CH633827A5 - Process for the production of a test system for the detection of gram-negative microorganisms - Google Patents

Description

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PATENTANSPRÜCHE

Verfahren zur Herstellung eines Testsystems zum Nachweis gramnegativer Keime über deren Aminopeptidaseakti-vität durch bakterielle Hydrolyse spezifischer Enzymsubstrate, dadurch gekennzeichnet,

a) dass man eine Lösung von 0,1 bis 50% (Gewicht/ Volumen) einer a-Aminosäure einsetzt, die über eine Peptid-bindung mit einer Komponente verknüpft ist, welche nach Spaltung der Peptidbindung farbig ist,

b) dass man dieser Lösung wässrige Puffersysteme hinzufügt, die einen pH-Wert zwischen 5 und 9 gewährleisten und c) dass man die Testlösung auf oder in ein Trägermaterial einbringt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Testsystems zum Nachweis grammnegativer Keime über deren Aminopeptidaseaktivität durch bakterielle Hydrolyse spezifischer Enzymsubstrate.

Das von H. Ch. Gram eingeführte Färbeverfahren ist mehrstufig, erfordert mehrere Reagentien und ist nur mikroskopisch auswertbar. Nach der Gramfärbung erscheinen grampositive Bakterienzellen blau, gramnegative hingegen rot.

Andere Unterscheidungsmethoden zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien, z.B. chemische Zellwandanalysen, sind für Routinetests wegen des grossen Zeit-und Materialaufwandes undenkbar.

Die Erfindung bezweckt ein Verfahren zur Herstellung eines Testsystems zu schaffen, welches auf einfache Weise eine rasche Unterscheidung zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterienkolonien auf festen Bakteriennährböden gestattet und in flüssigen Medien den Nachweis gramnegativer Keime ermöglicht. Bei diesem neuen Testsystem werden gramnegative Bakterien über ihre Aminopeptidase-Aktivität nachgewiesen.

Die Aminopeptidase wurde bei E. coli und vier weiteren gramnegativen Bakterienstämmen von Teuber und Cerny erstmals beschrieben [Arch. Mikrobiol. Bd. 91, S. 235-240 (1973) und konnte bei zehn untersuchten grampositiven Bakterienstämmen nicht oder nur mit erheblich verminderter Aktivität aufgefunden werden. Das Enzym wurde in der Folge auch von Lazdunski und Mitarbeitern [Eur. J. Bio-chem. Bd. 60, S. 349-369 (1975)] unter dem Namen «Ami-noendopeptidase» beschrieben.

Als Enzymsubstrate der Aminopeptidase eignen sich vornehmlich Verbindungen, die dadurch charakterisiert sind, dass eine a-Aminosäure über eine Peptidbindung mit einer Komponente verknüpft ist, welche in freiem Zustand (d.h. nach Spaltung der Peptidbindung) farbig ist.

Teuber und Cerny setzen als Aminopeptidasesubstrate 4-NitroaniIide von a-Aminosäuren ein. Diese Verbindungen sind in wässeriger Lösung im mittleren pH-Bereich (5-9) farblos.

Durch die Aminopeptidaseaktivität wird aus diesen Verbindungen p-Nitranilin abgespalten, was durch eine Gelbfärbung erkennbar wird. Die Enzymreaktion soll am Beispiel des L-Alanin-4-nitroanilids veranschaulicht werden:

L-AIanin-4-nitroaniIid Aminopeptidase L-Alanin + (farblos) (farblos)

+ p-Nitranilin (Re't>)

Neben den von Teuber und Cerny und in der Folge auch von Lazdunski und Mitarbeitern eingesetzten handelsüblichen Aminosäurenitroaniliden wurden von Lazdunski und Mitarbeitern auch Aminosäurenaphthylamide («Eur. J. Bio-chem.» Bd. 60, S. 363-369 [1975]) eingesetzt. Als geeignetste Verbindung hat sich jedoch das von Teuber und Cerny (Arch. Mikrobiol. Bd. 91, S. 235-240 [1973]) erstmals als Aminopeptidasesubstrat grammnegativer Zellen verwendete L-Alanin-4-nitroanilidhydrochlorid erwiesen.

Der Enzymnachweis wurde von Teuber und Cerny, sowie von Lazdunski und Mitarbeitern derart durchgeführt, dass die Bakterienzellen direkt mit wässrigen Lösungen der entsprechenden Enzymsubstrate in Berührung gebracht wurden, also durch Zupipettieren zu Bakteriensuspensionen bzw. bei Verwendung fester Bakteriennährböden durch Giessen der Substratlösungen auf die Bakterienkolonien.

Störend erweist sich zudem die rasche Diffusion, des farbigen Spaltproduktes der Enzymreaktion (vornehmlich p-Nitranilin) in den umliegenden Nähragar, wodurch die Nachweisgenauigkeit erheblich vermindert wird. Kleine Bakterienkolonien (mit Durchmessern unter 2 mm) können aufgrund des geringen Kontrastes meist nicht auf ihr Aminopeptida-severhalten getestet werden.

Sollte die Aminopeptidasereaktion für Routinetests Verwendung finden, war es erforderlich, ein einfach zu handhabendes, beständiges Material hoher Nachweisempfindlichkeit zu entwickeln, das auch ungeübtem Personal eine Auswertung erlaubt.

Umfangreiche Untersuchungen von Cerny (unveröffentlicht) an über 10 Bakterienisolaten aus Lebensmitteln und Packstoffen haben ergeben, dass, von seltenen Ausnahmen abgesehen, die Aminopeptidase als typisches Merkmal gramnegativer Bakterien betrachtet werden kann. Die Aminopeptidase konnte in eigenen Versuchen bei folgenden gramnegativen Bakteriengattungen nachgewiesen werden: Pseudomonas, Escherichia, Proteus, Salmonella (bei allen 12 untersuchten Stämmen), Achromobacter, Alcaligenes, Shigella, Haemophilus, Arizona, Citrobacter, Enterobacter undNeis-seria. Zu den Ausnahmen zählen beispielsweise der gramnegative Bacillus stearothermophilus, der aminopeptidase-negativ ist, sowie einige Stämme von Bacillus licheniformis (grampositiv), welche eine schwache Aminopeptidaseaktivität besitzen.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet:

a) dass man eine Lösung von 0,1 bis 50% (Gewicht/ Volumen) einer a-Aminosäure einsetzt, die über eine Peptidbindung mit einer Komponente verknüpft ist, welche nach Spaltung der Peptidbindung farbig ist,

b) dass man dieser Lösung wässrige Puffersysteme hinzufügt, die einen pH-Wert zwischen 5 und 9 gewährleisten und c) dass man die Testlösung auf oder in ein Trägermaterial einbringt.

Nachfolgend wird das erfindungsgemässe Verfahren beschrieben. Es wird ein Testsystem zum Nachweis amino-peptidasepositiver Mikroorganismen hergestellt, welche den typischen gramnegativen Keimen zuzurechnen sind.

Die Trägermaterialien sollen die Enzymsubstrate über einen längeren Zeitraum in unverändertem Zustand erhalten und ohne weitere Manipulationen direkt einsetzbar sein. Für den Nachweis gramnegativer Bakterienkolonien auf Agar-nährböden wird gefordert, dass das Trägermaterial die Diffusion des in der Aminopeptidasereaktion entstandenen Spaltproduktes (z.B. p-Nitranilin) in der Fläche des Trägermaterials erschwert, weil dadurch die Nachweisgenauigkeit erhöht und die Zeit bis zur Auswertung des Tests erheblich verkürzt werden kann.

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Das Testsystem lässt sich wie folgt erreichen:

a-Aminosäurenitroanilide oder a-Aminosäurenaphthyl-amide werden in einem Lösungsmittel in einer Konzentration von 0,1 bis 50% gelöst. Als Lösungsmittel können wässerige Medien sowie organische Lösungsmittel, z.B. Äthanol, dienen. Dieser Lösung werden wässrige Puffersysteme hinzugefügt, die einen pH-Wert zwischen 5 und 9 gewährleisten. Durch Tauchen in diese Testlösungen werden saugfähige Materialien, z.B. Cellulosefilterpapiere, Glasfaserfilter, Porzellanfilter u.a., der Dicke 0,1 bis 5 mm und zweckmässiger Weise eines Durchmessers von 10-100 mm mit der Testlösung imprägniert. Das Aufbringen der Testlösung kann auch durch Besprühen des Trägermaterials erfolgen. Das Trägermaterial kann anschliessend z.B. in einem Luftstrom bei 10-90°C getrocknet werden. Der Vorgang des Tauchens bzw. Ansprühens kann erforderlichenfalls mehrmals wiederholt werden. Die imprägnierten Trägermaterialien sind im Dunkeln bei Wassergehalten unter 3% mehrere Monate, unter 1,5% jahrelang bei Raumtemperatur haltbar. Die imprägnierten Testmaterialien können auf Bakterienkolonien auf festen Nährboden gelegt werden. Bei geeigneten Abmessungen des Testmaterials sind u.U. mehrere hundert Bakterienkolonien gleichzeitig auf ihr Gramverhalten prüfbar. Andererseits besteht die Möglichkeit, Bakterien auf den Teststreifen aufzustreichen, um deren Gramverhalten zu prüfen.

Letztlich können Teststreifen zum Nachweis gramnegativer Keime auch in Bakteriensuspensionen, z.B. verdorbene Milch u.a., getaucht werden.

Zur Erfindungshöhe wird ausgeführt: Die Publikation von Teuber und Cerny (Arch. Mikrobiol, 91 [1973] S. 235-240) hat bezüglich der Erfindungshöhe keine besonderen Auswirkungen:

1. Wie in der obigen Publikation erwähnt, gaben auch einige grampositive Bakterienstämme eine — wenn zwar auch geringere — Aminopeptidasereaktion. Es war daher nicht klar, ob nicht andere grampositive Bakterienstämme eine den gramnegativen Bakterienstämmen vergleichbare Aminopeptidasereaktion ergeben würden.

2. Die geringe Anzahl der in obiger Publikation getesteten Stämme liess nicht zu, dass verallgemeinernde Feststellungen daraus abgeleitet wurden. Dazu war es erforderlich, eine grosse Anzahl von Bakterienstämmen verschiedenster Gattungen zu überprüfen. Erst die Auswertung mehrerer hundert Bakterienstämme aus den Gattungen Shigella, Klebsiella, Salmonella, Escherichia, Hafnia, Citrobacter, Proteus, Enterobacter, Pseudomonas, Arizona, Haemophilus, Acine-tobacter, Flavobacterium, Neisseria, Serratia, Plesiomonas, Achromobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Edwardsiella, Yersinia, Bacillus, Dipolococcus, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Mycobacterium, Clostridium, Lactobacillus, Bifidobacterium, Corynebacterium, Erysipelothrix, sowie einiger Hefearten liess erkennen, dass zwischen dem Gramverhalten und der Aminopeptidaseaktivität eine strenge Korrelation besteht.

3. Da die Gramfärbung sehr aufwendig ist, hätte es vielleicht nahegelegen, die Aminopeptidasereaktion als Alternative einzusetzen. Da jedoch in der obigen Publikation zu wenig Stämme untersucht wurden und die Aminopeptidasereaktion in ihren biochemischen Grundlagen bislang noch nicht genügend erforscht war, war eine verallgemeinernde Feststellung im Hinblick auf die Unterscheidungsmöglichkeit grampositiver und gramnegativer Bakterien nicht ableitbar. Erst die Untersuchung zahlreicher Bakterienstämme und die gewonnene Erkenntnis, dass die Aminopeptidase ursächlich das Gramverhalten steuert, indem sie die dreidimensionale Vernetzung der Zellwand (Murein) z. B. über Inter-peptidbrücken der Bakterien unterbindet und so zur Ausbildung einer einschichtigen Mucopolysaccharidzellwand und damit zu grammnegativem Verhalten führt, liessen eine gesicherte Aussage zu.

4. Das Einbringen des Testsubstrates in bestimmte Trägermaterialien erfolgte nach eingehenden Untersuchungen, die gezeigt hatten, dass das Auftropfen einer flüssigen Test-substratlösung zu einer Verwaschung der Bakterienkolonien auf der Agaroberfläche führen kann und dass bei Aufstreuen des Testsubstrates als Pulver die Reaktion dadurch verfälscht werden kann, als die im Reaktionsverlauf frei werdende Farbkomponente (z.B. p-Nitranilin) von eigenen Bakterien (E. coli) wieder in eine farblose, noch nicht identifizierte Verbindung zurückverwandelt wird. Erst das Einbringen der Testsubstanz in Trägermaterialien mit bestimmten Diffusionseigenschaften( z.B. Glasfaserfilter) ermöglicht das Abdiffundieren des farbigen Spaltproduktes und entzieht es damit einer weiteren Umwandlung durch die Bakterienkolonie.

Die gelegentlich bei grampositiven Bakterien auftretende schwache Aminopeptidaseaktivität kann durch Einhaltung bestimmter Reaktionszeiten weitgehend eliminiert werden. Sie ist bei einigen Bacillus-Arten durch die einsetzende Sporulation bedingt. Bei einigen Streptococcen mit geringer Interpeptidbrückenausbildung und bei coryneformen Keimen (Arthrobacter, Corynebacterium), die gramvariables Verhalten zeigen, kann unter bestimmten Wachstumsbedingungen ebenfalls eine schwache Aminopeptidaseaktivität beobachtet werden. Diese ist allerdings mit der Synthese von Lipopoly-saccharid (einem typischen Bestandteil gramnegativer Bakterien) korreliert, so dass diese Bakterienarten bei positivem Aminopeptidasetest ohnedies nicht mehr als typisch gram-positiv anzusehen sind.

Beispiel I Zubereitung der Substratlösung 6,05 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst. Mit einer gesättigten Maleinsäurelösung wird der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Sodann wird mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Dieser Pufferlösung werden 6 g L-Alanin-4-nitroanilidhydro-drochlorid zugegeben.

Imprägnieren des Trägermaterials Runde, handelsübliche weisse Glasfaserfilter der Dicke 0,3 mm mit einem Durchmesser von 80 mm werden in die Substratlösung getaucht und im Warmluftstrom bei 40°C gut getrocknet, sowie trocken und dunkel gelagert.

Verwendung des Testsystems Die imprägnierten Glasfaserfilter eignen sich aufgrund ihres Diffusionsverhaltens hervorragend zum Nachweis gramnegativer Bakterien auf festen Standardbakteriennährböden. Sie brauchen nur auf den Nährboden aufgelegt zu werden. Innerhalb von 5 Minuten sind gramnegative Bakterienkolonien bei 23°C an der Gelbfärbung erkennbar. Die Methode ist nur bei Oberflächenkolonien anwendbar. Bei kleineren Abmessungen des Trägermaterials können selektiv einzelne Bakterienkolonien auf Nähragaroberflächen diagnostiziert werden bzw. besteht die Möglichkeit mit einer Impföse Bakterienkolonien auf dem Testsystem zu verstreichen, lim deren Gramverhalten zu testen.

Beispiel II Zubereitung der Substratlösung Wie unter Beispiel I beschrieben, dem Puffersystem werden jedoch 15 g L-Alanin-4-nitroanilidhydrochlorid pro 100 ml zugegeben.

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Zubereitung des Trägermaterials Ein saugfähiger weisser Papierstreifen der Dicke 1 mm und der Breite 5 mm durchläuft ein Bad der Substratlösung und wird anschliessend im Warmluftstrom getrocknct. Aus dem imprägnierten Papierstreifen werden 10 mm lange Ab- s schnitte gefertigt, welche auf 5 mm breite und 0,3 mm dicke Kunststoffstreifen (z.B. aus Polystyrol) geklebt werden,

derart, dass die Indikatorabschnitte am Ende der 50-200 mm langen Kunststoffstreifen befindlich sind. Der verwendete Klebstoff muss wasserfest sein. io

Verwendung des Testsystems Zum Nachweis von gramnegativen Keimen in einer Bakteriensuspension kann der Indikatorteststreifen kurz (1-2 Sekunden) in die Bakteriensuspension getaucht werden. Be- u stand die Bakteriensuspension überwiegend aus gramnegativen Keimen mit Keimzahlen über 1010/ml, tritt innerhalb von drei Stunden eine Gelbfärbung des Indikatorabschnittes auf. Es empfiehlt sich, den Teststreifen nach Eintauchen in die Bakteriensuspension in einem dicht verschlossenen Rea- 20 genzglas bis zur Auswertung aufzubewahren, um ein Austrocknen des Indikatorabschnittes zu vermeiden.

Beispiel III

Zubereitung der Pufferlösung 25

In destilliertes Wasser werden 7,72 g sekundäres Natriumphosphat und 3,52 g primäres Kaliumphosphat gelöst und auf 100 ml aufgefüllt.

Zubereitung der Substratlösung 30

20 g L-Alanin-4-nitroaniIidhydrochlorid werden in 100 ml Äthanol gelöst.

Zubereitung des Trägermaterials Ein saugfähiger weisser Karton aus Cellulose der Dicke 5 mm wird in die Pufferlösung getaucht und im Warmluftstrom getrocknet. Anschliessend wird der so vorbehandelte Karton beidseitig über Sprühdüsen so lange sukzessive mit der Substratlösung besprüht und getrocknet bis 50 mg L-Ala-nin-4-nitroanilidhydrochlorid auf einem Flächenabschnitt von 1 cm2 aufgebracht wurden. Sodann wird der präparierte Karton in Abschnitte der Kantenlänge 10 mm zerschnitten.

Verwendung des Testsystems Die imprägnierten Testabschnitte werden zu 2 ml einer Bakteriensuspension (z.B. verdorbener Milch) zugegeben und darin belassen. Durch Diffusion wandert das Enzymsubstrat aus der Trägerschicht in die Bakteriensuspension. Bei Anwesenheit grammnegativer Bakterien tritt eine Gelbfärbung auf. Bei Keimzahlen von IO8 bis 109/ml wird eine sechsstündige Bebrütung bei 30°C empfohlen.

Eine Erhöhung der Nachweisgenauigkeit (z.B. bei niedrigen Keimzahlen) bietet sich selbstverständlich darin, dass man das in der Enzymreaktion entstandene p-Nitranilin nach gängigen Verfahren (Zugabe von salpetriger Säure und einer Kupplungskomponente, z.B. ß-Naphtol-6,8-disulfonsäure) in einen Azofarbstoff verwandelt, der deutlicher nachweisbar ist.

Die vorstehend aufgeführten Beispiele gestatten einen unkomplizierten Nachweis grammnegativer Keime. Die unter Beispiel I aufgeführte Testmethode ermöglicht einen raschen Test auf das Gramverhalten zahlreicher Bakterienkolonien auf der Oberfläche fester Bakterienstandardnährbö-den. Selektivnährböden, insbesondere farbige Nährböden (z.B. Endo-Agar) sind für diesen Zweck u.U. ungeeignet.

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