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Flüssige Medien zur Identifizierung von Bakterien
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nach der Mikromethode und deren Verwendung Prioritäten: 14. Februar
1977 Frankreich 77 05483 3. November 1977 Frankreich 77 33832
nie
Erfindung betrifft flüssige Medien zur Identifizierung von Bakterien, die für die
Identifizierung mit Hilfe der Mikromethode geeignet sind, sowie Mikromethoden, bei
denen diese Medien verwendet werden.
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nie vorliegende Erfindung befaßt sich mit der Identifizierung von
Bakterien und insbesondere von Enterobakterien oder Darmbakterien, sowie mit Medien
zur Identifizierung der Bakterien, die für die Identifizierung mit Hilfe der Mikromethode
geeignet sind.
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Derzeit erfolgt die Identifizierung der Enterobakterien täglich in
medizinischen und veterinärmedizinischen Biologielahoratorien oder in bakteriologischen
Nahrungsmittellaboratorien.
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Im allgemeinen erfolgt diese Identifizierung durch den Nachweis einer
Vielzahl von biochemischen Eigenschaften der Bakterie mit F7ilfe von speziellen
Kulturmedien, die auch als Identifizierungsmedien bezeichnet werden.
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In der Vergangenheit handelte es sich bei diesen Medien um komplizierte
Agar(-agar)-medien, die in Glaskolben enthalten waren, die mit Hilfe eines großen
Gewindestopfens verschlossen wurden. Zur Animpfung dieser Kolben war es notwendig,
einen Stamm in Reinkultur zur Verfügung zu haben, der im Verlaufe von 24 Stunden
durch Überpflanzen der isolierten Kolonie auf ein Isoliermedium erhalten worden
ist.
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niese Identifizierungsmedien besitzen jedoch unter anderem den nachteil,
daß sie sperrig, für Reihenuntersuchungen wenig geeignet und arbeitsaufwendig sind.
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Es hestehen auch andere Einrichtungen zur Identifizierung von Enterobakterien,
die es ermöglichen, die Bakterie ausgehend von dem Isoliermedium zu identifizieren
und die es gestatten,
Zeit und Material einzusparen.
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Eine derartige Identifizierungseinrichtung umfaßt einen mehrere Behälter
aufweisenden Zylinder, der verschiedene Agarmedien enthält, und eine spitze Stange,
die in Längsrichtung durch das Rohr verläuft und es ermöglicht, durch Kontakt der
Spitze mit der zu identifizierenden Kolonie und durch Bewegung der Stange jedes
Medium bei der Hindurchbewegung anzuimpfen.
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Eine andere Vorrichtung umfaßt eine Vielzahl von kleinen, besonders
geformten Näpfchen, die in einer Trageeinrichtung aus einem synthetischen Material
angeordnet sind.und die Identifizierungsmedien in getrockneter Form enthalten. Diese
Näpfchen werden dann mit einer Suspension der zu identifizierenden Bakterie in Wasser
gefüllt.
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Es sind noch weitere Verfahren und Vorrichtungen zur Identifizierung
bekannt, die jedoch sämtlich die Anwendung eines besonderen Behälters erforderlich
machen und hohe Kosten verursachen.
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Die Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, flüssige Medien zur Identifizierung
von Bakterien anzugeben, die für die Identifizierung im Mikromaßstab geeignet sind.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch flüssige Medien zur Identifizierung
von Bakterien nach der Mikromethode gelöst, die gekennzeichnet sind durch solche
Eigenschaften, daß die verzögerten Umkehrungen des pH-Werts in Medien zur Untersuchung
der Zuckergärung oder der Vergärung von Zucker vermieden werden daß die Zugabe von
Vaselineöl zu bestimmten Medien (Medium zur Zuckergärung durch Enterobakterien,
Medium zum Nachweis von Urease, Medium zum Nachweis der Bildung von Schwefelwasserstoff,
Medium zum Nachweis von Decarboxylasen) nicht erfor-
derlich ist;
daß das Ergebnis der biochemischen Reaktion aufgrund der Färbung eines internen
Indikators ohne Zugabe eines speziellen Entwicklers gegen Ende der Inkubation im
allgemeinen direkt abgelesen werden kann; daß die Reaktionen schnell ablaufen und
in Abhängigkeit von dem biochemischen Charakter und der untersuchten Bakterie im
Verlaufe von 3 bis 18 Stunden durchgeführt werden können; daß die Mikromethode in
irgendwelchen in biologischen Laboratorien üblichen Behältern, wie Hämolyseröhrchen
oder Näpfchenplatten für die Mikrotitration, durchgeführt werden kann; und daß das
Endreaktionsvolumen 150 bis 650/ul beträgt, was 100 bis 500/ul Identifizierungsbrühe
oder Identifizierungsmedium entspricht.
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Wie andere Mikromethoden wendet die Mikromethode, die insbesondere
zur Identifizierung von Enterobakterien geeignet ist, eine Bakterienkolonie an,
die auf dem Isoliermedium gewonnen worden ist. Hierbei wird zur erfindungsgemäßen
Durchführung der Diagnose der Gattung und in gewissen Fällen zur Ermittlung der
Art der Enterobakterie eine Bakterienkolonie verwendet, die man auf dem Isoliermedium
in Abhängigkeit oder in Gegenwart der folgenden Reagentien bzw. Medien erhalten
hat: Medien zum Nachweis der Gärung von Glucose, Melibiose, Rhamnose, ein Medium
zur Bildung von Acetoin, ein Medium zum Nachweis von Aminosäure-oxidasen, ein Medium
zum Nachweis der Bildung von Indol, ein Medium zum Nachweis von ß-Galactosidase
und Nitrat-reduktase, Medien zum Nachweis von Urease, von Lysin-decarboxylase und
von Ornithin-decarboxylase, ein Nitratmedium und ein Medium zum Nachweis von Schwefelwasserstoff,
wobei die Diagnose in gewissen Fällen auch durch die Verwendung eines Mediums zum
Nachweis von Arginin-dihydrolase eines Mediums zur Untersuchung des Malonat-verbrauchs
bzw. der Malonat-verwertung und gegebenenfalls anderen Medien für die Gärung von
Zuckern, sowie eines Mediums zum Nachweis
von Gelatinase ergänzt
werden kann.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Mikromethode
dadurch gekennzeichnet, daß man in 2,5 ml Salzwasser, das 9 g,/l Natriumchlorid
enthält, eine Kolonie oder eine Fraktion einer Kolonie der zu untersuchenden Enterobakterie
suspendiert, dann einen Tropfen dieser Suspension mit einem Volumen von etwa 50/ul
in den Tdentifizierungsbrühen oder Identifizierungsmedien suspendiert, die man zuvor
in den Näpfchen der Platte für die Mikrotitration verteilt hat, wonach man die Näpfchen
mit Hilfe eines klebenden Papiers oder Klebstreifens verschließt und die Näpfchen,
die die Medien zum Nachweis von Acetoin, zum Nachweis der Verwertung von Citrat
oder von Malonat und zum Nachweis von Aminosäureoxidase enthalten,mit einem klebenden
Papier oder Klebstreifen verschließt, das bzw. der mit einem Loch mit einem Durchmesser
von mindestens 1 mm versehen ist, worauf man die in dieser Weise angeimpfte Platte
während 12 bis 18 Stunden in einen Wärmeschrank oder Brutschrank mit einer Temperatur
von 350C einbringt und anschließend die Ergebnisse abliest.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung verwendet die Mikromethode
mit dem Zweck der Biotypisierung von grampositiven (gram(+)) Kokken in Katalase(+)-
oder Katalase(-)-haufen nach der Baird-Parker-Klassifikation eine Bakterienkolonie,
die auf selektiven Medien oder Blutagar oder normalem Agar gezogen oder gewonnen
worden ist, und die folgenden Medien: ein konzentriertes modifiziertes Koser-Medium,
eine Nährbrühe (bouillon galerie), ein Medium zur Gärung von Glucose und Mannit,
Medien zum Nachweis der aeroben Verwertung von Lactose, Maltose, Arabinose und Mannit,
ein Medium zum Nachweis von Acetoin ohne pH-Indikator, Medien zum Nachweis von Phosphatase,
ein Medium zum Nachweis von Koagulase und ein Medium zum Nachweis der Reduktion
von Nitraten.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung besteht
die
Mikromethode hinsichtlich der Biotypisierung von grampositiven Kokken in Katalase(+)-
oder Katalase(-)-haufen gemäß der Baird-Parker-Klassifikation darin, in 1 ml einer
Nährbrühe (bouillon galerie) eine Bakterienkolonie zu suspendieren, die man auf
selektiven Medien oder Blutagar oder normalem Agar gezüchtet hat, einen Tropfen
der Suspension mit einem Volumen von etwa 50/ul in 100 /ul jedes der Identifizierungsmedien
verteilt, die man zuvor in den Näpfchen oder Vertiefungen der Mikrotitrationsplatte
verteilt hat, drei Tropfen steriles Vaselineöl zu dem Medium der Gärung von Glucose
und Mannit zuzusetzen, die Näpfchen mit einem klebenden Papier oder Klebstreifen
zu verschließen und anschließend die Platte während 16 bis 20 Stunden in einen Wärmeschrank
oder Brutschrank mit einer Temperatur von 35 0C einzubringen und anschließend die
Ergebnisse abzulesen.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung verwendet man bei
der Mikromethode zur Identifizierung von Pseudomonadaceae (gram-negative, Oxidase(+)-bazillen
oder gramnegative, Oxidase(-)- und Nitrat(-)-bazillen, die auf selektiven Lactosemedien
oder normalem Agarmedium gezüchtet werden können) die folgenden Medien: ein Medium
zum Nachweis der Verwertung von Glucose auf aerobem Wege, ein Medium zum Nachweis
der Verwertung von Glucose auf fermentativem Wege, ein Medium zum Nachweis der Reduktion
von Nitrat mit geringer und hoher Nitratkonzentration, ein Medium zum Nachweis der
Citratverwertung, ein Medium zum Nachweis von Gelatinase und ein Medium zum Nachweis
von Arginin-dihydrolase.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung führt man die
Mikromethode zur Identifizierung von Pseudomonadaceae wie folgt durch: man suspendiert
eine Kolonie der zu identifizierenden Bakterie (gram-negative, Oxidase(+)-bazille
oder gram-negative, Oxidase(-)- und Mitrat(-)-bazille, die man auf selektiven Lactosemedien
oder normalem Agarmedium züchten kann), die
man auf einem Isoliermedium,
wie Lactoseagar oder normalem Agar gewonnen hat, in 1 ml Nährbrühe (bouillon galerie)
und überführt die Suspension dann während 2 Stunden in einen Wärmeschrank oder Brutschrank
mit einer Temperatur von 37 0C. Anschließend verteilt man 50 kl der Suspension in
100/ul der Identifizierungsbrühen oder -medien, die man zuvor in den Näpfchen oder
Vertiefungen der Mikrotitrationsplatte verteilt hat. Zu dem Näpfchen, das das Medium
zur Untersuchung der Glucosegärung enthält, gibt man 3 Tropfen Vaselineöl, während
man in das Näpfchen, das das Medium zum Nachweis von Gelatinase enthält, ein kleines
Stückchen photographischen Film einbringt, wonach man die Näpfchen mit Hilfe eines
klebenden Papiers oder eines Klebstreifens verschließt, wobei man das klebende Papier
oder den Klebstreifen des Näpfchens, das das Medium zum Nachweis der Citrat-verwertung
enthält, mit einem Loch mit einem Durchmesser von 1 mm versieht. Schließlich bringt
man die Mikrotitrationsplatte und die Suspension in der Nährbrühe (bouilon galerie)
während 14 bis 18 Stunden in den Wärmeschrank oder Brutschrank mit einer Temperatur
von 35 0C ein. Nach dem Inkubieren entfernt man das klebende Papier oder den Klebstreifen
und liest die Ergebnisse in gleicher Weise wie im Fall der Enterobakterien ab, abgesehen
von den Näpfchen, die die Oxidation von Glucose und die Reduktion von Nitraten betreffen.
Jedem der beiden Medien zum Nachweis der Nitrat-reduktase gibt man Griess-Reagentien
zu. Wenn die Glucose oxidiert ist, nimmt das Medium einen gelben Farbton an, während
der Farbton im entgegengesetzten Fall blau bleibt.
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Im letzteren Fall entnimmt man der Nährbrühe einen Tropfen und bringt
ihn zwischen einen Objektträger und ein Deckgläschen ein, wonach man die Mobilität
mit Hilfe des Mikroskops bei Dunkelfeldbeleuchtung beobachtet.
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Die bei den erfindungsgemäßen Mikromethoden verwendeten Medien werden
im folgenden näher erläutert.
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1. Grundmedium zum Nachweis der Zuckergärung, das Eigenschaften aufweist,
die gegen verzögerte Umkehrungen des pH-Werts wirken.
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Dieses Medium dient dazu, die wäßrigen konzentrierten Lösungen der
zu untersuchenden Zucker auf 1/10 zu verdünnen und enthält einen Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-puffer,
der sich experimentell für die Zuckergärung als günstig erwiesen hat und dessen
Molarität derart ausgewählt wird, daß man sehr schnelle Ergebnisse erzielt, d. h.
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in Abhängigkeit von dem untersuchten Zucker innerhalb eines Zeitraums
von 3 bis 12 Stunden.
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Es kann der Fall eintreten, daß bei bestimmten Bakterien der pH-Wert
des Mediums,nach dem er unter dem Einfluß von ausgehend von dem Zucker gebildeten
gebundenen Säuren (acides fixes) einen im sauren Bereich liegenden Wert angenommen
hat, wieder einen Wert im alkalischen Bereich annimmt. Dieses Phänomen kann durch
die Umwandlung dieser Säuren in Acetylmethylcarbinol oder durch Oxidationsprozesse,
d. h. einen Verlust der Azidität erklärt werden und ist als verzögerte Umkehr des
pH-Werts bekannt. Zur Vermeidung dieses Phänomens, das die Ablesbarkeit der Ergebnisse
stört, enthält das erfindungsgemäße Grundmedium einen Enolase-inhibitor, d. h. Natriumfluorid,
in einer Konzentration, die die Umwandlung der Zucker nicht beeinträchtigt, jedoch
die Umwandlung der gebildeten gebundenen Säuren inhibiert, so daß die Umkehr des
pH-Werts oder die nichtspezifische Alkalisierung im Verlaufe von 24 bis 48 Stunden
unmöglich wird.
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Die inhibierende Wirkung des Fluorids ist umgekehrt proportional dem
pH-Wert, wobei die inhibierende Wirkung um so stärker ist, je weiter die Zuckergärung
fortgeschritten ist.
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Dieses Grundmedium zum Nachweis der Zuckergärung besitzt vor-
zugsweise
folgende Zusammensetzung: 2,5 g Hefeextrakt, 1 bis 2 mMol Natriumfluorid, 1 ml einer
Lösung von Bromcresolpurpur in Äthanol mit einer Konzentration von 16 g/l oder 100
mg Bromthymolblau, 10 bis 100 mMol Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-puffer
mit einem pH-Wert von 7,2 und destilliertes Wasser ad 1 000 ml.
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Die wäßrigen konzentrierten Zuckerlösungen, die vor ihrer Verwendung
in dem Grundmedium für die Zuckergärung verdünnt werden, sind die folgenden: eine
0,5m Lösung von Glucose, Mannit, Mesoinosit, Sorbit, Rhamnose, Saccharose, Arabinose,
Adonit, Fructose, Galactose, Maltose, Trehalose, Xylose oder Melibiose, eine 0,3m
Lösung von Lactose eine 0,25m Lösung von Raffinose oder Amygdalin und eine 0,15m
Lösung von Salicin oder Dulcit.
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Es sind jedoch beliebige andere Zucker ebenfalls geeignet.
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2. Medium zum Nachweis von Acetoin.
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Die Enterobakterien säuern das Kulturmedium durch Vergären der darin
enthaltenen Glucose an, wobei einige dieser Bakterien dazu in der Lage sind, diese
Azidität zu korrigieren, indem sie das aus der Glucose gebildete Pyruvat gemäß der
folgenden Gleichung in Acetylmethylcarbinol umwandeln, eine Substanz, die hinsichtlich
des pH-Werts neutral ist:
Das Acetylmethylcarbinol kann mit Hilfe der Vosges-Proskauer-
Reaktion
nachgewiesen werden, die das Ergebnis hat, daß 30 Minuten nach der Zugabe einer
Lösung von Kaliumhydroxid und von i-Maphthol, eine johannisbeerrote Färbung auftritt.
Ein Nachteil dieser Reaktion ist in der Tatsache zu sehen, daß man mit Bakterien,
von denen angenommen wird, daß sie nicht dazu in der Lage sind, Acetoin zu bilden,
stark verzögerte hellrosa Färhungen erzielt, wobei angenommen wird, daß diese Verfärbung
durch die Reagentien als solche oder wahrscheinlicher durch eine sehr geringe Bildung
von Acetoin bedingt ist.
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Wegen der Änderung der Azidität, die sich durch die Umwandlung von
Pyruvat in Acetylmethylcarbinol ergibt, wurde bereits vorgeschlagen, einen pH-Indikator
zuzugeben, der eine verschiedene färbung in Abhängigkeit von der Tatsache annimmt,
ob die Bakterien Acetylmethylcarbinol bilden oder nicht. Dieses Vorgehen wurde in
Form des Methylrot-tests angewandt, welcher Indikator bei einem pH-Wert von unterhalb
2 rot und bei einem pH-Wert von mehr als 6,3 gelb gefärbt ist. In allen Fällen sind
die in dieser Weise erzielten Reaktionen nicht deutlich, da der Mittelwert des pH-Werts,
den man mit kein Acetoin bildenden Bakterien erzielt, 4,70 beträgt, während man
im Fall von Bakterien, die Acetoin zu bilden vermögen, einen pH-Wert von 5,50 erzielt.
Dies ist der Grund dafür, daß die Färbung, die Acetoin(-)-bakterien mit Methylrot
liefern, sich nur sehr wenig von der Färbung unterscheidet, die man mit Acetoin(+)-bakterien
erhält. Hierdurch ergibt sich die Schwierigkeit der Anwendung des Methylrot-tests,
die noch dadurch erschwert wird, daß dieser Indikator nur schlecht löslich ist und
daß die Bakterien ihn reduzieren, wodurch er gegenüber Änderungen des pH-Werts noch
unempfindlicher wird, was es unmöglich macht, diesen Indikator von Anfang an in
die Identifizierungsbrühe oder das Identifizierungsmedium einzubringen.
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Es wurde nunmehr gefunden, daß wenn das Medium neben Glucose Pyruvat
oder Lactat enthält, der Mittelwert der pH-Werte der mit Acetoin(-)-bakterien angeimpften
Medien 5,4 beträgt, wäh-
rend der der Medien, die mit Acetoin(+)-bakterien
angeimpft worden sind, 6,9 beträgt, so daß der Unterschied zwischen diesen beiden
Mittelwerten etwa doppelt so groß ist, wie bei dem Medium, das nur Glucose enthält.
Unter diesen Bedingungen ist es möglich, als pH-Indikator Bromthymolblau zu verwenden,
dessen Umschlag von gelb bei einem pH-Wert von weniger als 6 über grün zu blau bei
einem pH-Wert von oberhalb 6 verläuft.
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Dieser Indikator ist leicht löslich und wird durch die Bakterien nicht
umgewandelt. Weiterhin lassen sich die Ergebnisse sofort ablesen, ohne daß es erforderlich
ist, nach dem Inkubieren Entwickler oder Indikatoren zuzusetzen, wobei die Übereinstimmung
der Ergebnisse dieser neuen Methode und der Methode, bei der die Vosges-Proskauer-Reaktion
angewandt wird, vollständig ist.
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In diesem Medium zum Nachweis von Acetoin werden erfindungsgemäß Substanzen
verwendet, die die Bildung von Acetoin aktivieren, d. h. eine erhebliche Menge Hefeextrakt
und eine geringe Menge Kreatin, Arginin oder einer Mischung aus beiden Bestandteilen.
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Das Medium zum Nachweis von Acetoin besitzt vorzugsweise folgende
Zusammensetzung: 10 g Hefeextrakt, 50 mMol Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäurepuffer
mit einem pH-Wert von 7,2, 100 mg Bromthymolblau, 20 mMol Kreatin oder 10 mMol Arginin
oder 20 mMol Kreatin und 10 mMol Arginin, 20 bis 100 mMol Glucose, 200 mMol Pyruvat
oder 100 mMol Lactat und destilliertes Wasser ad 1 000 ml.
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Andere Bakterien als die Enterobakterien bilden Acetoin in weniger
starkem Ausmaß und sind daher nicht dazu in der Lage,
den pH-Wert
der durch die Vergärung von Glucose gebildeten sauren Produkte in die Nähe des Neutralpunkts
zu bringen. Die den Farbindikator anwendende Methode ist daher nicht anwendbar,
so daß das Acetoin mit Hilfe der Vosges-Proskauer-Reaktion nachgewiesen werden muß.
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In diesem Fall besitzt das Medium zum Nachweis von Acetoin vorzugsweise
folgende Zusammensetzung: 10 g Hefeextrakt, 50 mMol Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäurepuffer
mit einem pH-Wert von 7,2, 20 mMol Kreatin oder 10 mMol Arginin oder 20 mMol Kreatin
und 10 mMol Arginin, 20 bis 100 mMol Glucose, 200 mMol Pyruvat oder 100 mMol Lactat
und destilliertes Wasser ad 1 000 ml.
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3. Medium zum Nachweis von Aminosäure-oxidasen.
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Die üblichen Methoden zum Nachweis von Aminosäure-oxidasen bestehen
darin, mit Hilfe von Eisen(III)-chlorid die Bildung von aus Phenylalanin oder Tryptophan
gebildeter i-Ketonsäure nachzuweisen (Phenylalanin-desaminase-test oder Tryptophan-desaminase-test).
Erfindungsgemäß werden verschiedene Medien geschaffen, die schnelle und intensive
Reaktionen (3 bis 14 Stunden je nach dem Keim) ermöglichen und die in gewissen Fällen
nicht die Anwendung von Entwicklungsreagentien benötigen.
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Es hat sich gezeigt, daß viele Aminosäuren in «-Ketonsäuren umgewandelt
werden können, wobei nicht sämtliche «-Ketonsäuren mit Eisen (III) -chlorid reagieren
(siehe auch "An improved ferric chloride test for differentiating Proteus - Providence
Group from other enterobacteriacees" J. Singer et coll (1954)).
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Andererseits enthalten die Medien verschiedene Aminosäuren in definierten
Verhältnissen, was sich für die Erzielung schneller positiver Reaktionen als besonders
interessant erwiesen hat. So haben sich die Kombination aus L-Tryptophan, L-Leucin
und L-Arginin oder die Kombination aus L-Tryptophan, L-Methionin und L-Arginin als
besonders interessant und besser erwiesen als die einzeln verwendeten Aminosäuren
L-Tryptophan, L-Methionin, L-Leucin oder L-Arginin.
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Die Reaktion der Aminosäure-oxidase kann durch Zugabe einer geringen
Dosis verschiedener Oxidationsmittel, wie Nitrate (Natriumnitrat oder Kaliumnitrat),
Persulfate (Ammoniumpersulfat) oder Chloramin T, beschleunigt werden. Auch der atmosphärische
Sauerstoff kann die Reaktion deutlich aktivieren, ohne daß er inhibierende Effekte
verursacht, die man bei zu hohen Konzentrationen der oben erwähnten Oxidationsmittel
beobachtet. Die begünstigende Wirkung des in der Atmosphäre vorhandenen Sauerstoffs
kann auch dadurch verstärkt werden, daß man Peroxidase (Meerrettich-peroxidase)
in das Medium einbringt. In diesem Fall ist die Menge der 4-Ketonsäure, die die
Aminosäure-oxidasen bildenden Bakterien ausgehend von der Mischung aus L-Tryptophan,
L-Leucin und L-Arginin bilden, so groß, daß das Medium einen gemsenbraunen Farbton
annimmt, der sich ohne weiteres von dem unverfärbten Medium unterscheiden läßt,
das man dann erhält, wenn das Medium mit Bakterien angeimpft wird, die keine Aminosäure-oxidasen
bilden oder enthalten. In diesem Fall ist es somit nicht notwendig, einen Entwickler
oder Indikator der Reaktion zu verwenden. Die bevorzugten Medien dieser Art besitzen
die folgenden Zusammensetzungen: A. Medium, das die Verwendung einer Lösung von
20 mMol Eisen-(III)-chlorid in 2,5m Chlorwasserstoffsäure als Entwickler benötigt:
42
mMol L-Tryptophan, 6 mMol L-Leucin, 0,25 mMol L-Arginin, 0,25 bis 0,75 mMol Natriumnitrat
oder Kaliumnitrat oder 0,25 bis 0,50 mMol Ammoniumpersulfat oder 2,5 mMol Chloramin
T, 2,25 g Hefeextrakt und destilliertes Wasser ad 1 000 ml oder 50 mMol Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäurepuffer
mit einem pH-Wert von 7,2 ad 1 000 ml oder 50 mMol Piperazindichlorid/Natriumhydroxid-puffer
mit einem pH-Wert von 6,5 ad 1 000 ml.
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B. Medium, das die Entwicklung mit einer Lösung von 20 mMol Eisen
(111)-chlorid in 2,5m Chlorwasserstoffsäurelösung nicht benötigt: 42 mPlol L-Tryptophan,
6 mMol L-Leucin, 0,25 mPIol L-Arginin, 2,25 g Hefeextrakt, 10 mg Meerrettich-peroxidase
und destilliertes Wasser ad 1 000 ml.
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Gewisse gefärbte Substanzen können sich bei der Reaktion der Aminosäure-oxidasen
als Oxidationsmittel verhalten. Ihre Zugabe zu der Reaktion führt zu ihrer Reduktion
und damit zu einer Veränderung des Farbtons oder einer Entfärbung. Somit verändert
sich der dunkelblaue Farbton des Dichlorphenolindophenols (in oxidiertem Zustand)
zu einem Hellrosafarbton (in reduziertem Zustand), wenn die zugeführten Aminosäuren
unter dem Einfluß der Bakterien-aminosäure-oxidasen zu den entsprechenden « -Ketonsäuren
oxidiert werden. Wenn die Bakterien das Enzym nicht enthalten oder bilden, bleibt
das Medium dunkelblau gefärbt. Gewisse Aminosäuren sind für diese Reaktion besser
geeignet als andere, was der Grund
dafür ist, daß erfindungsgemäß
eine Mischung aus L-Tryptophan, L-Methionin und L-Arginin ausgewählt wurde. Das
Pepton oder der Zellextrakt, das bzw. der im Medium als Wachstumssubstanz oder Nährsubstanz
zugesetzt worden ist, darf nicht zu nichtspezifischen Reduktionsreaktionen des Dichlorphenolindophenols
führen, was wiederum der Grund dafür ist, daß erfindungsgemäß ein mit Papain aus
Soja gewonnenes Pepton (Soja-Papain-Pepton) verwendet wird. Schließlich verbessern
der atmosphärische Sauerstoff und die Peroxidase die Reaktion und verstärken den
Unterschied zwischen den positiven Ergebnissen (hellrosa Farbton) und den negativen
Ergebnissen (dunkelblauer Farbton).
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Demzufolge macht dieses Reaktionsprinzip die Entwicklung mit Eisen(III)-chlorid
überflüssig, so daß man die Ergebnisse direkt ablesen kann.
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Die bevorzugte Zusammensetzung des Mediums ist die folgende: C. 20
mMol L-Tryptophan, 20 mMol L-Methionin, 0,25 mMol L-Arginin, 600,uPIIol Dichlorphenolindophenol,
5 g Soja-Papain-Pepton, 10 mg Meerrettich-peroxidase und destilliertes Wasser ad
1 000 ml.
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4. Medium zum Nachweis der Bildung von Indol.
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In klassischer Weise wird die Bildung von Indol in einem Medium untersucht,
das Tryptophan enthält. Nach der Inkubation einer Nacht reagiert das gegebenenfalls
gebildete Indol mit dem Kowacks-Reagens, wodurch eine johannisbeerrote Färbung verursacht
wird. Ein anderes Verfahren besteht darin, dem Kulturmedium entweder eine Bakterie,
die eine Indol-3-hydroxylase bildet, wie Pseudomonas indoloxidans, oder irgend-
eine
andere Bakterie, die dazu in der Lage ist, Indol durch Hydroxylierung in Indoxyl
umzuwandeln, oder die eingeengte und gereinigte Kulturbrühe einer Bakterie, die
diese Hydroxylase in dem Kulturmedium bildet, zuzusetzen. Das mit Hilfe dieser Indol
bildenden Bakterienarten produzierte Indol wird unter dem Einfluß dieser spezifischen
Hydrolase in Indoxyl umgewandelt, das sich spontan zu dem dunkelblau gefärbten Indigo
kondensiert. Die Anwendung dieser enzymatischen Reaktion ist möglich, da Pseudomonas
indoloxidans keine Enzyme bildet, die auf Tryptophan oder seine Stoffwechselprodukte,
mit Ausnahme von Indol, einwirken. Demzufolge wird die Anwendung eines Reaktionsindikators,
wie des Kowacks-Reagens, überflüssig.
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Die bevorzugten Medien, die diesen beiden Lösungen entsprechen, besitzen
folgende Zusammensetzung: a. Medium, das die Anwendung des Kowacks-Reagens benötigt:
30 mMol L-Tryptophan, 2,5 g Hefeextrakt und destilliertes Wasser ad 1 000 ml oder
50 mMol Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäurepuffer mit einem pH-Wert
von 7,2 ad 1 000 ml oder 50 mMol Piperazindichlorid/Natriumhydroxid-puffer mit einem
pH-Wert von 6,5 ad 1 000 ml.
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b. Medium, das die Anwendung eines Entwicklers oder Indikators nicht
erforderlich macht: 30 mMol L-Tryptophan, 2,5 g Hefeextrakt, 25 ml der gereinigten
und eingeengten Kulturbrühe einer Bakterie, die in ihrem Medium Indol-3-hydroxylase
bildet, und destilliertes Wasser ad 1 000 ml.
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5. Medium zum Nachweis von ß-Galactosidase und Nitrat-reduktase.
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Das Medium zum Nachweis von ß-Galactosidase und Nitrat-reduktase kennzeichnet
sich durch eine Kombination aus zwei Substraten aus, nämlich o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid
und Natriumnitrat, welche Substrate in einem Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-puffer
gelöst sind, welcher Puffer bei der Verwendung von Zuckern als experimentell günstig
bekannt ist. Es ist weiterhin bekannt, daß wenn die Bakterie ß-Galactosidase enthält
oder bildet, o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid zu o-Nitrophenol abgebaut wird,
das gelb gefärbt ist. Nach der Beobachtung dieser ersten Eigenschaft der Bakterie
wird das gegebenenfalls durch die bakterielle Reduktion von Nitrat gebildete Nitrit
mit Hilfe von in Essigsäure gelöstem i-Naphthylamin (zweites Griess-Reagens) nachgewiesen,
das man dem Medium nach dem Inkubieren zusetzt und das bei Anwesenheit von o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid
oder o-Nitrophenol in dem Medium eine der folgenden Reaktionen eingeht: A. Nitrit
+ -Napthylamin + o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid
roter Azofarbstoff; B. Nitrit + «-Naphthylamin + o-Nitrophenol
roter Azofarbstoff.
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Dieses Vorgehen vermeidet die Anwendung des ersten Griess-Reagens,
das aus einer Lösung von Sulfanilsäure in Essigsäure besteht.
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Das ganz allgemein von sämtlichen Enterobakterien gebildete Nitrit
übt eine inhibierende Wirkung auf die Vergärung von Galactose aus, die von der Bakterie
ausgehend von o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid freigesetzt wird, was die Ansammlung
von gebundenen Säuren verhindert und in dieser Weise den
Puffer
verstärkt, wodurch eine bessere Ablesbarkeit der Nachweisreaktion der ß-Galactosidase
sichergestellt wird.
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Das Medium zum Nachweis von ß-Galactosidase und Nitrat-reduktase besitzt
vorzugsweise folgende Zusammensetzung: 3 mMol o-Nitrophenyl-B-D-galactopyranosid,
50 mMol Natriumnitrat, 2,25 g Hefeextrakt, 100 mMol Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäurepuffer
mit einem pH-Wert von 7,2 und destilliertes Wasser ad 1 000 ml.
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6. Medium zum Nachweis von Urease.
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Die Anwendung dieses Mediums basiert auf dem wohlbekannten Prinzip,
nach dem die Umwandlung von Harnstoff durch Bakterien in Ammoniumcarbonat das Medium
alkalisch stellt, wodurch die Färbung eines pH-Indikators geändert wird.
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Üblicherweise enthalten die klassischen Medien einen Puffer, der es
ermöglicht, den Anfangs-pH-wert in einem sauren Bereich zu halten, der mit dem Bakterienwachstum
verträglich ist. Diese Medien verändern ebenso wie die gegenüber Harnstoff inaktiven
Bakterien die Färbung des Indikators nicht.
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Im Gegensatz zu diesen Medien enthält das erfindungsgemäße Medium
keinen Puffer und verwendet als Entwickler der Gärung Glucose. Die Glucose, die
von sämtlichen Enterobakterien vergoren wird, bildet Säuren in so geringen Mengen,
daß diese ohne weiteres durch das durch die Ureolyse gebildete Ammoniumcarbonat
neutralisiert werden können, so daß das Medium einen alkalischen pH-Wert annimmt,
wodurch sich der Indikator verfärbt. Wenn die Bakterie gegenüber Harnstoff inaktiv
ist, bleibt das Medium sauer.
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Weiterhin aktiviert die Glucosegärung die Ureolyse sehr stark,
wenn
die Bakterie eine Urease enthält oder bildet. Als weiteren Aktivator enthält das
Medium Hefeextrakt. Das Medium enthält eine Harnstoffmenge zwischen 26 und 44 mMol,
so daß sich eine optimale Ureolysereaktion ergibt. Um eine nichtspezifische Alkalisierung
zu verhindern, die entweder das Ergebnis der alkalischen Umwandlung des Hefeextrakts
oder der Umkehr des pH-Werts als Folge von oxidativen Prozessen oder der Umwandlung
der bei der Glucosegärung gebildeten Säuren in Acetylmethylcarbinol sein kann, wird
vorgeschlagen: 1) eine ausreichend große Glucosemenge zuzusetzen, damit die aus
dem Hefeextrakt gebildeten alkalischen Produkte neutralisiert werden, welche Menge
jedoch so gering sein muß, daß der Umschlag in den alkalischen Bereich unter dem
Einfluß der Ureolyse nicht verhindert oder verzögert wird; oder 2) in das Medium
einen Enolase-inhibitor einzubringen, der den Verlust der Säuren durch Umwandlung
der bei der Glucosegärung gebildeten sauren Produkte in Substanzen, wie Acetylmethylcarbinol,
verhindert. Als Inhibitor verwendet man Natriumfluorid in einer Konzentration zwischen
1 und 2 mMol/l, welche Konzentration gegenüber der Ureolyse inaktiv ist.
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Dieses Medium ist dem klassischen Medium deutlich überlegen, das es
sich gezeigt hat, daß die Ureolyse sehr stark durch die Anwesenheit von Glucose
in dem Medium aktiviert wird, so daß es möglich wird, schnelle Ergebnisse zu erzielen,
die in Abhängigkeit von den untersuchten Bakterien im Verlaufe von 3 bis 12 Stunden
üblich sind.
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Dieses Medium zum Nachweis von Urease besitzt vorzugsweise folgende
Zusammensetzung: 35 mMol Harnstoff, 16 bis 20 mMol Glucose,
1 bis
2 mMol Natriumfluorid, 2,5 g Hefeextrakt, 1 ml einer Lösung von Bromcresolpurpur
in Äthanol mit einer Konzentration von 16 g/l oder 100 mg Bromthymolblau, 16 mMol
Kaliumchlorid und destilliertes Wasser ad 1 000 ml.
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7. Medium zum Nachweis von Lysin-decarboxylase und Ornithindecarboxylase.
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Die Medien zum Nachweis von Lysin-decarboxylase und Ornithindecarboxylase
basieren auf dem wohlbekannten Prinzip, daß die Decarboxylierung von Lysin oder
Ornithin das Kulturmedium alkalisch stellt, wodurch der Umschlag eines pH-Indikators
verursacht wird. Wenn die Bakterie gegenüber Lysin oder Ornithin inaktiv ist, nimmt
das Medium unter dem Einfluß der Vergärung der enthaltenen Glucose einen sauren
pH-Wert an. Um nichtspezifische und schnelle Alkalisierungen zu verhindern, die
durch die Umwandlung von Zellextrakten, Peptonen und dem Abbau der sauren Stoffwechselprodukte
der Glucose verursacht werden, wurde bereits vorgeschlagen, die Kultur unter einer
Vaselineölschicht zu inkubieren (siehe auch "Simplified Tests for some aminoacid
decarboxylase and for the arginine dihydrolase system", V. Möller, Acta Path. XXXVI,
2, (1954); "Identification rapide des sous genres du groupe Enterobacter", C. Richard,
Ann. Biol. Clin. 28 (1970) 186-189). Leider hat sich auch gezeigt, daß die durch
die Verwendung des Öls bewirkte anaerobe biologische Reaktion die wenig aktiven
Decarboxylasen gewisser Bakterien inhibiert (C. Richard, Ann.
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Biol. Clin. 28 (1970) 185-189) und daß bei anderen Bakterien die nichtspezifischen
Alkalisierungen nicht verhindert werden. Im Gegensatz dazu ermöglichen es die erfindungsgemäßen
Medien diesen Nachteil zu überwinden,ohne Vaselineöl zu verwenden. Diese erfindungsgemäßen
Medien besitzen die folgenden Eigenheiten:
1. Sie enthalten Lysin
bzw. Ornithin in Mengen zwischen 36 und 48 mMol/l bzw. 24 und 36 mMol/l, so daß:
a) die Reaktionen der Lysin-decarboxylase bzw. der Ornithindecarboxylase in maximalem
Umfang ablaufen und b) die Inhibierung durch einen Überschuß des Substrats, die
man bei bestimmten Bakterien beobachtet, vermieden wird.
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2. Die Möglichkeit einer optimalen Reaktion von Lysin-decarboxylase
bzw. Ornithin-decarboxylase ermöglicht es, die Glucosemenge in den Medien auf 9
mMol/l bzw. 8 mMol/l zu erhöhen (anstelle der 5 mMol/l in den Medien von Möller
und Richard). In dieser Weise werden die sauren Produkte der Glucosegärung in größerer
Menge gebildet, wodurch eine genaue Neutralisation der alkalischen Substanzen möglich
wird, die aus den Peptonen oder Zellextrakten gebildet werden, die in den Medien
enthalten sind.
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3. Sie enthalten einen Enolase-inhibitor, der die Umwandlung der durch
die Vergärung der Glucose gebildeten sauren Produkte verhindert und damit nichtspezifische
alkalische Reaktionen des Mediums vermeidet. Man verwendet als Inhibitor Natriumfluorid
in einer Konzentration zwischen 1 und 2 mMol/l, bei welcher Konzentration er gegenüber
Lysindecarboxylase und Ornithin-decarboxylase inaktiv ist.
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4. Die Kombination des Substrats (Lysin oder Ornithin) in optimalen
Mengen mit Glucose und dem Enolase-inhibitor in angepaßten Mengen ermöglicht es,
die Verwendung von Vaselineöl zu vermeiden.
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Das Medium zum Nachweis von Lysin-decarboxylase besitzt vorzugsweise
folgende Zusammensetzung:
40 indol Lysin-hydrochlorid, 9 mMol D-Glucose,
1 bis 2 mMol Natriumfluorid, 2,5 g Hefeextrakt, 1 ml einer Bromeresolpurpurlösung
in Äthanol mit einer Konzentration von 16 g/l oder 100 mg Bromthymolblau und destilliertes
Wasser ad 1 000 ml.
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Das Medium zum Nachweis von Ornithin-decarboxylase besitzt vorzugsweise
die folgende Zusammensetzung: 30 mMol Ornithin-hydrochlorid, 8 mMol Glucose, 1,5
g Hefeextrakt, 1 bis 2 mMol Natriumfluorid, 1 ml einer Bromcresolpurpurlösung in
Äthanol mit einer Konzentration von 16 g/l oder 100 mg Bromthymolblau und destilliertes
Wasser ad 1 000 ml.
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8. Medium zum Nachweis der Verwertung von Citrat und Malonat.
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Die Medien zum Nachweis der Verwertung oder des Verbrauchs von Citrat
und Malonat sind durch einen Puffer gekennzeichnet, der eine Mischung aus Natriumcitrat
und Zitronensäure bzw. Natriummalonat und Malonsäure in solchen Mengen umfaßt, daß
ein pH-Wert von etwa 6 erreicht wird, wobei der Puffer des Mediums auch das Substrat
für das Bakterienwachstum darstellen kann. Wenn das Bakterium Citrat oder Malonat
verwertet, zerstört die dadurch verursachte Decarboxylierung progressiv die Pufferwirkung
des Substrats, so daß, da der Anfangs-pH-wert des Mediums nur wenig von der Grenze
der Pufferwirkung des Citrat/Zitronensäure-systems oder des Malonat/ Malonsäure-systems
entfernt ist, der pH-Wert des Mediums schnell in den alkalischen Bereich wechselt,
was sich durch eine Änderung des Farbindikators ins Blaue manifestiert.
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Dieses Vorgehen vermeidet die Anwendung von zusätzlichen che-
mischen
Substanzen mit Pufferwirkung und ermöglicht es bei identischen molaren Citrat- oder
Malonat-konzentrationen ein wesentlich schnelleres Ansprechen im Bereich von 12
bis 16 Stunden zu erreichen.
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Die bevorzugte Zusammensetzung des Mediums zum Nachweis der Citrat-verwertung
ist die folgende: 22 mMol Trinatriumcitrat, 3 mMol Zitronensäure, 100 mg Bromthymolblau,
0,6 g Hefeextrakt und destilliertes Wasser ad 1 000 ml.
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Das Medium zum Nachweis der Malonat-verwertung besitzt vorzugsweise
folgende Zusammensetzung: 22,5 mMol Natriummalonat, 2,5 mMol Malonsäure, 100 mg
Bromthymolblau, 0,6 g Hefeextrakt und destilliertes Wasser ad 1 000 ml.
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9. Medium zum Nachweis von Arginin-dihydrolase.
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Dieses Medium besitzt vorzugsweise folgende Zusammensetzung: 25 mMol
Argininbase, 20 mg Phenolrot, 2,25 g Hefeextrakt, Chlorwasserstoffsäure bis zu einem
pH-Wert von 6,2 und 0,01m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,2 ad 1 000 ml (Dinatriumphosphat,
Monokaliumphosphat).
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10. Medium zum Nachweis von Gelatinase.
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nie Gelatinolyse der Gelatine eines photographischen Films wird durch
die Art des Peptons des Kulturmediums und die Zugabe von Mineralsalzen, wie Calciumchlorid,
erleichtert. Das Pepton, das die schnellsten Ergebnisse liefert, ist das mit Pancreatin
aus Gelatine gewonnene Pepton (Gelatine-Pankreatin-Pepton).
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Dieses Medium zum Nachweis der Gelatinase besitzt vorzugsweise folgende
Zusammensetzung: 5 bis 10 g Gelatine-Pankreatin-Pepton, 2,5 bis 10 g Hefeextrakt,
150 mMol Natriumchlorid, 50 mMol Calciumchlorid und destilliertes Wasser ad 1 000
ml.
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11. Medium zum Nachweis der Bildung von Schwefelwasserstoff.
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Die Bildung von Schwefelwasserstoff erfolgt üblicherweise entweder
ausgehend von Cystein oder ausgehend von Hyposulfit, und wird mit Hilfe der Reaktion
eines in das Medium eingebrachten Schwermetalls nachgewiesen, das ein bei einem
pH-Wert von mehr als 5,5 unlösliches Metallsulfid bildet (siehe Brisou et coll).
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Die klassischen Medien verwenden Hyposulfit in Gegenwart von Eisen(II)-ammonium-sulfat
in Kombination mit einer großen Menge Pepton, dessen Auswahl offenbar durch den
Schwefelgehalt bedingt ist. Die Verwendung eines Puffers wurde nicht als nötig erachtet.
Jedoch ist festzustellen, daß in Abhängigkeit von der Art des Peptons und der Art
der untersuchten Bakterie das Medium sauer oder alkalisch wird und daß die Bildung
des unlöslichen Metallsulfids gestört werden kann. Das erfindungsgemäße Medium enthält
einen Trihydroxymethylaminomethan-puffer (mit einem pH-Wert von 7 bis 7,4) und die
Reaktion stark beschleunigende Substanzen, wie Arginin, Magnesiumchlorid und
eine
Mischung aus Pepton und Zellextrakten, wie ein mit Pankreatin aus Lactalbumin gewonnenes
Pepton (Lactalbumin-Pankreatin-Pepton) und Hefeextrakt. Die Kombination dieser verschiedenen
günstigen Faktoren (Puffer, Arginin, Magnesiumchlorid, die Art des Peptons und der
Zellextrakte) ermöglicht es, die Gesamtmenge des Peptons und der Zellextrakte zu
vermindern und schnelle und intensive Reaktionen selbst mit Bakterien zu erreichen,
die für eine langsame Bildung von Schwefelwasserstoff bekannt sind. Die bevorzugte
Zusammensetzung des Mediums zum Nachweis der Bildung von Schwefelwasserstoff ist
die folgende: 15 bis 30 g einer Mischung aus 1,2 Teilen Lactalbumin-Pankreatin-PePton
und 1 Teil Hefeextrakt, 18 mMol L-Arginin, 2 mMol Magnesiumchlorid, 2,5 mMol Natriumhyposulfit,
1,5 mMol Eisen(II)-ammoniumsulfat und 0,15m Trihydroxymethylaminomethan-puffer mit
einem pH-Wert von 7,2 ad 1 000 ml.
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12. Grundmedium zur Untersuchung der Vergärung und aeroben Verwertung
von Zuckern durch gram-positive Kokken in Katalase (+) - oder Katalase(-)-haufen.
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Das Grundmedium zur Untersuchung der Gärung oder aeroben Verwertung
von Zuckern dient dazu, die oben beschriebenen, konzentrierten wäßrigen Lösungen
auf 1/10 ihrer Konzentration zu verdünnen. Das erfindungsgemäße Medium enthält Hefeextrakt
in großer Menge (etwa 20 g/l) in einem Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-puffer,
der sich experimentell für die Verwertung der Zucker als günstig erwiesen hat. Diese
große Menge Hefeextrakt ermöglicht es, die Ergebnisse der Zuckergärung schnell nach
12 bis 16 Stunden im Wärmeschrank oder Brutschrank bei 35 0C zu erzielen.
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Dieses Grundmedium der Untersuchung der Zuckergärung besitzt vorzugsweise
folgende Zusammensetzung: 20 g Hefeextrakt, 1 ml einer Bromcresolpurpurlösung in
Äthanol mit einer Konzentration von 16 g/l oder 100 mg Bromthymolblau, 50 mMol Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäurepuffer
mit einem pH-Wert von 7,2 und destilliertes Wasser ad 1 000 ml; 13. Medium zum Nachweis
von Phosphatase.
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Das üblicherweise verwendete Medium führt zu langwierigen Reaktionen
und macht die Anwendung eines Entwicklers nach der Inkunierung erforderlich. Das
erfindungsgemäße Medium enthält ein farbloses Substrat, wie p-t-litrophenylphosphat,
das unter der Einwirkung der Phosphatase Phosphat und kanarlengelb gefärbtes p-Nitrophenol
liefert. Es ist daher nicht notwendig, nach der Inkubation einen Entwickler oder
Indikator zuzusetzen. Der optimale pH-Wert der Phosphatase-reaktion liegt zwischen
8 und 10, wobei zwischen diesen pH-Werten eine spontane Lyse des Substrats erfolgt,
wodurch eine nichtspezifische gelbe Färbung auftritt. Um die spontane Lyse des Substrats
zu vermeiden, wird der pH-Wert des Mediums in der Nähe des Neutralitätspunkts gehalten,
wozu man einen Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-puffer verwendet.
Dieses Medium enthält weiterhin ein aus Sojakeimprotein mit Papain gewonnenes Pepton
(Sojakeimprotein-Papain-Pepton) in einer solchen Menge, daß das Wachstum von anspruchsvollen
Bakterien, wie Staphylokokken, möglich ist.
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Dieses Medium zum Nachweis von Phosphatase besitzt vorzugsweise folgende
Zusammensetzung:
12 mMol p-Nitrophenylphospaht, 10 g Soj akeimprotein-
Papain-Pepton, 50 mMol Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäurepuffer mit
einem pH-Wert von 7,2 und destilliertes Wasser ad 1 000 ml.
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14. Das Medium zum Nachweis von Nitrat-reduktase besitzt vorzugsweise
folgende Zusammensetzung: 20 mMol Natriumnitrat, 5 g Casein-Trypsin-Pepton und destilliertes
Wasser ad 1 000 ml.
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15. Das Medium zum Nachweis von Coagulase besteht aus einer Mischung
aus oxalatbehandelten Humanplasmas, die durch Filtration sterilisiert worden sind.
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16. Die konzentrierte, modifizierte Koser-Lösung besteht aus einer
wäßrigen Lösung von 430 mMol/l Natriumchlorid, 4 mMol/l Magnesiumsulfat, 18 mttol/l
Kaliumchlorid und 43 mMol/l Ammoniumchlorid.
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17. Die Nährbrühe (houillon galerie) enthält folgende Bestandteile:
200 ml der konzentrierten modifizierten Koser-Lösung, 4 bis 7 g Hefeextrakt und
destillisertes Wasser ad 1 000 ml.
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18. Das Medium zum Nachweis von Nitrat-reduktase, das geringe Nitratkonzentrationen
enthält, besitzt vorzugsweise folgenden Aufbau: O,Ol,uMol Ammoniumheptamolybdat,
5 mMol Natriumnitrat,
0,5 g Gelatine-Pankreatin-Pepton, 50 mMol
Glycerin und destilliertes Wasser ad 1 000 ml.
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19. Das Medium zum Nachweis von Nitrat-reduktase, das hohe Nitratkonzentrationen
enthält, besitzt vorzugsweise folgende Zusammensetzung: O,O1/uMol Ammoniumheptamolybdat,
500 mMol Natriumnitrat, 0,5 g Gelatine-Pankreatin-Pepton, 50 mMol Glycerin und destilliertes
Wasser ad 1 000 ml.
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Die Reduktion der Nitrate wird über die Anwesenheit von Nitrit in
dem Medium untersucht, was mit Hilfe der beiden Griess-Reagentien erfolgt, die jeweils
nach der Inkubation in einer Menge von einem Tropfen zu den beiden Medien zugesetzt
werden.
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Die Verwendung der beiden Medien, von denen eines eine sehr geringe
Menge Nitrat enthält, die ohne weiteres durch geeignet te Bakterien über den Zustand
des Nitrits hinaus reduziert werden kann, und das andere eine sehr große Menge Nitrat
enthält, deren vollständige Reduktion über den Zustand des Nitrits hinaus unmöglich
ist, ermöglicht es, Schlüsse über die Stoffwechselmöglichkeiten der Bakterie zu
ziehen (Reduktion zu dem Nitrit, Reduktion über den Zustand des Nitrits hinaus und
Ilnfähigkeit, das Nitrat zu reduzieren).
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20. Das Medium zum Nachweis der Verwertung der Glucose auf oxidativem
oder fermentativem Wege besitzt vorzugsweise folgende Zusammensetzung: 50 mMol D-Glucose,
10 bis 25 mMol Trihydroxymethylaminomethan/Chlorwasserstoffsäure-puffer mit einem
pH-Wert von 7,2 und destilliertes Wasser ad 1 000 ml.
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Die Medien zum Nachweis der Verwertung von Citrat, zum Nachweis von
Gelatinase und zum Nachweis von Arginin-dihydrolase sind die gleichen, wie sie für
die Enterobakterien beschrieben wurden.
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Im Fall der Durchführung der Diagnose der Gattung und der Ermittlung
der Art der Enterobakterie an einer Suspension der Bakterie in 2,5 ml Salzwasser,
das 9 g/l Natriumchlorid enthält, sind die Reaktionen der Bildung von Acetoin und
der Verwertung von Citrat oder Malonat Decarboxylierungsreaktionen, bei denen Kohlendioxidgas
gebildet wird. Wenn das Reaktionsmedium mit einem ausreichenden Volumen Luft in
Kontakt steht, kann das Kohlendioxidgas aus dem Medium entweichen und somit zu einer
schnellen Verminderung der Azidität und damit einem schnelleren Umschlag des pH-Indikators
beitragen. Wenn die Näpfchen mit klebendem Papier oder Klebstreifen verschlossen
sind, ist das Luftvolumen zwischen der Flüssigkeitsoberfläche und dem klebenden
Papier oder dem Klebstreifen ungenügend, so daß, da das gebildete Kohlendioxidgas
nur schlecht durch das Papier hindurchdiffundiert, der Kohlendioxidpartialdruck
oberhalb der Brühe ansteigt, wodurch eine gewisse Menge der Azidität in dem Medium
zurückgehalten wird, wodurch der Umschlag des pH-Indikators verzögert oder verhindert
wird.
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Dies ist der Grund dafür, daß das klebende Papier oder der Klebstreifen,
mit dem die Näpfchen verschlossen sind, die diese Medien enthalten, mit einem Loch
mit einem Durchmesser von weniger als 1 mm versehen wird. Nach einer Inkubationszeit
im Wärmeschrank oder Brutschrank mit einer Temperatur von 35 0C von 3 bis 18 Stunden
liest man die Ergebnisse unter Anwendung der nachstehenden Tabelle ab.
| Positive Negative |
| Reaktion Reaktion |
| 1. Zuckergärung (Glucose, Melibiose, Rhamnose blau oder |
| odersämtliche anderen Zucker) gelb grün |
| 2. Nachweis von ß-Galactosidase gelb farblos |
| 3. Reduktion von Nitrat zu Nitrit: man gibt johannisbeer- farblos |
| dem Näpfchen zum Nachweis der ß-Galactosidase rot |
| 1 Tropfen einer Lösung von«-Naphthylnmin (2. |
| Griess-Reagens) zu |
| 4. Bildung von Acetoin grün-blau bis gelb |
| intensiv blau |
| 5. Verwertung von Citrat oder von Malonat intensives grün oder
gelb |
| blau |
| 6. Anwesenheit von Urease, von Lysin-decarb- grün oder gelb |
| oxylase oder von Ornithin-decarboxylase blau |
| 7. Nachweis der Aminosäure-oxidasen: |
| a) mit dem Medium, das die Zugabe eines rot-braun bis farblos |
| Tropfens Eisen(III)-chlorid notwendig weinviolett oder stroh- |
| macht gelb |
| b) mit einem Medium, das die Entwicklung gemsenbraun farblos |
| mit einer Eisen(III)-chloridlösung |
| nicht zwingend erforderlich macht, |
| ohne die Anwendung von Eisen(III)-chlorid |
| c) mit einem Dichlorphenolindophenol enthal- hellrosa dunkelblau |
| tenden Medium |
| 8. Nachweis der Bildung von Indol: |
| a) mit einem Medium1 das die Zugabe von 2 roter Ring farbloser
od. |
| Tropfen des Kowacks-Reagens erforderlich leicht grünli- |
| macht cher Ring |
| b) mit einem Indol-3-hydroxylase enthalten- dunkelblauer Medium
unver- |
| den Medium Niederschlag ändert |
| 9. Bildung von Schwefelwasserstoff schwarzer Medium unver- |
| Niederschlag ändert |
| 10. Nachweis von Arginin-dihydrolase rosa bis rot Medium unver- |
| ändert |
| 11. Nachweis von Gelatinase transparenter unveränderter |
| photographi- photographi- |
| scher Film- scher Film- |
| streifen und streifen |
| schwarzer |
| Niederschlag |
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Im Fall der Biotypisierung von gram-positiven Kokken in Katalase(+)-
oder Katalase(-)-haufen unter Anwendung einer Suspension der Bakterien in 1 ml Nährbrühe
bewirkt man das Ablesen der Ergebnisse nach der Inkubation während 16 bis 20 Stunden
im
Wärmeschrank oder Brutschrank bei 350C unter Anwendung der folgenden Tabelle:
| Positive Negative |
| Reaktion Reaktion |
| 1. Vergärung von Glucose oder von Mannit oder gelb grün oder |
| aerobe Verwertung von Maltose, Lactose, blau |
| Arabinose und Mannit oder sämtlicher anderen |
| Zucker |
| 2. Bildung von Acetoin: man gibt dem Medium johannisbeer- farblos |
| 1 Tropfen 7m Kaliumhydroxidlbsung und rot |
| 1 Tropfen 0,4m «-Naphthollösung zu, nach |
| 30 Minuten bei Raumtemperatur |
| 3. Nachweis von Phosphatase kanariengelb farblos |
| 4. Nachweis von Coagulase trübes Medium klares Medium |
| 5. Nachweis der Nitratreduktion: man gibt johannisbeer- farblos |
| 1 Tropfen jedes der Griess-Reagentien zu rot, das in |
| braun um- |
| schlägt |
Bei der Identifizierung von Pseudomonadaceae erfolgt die Ablesung der Ergebnisse
wie für die Enterobakterien oder für die gram-positiven Kokken im Fall des Nachweises
der Nitratreduktion.