DE60215384T2

DE60215384T2 - Verfahren zum nachweis von mikroorganismen

Info

Publication number: DE60215384T2
Application number: DE60215384T
Authority: DE
Inventors: Alain Rambach
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-12-13
Filing date: 2002-12-12
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2022-12-13
Also published as: DE60215384D1; EP1453969B1; EP1453969A2; CA2469840A1; FR2833613A1; WO2003050289A3; FR2833613B1; ATE342375T1; ES2272817T3; US20050118667A1; JP2005511091A; WO2003050289A2; WO2003050289A8

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von in einer Probe vorhandenen Mikroorganismen, in welchem ein Kulturmedium mit der Probe inokuliert wird, wobei das Kulturmedium vorzugsweise chromogene Substanzen, die in Anwesenheit der Ziel-Mikroorganismen Chromophore freisetzen, oder fluorogene Substanzen enthält, wobei sich das Kulturmedium in einem Behälter befindet, der einen farbigen Boden aufweist, so dass der Nachweis durch den Kontrast zwischen dem farbigen Boden des Behälters und den isolierten Kolonien erleichtert ist.
Der schnelle Nachweis von Mikroorganismen, die in biologischen Proben, Lebensmittelproben oder im Krankenhausmilieu vorhanden sind, ist unerlässlich, um im Fall einer Kontamination schnellstmöglich die zu ergreifenden Maßnahmen zu bestimmen.
Es erscheint ebenfalls wichtig, die verschiedenen Kontaminationen unterscheiden zu können, um geeignete Desinfizierungen vornehmen zu können.
Es existieren Verfahren wie die PCR, die schnell und spezifisch ist, die aber den Einsatz von Geräten wie Thermozyklern erfordert und die im Krankenhausmilieu nicht immer angewandt werden kann. Darüber hinaus kann dieses Verfahren eine Vorbereitung der zu testenden Proben erfordern, was nicht immer einfach durchführbar ist.
Es wurden Verfahren beschrieben, die auf der Kultur der kontaminierenden Mikroorganismen auf geeigneten Medien und auf deren Identifizierung aufgrund der Zugabe von chromogenen Substanzen beruhen, welche nach Einwirkung eines für den Mikroorganismus spezifischen Enzyms ein Chromophor freisetzen.
So beschreiben die Patentanmeldungen WO 00/53799, WO 00/46345, WO 97/39103, WO 95/04156, WO 94/09152, US-A-6087156, WO 98/48042 und US-A-6130057 Kulturmedien zur Identifizierung von Staphylokokken, von anaeroben Bakterien oder enterohämorrhagischen Colibakterien, von Salmonellen oder anderen Mikroorganismen, wie Candida.
Da die verwendeten Medien im Allgemeinen relativ transparent sind, kann es sich jedoch manchmal aufgrund des Fehlens eines ausreichenden Kontrastes als schwierig erweisen, die Farben der freigesetzten Chromophore richtig zu bestimmen. So erlaubt die Verwendung des in der Patentanmeldung WO 95/04156 beschriebenen Mediums C eine gute Unterscheidung der unterschiedlichen Candida-Hefen, aber die erhaltenen Farben sind hell, was für einige Benutzer problematisch sein kann.
Ebenso kann es das in der Anmeldung WO 00/46345 beschriebene Verfahren zur Identifizierung von Staphylokokken erforderlich machen, dem Kulturmedium ein Kontrastmittel, zum Beispiel ein Trübungsmittel, zuzusetzen.
Ein solcher Kontrastbedarf zeigt sich ebenfalls bei Medien zum Nachweis von Salmonellen, wie dem von der Firma Chromagar (Paris, Frankreich) verkauften Rambach-Agar.
Um die Medien zu trüben, wurde unter anderem die Zugabe von Kaolin vorgeschlagen, insbesondere zum Nachweis von E. coli mittels Phenylglucuronid. Jedoch kann sich herausstellen, dass die Zugabe von dieser Art von Verbindung, abgesehen davon, dass sie die Herstellungskosten des Mediums erhöht, bei der industriellen Herstellung von Nachweismedien zahlreiche Probleme bereiten kann (insbesondere Präzipitation).
Das Dokument EP 0 103 915 beschreibt ein Verfahren zum visuellen Nachweis einer Farbintensität einer Flüssigkeit in einer Reihe von Behältern mit unterschiedlichen Farbstoffkonzentrationen, wobei die Behälter farbig sein können.
Die vorliegende Erfindung beabsichtigt, auf das Problem einzugehen, das durch das beobachtete Fehlen eines Kontrastes zwischen den isolierten Kolonien und dem Kulturmedium gegeben ist, insbesondere wenn diese Kolonien aufgrund des Vorliegens von chromogenen Substanzen in dem Kulturmedium gefärbt sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft demgemäß Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, die in einer Probe vorhanden sind, umfassend die Schritte, die bestehen in:

a) Herstellen eines Kulturmediums, das an die Ziel-Mikroorganismen angepasst ist,
b) Gießen des Mediums in einen Behälter, der einen gefärbten Boden aufweist,
c) Inokulieren des festen Kulturmediums von a) mit der Probe oder einem Inokulum, das von der Probe abstammt, und Inkubieren,
d) Nachweisen der Anwesenheit der Mikroorganismen auf dem Kulturmedium unter Verwendung des Kontrasts zwischen der Farbe des Bodens des Behälters und der isolierten Kolonien.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, die in einer Probe vorhanden sind, durch enzymatische Freisetzung von Chromophoren aus chromogenen Substanzen, die in einem Medium vorhanden sind, das an die Mikroorganismen angepasst ist, umfassend die Schritte, die bestehen aus:

a) Herstellen eines geeigneten Kulturmediums, das chromogene Substanzen enthält, die für den Nachweis der Ziel-Mikroorganismen geeignet sind,
b) Gießen des Mediums in einen Behälter, der einen gefärbten Boden aufweist,
c) Inokulieren des festen Kulturmediums von a) mit der Probe oder einem Inokulum, das von der Probe abstammt, und Inkubieren,
d) Nachweisen der Anwesenheit der in der Probe vorliegenden Mikroorganismen auf dem Kulturmedium unter Verwendung des Kontrasts, der durch die Farbe des Bodens des Behälters im Vergleich zu der Färbung durch die freigesetzten Chromophore bedingt ist.

In einer anderen Ausführungsform enthält das Kulturmedium farbgebende Mittel (zum Beispiel McConkey-Agar).
In einer anderen Ausführungsform enthält das Kulturmedium fluorogene Substanzen, die in Anwesenheit der Ziel-Mikroorganismen Fluorophore freisetzen. Als Fluorophor kann unter anderem 4-Methylumbelliferyl, zum Beispiel an ein Galactosid gebunden (4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosid), verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Behälter rund und insbesondere eine Petrischale mit einem Durchmesser von 40 bis 210 mm. Der Durchmesser des erfindungsgemäßen Behälters beträgt bevorzugt 47 mm, 55 mm, 90 mm, 100 mm oder 200 mm.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Fläche des Behälters derart, dass es möglich ist, das in dem Behälter enthaltene Kulturmedium so zu inokulieren, dass das Wachstum von isolierten Kolonien erreicht wird. So beträgt die Fläche des erfindungsgemäßen Behälters bevorzugt mehr als etwa 15–17 cm².
In einer Ausführungsform der Erfindung weist der Behälter einen opaken gefärbten Boden auf. In einer anderen Ausführungsform weist der Behälter einen transparenten gefärbten Boden auf. Der Behälter weist bevorzugt einen Boden mit einer Farbe auf, die aus den Farben Blau, Rot, Gelb, Schwarz oder opakem Weiß ausgewählt ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Chromophore oder die anderen farbigen Produkte durch Hydrolyse aufgrund der Einwirkung eines für den Mikroorganismus spezifischen Enzyms auf die in dem Kulturmedium vorliegenden chromogenen Substanzen freigesetzt, und die chromogene(n) Substanz(en) ist (sind) ausgewählt aus den Substraten der Enzyme, die mit dem Zuckerstoffwechsel assoziiert sind, und insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Substraten der β-Glucosidase, Substraten der β-Galactosidase und Substraten der β-Glucuronidase und Substraten der Phosphatase.
Bevorzugt ist (sind) der (die) Chromophor(e) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Indoxyl-, Halogenindoxyl- (Bromindoxyl-, Chlorindoxyl-, Fluorindoxyl-, Iodindoxyl-, Dichlorindoxyl-, Chlorbromindoxyl-, Trichlorindoxyl-), Methylindoxyl- und Hydroxychinolin-Derivaten, insbesondere aus den folgenden Derivaten: 6-Chlorindoxyl, 5-Bromindoxyl, 3-Bromindoxyl, 6-Fluorindoxyl, 5-Iodindoxyl, 4,6-Dichlorindoxyl, 6,7-Dichlorindoxyl, 5-Brom-4-chlorindoxyl, 5-Brom-6-chlorindoxyl, 4,6,7-Trichlorindoxyl, N-Methylindoxyl oder 8-Hydroxychinolin.
Um das Wachstum von Mikroorganismen einschränken zu können, die nicht gesucht sind, ist es von Vorteil, wenn das Kulturmedium auch Faktoren enthält, die für die gesuchten Mikroorganismen selektiv sind.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung enthält das Kulturmedium auch eine erhöhte Konzentration an Saccharose oder Glucose.
Das Verfahren der Erfindung wird vorteilhafterweise dann eingesetzt, wenn der Ziel-Mikroorganismus der Art Candida angehört, insbesondere mit dem Chromagar Candida, der in der WO 95/04156 beschrieben ist. In diesem Fall wird ein gefärbter Behälter verwendet, der transparent oder opak ist, wobei die Farbe von der Natur der meistgesuchten Hefe abhängt.
Das Verfahren der Erfindung ist auch dann besonders geeignet, wenn der Ziel-Mikroorganismus der Art Staphylococcus angehört, und der Behälter wird dann bevorzugt mit einem gefärbten opaken, bevorzugt opak-weißen Boden gewählt.
Das Verfahren kann auch eingesetzt werden, wenn der Ziel-Mikroorganismus der Art Vibrio, der Art der Colibakterien und insbesondere den enterohämorrhagischen E. coli-Bakterien angehört.
Es werden insbesondere die Lehren der Patentanmeldungen WO 00/53799, WO 00/46345, WO 97/39103, WO 95/04156, WO 94/09152 verwendet, um die Farben der Mikroorganismen entsprechend der Natur der erhaltenen Medien zu bestimmen.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit zum Nachweis von Mikroorganismen, bestehend aus der Kombination eines Behälters, der einen gefärbten Boden aufweist, mit einem Kulturmedium, das bevorzugt chromogene Substanzen enthält, die in Anwesenheit der Ziel-Mikroorganismen Chromophore freisetzen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Behälters mit gefärbtem Boden als Träger, in den man ein Kulturmedium gießt, das bevorzugt chromogene Substanzen enthält, die nach Einwirkung spezifischer Enzyme, die in Stämmen von Mikroorganismen vorhanden sind, Chromophore freisetzen.
Die Farbe der verwendeten Behälter (im Allgemeinen Petrischalen) ist vorteilhafterweise so gewählt, dass sie einen nützlichen Kontrast mit den Kolonien der Mikroorganismen oder den verwendeten Chromogenen bietet. Der nützliche Kontrast ist definiert als ein Kontrast, der bei der Unterscheidung der Farben der Kolonien gegenüber dem Boden der Schale behilflich ist. So sind, wenn das Kulturmedium keine Chromogene enthält, die Kolonien im Allgemeinen hell und der Boden des Behälters ist eher dunkel.
Die Farbe des Bodens der Schale wird auch entsprechend der Farbe der freigesetzten Chromophore gewählt. So weist der blaue Chromophor 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl eine Absorption bei 615 nm auf, die leicht differenziert werden kann, wenn rote Schalen (etwa 515 nm) verwendet werden. Für Chromogene, die blasslila, rote oder purpurfarbene Kolonien bilden, werden Schalen in einer Farbe mit entfernter Wellenlänge verwendet, zum Beispiel gelbe Schalen. Wenn Kolonien von heller Farbe erhalten werden, werden dunkle und/oder opake Schalen verwendet.
Die Chromophore, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, haben somit die folgende allgemeine Formel und werden durch Oxidation einer chromogenen Substanz erhalten, die an ein Enzymsubstrat gekoppelt ist. Diese Chromophore sind unlöslich, was zur Bildung eines gefärbten Niederschlags führt. Es sei bemerkt, dass die Chromophore nach Einwirkung von Glycosidasen, aber auch nach Einwirkung von Phosphatasen erhalten werden können.
Eine Liste chromogener Substanzen kann dem Patent US 6,130,057 entnommen werden.
Formel für Chromophore, die im Rahmen der Erfindung verwendet werden können:
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Kits ist die Möglichkeit, die bestimmte Substanzen enthaltenden Schalen leicht zu erkennen. Die Medien, die chromogene Substanzen enthalten, sind nämlich vor der Reaktion der Mikroorganismen und Freisetzung der Chromophore farblos. Ihr Einbringen in farbige Schalen erweist sich somit als hilfreich für das leichte Ordnen und Wiederfinden der interessierenden Medien, wobei die Farbe der Schale entsprechend der und in Korrelation mit den im Medium enthaltenen Chromogenen und den in Anwesenheit von Mikroorganismen erwarteten Farben gewählt wird.

Claims

Verfahren zum Nachweisen von Mikroorganismen, die in einer Probe vorhanden sind, umfassend die Schritte, die bestehen aus: a) Herstellen eines Kulturmediums, das an die Ziel-Mikroorganismen angepasst ist, b) Gießen des Mediums in einen Behälter, der einen gefärbten Boden aufweist, c) Impfen des festen Kulturmediums von a) mit der Probe oder einem Inokulum, das von der Probe abstammt, und Inkubieren, d) Nachweisen der Anwesenheit der Mikroorganismen über dem Kulturmedium, indem der Kontrast zwischen der Farbe des Bodens des Behälters und der isolierten Kolonien verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium fluorogene Mittel enthält, welche Fluorophore in Anwesenheit der Ziel-Organismen freisetzen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium chromogene Mittel enthält, die für den Nachweis der Ziel-Mikroorganismen durch enzymatische Freisetzung von Chromophoren aus den chromogenen Mitteln geeignet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter einen opaken gefärbten Boden aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter einen transparenten gefärbten Boden aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter einen Boden mit einer Farbe aufweist, die aus den Farben Blau, Rot, Gelb, Schwarz oder opakes Weiß ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Chromophore durch Hydrolyse aufgrund der Einwirkung eines für den Mikroorganismus spezifischen Enzyms auf die chromogenen Mittel freigesetzt werden, welche in dem Kulturmedium vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die chromogene(n) Mittel aus den Substraten von Enzymen, die mit dem Metabolismus von Zuckern assoziiert sind, und insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Substraten von β-Glucosidase, Substraten von β-Galactosidase und Substraten von β-Glucuronidase ausgewählt ist (sind).
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der oder die Chromophor(e) ausgewählt ist (sind) aus der Gruppe bestehend aus Indoxyl-, Halogenindoxyl- (Bromindoxyl-, Chlorindoxyl-, Fluorindoxyl-, Iodindoxyl-, Dichlorindoxyl-, Chlorbromindoxyl-, Trichlorindoxyl-), Methylindoxyl- und Hydroxychinolin-Derivaten, insbesondere aus den folgenden Derivaten: 6-Chlorindoxyl, 5-Bromindoxyl, 3-Bromindoxyl, 6-Fluorindoxyl, 5-Iodindoxyl, 4,6-Dichlorindoxyl, 6,7-Dichlorindoxyl, 5-Brom-4-chlorindoxyl, 5-Brom-6-chlorindoxyl, 4,6,7-Trichlorindoxyl, N-Methylindoxyl oder 8-Hydroxychinolin.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium auch Faktoren enthält, die für die gesuchten Mikroorganismen selektiv sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Ziel-Mikroorganismus die Art Candida ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Ziel-Mikroorganismus die Art Staphylococcus ist und dass der Behälter einen gefärbten opaken, bevorzugt weißen opaken Boden aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Ziel-Mikroorganismus die Art Vibrio ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Ziel-Mikroorganismus aus der Art der Colibakterien und insbesondere der enterohämorragischen E. coli-Bakterien ist.
Kit zum Nachweis von Mikroorganismen, bestehend aus der Kombination eines Behälters, der einen gefärbten Boden aufweist, und eines Kulturmediums, wobei die Farbe des Behälters so ausgewählt ist, dass sie einen nützlichen Kontrast mit der Farbe von isolierten Kolonien bereitstellt.
Kit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium fluorogene Mittel enthält, welche in Anwesenheit der Ziel-Mikroorganismen Fluorophore freisetzen.
Kit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium chromogene Mittel enthält, welche Chromophore in Anwesenheit der Ziel-Mikroorganismen freisetzen, wobei die Farbe des Behälters so gewählt ist, dass sie einen nützlichen Kontrast mit der Farbe der freigesetzten Chromophore bereitstellt.
Verwendung eines Behälters, der einen gefärbten Boden aufweist, als Träger, in den man ein Kulturmedium gießt, das zum Züchten von Mikroorganismen geeignet ist, wobei die Farbe des Bodens des Behälters einen Kontrast mit den Kolonien der Mikroorganismen gestattet.
Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium fluorogene Mittel enthält, die in Anwesenheit der Ziel-Mikroorganismen Fluorophore freisetzen.
Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium chromogene Mittel enthält, die nach Einwirkung von spezifischen Enzymen, die in Stämmen von Mikroorganismen vorhanden sind, Chromophore freisetzen, wobei die Farbe des Behälters so gewählt ist, dass sie einen nützlichen Kontrast mit der Farbe der freigesetzten Chromophore bereitstellt.