DE2715326C3 - Kulturbrühe zum selektiven Nachweis von Citrobacter freundii - Google Patents

Description

Die Erfindung betriffi eine Kulturbrühe zum selektiven Nachweis von cUrobacter freundii (C. freundii). C. freundii ist ein Organismus, der in Wasser, Nahrungsmitteln, Fäkalien und Urin auftritt. Es wird angenommen, daß der Organismus ständig bei gesunden Personen auftritt. Bestirnte Serotypen verursachen offensichtlich sporadische Infektionen der Verdauungs- und Harnwege. Auch über Infektionen der Gallenblase, des Mittelohres und der Hirn- und Rückenmarkhaut wird berichtet. Die Anwesenheit dieses Organismus im Urin ist ein zuverlässiger Indikator für eine Infektion des Harntraktes. 1st C. freundii in einer Urinprobe vorhanden, so können auch Acromonas und Kiebsiclla zugegen sein.

Das Medium der Erfindung stellt eine Weiterentwicklung zur Anwendung mit einem optischen Nachweissystem für die Analyse von Proben bestimmter Mikroorganismen unter Verwendung einer Plastikschale oder -karte dar, welche eine Reihe von getrockneten Kulturbrühen in gesonderten, jedoch untereinander verbundenen Vertiefungen, enthält, wobei jedes Medium für einen einzelnen Organismus spezifisch ist. Wenn die Probe in die Karte eingesetzt, mit den Medien der Vertiefungen vermischt und in die Vorrichtung inkubiert wird, tritt der Organismus (die Organismen), der in der Probe vorliegt, mit dem Kulturmedium, das für jenen Organismus spezifisch ist, in Wechselwirkung und ruft eine Änderung im Medium hervor, die von der Vorrichtung abgelesen wird, um das Vorliegen jenes Organismus anzuzeigen. Die Änderung im Medium schließt eine Änderung der Liehtdurchlässigkeitscigcnschaften des Mediums ein, d. h., eine Färb- oder Triibungsiindcrung. Die Änderung kann durch Stoffwechselprozcsse des Organismus verursacht sein, welche beispielsweise zur Siiurecrzcugung führen und eine Änderung des pH-Wertes bedingen können, die eine Farbänderung bei einem pH-empfindlichen Indikator im Medium hervorrufen. Die Änderung in den Lichtdurchlässigkeitscigcnschaftcn des Mediums kann auch durch Nicdersehlaghildung im Medium aufgrund von Stoffwechsclvorgängen des Organismus verursacht sein oder durch das Wachstum des Organismus hervorgerufen werden. Die spezifischen Medien zur Verwendung in den vostehend genannten Karten sollen das Wachstum eines Mikroorganismus begünstigen, der Gefriertrocknungzugänglich sein und in der sauerstoffarmen Umgebung der Kartenvertiefungen funktionieren.

Ein Nachweismedium, das für Citrobacter selektiv ist, wurde bisher nicht bekannt. Die Bouillon von MacConkey's enthält zwar Bestandteile, die grampositive Organismen hemmen, das Medium ermöglicht jedoch general! das Wachstum von Lactose fermentierenden gramnegativen Stämmen und damit auch anderer als der Gattung Citrobacter. Deshalb muß das in dem MacConkey's-Medium beobachtete Wachstum erst weiter nach Art und Stamm identifiziert werden,

DerErfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Kulturmedium bereitzustellen, das C. freundiiOrganismen, z. B. im Urin, selektiv und innerhalb eines relativkurzen Zeitraums von 8 bis 12 Stunden in einem PoIymikrobenmedium identifizieren kann.

Diese Aufgabe wurde mit dem im Patentanspruch angegebenen Kulturmedium gelöst.

Durch die Erfindung wird erreicht, daß eine selektive Anzeige lediglich des einen Organismus C. freundii möglich wird, während durch Hemmung bzw. Verzögerung des Wachstums anderer konkurrierender gramnegativer Mikroben durch deren Anwesenheit verursachte Falschpositiv-Ergebnisse vermieden werden. Gegenüber bisherigen Medien ermöglicht die erfindungsgemäße Kulturbrühe darüber hinaus, diesen Nachweis von C. freundii in einer kürzeren Zeitspanne von 13 Stunden oder weniger zu führen.

Positive Ergebnisse werden durch Niederschlagsbildung im klaren Medium angezeigt, wodurch eine Änderung in den Lichtdurchlässigkeitseigenschaften des Mediums hervorgerufen wird, welche mit Hilfe des optischen Nachweismechanismus abgelesen wird. Der gesamtp Test kann innerhalb von 8 bis 12 Stunden abgeschlossen sein, wogegen die bisherigen Nachweismethoden etwa 36 bis 48 Stunden erfordern.

Das Medium enthält verschiedene Nährstoffe, einschließlich Palatinose und/oder Rhamnose in den angegebenen Mengen, und die chemischen Inhibitoren 2-Hydroxy-2',4,4'-trichlordiphcnyloxid und Brillantgrün. Gemische von oberflächenaktiven Stoffen, die grampostivic Organismen inhibieren, wie beispielsweise S. aurcus, cntcrococci, sind die als Gallcnsalzgemischc im Handel erhältlichen Extraktstoffe. Andere geeignete oberflächenaktive S'offe sind Natriumdesoxycholat, Cholsäure und Dcsoxycholsäure. Pa.'atinosc und Rhamnose stimulieren selektiv das Wachstum von C. freundii und fällen Gallcnsalze aus Lösungen mit sauren pH-Werten. 2-Hydroxy-2",4,4'-trichlordiphenyloxid wird als Wachstumsinhibitor von Klchsiclla verwendet; höhere als übliche Mengen Brillantgrün (52 bis 55 mg/1) werden zur Wachstumsinhibierung von Aeromonas, Shigclla etc. verwendet. Die Anwesenheit von C. freundii wird dabei durch Ausfällung von Gallensalzen aus dem Medium nachgewiesen. Die Ausfällung wird durch die Änderung des pH-Wertes des Mediums verursacht, das aufgrund der während der Fermentierung von Palatinose oder Rhamnose produzierten Säuren sauer wird.

Die Nachweisbrühe enthält zweckmäßig 22,5 bis 27,7 g/l Nährstoffe (Aminosäuren und Kohlenhydrate) und 9 bis 11 g/l Gallcnsalzgemisch, das als biologischer Inhibitor das Wachstum graniposilivcr Or-

ganismen inhibiert, die normalerweise zu Positiv-Ergebnissen bei den Tests auf C. freundii führen.

Der Nährstoffanteil der Kulturbrühe enthält z. B. etwa 4,5 bis 5,5 g/l (zweckmäßig etwa 5 g/I) eines Gelatinehydrolysats, das durch pankreatiscne Verdauung ·> gebildet wird und sich durch einen niedrigen Cystin- und Tryptophangehalt auszeichnet, zweckmäßig 10 g/l Rhamnose und zweckmäßig 10 g/l Palatinose. Ein geeigneter Ersatz für das Gelatinehydrolysat ist ein Pepton, das aus Casein durch pankreatische Verdauung erhalten wird.

Palatinose wird durch C. freundii fermentiert, wobei eine Säure entsteht, welche eine Änderung des pH-Wertes des Mediums verursacht. Wenn von einem Medium des pH-Wertes 7,5 ausgegangen und dieses r> Medium sauer wird, d. h., der pH-Wert sinkt, wird aus der Lösung ein Niederschlag gefällt, der die Lichtdurchlässigkeitseigenschaften ändert. Diese Änderungwird beobachtet und zum Beispiel durch ein automatisiertes MiKiobenanalysiergerä! aufgezeichnet. Rhamncse ist wie Palatincse ein Zucker und wird durch geringe Prozentgehalte von C. freundii-Organistnen fermentiert, die nicht Palatinose verwerten. Wird Rhamnose fermentiert, so wird Säure produziert und das Medium reagiert, wie zuvor für Palatinose >> beschrieben. Palatinose wird im allgemeinen nicht als Nährstoff für C. freundii verwendet, es regt jedoch das Wachstum verschiedener Stämme von C. freundii an, die üblicherweise in einem herkömmlichen Wachstumsmedium für C. freundii nicht wachsen.

Natriumhydroxid dient zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums auf 7,5.

2-Hydroxy-2',4,4'-trichlordipheiiyloxid inhibiert in der Konzentration von 14,5 ml bis 15,5 ml einer 1 %igen Lösung pro Liter Medium das Wachstum von r> Klebsiella-Organismen, die falsche positive Testergebnisse in der herkömmlichen Nachweismethode für C. freundii liefern. Die günstigste und wirksamste Konzentration sind 15 ml einer 1 %igcn Lösung pro Liter Medium. Ist die Konzentration eines Inhibitors 4» zu gering, erscheint eine höhere Ausbeute an ungewollten falschen Positiv-Ergebnissen. Ist die Konzentration zu hoch, erscheint eine niedrigere Ausbeute an Positiv-Ergebnissen.

Brillantgrün wird als Inhibitor für Aeromonas, Shi- π gella und andere Organismen verwendet. Brillantgrün wird in höheren Konzentrationen als üblich verwendet, sie liegt im Bereich von 52 mg bis 55 mg/1 des Mediums. Der zweckmäßige Konzentrationsbereich liegt bei etwa 53,2 mg/1 des Mediums.

Beispiel 1

Zur Herstellung eines 2 x-Mediums in einer Menge von 100 ml wird eine Nachweisbrühe für C. freundii durch sorgfältiges Mischen der folgenden Bestandteile in den angegebenen Mengen hergestellt:

Pepton, erhalten aus Casein
durch pankreatische Verdauung 1 g
Galiensalzgemisch 2 g

Palatinose 2 g

Rhamnose 2 g

Destilliertes Wasser 92 ml

Diese Bestandteile werden gerührt und mil 8 ml Brillantgrün-Stammlösung, die 0,133 g Feststoffe enthält, versetzt.

In einem gesonderten Gefäß wird 1 g 2-Hydroxy-2',4,4*-trichlordiphenyloxid mit °0 ml destilliertem Wasser und 10 ml IN NaOH gemischt und bis zur Auflösung erhitzt (Stammlösung). 3 ml dieser Stammlösung werden der Nährlösung zugesetzt, der pH-Wert wird mit Hilfe von Natriumhydoxid auf 7,5 eingestellt und die Losung filtersterilisiert.

Die Konzentration des Mediums ist doppelt so hoch (2 X) wie die übliche Konzentration zur Verwendung in den Vertiefungen und Karten, wie sie in dem Mikrobenanalysengerät eingesetzt wird.

Beispiel 2

Eine weitere zweckmäßige Kulturbrühe hat folgende Zusammensetzung pro Liter:

a) 5 g eines Gelatinehydroiysats, das durch pankreatische Verdauung gebildet wird und sich durch einen niedrigen Cystin- und Tryptophangehalt auszeichnet,

b) 1,0 g Galiensalzgemisch
. c) 10 g Palatinose,

d) 10 g Rhamnose,

e) 53 mg Brillantgrün

f) das Äquivalent von 15 ml einer l%igcn Lösung von 2-Hydrox)-2'.4,4'-trichlordiphenykixid und

g) destilliertes Wasser.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Kulturbrühe zum selektiven Nachweis Citrobacter freundii, dadurch gekennzeichnet, > daß sie

   a) eine Nährstoffquelle, einschließlich Palatinose und/oder Rhamnose in einer Menge von jeweils 9 bis 11 g/l, die spezifisch das Wachstum von C. freundii beschleunigen und durch 'ⁿ C. freundii unter Azidifizierung der Kulturbrühe fermentiert werden,

   b) ein Gemisch oberflächenaktiver Substanzen in einer Menge von 9 bis 11 g/l, die zur Wachstumsinhibierung gram-positiver Or- ü ganismen geeignet sind, und

   c) das Äquivalent von 14,5 bis 15,5 g/l Kulturbrühe einer l%igen Lösung von 2-Hydroxy-2",4,4'-trichlordiphenyloxid und 52 bis 55 mg Brillantgrün/l enthält. -'<>