P＞0.05)。

表28 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中TSH含量的影响 μIU/L

4.3.9奶牛饲料添加剂对奶牛血清中T3含量的影响

T3含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时和28d时，奶牛血清中T3含量差异不显著(P＞0.05)。

T3含量在不同时间点同组间比较：各组件差异不显著(P＞0.05)。

表29 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中T3含量的影响 ng/mL

4.3.10奶牛饲料添加剂对奶牛血清中T4含量的影响

T4含量在同时间点不同组间比较：饲喂7d时和28d时，奶牛血清中T4含量差异不显著(P＞0.05)。

T4含量在不同时间点同组间比较：各组件差异不显著(P＞0.05)。

表30 奶牛饲料添加剂对奶牛血清中T4含量的影响 ng/Ml

通过以上实验例的结果可以看出：

姜黄素和姜黄挥发油是姜黄的主要成分，具有抗炎，抗应激，抗氧化，抗肿瘤，提高免疫力等作用。枯草芽孢杆菌具有提高机体免疫力，维持肠道菌群稳态等特点；同时可通过分泌纤维降解酶等活性物质，提高如黄芪、黄芩等中草药的利用率。本试验以醇沉为主要方式，从姜黄中提取姜黄素和姜黄挥发油制成成品姜黄提取物，联合枯草芽孢杆菌对小鼠进行体内抑菌试验，结果表明，姜黄素和枯草芽孢杆菌联合使用拥有较好的抑菌效果，其最优剂量为姜黄素200mg/kg+枯草芽孢杆菌2×10⁹cfu/mL。

肠道菌群及生活在哺乳动物消化道中的微生物群落。在过去的几十年中，大量的临床研究表明肠道菌群与宿主的生理稳态有关，特别是免疫系统。均衡的胃肠微生物种群为其宿主提供营养和代谢益处，调节免疫系统和各种信号分子，保护肠道免受病原体入侵，并促进健康的肠道结构和调节肠道功能。研究表明，用抗生素治疗会导致肠道微生物的组成和功能发生巨大变化。在过去的几十年中，减少抗生素的使用一直是研究的热点。欧洲禁止使用抗生素添加剂，增加了饲料添加剂的使用量，提高动物的生长性能和健康状况。适当使用饲料添加剂可以通过调节胃肠道黏膜和微生物组来预防疾病并提高生产性能。常用饲料添加剂的类型包括酸、矿物质、益生元、益生菌、酵母、核苷酸和植物产物等。对奶牛日常添加姜黄素和枯草芽孢杆菌奶牛饲料添加剂，采用16sDNA方法对奶牛粪便进行分析，共获得1742891条有效序列，有效碱基数为719797584bp，平均长度为412.99bp。在OTU水平上进行OUT物种分类学统计，样本菌群分布在16个纲，23个目，44个科，92个属，552个种。按照97％相似性对有效数据进行OTU聚类，得到1552个OUT。Rank-Abundance曲线下降较为平滑，物种多样性较高。对样本进行Alpha多样性指数分析，在Shannon指数中，JGJG组与KB组差异极显著(P＜0.01)。在Simpson指数中，JGJG组与HPDT组差异极显著(P＜0.01)。在Coverage指数中，JGJG组与KB组差异显著(P＜0.05)。在Sobs指数中，JGJG组与KB组差异极显著(P＜0.01)；HPDT组与JGJG组差异显著(P＜0.05)。Shannon指数，Simpson指数反映物种多样性，Coverage指数反映物种覆盖度，Sobs指数反映物种丰度。由此表明姜黄素和枯草芽孢杆菌奶牛饲料添加剂对物种多样性，覆盖度，丰度均有影响，相对增加物种丰度，以姜高菌高剂量为佳。对样本进行直肠微生物门水平分析，优势菌门为厚壁菌门和拟杆菌门，JGJG组和KB组两两比较，Bacteroidetes拟杆菌门和Proteobacteria变形菌门差异显著(P＜0.05)，一定剂量的姜黄素和枯草芽孢杆菌奶牛饲料添加剂会提高变形菌门丰度。对样本直肠微生物进行进化分析，科水平分类丰度在前15的物种，分布在厚壁菌门、拟杆菌门、螺旋体门、放线菌门。瘤胃菌科广泛存在，且随着添加剂剂量增加而相对增加。研究表明，Proteobacteria变形菌门与IL-6呈正相关，与TNF-α呈负相关，与本试验结果一致。研究表明，肠道微生物群的稳态失调可能是奶牛乳腺炎的一个原因，恢复肠道微生物群是防治乳腺炎的有效且安全的策略。对奶牛日常添加姜黄素和枯草芽孢杆菌奶牛饲料添加剂，改变了奶牛肠道菌群物种丰度，为防治奶牛乳房炎等提供新的视角。

单核细胞和巨噬细胞是先天免疫系统的重要细胞，具有多种功能，包括吞噬入侵的病原体，吞噬坏死细胞及碎片，在MHC I类和II类分子中呈递抗原以及产生各种活性因子。研究表明，姜黄素对炎症的强烈抑制，其中巨噬细胞起主要作用，影响巨噬细胞活性并诱导M2表型极化，从而抑制活化巨噬细胞中多个白介素家族成员(IL-1，IL-6，IL-8等)的表达和产生。姜黄素诱导的吞噬作用首先被认为是姜黄素的细胞毒性导致的死细胞引起的继发作用，姜黄素抑制LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞的正常刺激反应，包括TNF-α和IL-1β的分泌以及CD14和CD40的表达。IL-2可活化吞噬细胞，刺激T、B细胞增殖。试验结果表明：在整个饲喂过程中，姜高菌高剂量组CD4+细胞含量显著高于空白对照组(P＜0.05)，且随着饲喂时间的延长含量升高；CD8⁺细胞含量显著低于空白对照组(P＜0.05)，CD4⁺/CD8⁺比值显著高于空白对照组(P＜0.05)；CD21⁺细胞含量极显著高于空白对照组(P＜0.05)，CD14⁺细胞含量显著低于空白对照组(P＜0.05)；奶牛血清中的IL-1，IL-6，IL-8，TNF-α含量姜高菌高剂量组显著低于空白对照组(P＜0.05)，CD3，IL-2，IL-10，IFN-γ，IgG含量姜高菌高剂量组显著高于空白对照组(P＜0.05)。NAGase水平代表着奶牛乳腺上皮细胞的破坏和奶牛乳腺炎的发病程度。试验结果表明，奶牛血清中NAGase含量姜高菌高剂量组显著低于空白对照组(P＜0.05)。说明高剂量姜黄素和枯草芽孢杆菌混合型饲料可以提高奶牛免疫水平。

激素对动物的代谢、生长、发育和繁殖等起重要的调节作用。下丘脑-腺垂体-肾上腺皮质轴主要通过调节促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(Cor)使肾上腺皮质发育，促进蛋白质、脂肪分解，升高血糖浓度；下丘脑-腺垂体-甲状腺轴主要通过调节促甲状腺激素释放激素(TRH)、促甲状腺激素(TSH)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)促进蛋白质、脂肪分解，升高血糖浓度，增加组织产热，促进机体生长发育，当奶牛T3、T4不足时，产奶量和乳脂率均降低；促肾上腺皮质激素(ACTH)可间接通过糖皮质激素促进肾上腺髓质激素的合成，肾上腺素(E)促进肌糖元分解、肝糖异生，血糖升高，加强脂肪组织脂肪分解，加快心跳，提高心输出量。催乳素(PRL)促进乳腺发育，促进完全具备泌乳条件的乳腺维持泌乳，同时催乳素可以协同细胞因子促进淋巴细胞增殖和抗体产生，调节机体免疫功能；生长激素(GH)促进蛋白质合成、抑制其分解，促进脂肪和脂肪酸分解供能，抑制葡萄糖的利用使血糖升高，使能量来源转向脂肪代谢。当ACTH和GC释放量增加时，使机体对有害刺激耐受力增强。通过测定奶牛血清中部分激素含量，分析姜黄素和枯草芽孢杆菌奶牛饲料添加剂对奶牛血清中激素含量的影响。结果表明奶牛日粮添加姜黄素和枯草芽孢杆菌奶牛饲料添加剂对奶牛血清中催乳素(PRL)、生长激素(GH)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(Cor)、肾上腺素(E)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、促甲状腺激素(TSH)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)无显著性影响(P＞0.05)，但随着姜黄素和枯草芽孢杆菌奶牛饲料添加剂饲喂剂量增加而增加。这与激素水平小幅度增加是一致的。其他研究表明长期使用姜黄素对内分泌具有调理作用，例如姜黄素治疗可以逆转神经内分泌系统的异常，HPA系统的畸变和暴露于无法控制和不可预测的慢性应激引起的行为缺陷。动物受到慢性应激的影响会导致多种生理效应，例如血清皮质酮水平升高，肾上腺皮质厚度增加和糖皮质激素受体mRNA表达下调，而长期服用姜黄素可以逆转这种情况。因此，这一结果出现，说明长期饲喂姜黄素和枯草芽孢杆菌奶牛饲料添加剂可维持内分泌稳态，并提高生产性能。

肠道菌群通过表面抗原和自身代谢产物等调节肠道神经-内分泌-免疫系统功能，而肠道神经-内分泌-免疫系统之间的相互作用维持胃肠道和机体的稳态。试验结果表明姜黄素和枯草芽孢杆菌奶牛饲料添加剂对肠道菌群、内分泌，免疫系统均有调节，可提高菌群丰度和奶牛免疫力，维持激素水平稳态，从而减少奶牛疾病发生。

综上所述，姜黄素和枯草芽孢杆菌奶牛饲料添加剂能在肠道菌群、免疫系统和内分泌系统等多方面对机体进行调节，从而提高奶牛的免疫能力。

应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、同等替换、改进等，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种奶牛饲料添加剂，其特征在于，包括：

姜黄素、姜黄挥发油及枯草芽孢杆菌。

2.根据权利要求1所述的奶牛饲料添加剂，其特征在于：

所述枯草芽孢杆菌浓度1×10⁷cfu/mL～1×10¹²cfu/mL。

3.根据权利要求1所述的奶牛饲料添加剂，其特征在于，所述姜黄挥发油的制备方法是：

将姜黄室通过水蒸气蒸馏法进行提取。

4.根据权利要求1所述的奶牛饲料添加剂，其特征在于，所述姜黄素的制备方法是：

采用乙醇对姜黄进行提取获得提取液；

对所述提取液进行浓缩并醇沉获得。

5.根据权利要求1所述的奶牛饲料添加剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌制备方法是：

将枯草芽孢杆菌菌种(CMCCB62501)接种到固体营养琼脂培养基中，37℃倒置培养24h，挑取边缘褶皱的较大的单个菌落于营养肉汤中，37℃培养24h。在菌落生长对数期时，用酶标仪测定在600nm OD值下的菌密度制成所需浓度，以悬浮液保存方式存放在4℃冰箱。

6.一种奶牛饲料添加剂的制备方法，其特征在于：

将姜黄挥发油与姜黄素混合，然后将所述姜黄挥发油与所述姜黄素的混合物中加入所述枯草芽孢杆菌制得。

7.根据权利要求6所述的奶牛饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述混合物的制备方法是：

将所述姜黄挥发油与所述姜黄素混合后加入辅料，其中，姜黄挥发油与姜黄素的重量百分含量为50％～95％，然后收膏、制粒、干燥过筛、灭菌、包装。

8.一种奶牛饲料添加剂在提高奶牛免疫能力中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

所述免疫能力是预防疾病的能力、维持奶牛的奶产量和奶品质的能力、奶牛的体液免疫力和细胞免疫力的一种或几种。

10.一种奶牛饲料添加剂的使用方法，其特征在于，包括：

将奶牛饲料添加剂与日粮混合均匀后进行饲喂，每头牛饲喂奶牛饲料添加剂为100～500g，颈夹关闭30min，确保所述奶牛完全采食后，放开牛颈夹，自由活动，自由饮水，每日1次，28d。

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