CH636376A5

CH636376A5 - Process for the identification of bacteria and culture medium for its implementation

Info

Publication number: CH636376A5
Application number: CH1619177A
Authority: CH
Inventors: Jean-Georges Barth
Original assignee: Sarrebourg Hopital Civil Saint
Priority date: 1977-02-14
Filing date: 1977-12-29
Publication date: 1983-05-31
Also published as: IT7812415A0; LU78801A1; NL7714601A; DE2803358A1; IT1106736B; DE2803358C2

Description

La présente invention concerne le domaine de l'identification des bactéries, notamment des entérobactéries, et a pour objet des milieux pour l'identification des bactéries applicables à l'identification en microméthode.

Actuellement, l'identification des entérobactéries est pratiquée quotidiennement dans les laboratoires de biologie médicale et vétérinaire, ou dans les laboratoires de bactériologie alimentaire.

Généralement, cette identification est réalisée en mettant en évidence un ensemble de propriétés biochimiques de la bactérie à l'aide de milieux de culture spéciaux appelés milieux d'identification.

Par le passé, ces milieux étaient des milieux gélosés complexes contenus dans des tubes en verre à fermeture au moyen d'une vis de grande dimension. Pour ensemencer les tubes, il était alors nécessaire de disposer d'une souche en culture pure obtenue en 24 h par repiquage de la colonie isolée sur milieu d'isolement.

Ces milieux d'identification présentent, cependant, entre autres, l'inconvénient d'être encombrants, peu pratiques pour le travail en série et onéreux.

Il existe également d'autres dispositifs d'identification des entérobactéries qui permettent d'identifier la bactérie à partir du milieu d'isolement, et ayant pour corollaire un gain de temps et de matériel.

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Un tel dispositif d'identification peut être constitué par un cylindre compartimenté contenant différents milieux gélosés, une tige pointue traversant le tube dans sa longueur, et permettant, par contact de sa pointe avec la colonie à identifier, et par traction sur la tige, d'ensemencer chaque milieu au passage.

Un autre dispositif se présente sous la forme d'un ensemble de petites cupules de formes particulières placées sur un support en matière synthétique, et contenant les milieux d'identification sous formes desséchées. Ces cupules sont alors remplies à l'aide d'une suspension dans l'eau de la bactérie à identifier.

Il existe encore d'autres procédés et dispositifs d'identification, mais tous nécessitent l'emploi d'un contenant spécial et sont d'un prix de revient élevé.

La présente invention a pour objet la mise au point de milieux liquides pour l'identification des bactéries applicables à l'identification en microméthode.

Ces milieux sont caractérisés en ce qu'ils présentent des propriétés telles que les réversions tardives du pH sont évitées dans les milieux pour l'étude des fermentations sucrées, que l'ajout d'huile de vaseline à certains milieux (milieu pour fermentations sucrées des entérobactéries, milieu pour la recherche de l'uréase, milieu pour la mise en évidence de la production d'acide sulfhydrique, milieu pour la recherche des décarboxylases) est inutile, que le résultat d'une réaction biochimique peut être lu, en général, directement grâce à la teinte d'un indicateur interne, sans ajouter de révélateurs spéciaux en fin d'incubation, que les réactions sont rapides, pouvant être obtenues en 3 à 18 h selon le caractère biochimique, et selon la bactérie étudiée, que la microméthode peut être mise en œuvre dans des contenants quelconques habituels dans les laboratoires de biologie, tels des tubes à hémolyse ou des godets de plaque pour microtitration, et en ce que le volume réactionnel final est de 150 à 650 (il dont 100 à 500 |il de bouillon d'identification.

Comme d'autres, la microméthode d'identification, applicable notamment à l'identification des entérobactéries, utilise une colonie bactérienne obtenue sur milieu d'isolement. La microméthode associe, pour obtenir le diagnostic du genre et quelquefois d'espèce d'entérobactérie, les milieux suivants: milieux pour la recherche de la fermentation du glucose, du mélibiose, du rhamnose, milieu pour la production d'acétoïne, milieu pour la recherche des aminoacides-oxydases et milieu pour la mise en évidence de la production d'indole, milieu pour la recherche de la ß-galactosidase et de la nitrate-réductase, milieux pour la recherche de l'uréase, de la lysine-décarboxylase et de l'ornithine-décarboxylase, milieu au citrate, et milieu pour la mise en évidence de la production d'acide sulfhydrique, le diagnostic pouvant, dans certains cas, être complété par l'emploi du milieu pour la recherche de l'arginine-dihydrolase, du milieu pour l'étude de l'utilisation du malonate, et éventuellement d'autres milieux pour fermentations sucrées, ainsi que du milieu pour la mise en évidence de la gélatinase.

Conformément à une caractéristique de l'invention, la microméthode consiste à mettre en suspension, dans 2,5 ml d'eau salée à 9 g/1 de chlorure de sodium, une colonie ou fraction de colonie d'entérobactérie à étudier, à répartir alors une goutte d'environ 50 (il de cette suspension dans les bouillons d'identification préalablement répartis dans les godets de la plaque pour microtitration et à fermer les godets au moyen d'un papier adhésif, les godets contenant les milieux pour la recherche de l'acétoïne, pour l'utilisation du citrate ou du malonate et pour la mise en évidence des aminoacides-oxydases, étant fermés par un papier adhésif percé d'un trou d'un diamètre de moins de 1 mm, puis à placer la plaque ainsi ensemencée dans une étuve à 35° C pendant une durée de 12 à 18 h et, enfin, à procéder à la lecture des résultats.

Selon une variante de l'invention, la microméthode met en œuvre, en vue du biotypage des Cocci Gram (+) en amas catalase (+) ou catalase (—) selon la classification de Baird Parker, avec une colonie de bactéries prélevée sur des milieux sélectifs ou sur gélose au sang ou gélose ordinaire, les milieux suivants: milieu de Koser concentré modifié, bouillon galerie, milieu pour la fermentation du glucose et du mannitol, milieux pour l'utilisation aérobie du lactose, du maltose, de l'arabinose et du mannitol, milieu pour la recherche de l'acétoïne sans indicateur de pH, milieux pour la recherche "de la phosphatase, milieu pour la recherche de la coagulase, milieu pour la mise en évidence de la réduction des nitrates.

Conformément à une caractéristique de l'invention, la microméthode consiste à mettre en suspension dans 1 ml de bouillon galerie une colonie de bactéries prélevée sur milieux sélectifs ou sur gélose au sang ou gélose ordinaire, en vue du biotypage des Cocci Gram (+) en amas catalase (+) ou catalase (—) selon la classification de Baird Parker, puis à distribuer une goutte de suspension d'environ 50 ni dans 100 pi de chacun des milieux d'identification préalablement répartis dans les godets de la plaque pour microtitration, à ajouter trois gouttes d'huile de vaseline stérile au milieu pour la fermentation du glucose et du mannitol, à fermer alors les godets avec un papier adhésif, à mettre ensuite la plaque dans une étuve à 35° C pendant une durée de 16 à 20 h et, enfin, à procéder à la lecture des résultats.

Conformément à une autre variante de réalisation de l'invention, la microméthode met en œuvre, en vue de l'identification des pseu-domonadacées (bacilles Gram (—) oxydase (+) ou bacilles Gram (—) oxydase et nitrate (—) cultivant sur milieux sélectifs lactosés ou sur gélose ordinaire), les milieux suivants: milieu pour la recherche de l'utilisation du glucose par voie aérobie, milieu pour la recherche de l'utilisation du glucose par voie fermentative, milieu pour la recherche de la réduction du nitrate à faible et à forte concentration de nitrate, milieu pour la vérification de l'utilisation du citrate, milieu pour la mise en évidence de la gélatinase, et milieu pour la recherche de l'arginine-dihydrolase.

Conformément à une caractéristique de l'invention, la microméthode appliquée aux pseudomonadacées est mise en œuvre de la manière suivante:

Une colonie de bactéries à identifier (bacilles Gram (—) oxydase (+) ou bacilles Gram (—) oxydase et nitrate (—) cultivant sur milieux sélectifs lactosés ou sur gélose ordinaire), prélevée sur un milieu d'isolement, tel que gélose lactosée ou gélose ordinaire est mise en suspension dans 1 ml de bouillon galerie, puis est passée en étuve à 37° C pendant 2 h. On répartit ensuite 50 (il de la suspension dans 100 (il des bouillons d'identification préalablement répartis dans les godets de la plaque à microtitration. Au godet contenant le milieu pour l'étude de la fermentation du glucose, on ajoute trois gouttes d'huile de vaseline, et au godet contenant le milieu pour la recherche de la gélatinase, on ajoute un petit morceau de pellicule photographique, puis les godets sont fermés à l'aide d'un papier adhésif, le papier adhésif du godet citrate étant muni d'un trou d'un diamètre de 1 mm. Enfin, la plaque à microtitration et la suspension dans le bouillon galerie sont mises à l'étuve à 35°C pendant 14 à 18 h. Après incubation, on enlève le papier adhésif et on procède à la lecture des résultats de la même manière que pour les entérobactéries, sauf en ce qui concerne l'oxydation du glucose et la réduction des nitrates. Dans chacun des deux milieux pour la mise en évidence de la nitrate-réductase, on ajoute les réactifs de Griess. Lorsque le glucose est oxydé, le milieu vire au jaune, tandis qu'il reste bleu dans le cas contraire.

En dernier lieu, on prélève du bouillon galerie une goutte entre lame et lamelle et on observe la mobilité au microscope à fond noir.

Les milieux mis en œuvre dans les microméthodes objet de l'invention sont décrits ci-après.

1. Milieu de base pour l'étude des fermentations sucrées doué de propriétés s'opposant aux réversions tardives du pH

Ce milieu sert à diluer au 1/10 des solutions aqueuses concentrées de sucres à étudier, et contient un tampon trihydroxyméthyl-aminométhane/acide chlorhydrique qui s'est montré expérimentalement favorable à l'utilisation sucrée, et dont la molarité a été choisie telle que l'on obtient des résultats très rapides, à savoir dans un intervalle de temps compris entre 3 et 12 h selon le sucre étudié.

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Il peut arriver que, avec certaines bactéries, le pH du milieu,

après avoir passé dans une zone acide sous l'influence des produits acides fixes formés à partir du sucre, revienne dans une zone alcaline. Ce phénomène s'explique par la transformation de ces acides en acétylméthylcarbinol, ou par des processus oxydatifs, c'est-à-dire de perte d'acidité, et est connu sous le nom de réversion tardive du pH. Pour éviter ce phénomène, qui perturbe la lisibilité des résultats, le milieu de base selon l'invention contient un inhibiteur de l'énolase, à savoir le fluorure de sodium, à une dose qui n'empêche pas la transformation des sucres, mais qui inhibe la transformation des acides fixes formés, si bien que les réversions de pH ou alcalinisations non spécifiques sont impossibles en 24 à 48 h.

L'effet inhibiteur du fluorure est inversement proportionnel au pH, si bien que l'action inhibitrice est progressivement plus importante au fur et à mesure de l'évolution de la fermentation sucrée.

Ce milieu de base pour l'étude des fermentations sucrées présente la composition préférentielle suivante:

2,5 g d'extrait de levure 1 à 2 mmol de fluorure de sodium

1 ml de solution de pourpre de bromocrésol à 16 g/1 dans l'étha-nol ou 100 mg de bleu de bromothymol 10 à 100 mmol de trihydroxyméthylaminométhane/acide chlorhydrique q.s.p. pH 7,2 eau distillée q.s.p. 1000 ml.

Les solutions aqueuses concentrées de sucres, diluées avant leur emploi dans le milieu de base pour fermentations sucrées, sont les suivantes:

solution 0,5M de glucose, de mannitol, de mésoïnositol, de sorbi-tol, de rhamnose, de saccharose, d'arabinose, d'adonitol, de fructose, de galactose, de maltose, de tréhalose, de xylose, ou de mé-Iibiose,

solution 0,3M de lactose,

solution 0,25M de raffinose, ou d'amygdaline,

solution 0,15M de salicine, ou de dulcitol,

la méthode étant applicable à tout autre sucre.

2. Milieu pour la recherche de l'acétoïne

Les entérobactéries acidifient le milieu de culture par fermentation du glucose qu'il contient, et certaines d'entre elles sont capables de corriger cette acidité en transformant le pyruvate formé à partir de glucose en acétylméthylcarbinol, substance neutre du point de vue du pH d'après:

2CH3 - CO - COOH -» CH3 - CH - C - CH3 4- 2C02

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OH O

L'acétylméthylcarbinol peut être détecté par la réaction de Vosges-Proskauer, qui a pour résultat de faire apparaître, 30 min après addition d'une solution de potasse et d'a-naphtol, une teinte rouge groseille. Un défaut de cette réaction réside dans le fait que l'on obtient, avec les bactéries réputées incapables de fabriquer de l'acétoïne, des teintes très tardives rose pâle, cette coloration étant supposée due aux réactifs eux-mêmes, mais plus vraisemblablement à une très faible production d'acétoïne.

Etant donné la modification d'acidité qui résulte de la transformation du pyruvate en acétylméthylcarbinol, il a été proposé d'ajouter un indicateur de pH qui prend une teinte différente selon que les bactéries produisent ou ne produisent pas de l'acétylméthylcarbinol. Ce mode opératoire a été appliqué sous forme de test au rouge de méthyle, ce dernier virant au rouge en dessous de pH 4,2 et au jaune au-dessus de pH 6,3. Toutefois, les réponses ainsi obtenues ne sont pas nettes, car la moyenne des pH obtenus avec des bactéries ne fabriquant pas d'acétoïne est de 4,70, et celle obtenue avec des bactéries capables d'en fabriquer est de 5,50. C'est pourquoi la teinte que produisent avec le rouge de méthyle les bactéries acétoïne (—) n'est que très peu différente de celle obtenue avec les bactéries acétoïne (+). Il en résulte la difficulté d'emploi du test au rouge de méthyle, à laquelle s'ajoute le fait que ce dernier n'est pas très soluble et que les bactéries le réduisent, le rendant ainsi insensible aux variations de pH, ce qui empêche son introduction par avance dans le bouillon d'identification.

Il a été établi que, si le milieu contient, en plus du glucose, du pyruvate ou du lactate, la moyenne des pH des milieux ensemencés avec des bactéries acétoïne (—) est de 5,4, tandis que celle des milieux ensemencés avec des bactéries acétoïne (+) est de 6,9, c'est-à-dire que l'écart entre ces deux moyennes est environ le double de ce qu'il était avec un milieu ne contenant que du glucose. Dans ces conditions, il est possible d'utiliser comme indicateur de pH le bleu de bromothymol qui vire au jaune à des pH inférieurs à 6, et au vert, puis au bleu à des pH supérieurs à 6. Cet indicateur est facilement soluble et non transformé par les bactéries. En outre, la lecture des résultats est immédiate, sans qu'il soit nécessaire d'ajouter des révélateurs après incubation, et la concordance des résultats entre cette nouvelle méthode et celle utilisant la réaction de Vosges-Proskauer est totale.

Dans ce milieu, pour la recherche de l'acétoïne, sont employées des substances activatrices de la production d'acétoïne, et une faible quantité de créatine, d'arginine, ou des deux composants employés simultanément.

Le milieu pour la recherche de l'acétoïne présente la composition préférentielle suivante:

10 g d'extrait de levure

50 mmol de trihydroxyméthylaminométhane/acide chlorhydrique q.s.p. pH 7,2 100 mg de bleu de bromothymol

20 mmol de créatine, ou 10 mmol d'arginine, ou 20 mmol de créatine et 10 mmol d'arginine

20 à 100 mmol de glucose

200 mmol de pyruvate ou 100 mmol de lactate eau distillée q.s.p. 1000 ml.

Les bactéries autres que les entérobactéries produisent moins activement de l'acétoïne et sont incapables de ramener le pH au voisinage de la neutralité à partir des produits acides formés par la fermentation du glucose. La méthode employant l'indicateur coloré est alors inapplicable et l'acétoïne doit être révélée par la réaction de V osges-Proskauer.

Dans ce cas, le milieu pour la recherche de l'acétoïne présente la composition préférentielle suivante:

10 g d'extrait de levure

50 mmol de trihydroxyméthylaminométhane/acide chlorhydrique q.s.p. pH 7,2

20 à 100 mmol de glucose

200 mmol de pyruvate ou 100 mmol de lactate eau distillée q.s.p. 1000 ml.

3. Milieu pour la recherche des aminoacides-oxydases

Les techniques habituelles de recherche des aminoacides-oxydases consistent à mettre en évidence par le perchlorure de fer la formation d'acide a-cétonique à partir de phénylalanine ou de tryp-tophane (test de la phénylalanine-désaminase ou de la tryptophane-désaminase). La présente invention a pour objet la mise au point de divers milieux permettant des réactions rapides et intenses (3 à 14 h suivant le germe) qui, quelquefois, ne nécessitent pas l'emploi de réactifs révélateurs.

11 a été montré que de nombreux aminoacides pouvaient être transformés en acides a-cétoniques, mais que tous ces acides a-cétoniques ne réagissaient pas avec le perchlorure de fer («An im-proved ferrie chloride test for differentiating. Proteus - Providence Group from other enterobacteriacees», J. Singer et coll., 1954). D'autre part, les milieux utilisés associent en proportions définies divers aminoacides, ce qui s'est montré particulièrement intéressant pour l'obtention de réactions rapidement positives. Ainsi, l'association de L-tryptophane, de L-leucine et de L-arginine, ou l'association de L-tryptophane, de L-méthionine et de L-arginine se sont

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montrées particulièrement intéressantes et meilleures que le L-tryptophane ou la L-méthionine ou la L-leucine ou la L-arginine seuls.

La réaction de Paminoacide-oxydase peut être accélérée par l'addition d'une dose modérée de divers oxydants, tels les nitrates (nitrate de sodium ou de potassium), les persulfates (persulfate d'ammonium), ou la chloramine T. L'oxygène atmosphérique peut également activer nettement la réaction sans entraîner les effets inhibiteurs observés avec des doses trop fortes des oxydants cités ci-dessus. L'effet favorisant de l'oxygène atmosphérique peut encore être intensifié en introduisant de la Peroxydase (peroxyde de raifort) dans le milieu. Dans ce cas, la quantité d'acide a-cétonique produite par les bactéries possédant les aminoacides-oxydases à partir du mélange de L-tryptophane, de L-leucine et de L-arginine, est telle que le milieu prend une teinte brun chamois qui se distingue facilement du milieu resté incolore, lorsqu'il est ensemencé avec des bactéries ne possédant pas d'aminoacides-oxydases. Dans ce cas, il n'est donc plus nécessaire d'employer de révélateur de réaction. Les compositions préférentielles des milieux correspondant aux indications ci-dessus sont les suivantes:

A. Milieu nécessitant l'emploi d'une solution de perchlorure de fer (20 mmol) dans l'acide chlorhydrique 2,5M comme révélateur, dont la composition préférentielle est:

42 mmol de L-tryptophane 6 mmol de L-leucine 0,25 mmol de L-arginine

0,25 à 0,75 mmol de nitrate de sodium ou de potassium ou 0,25 à 0,50 mmol de persulfate d'ammonium ou 2,5 mmol de chloramine T

2,25 g d'extrait de levure eau distillée q.s.p. 1000 ml, ou tampon trihydroxyméthylaminométhane 50 mmol/acide chlorhydrique q.s.p. pH 7,2, q.s.p. 1000 ml,

ou tampon dichlorure de pipérazine 50 mmol/soude q.s.p. pH 6,5, q.s.p. 1000 ml.

B. Milieu rendant facultative la révélation par la solution de 20 mmol de perchlorure de fer dans l'acide chlorhydrique 2,5M,

dont la composition préférentielle est:

42 mmol de L-tryptophane 6 mmol de L-leucine 0,25 mmol de L-arginine 2,25 g d'extrait de levure 10 mg de Peroxydase de raifort eau distillée q.s.p. 1000 ml.

Certaines substances colorées peuvent se comporter comme un oxydant dans la réaction des aminoacides-oxydases. Leur contribution à la réaction les réduit et, de ce fait, les fait changer de teinte, ou les décolore. Ainsi, le dichlorophénolindophénol passe du bleu foncé (état oxydé) à une teinte rose pâle (état réduit), lorsque les acides aminés mis enjeu sont oxydés en acides a-cétoniques correspondants sous l'influence des aminoacides-oxydases bactériennes. Lorsque les bactéries ne possèdent pas l'enzyme, le milieu reste bleu foncé. Certains aminoacides se prêtent mieux que d'autres à cette réaction; c'est pourquoi il a été choisi un mélange L-tryptophane, L-méthionine et L-arginine. La peptone ou l'extrait cellulaire introduit comme substance de croissance dans le milieu ne doit pas donner lieu à des réactions de réduction non spécifiques du dichlorophénolindophénol; c'est pourquoi il est proposé une peptone papaïnique de soja. Enfin, l'oxygène atmosphérique et la Peroxydase améliorent la réaction et renforcent la différence entre résultats positifs (rose pâle) et résultats négatifs (bleu foncé).

Par conséquent, ce principe de réaction rend tout à fait inutile la révélation au perchlorure de fer, et les résultats sont lus directement. La composition préférentielle du milieu est la suivante:

C. 20 mmol de L-tryptophane 20 mmol de L-méthionine 0,25 mmol de L-arginine

600 (imol de dichlorophénolindophénol

5 g de peptone papaïnique de soja 10 mg de Peroxydase de raifort eau distillée q.s.p. 1000 ml.

5 4. Milieu pour la recherche de la production d'indole

Classiquement, la production d'indole est étudiée dans un milieu contenant du tryptophane. Après une nuit d'incubation, l'indole éventuellement produit réagit avec le réactif de Kowacks, en donnant une teinte rouge groseille. Un autre procédé consiste à in-îo troduire dans le milieu de culture soit une bactérie produisant une indol-3-hydroxylase, tel le Pseudomonas indoloxydans, ou toute autre bactérie capable de transformer par hydroxylation l'indole en indoxyle, soit le jus de culture concentré et purifié d'une bactérie productrice de cette hydroxylase dans son milieu. L'indole produite 15 par les espèces indologènes est transformée sous l'influence de cette hydrolase spécifique en indoxyle qui se condense spontanément en indigo coloré bleu foncé. L'emploi de cette préparation enzymatique est possible, car le Pseudomonas indoloxydans ne produit pas d'enzymes actives sur le tryptophane ou ses catabolites autres que l'indole. 20 Par conséquent, l'emploi d'un révélateur de réaction tel que le réactif de Kowacks devient inutile. Les compositions préférentielles des milieux correspondant à ces deux solutions sont les suivantes:

a. Milieu nécessitant l'emploi du réactif de Kowacks, constitué par:

25 30 mmol de L-tryptophane 2,5 g d'extrait de levure eau distillée q.s.p. 1000 ml, ou tampon trihydroxyméthylaminométhane 50 mmol/acide chlorhydrique q.s.p. pH 7,2, q.s.p. 1000 ml,

30 ou tampon dichlorure de pipérazine 50 mmol/soude q.s.p. pH 6,5, q.s.p. 1000 ml.

b. Milieu rendant inutile l'emploi d'un révélateur constitué par: 30 mmol de L-tryptophane

2,5 g d'extrait de levure 35 25 ml de jus de culture purifié et concentré d'une bactérie produisant dans son milieu l'indol-3-hydroxylase eau distillée q.s.p. 1000 ml.

5. Milieu pour la recherche de la ß-galactosidase et de la nitrate-40 réductase

Le milieu pour la recherche de la ß-galactosidase et de la nitrate-réductase est caractérisé par l'association de deux substrats: l'orthonitropltenyl-ß-D-galactopyrannoside et le nitrate de sodium en solution dans un tampon trihydroxyméthylaminométhane/acide 45 chlorhydrique, lequel est reconnu expérimentalement favorable à l'utilisation des sucres. Il est, par ailleurs, connu que, lorsque la bactérie possède la ß-galactosidase, l'orthonitrophinyl-ß-D-galactopyrannoside est dégradé en orthonitrophénol de couleur jaune. Après observation de cette première propriété bactérienne, le so nitrite éventuellement formé par réduction bactérienne du nitrate est recherché grâce à l'a-naphtylamine en solution dans l'acide acétique (deuxième réactif de Griess) que l'on ajoute au milieu après incubation et grâce à l'orthonitroph6nyl-ß-D-galactopyrannoside ou à l'or-thonitrophénol contenu dans le milieu selon l'une des réactions sui-55 vantes:

A) Nitrite + a-naphtylamine + orthonitrophényl-P-D-galactopyrannoside-► azoïque de couleur rouge

B) Nitrite + a-naphtylamine -I- orthonitrophénol-»azoïque de couleur rouge.

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Cette façon d'opérer évite l'emploi du premier réactif de Griess constitué par de l'acide sulfanilique en solution acétique.

Le nitrite formé en général par toutes les entérobactéries exerce un effet inhibiteur sur la fermentation du galactose libéré par la bac-65 térie à partir de l'orthonitrophényl-P-D-galactopyrannoside, ce qui évite l'accumulation d'acides fixes, renforçant ainsi le tampon et assurant de ce fait une meilleure lisibilité des réactions de recherche de la ß-galactosidase.

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Le milieu pour la recherche de la ß-galactosidase et de la nitrate-réductase présente la composition préférentielle suivante:

3 mmol d'orthonitrophényl-p-D-galactopyrannoside 50 mmol de nitrate de sodium 2,25 g d'extrait de levure

100 mmol de trihydroxyméthylaminométhane/acide chlorhydrique pH 7,2

eau distillée q.s.p. 1000 ml.

6. Milieu pour la recherche de l'uréase

L'emploi de ce milieu est fondé sur le principe bien connu suivant lequel la transformation bactérienne de l'urée en carbonate d'ammonium alcalinise le milieu et fait changer la couleur d'un indicateur de pH.

Habituellement, les milieux classiques contiennent un tampon permettant de maintenir le pH de départ dans une zone acide compatible avec la vie bactérienne; les milieux sont tels que les bactéries inactives sur l'urée ne changent pas la teinte de l'indicateur. Contrairement à ces milieux, le milieu selon l'invention ne contient pas de tampon et emploie comme révélateur la fermentation du glucose; le glucose qui est fermenté par toutes les entérobactéries est générateur de produits acides en quantités suffisamment faibles pour pouvoir être largement neutralisées par le carbonate d'ammonium produit par l'uréolyse, si bien que le milieu vire à l'alcalin, faisant changer la teinte de l'indicateur coloré. Lorsque la bactérie est inactive sur l'urée, le milieu reste acide.

De plus, la fermentation du glucose active très fortement l'uréolyse, lorsque la bactérie possède une uréase. Comme autre activa-teur, le milieu contient de l'extrait de levure. Le milieu contient une quantité d'urée comprise entre 26 et 44 mmol, de telle sorte que la réaction d'uréolyse soit optimale. Pour éviter l'alcalinisation non spécifique — résultat soit de la transformation alcaline de l'extrait de levure, soit de la réversion de pH par suite de processus oxydatifs ou de la transformation des acides formés par fermentation du glucose en acétylméthylcarbinol — il est proposé:

1) d'employer une quantité de glucose suffisamment importante pour que les produits alcalins formés à partir de l'extrait de levure soient neutralisés, mais suffisamment faibles pour que le virage à l'alcalin sous l'influence de l'uréolyse ne soit pas empêché ou retardé;

2) d'introduire dans le milieu un inhibiteur de l'énolase permettant d'éviter la perte d'acides par transformation des produits acides formés par fermentation du glucose en substances telles que l'acétylméthylcarbinol; l'inhibiteur employé est le fluorure de sodium à une concentration comprise entre 1 et 2 mmol/l, concentration à laquelle il est inactif sur l'uréolyse.

Ce milieu est nettement supérieur aux milieux classiques, car il a été montré que l'uréolyse est très fortement activée par la présence de glucose dans le milieu, permettant ainsi d'obtenir des résultats rapides en 3 à 12 h selon les bactéries étudiées.

Ce milieu pour la recherche de l'uréase présente la composition préférentielle suivante:

35 mmol d'urée 16 à 20 mmol de glucose 1 à 2 mmol de fluorure de sodium 2,5 g d'extrait de levure

1 ml de solution de pourpre de bromocrésol à 16 g/1 dans l'étha-nol ou 100 mg de bleu de bromothymol 16 mmol de chlorure de potassium eau distillée q.s.p. 1000 ml.

7. Milieu pour la recherche de la lysine-décarboxylase et de l'ornithine-décarboxylase

Les milieux pour la mise en évidence de la lysine-décarboxylase et de l'ornithine-décarboxylase sont fondés sur le principe bien connu suivant lequel la décarboxylation de la lysine ou de l'ornithine alcalinise le milieu de culture et fait virer un indicateur de pH. Lorsque la bactérie est inactive sur la lysine ou sur l'ornithine, le milieu devient acide sous l'influence de la fermentation du glucose qu'il contient. Pour éviter les alcalinisations non spécifiques rapides, résultat de la transformation des extraits cellulaires, des peptones et de la dégradation des catabolites acides du glucose, il a été proposé d'incuber sous une couche d'huile de vaseline («Simplified tests for some aminoacid decarboxylases and for the arginine dihydrolase system», V. Möller, «Acta Path.», XXXVI, 2,1954; «Identification rapide des sous-genres du groupe Enterobacter», C. Richard, «Ann. Biol. Clin.», 1970, 28, 186-189). Malheureusement, il a été montré également que l'anaérobiose réalisée par l'emploi de l'huile inhibait les décarboxylases peu actives de certaines bactéries (C. Richard, «Ann. Biol. Clin.», 1970, 28, 185-189) et que les alcalinisations non spécifiques ne sont pas évitées avec d'autres bactéries. Par contre, les milieux conformes à l'invention permettent d'éviter ce défaut tout en n'employant pas d'huile de vaseline. Ces milieux possèdent les particularités suivantes:

1) ils contiennent de la lysine ou de l'ornithine en une quantité respectivement comprise entre 36 et 48 mmol/l et 24 et 36 mmol/l, de telle sorte que:

a) les réactions de la lysine-décarboxylase ou de l'ornithine-décarboxylase soient maximales,

b) l'inhibition par excès de substrat constaté avec certaines bactéries soit évitée

2) l'obtention d'une réaction de la lysine-décarboxylase ou de l'ornithine-décarboxylase optimale permet d'augmenter la quantité de glucose dans les milieux, respectivement à 9 mmol/l et 8 mmol/l (au lieu de 5 mmol dans les milieux de Möller et Richard); ce faisant, les produits acides de la fermentation glucosée seront formés en plus grande quantité, permettant la neutralisation correcte des substances alcalines formées à partir des peptones ou des extraits cellulaires contenus dans les milieux;

3) ils contiennent un inhibiteur de l'énolase permettant d'éviter la transformation des produits acides formés par fermentation du glucose et, par conséquent, permettent d'éviter les réactions alcalines non spécifiques du milieu; l'inhibiteur employé est le fluorure de sodium à une concentration comprise entre 1 et 2 mmol/l à laquelle il est inactif sur la lysine-décarboxylase et l'ornithine-décarboxylase;

4) l'association d'un substrat (lysine ou Ornithine) en quantités optimales avec du glucose et de l'inhibiteur de l'énolase en quantités adaptées permet d'éviter l'emploi de l'huile de vaseline.

Le milieu pour la mise en évidence de la lysine-décarboxylase présente la composition préférentielle suivante:

40 mmol de lysine chlorhydrate 9 mmol de D-glucose 1 à 2 mmol de fluorure de sodium 2,5 g d'extrait de levure

1 ml de solution de pourpre de bromocrésol à 16 g/1 dans l'étha-nol ou 100 mg de bleu de bromothymol eau distillée q.s.p. 1000 ml.

Le milieu pour la mise en évidence de l'ornithine-décarboxylase présente de préférence la composition suivante:

30 mmol d'ornithine chlorhydrate 8 mmol de glucose 1,5 g d'extrait de levure 1 à 2 mmol de fluorure de sodium

8. Milieux au citrate et pour l'étude de l'utilisation du malonate

Les milieux pour la vérification de l'utilisation du citrate et du malonate sont caractérisés par un tampon constitué par un mélange en proportions convenables de citrate de sodium et d'acide citrique ou de malonate de sodium et d'acide malonique afin d'obtenir un pH du milieu voisin de 6, le tampon du milieu constituant également le substrat de la bactérie. Lorsque la bactérie utilise le citrate ou le malonate, la décarboxylation qui en résulte détruit progressivement la capacité tampon du substrat, et comme le pH initial du milieu est

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peu éloigné de la limite du pouvoir tampon du système citrate/acide citrique ou malonate/acide malonique, le pH du milieu passe rapidement à l'alcalin, ce qui se manifeste par le virage au bleu de l'indicateur coloré. Cette manière d'opérer évite l'emploi de substances chimiques supplémentaires ayant qualité de tampon et permet d'obtenir, à concentrations molaires de citrate ou de malonate identiques, des réponses beaucoup plus rapides, de l'ordre de 12 à 16 h.

La composition préférentielle du milieu pour la vérification de l'utilisation du citrate est la suivante:

22 mmol de citrate trisodique 3 mmol d'acide citrique 100 mg de bleu de bromothymol 0,6 g d'extrait de levure eau distillée q.s.p. 1000 ml.

Le milieu pour la vérification de l'utilisation du malonate présente de préférence la composition suivante:

22,5 mmol de malonate de sodium 2,5 mmol d'acide malonique 100 mg de bleu de bromothymol 0,6 g d'extrait de levure eau distillée q.s.p. 1000 ml.

9. Milieu pour la recherche de l'arginine-dihydrolase Ce milieu est de préférence composé par:

25 mmol d'arginine base

20 mg de rouge de phénol

2,25 g d'extrait de levure acide chlorhydrique q.s.p. pH 6,2

tampon phosphate 0,01M pH 6,2, q.s.p. 1000 ml

(phosphate disodique, phosphate monopotassique).

10. Milieu pour la mise en évidence de la gélatinase

La gélatinolyse de la gélatine d'une pellicule photographique est facilitée par la nature de la peptone du milieu de culture et par l'addition de sels miinéraux tels que le chlorure de calcium. La peptone donnant les résultats les plus rapides est la peptone pancréatique de gélatine.

Ce milieu pour la mise en évidence de la gélatinase présente la composition préférentielle suivante:

5 à 10 g de peptone pancréatique de gélatine 2,5 à 10 g d'extrait de levure 150 mmol de chlorure de sodium 50 mmol de chlorure de calcium eau distillée q.s.p. 1000 ml.

11. Milieu pour la mise en évidence de la production d'acide sulfhydrique

La production d'acide sulfhydrique se fait habituellement soit à partir de cystéine, soit à partir d'hyposulfite, et elle est mise en évidence par la réaction avec un métal lourd introduit dans le milieu qui forme avec lui du sulfure métallique insoluble à pH supérieur à 5,5 (cf. Brisou et coll.). Les milieux classiques emploient de l'hypo-sulfite en présence de sulfate de fer ferreux et d'ammonium associés à une grande quantité de peptone dont le choix semble avoir été guidé par la teneur en soufre. L'emploi d'un tampon n'était pas jugé utile. Mais, selon la nature de la peptone et selon la bactérie étudiée, on voit le milieu s'acidifier, ou s'alcaliniser, si bien que la formation du sulfure métallique insoluble peut être perturbée. Le milieu objet de l'invention est constitué par un tampon trihydroxyméthylaminométhane (pH 7 à 7,4) et par des substances accélérant fortement la réaction, telles que l'arginine, le chlorure de magnésium et un mélange de peptone et d'extraits cellulaires, tel qu'une peptone pancréatique de lactalbumine et de l'extrait de levure. L'association de ces divers facteurs favorisants (tampon, arginine, chlorure de magnésium, mélange de peptone et d'extraits cellulaires) permet de réduire la quantité totale de peptone et d'extraits cellulaires, et d'obtenir des réactions rapides et intenses, même avec des bactéries réputées paresseuses à produire l'acide sulfhydrique. La composition préférentielle du milieu pour la mise en évidence de la production d'acide sulfhydrique est la suivante:

15 à 30 g de peptone pancréatique de lactalbumine 1,2 partie,

extrait de levure 1 partie

18 mmol de L-arginine

2 mmol de chlorure de magnésium

2,5 mmol d'hyposulfite de sodium

1,5 mmol de sulfate de fer ferreux et d'ammonium tampon trihydroxyméthylaminométhane 0,15M pH 7,2, q.s.p.

1000 ml.

12. Milieu de base pour fermentation et utilisation aérobie des sucres par les Cocci Gram (+) en amas catalase (+)

ou catalase ( — )

Le milieu de base pour l'étude de la fermentation ou de l'utilisation aérobie des sucres sert à diluer au 1/10 les solutions aqueuses concentrées décrites ci-dessus. Le milieu conforme à l'invention contient de l'extrait de levure en grande quantité (20 g/1 environ) dans un tampon trihydroxyméthylaminométhane/acide chlorhydrique, qui s'est montré expérimentalement favorable à l'utilisation des sucres. Cette grande quantité d'extrait de levure permet d'obtenir les résultats des fermentations sucrées rapidement en 12 à 16 h en étuve à 35° C.

Ce milieu de base pour fermentations sucrées présente la composition préférentielle suivante:

20 g d'extrait de levure

1 ml de solution de pourpre de bromocrésol à 16 g/1 dans l'étha-nol ou 100 mg de bleu de bromothymol 50 mmol de trihydroxyméthylaminométhane/acide chlorhydrique q.s.p. pH 7,2 eau distillée q.s.p. 1000 ml.

13. Milieu pour la recherche de la phosphatase

Le milieu habituellement utilisé donnait des réactions paresseuses et nécessitait l'emploi d'un révélateur après incubation. Le milieu objet de la présente invention contient un substrat tel que le paranitrophénylphosphate, incolore, qui, sous l'action de la phosphatase, fournit du phosphate et du paranitrophénol de couleur jaune canari. Il n'est donc pas nécessaire d'employer de révélateur après incubation. Le pH optimal d'action de la phosphatase est situé entre 8 et 10 et, entre ces pH, le substrat se lyse spontanément, faisant apparaître une coloration jaune non spécifique. Pour éviter la lyse spontanée du substrat, le pH du milieu est maintenu au voisinage de la neutralité par un tampon trihydroxyméthylamino-méthane/acide chlorhydrique. Ce milieu contient, en outre, de la peptone papaïnique de protéine de graine de soja en quantité telle que la croissance des bactéries exigeantes telles que les staphylocoques est possible.

Ce milieu pour la recherche de la phosphatase présente la composition préférentielle suivante:

12 mmol de paranitrophénylphosphate 10 g de peptone papaïnique de protéine de graine de soja 50 mmol de trihydroxyméthylaminométhane/acide chlorhydrique pH 7,2 eau distillée q.s.p. 1000 ml.

14. Milieu pour la recherche de la nitrate-réductase qui est, de préférence, constitué par:

20 mmol de nitrate de sodium 5 g de peptone trypsique de caséine eau distillée q.s.p. 1000 ml.

15. Milieu pour la mise en évidence de la coagulase constitué par un mélange de plasmas oxalatés humains stérilisés par filtration.

16. Solution de Koser modifiée concentrée, constituée par une solution aqueuse de:

430 mmol/l de chlorure de sodium s

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4 mmol/l de sulfate de magnésium 18 mmol/l de chlorure de potassium 43 mmol/l de chlorure d'ammonium.

17. Bouillon galerie constitué par:

200 ml de solution de Koser modifiée concentrée

4 à 7 g d'extrait de levure eau distillée q.s.p. 1000 ml.

18. Milieu pour la recherche de la nitrate-réductase contenant de faibles concentrations de nitrates, constitué, de préférence, par:

0,01 (imol d'heptamolybdate d'ammonium

5 mmol de nitrate de sodium

0,5 g de peptone pancréatique de gélatine

50 mmol de glycérol eau distillée q.s.p. 1000 ml.

19. Milieu pour la recherche de la nitrate-réductase contenant de fortes concentrations de nitrates, dont la composition préférentielle est la suivante:

0,01 jimol d'heptamolybdate d'ammonium

500 mmol de nitrate de sodium

0,5 g de peptone pancréatique de gélatine

50 mmol de glycérol eau distillée q.s.p. 1000 ml.

La réduction des nitrates est recherchée par la présence de nitrite dans le milieu, à l'aide des deux réactifs de Griess ajoutés après incubation, à raison d'une goutte chacun aux deux milieux. L'emploi de deux milieux, l'un contenant une quantité très faible de nitrate pouvant être facilement réduit par les bactéries capables au-delà du stade nitrite, l'autre contenant une quantité très forte de nitrate dont la réduction totale au-delà du stade nitrite est impossible, permet de tirer des conslusions sur les possibilités métaboliques de la bactérie (réduction en nitrites, réduction au-delà du stade nitrite, incapable de réduire les nitrates).

5 20. Milieu pour l'étude de l'utilisation du glucose par voie oxydative ou fermentative, dont la composition préférentielle est la suivante:

50 mmol de D-glucose

10 à 25 mmol de trihydroxyméthylaminométhane/acide chlorhy-îo drique q.s.p. pH 7,2

eau distillée q.s.p. 1000 ml.

Les milieux pour l'utilisation du citrate, pour la mise en évidence de la gélatinase et de l'arginine-dihydrolase sont les mêmes que ceux décrits pour les entérobactéries.

15 Dans le cas de l'établissement du diagnostic du genre et de l'espèce d'entérobactérie sur une suspension bactérienne dans 2,5 ml d'eau salée à 9 g/1 de chlorure de sodium, les réactions de production d'acétoïne et d'utilisation du citrate ou du malonate sont des réactions de décarboxylation produisant du gaz carbonique. Lorsque le 20 milieu réactionnel est en contact avec un volume suffisant d'air, ce gaz carbonique peut s'échapper du milieu, contribuant ainsi rapidement à la perte d'acidité, donc au virage plus rapide de l'indicateur de pH. Lorsque les godets sont fermés par le papier adhésif, le volume d'air entre la surface du liquide et le papier adhésif est insuf-25 fisant, le gaz carbonique formé diffuse mal à travers le papier, et par conséquent, la pression partielle de gaz carbonique augmentant au-dessus du bouillon, une certaine quantité d'acidité est retenue dans le milieu, retardant ou empêchant le virage de l'indicateur de pH. C'est pour ces raisons que le papier adhésif des godets contenant ces 30 milieux est percé d'un trou d'un diamètre inférieur à 1 mm. Après 3 à 18 h d'incubation en étuve à 35°C, on procède à la lecture des résultats d'après le tableau ci-dessous:

Réponses positives Réponses négatives

1. Fermentation des sucres (glucose, mélibiose, rhamnose, ou tout autre sucre)

jaune bleu ou vert

2. Recherche de la ß-galactosidase jaune incolore

3. Réduction des nitrates en nitrites: ajouter au godet pour la recherche de la ß-galactosidase une goutte d'une solution d'a-naphtylamine (deuxième réactif de Griess)

rouge groseille incolore

4. Production d'acétoïne bleu-vert à bleu intense jaune

5. Utilisation du citrate ou du malonate bleu intense vert

6. Présence d'uréase, de lysine-décarboxylase ou d'ornithine-décarboxylase vert ou bleu jaune

7. Recherche des aminoacides-oxydases:

a) avec milieu nécessitant l'addition d'une goutte de perchlorure de fer b) avec milieu rendant facultative une révélation par une solution de perchlorure, sans addition de perchlorure c) avec milieu au dichlorophénolindophénol rouge-brun à violet - lie-de-vin brun chamois rose pâle incolore ou jaune paille incolore bleu foncé

8. Recherche de la production d'indole:

a) milieu nécessitant l'ajout de deux gouttes de réactif de Kowacks b) milieu à l'indol-3-hydroxylase anneau rouge précipité bleu foncé

anneau incolore ou légèrement verdâtre milieu inchangé

9. Production d'acide sulfhydrique précipité noir milieu inchangé

10. Recherche de l'arginine-dihydrolase rose à rouge milieu inchangé

11. Recherche de la gélatinase bandelette de pellicule photographique transparente et précipité noir bandelette inchangée

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Dans le cas du biotypage des Cocci Gram (+) en amas catalase (+) ou catalase (—) sur une suspension bactérienne de 1 ml de bouillon galerie, la lecture des résultats, après incubation pendant 16 à 20 h en étuve à 35°C, s'effectue comme indiqué dans le tableau ci-dessous:

Réactions positives

Réactions négatives

1. Fermentation du glucose ou du mannitol, ou utilisation aérobie du maltose, du lactose, de l'arabinose et du mannitol, ou de tout autre sucre jaune vert ou bleu

2. Production d'acétoïne: ajouter au milieu une goutte de potasse 7M et une goutte d'ci-naphthol 0,4M après 30 min à température ordinaire rouge groseille incolore

3. Recherche de la phosphatase jaune canari incolore

4. Recherche de la coagulase milieu trouble milieu limpide

5. Recherche de la réduction des nitrates: ajouter une goutte de chacun des réactifs de Griess rouge groseille virant au brun incolore

Dans le cas de l'identification des pseudomonadacées, la lecture des résultats s'effectue comme pour les entérobactéries, ou comme pour les Cocci Gram (+) dans le cas de la recherche de la réduction des nitrates.

Claims

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1 ml de solution de pourpre de bromocrésol à 16 g/1 dans l'étha-nol, ou 100 mg de bleu de bromothymol 50 mmol de trihydroxyméthylaminométhane/acide chlorhydrique q.s.p. pH 7,2 eau distillée q.s.p. 1000 ml.

41. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de la phosphatase contient comme substrat le paranitrophénylphosphate.

42. Milieu selon la revendication 41, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de la phosphatase contient un tampon maintenant le milieu au voisinage de la neutralité pour éviter l'hydrolyse spontanée du substrat.

43. Milieu selon les revendications 41 et 42, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de la phosphatase présente la composition suivante:

44. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de la nitrate-réductase est constitué par:

45. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de la nitrate-réductase contenant de faibles concentrations de nitrates est constitué par:

0,01 nmol d'heptamolybdate d'ammonium

1,5 mmol de sulfate de fer ferreux et d'ammonium tampon trihydroxyméthylaminométhane 0,15M pH 7,2 q.s.p. 1000 ml.

40. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu de base pour fermentations sucrées présente la composition suivante:

20 g d'extrait de levure

35. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour la vérification de l'utilisation du citrate est constitué par:

36. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour la vérification de l'utilisation du malonate présente la composition suivante:

37. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de l'arginine-dihydrolase est constitué par:

25 mmol d'arginine base 20 mg de rouge de phénol 2,25 g d'extrait de levure acide chlorhydrique q.s.p. pH 6,2

tampon phosphate 0,01 M pH 6,2 q.s.p. 1000 ml (phosphate diso-dique, phosphate monopotassique).

38. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de la gélatinase présente la composition suivante:

31. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de l'ornithine-décarboxylase contient une concentration d'ornithine comprise entre 24 et 36 mmol/l.

32. Milieu selon la revendication 31, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de l'ornithine-décarboxylase contient une quantité de glucose permettant de neutraliser l'alcalinité non spécifi5

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1 ml de solution de pourpre de bromocrésol à 16 g/1 dans l'étha-nol ou 100 mg de bleu de bromothymol 16 mmol de chlorure de potassium eau distillée q.s.p. 100 ml.

27. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de la lysine-décarboxylase contient une concentration de lysine comprise entre 36 et 48 mmol/l.

28. Milieu selon la revendication 27, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de la lysine-décarboxylase contient une quantité de glucose permettant de neutraliser l'alcalinité non spécifique produite à partir de peptones ou extraits cellulaires contenus dans les milieux.

29. Milieu selon l'une des revendications 27 ou 28, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de la lysine-décarboxylase contient comme inhibiteur de l'énolase du fluorure de sodium à une concentration de 1 à 2 mmol/l.

30. Milieu selon les revendications 27 à 29, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de la lysine-décarboxylase présente la composition suivante:

40 mmol de lysinechlorhydrate 9 mmol de D-glucose 1 à 2 mmol de fluorure de sodium 2,5 g d'extrait de levure

1 à 2 mmol de fluorure de sodium

1 mm de diamètre, et à incuber la microplaque ainsi ensemencée à 35e C pendant une durée de 3 à 18 h, et enfin à procéder à la lecture des résultats.

1. Procédé d'identification des bactéries, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en suspension dans de l'eau salée à 9 g/1 de chlorure de sodium, ou dans un bouillon galerie, une colonie ou fraction de colonie de bactéries à étudier, à répartir alors une goutte d'environ 50 ni de cette suspension dans 100 ni de bouillon d'identification préalablement répartis dans les godets de plaque pour microtitra-tion, à réaliser des conditions d'anaérobiose par l'ajout d'huile de vaseline ou d'aération par un papier adhésif percé d'un trou de

2 mmol de chlorure de magnésium 2,5 mmol d'hyposulfite de sodium

2,5 g d'extrait de levure

2,25 g d'extrait de levure eau distillée q.s.p. 1000 ml,

ou tampon trihydroxyméthylaminométhane 50 mmol/acide chlorhydrique q.s.p. pH 7,2, q.s.p. 1000 ml ou tampon dichlorure de pipérazine 50 mmol/soude q.s.p. pH 6,5, q.s.p. 1000 ml

17. Milieu selon la revendication 15, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche des aminoacides-oxydases contient une Peroxydase ayant un effet activateur, et dont la composition est:

18. Milieu selon la revendication 15, caractérisé en ce que le milieu pour la mise en évidence des aminoacides-oxydases comporte comme indicateur d'oxydoréduction du dichlorophénolindophénol, comme peptone ne donnant pas de réaction d'oxydoréduction non spécifique la peptone papaïnique de soja et, comme accélérateur de réaction, une Peroxydase, ce milieu étant constitué par:

20 mmol de L-tryptophane

20 mmol de L-méthionine

0,25 mmol de L-arginine

600 nmol de dichlorophénolindophénol

2,5 g d'extrait de levure 1 à 2 mmol de fluorure de sodium

2. Procédé d'identification selon la revendication 1, caractérisé en ce que, pour obtenir le diagnostic du genre et quelquefois d'espèce d'entérobactérie, les colonies bactériennes obtenues sur milieu d'isolement sont utilisées en relation avec des réactifs choisis parmi des milieux pour la recherche de la fermentation du glucose, du mélibiose, du rhamnose, milieu pour la production d'acétoïne, milieu pour la recherche des aminoacides-oxydases et milieu pour la mise en évidence de la production d'indole, milieu pour la recherche de la ß-galactosidase et de la nitrate-réductase, milieux pour la rechercher de l'uréase, de la lysine-décarboxylase, et de l'ornithine-décarboxylase, milieu au citrate, et milieu pour la mise en évidence de la production d'acide sulfhydrique.

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REVENDICATIONS

100 mmol de trihydroxyméthylaminométhane/acide chlorhydrique pH 7,2 eau distillée q.s.p. 1000 ml.

23. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de l'uréase associe comme substrats le glucose et l'urée.

24. Milieu selon la revendication 23, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de l'uréase contient entre 26 et 44 mmol/l d'urée et entre 16 et 20 mmol/l de glucose.

25. Milieu selon la revendication 24, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de l'uréase contient comme inhibiteur de l'énolase du fluorure de sodium en une quantité comprise entre 1 et 2 mmol.

26. Milieu selon la revendication 25, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de l'uréase est constitué par:

35 mmol d'urée

16 à 20 mmol de glucose

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10 g d'extrait de levure

50 mmol de trihydroxyméthylaminométhane/acide chlorhydrique q.s.p. pH 7,2

20 mmol de créatine, ou 10 mmol d'arginine, ou 20 mmol de creatine et 10 mmol d'arginine

20 à 100 mmol de glucose

200 mmol de pyruvate ou 100 mmol de lactate eau distillée q.s.p. 1000 ml.

15. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il consiste en un milieu pour la recherche des aminoacides-oxydases contenant comme oxydants du nitrate de sodium ou de potassium, du persulfate d'ammonium ou de la chloramine T, et un tampon trihydroxyméthylaminométhane pH 7,2, ou un tampon dichlorure de pipérazine/soude pH 6,5 ainsi qu'un mélange de L-tryptophane, L-leucine, L-arginine.

16. Milieu selon la revendication 15, caractérisé en ce que ce milieu présente la composition suivante:

42 mmol de L-tryptophane 6 mmol de L-leucine 0,25 mmol de L-arginine

3. Procédé d'identification selon la revendication 2, caractérisé par le fait qu'on complète le diagnostic par l'emploi du milieu pour la recherche de l'arginine-dihydrolase, du milieu pour l'étude de l'utilisation du malonate, et/ou d'autres milieux pour fermentations sucrées, ainsi que du milieu pour la mise en évidence de la gélatinase.

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que produite à partir de peptones ou extraits cellulaires contenus dans les milieux.

33. Milieu selon l'une des revendications 31 ou 32, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de l'ornithine-décarboxylase contient comme inhibiteur de l'énolase du fluorure de sodium en une concentration comprise entre 1 et 2 mmol/l.

34. Milieu selon les revendications 31 à 33, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de l'ornithine-décarboxylase est constitué par:

4. Procédé d'identification selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il met en œuvre, en vue du biotypage des Cocci Gram (+) en amas catalase (+) ou catalase (—), selon la classification de Baird Parker, une colonie de bactéries prélevée sur des milieux sélectifs ou sur gélose au sang ou gélose ordinaire, en relation avec des réactifs choisis parmi un milieu pour la fermentation du glucose et du mannitol, des milieux pour l'utilisation aérobie du lactose, du maltose, de l'arabinose et du mannitol, un milieu pour la recherche de l'acétoïne sans indicateur de pH, et des milieux pour la recherche de la phosphatase et pour la mise en évidence de la coagulase, ainsi qu'une solution de Koser concentrée modifiée, et un bouillon galerie.

5 mmol de nitrate de sodium

0,5 g de peptone pancréatique de gélatine

50 mmol de glycérol eau distillée q.s.p. 1000 ml.

46. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de la nitrate-réductase contenant de fortes concentrations de nitrates présente la composition suivante:

0,01 }imol d'heptamolybdate d'ammonium

500 mmol de nitrate de sodium

0,5 g de peptone pancréatique de gélatine

50 mmol de glycérol eau distillée q.s.p. 1000 ml.

47. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour l'étude de l'utilisation du glucose par voie oxydative est constitué par:

50 mmol de D-glucose

39. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour la vérification de la production d'acide sulfhydrique présente la composition suivante:

15 à 30 g de peptone pancréatique de lactalbumine: 1,2 partie; extrait de levure: 1 partie 18 mmol de L-arginine

5 g de peptone papaïnique de soja

10 mg de Peroxydase de raifort eau distillée q.s.p. 1000 ml.

19. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de la production d'indole emploie un réactif de Kowacks, et présente la composition suivante:

30 mmol de L-triptophane 2,5 g d'extrait de levure eau distillée q.s.p. 1000 ml ou tampon trihydroxyméthylaminométhane 50 mmol/acide chlorhydrique q.s.p. pH 7,2, q.s.p. 1000 ml ou tampon dichlorure de pipérazine 50 mmol/soude q.s.p. pH 6,5, q.s.p. 1000 ml.

20. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de la production d'indole contient une préparation concentrée et partiellement purifiée d'une indol-3-hydroxylase obtenue à partir d'un jus de culture d'une bactérie

<Pseudomonoas indoloxydans), ce milieu étant constitué par: 30 mmol de L-tryptophane 2,5 g d'extrait de levure

25 ml de jus de culture purifié et concentré d'une bactérie produisant dans son milieu l'indol-3-hydroxylase eau distillée q.s.p. 1000 ml.

21. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que, dans le milieu pour la recherche de la ß-galactosidase et de la nitrate-réductase permettant la recherche des nitrites par addition du deuxième réactif de Griess (alphanaphtylamine en solution acétique), l'agent copulant est constitué par le substrat de la ß-galactosidase ou par l'orthonitrophénol formé par la bactérie, tous deux contenus dans le milieu.

22. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de la ß-galactosidase et de la nitrate-réductase est constitué par :

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5. Procédé d'identification selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il met en œuvre, en vue de l'identification des pseudomono-adacées (bacilles Gram (—) oxydase (+) ou bacilles Gram (—) oxydase et nitrate (—) cultivant sur milieux sélectifs lactosés ou sur gélose ordinaire) les milieux suivants: milieu pour la recherche de l'utilisation du glucose par voie aérobie, milieu pour la recherche de l'utilisation du glucose par voie fermentative, milieu pour la recherche de la réduction du nitrate à faible et à forte concentration de nitrate, milieu pour la vérification de l'utilisation du citrate, milieu pour la mise en évidence de la gélatinase, et milieu pour la recherche de l'arginine dihydrolase.

6. Milieu de culture pour la mise en œuvre du procédé d'identification selon la revendication 1, caractérisé par la présence d'inhibiteur de l'énolase dans ceux destinés à l'étude des fermentations sucrées et dans ceux destinés à la mise en évidence de réactions négatives de l'uréase, de la LDC et de l'ODC par la fermentation du glucose, par l'association de glucose et de pyruvate ou de lactate dans celui pour la recherche de l'acétoïne, par l'association d'un oxydant ou de Peroxydase avec un mélange d'acides aminés dans celui destiné à la recherche de l'aminoacide-oxydase, par la présence d'indole-3-hydroxylase dans celui pour la recherche de l'indole, par l'association de l'orthonitrophényl-P-galactopyrannoside et du nitrate de sodium dans celui pour la recherche de la ß-galactosidase et de la nitrate-réductase, par le mélange acide citrique/citrate de sodium, ajusté à pH 5,9 par de l'acide citrique, contenu dans le milieu pour l'utilisation du citrate, par le mélange d'acide maloni-

que/malonate de sodium ajusté à pH 5,9 par de l'acide malonique, contenu dans le milieu pour l'utilisation du malonate, par le mélange tamponné à pH 7,2 par du trihydroxyméthylaminométhane, de peptone pancréatique, de lactalbumine d'extrait de levure, d'aginine, de chlorure de magnésium, d'hyposulfite de sodium et de sulfate de fer et d'ammonium dans celui destiné à la recherche de la production d'acide sulfhydrique, par le mélange de peptone pancréatique de gélatine et de chlorure de calcium dans celui destiné à la recherche de la gélatinase, par le mélange de glucose et d'urée dans celui pour la recherche de l'uréase, par la présence de lysine dans celui pour la recherche de la lysine-décarboxylase, par la présence d'orni-thine dans celui pour la recherche de l'ornithine-décarboxylase, par la présence d'arginine dans celui pour la recherche de l'arginine-di-hydrolase, par la présence de phosphate de p-nitrophényle dans celui pour la recherche de la phosphatase, par le mélange de nitrate et de peptone dans celui pour la recherche de la nitrate-réductase, et par le mélange de glucose, de trihydroxyméthylaminométhane et d'acide chlorhydrique dans celui pour l'étude de l'utilisation de glucose par voie oxydative.

7. Milieu selon la revendication 6, caractérisé par le fait qu'il contient, comme inhibiteur de l'énolase, du fluorure de sodium à une dose comprise entre 1 et 2 mmol/1, empêchant les réversions de pH suite au blocage du catabolisme des acides fixes formés à partir du sucre, mais n'empêchant pas la transformation du sucre étudié.

8. Milieu selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il se compose de:

9. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il consiste en des solutions aqueuses concentrées de sucres diluées avant leur emploi dans le milieu de base pour fermentations sucrées, à savoir:

solution 0,5M de glucose, de mannitol, de mésoïnositol, de sorbi-tol, de rhamnose, de saccharose, d'arabinose, d'adonitol, de fructose, de galactose, de maltose, de tréhalose, de xylose, ou de mélibiose,

solution 0,3M de lactose,

solution 0,25M de raflinose, ou d'amygdaline,

solution 0,15M de sailicine, ou de dulcitol.

10. Milieu selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il consiste en un milieu pour la recherche de l'acétoïne associant deux substrats, à savoir le glucose et l'un de ses produits de dégradation, le pyruvate ou le lactate.

11. Milieu selon la revendication 10, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de l'acétoïne contient du bleu de bromothymol comme révélateur de l'état d'acidité des milieux après incubation.

12. Milieu selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de l'acétoïne contient comme substances activatrices de la production d'acétoïne un extrait de levure, de la creatine ou de l'arginine.

13. Milieu selon les revendications 10 à 12, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de l'acétoïne est constitué par:

10 g d'extrait de levure

20 mmol de creatine, ou 10 mmol d'arginine, ou 20 mmol de créatine et 10 mmol d'arginine

20 à 100 mmol de glucose

200 mmol de pyruvate ou 100 mmol de lactate eau distillée q.s.p. 1000 ml.

14. Milieu selon les revendications 10 et 12, caractérisé en ce que le milieu pour la recherche de l'acétoïne a la composition suivante:

10 à 25 mmol de trihydroxyméthylaminométhane/acide chlorhydrique q.s.p. pH 7,2 eau distillée q.s.p. 1000 ml.