DE19739804C2

DE19739804C2 - Neuartiger, gegen Wasserstoffperoxid widerstandsfähiger Mikroorganismus

Info

Publication number: DE19739804C2
Application number: DE19739804A
Authority: DE
Inventors: In-Seop Kim; Seung-Uhn Kim; Nam-Hee You; Soon-Young Lee
Original assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Current assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Priority date: 1997-02-25
Filing date: 1997-09-10
Publication date: 1999-01-28
Anticipated expiration: 2017-09-11
Also published as: CN1109751C; US6015706A; KR19980068907A; GB2322381A8; TW422880B; KR100211674B1; CN1191897A; JPH10234360A; DE19739804A1; GB2322381B; GB2322381A; GB9715276D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuartigen, gegen Wasserstoffperoxid widerstandsfähigen Mikroorganismus, und insbesondere einen neuartigen Mikroorganismus, der eine lineare Überlebenskurve gegen die Konzentration von Wasserstoffperoxid aufweist, um Standards zur Sterilisation mit Wasserstoffperoxid zu ermöglichen.

Reinstindustrieen wie die Halbleiter herstellende Industrie benötigen Wasser von höchster Reinheit, z. B. ultrareines Wasser oder deionisiertes Wasser. Ultrareines Wasser wird üblicherweise durch physikalische Filtration mit Filtern, die geeignete Porengrößen aufweisen, gewonnen. Um deionisiertes Wasser zu erhalten, werden Ionen, die im Wasser enthalten sind, durch ein spezielles elektrochemisches Verfahren oder unter Verwendung von Ionenaustauschharzen abgetrennt oder adsorbiert. Es ist für den Fachmann ersichtlich, daß die Herstellung von ultrareinem und deionisiertem Wasser durch kommerziell erhältliche und dafür geeignete Anlagen bewerkstelligt werden kann.

Im Gegensatz zu Partikeln oder Ionen können Mikroorganismen, die im Wasser enthalten sind, zwar durch Sterilisation zu einem gewissen Ausmaß entfernt, jedoch nicht vollständig zerstört werden. Selbst unter keimfreien Bedingungen kann jederzeit eine Rekontamination durch die Atmosphäre oder andere Einflüsse verursacht werden. Einmal mit Mikroorganismen rekontaminiert, hat die einfache Verringerung der Anzahl der Mikroorganismen keinen Wert, da sich die Mikroorganismen unter Verwendung aller Arten von Nährstoffen, die im Wasser enthalten sind, vermehren.

Es ist ein allmählicher Vorgang von der Bildung von Biofilmen, im Anschluß an die Vermehrung der Mikroorganismen bis zur Verrottung des Organismus, die ein ernsthafteres Problem als die Vermehrung der Mikroorganismen selbst darstellt. Ein Biofilm ist eine Schicht im gelartigen Zustand, die Mikroorganismen enthält, die auf der Grenzfläche zwischen Flüssigkeit und Feststoff in einer wäßrigen Umgebung wachsen, nämlich der Oberfläche des Substrats und des Aggregats der EPS (extrazelluläre Polymersubstanzen), die durch die Organismen hergestellt werden. Der Biofilm besteht zum größten Teil aus Wasser (70 bis 95% des Naßgewichtes) und einer organischen Substanz (70 bis 95% des Trockengewichtes), einschließlich der Mikroorganismen. Ein großer Teil des Biofilms ist üblicherweise aus Polysacchariden aufgebaut. Ein anderer Name des Biofilms ist Glycocalyx.

Der Biofilm wird entweder gleichförmig auf der gesamten Oberfläche des Substrats oder teilweise auf der Oberfläche als sehr dünne unregelmäßige Struktur von maximal einigen hundert Mikrometern gebildet. Da der Biofilm die Diffusion von gelöstem Sauerstoff verhindert, werden aerobe Mikroorganismen, die in den Biofilmen mit einer Dicke von lediglich 50 bis 150 µm enthalten sind, anaerob.

Der Biofilm zeigt eine strukturelle Heterogenität, da er verschiedene Arten von Mikroorganismen aufweist und die Eigenschaften der Mikroorganismen unter den jeweiligen Gegebenheiten in bezug auf Raum und Zeit anpaßt. Die Mikroorganismen in einem Biofilm bilden ein Mikrokonsortium, das die gleiche Aufgabe besitzt, und bewirken somit eine funktionelle Homogenität.

In ökologischer Hinsicht wird der Biofilm als ein biologisches Mittel zur Anpassung der Mikroorganismen an eine extrem unvorteilhafte Umgebung angesehen. Ein Biofilm enthält eine Vielzahl von Mikroorganismen mit unterschiedlichen Funktionen, beispielsweise zur Ansammlung einer geringen Menge von Nährstoffen, die in einer wäßrigen nährstoffarmen Phase gelöst sind, zur Induktion einer Widerstandsfähigkeit gegen kurzzeitige Änderungen von Umweltfaktoren, wie pH-Wert, Salz, biozide Reagenzien oder Dehydration, oder zur Bereitstellung eines Pools zum genetischen Austausch zwischen den im Biofilm lebenden Mikroorganismen. Es hat sich herausgestellt, daß der Biofilm eine Ansammlung von Mikroorganismen bildet, die eine neue ökologische Nische wie die Zersetzung von nicht zersetzbarem Material zeigen.

In einer Fertigungsstraße zur Herstellung von Halbleitern hat das Wachstum von Mikroorganismen im ultrareinen oder deionisierten Wasser aufgrund der kurzen Verweilzeit des Wassers, das durch die Fertigungsstraße fließt, keinen Einfluß auf die Qualitätskontrolle. Die wichtigen Faktoren für die Qualitätskontrolle sind Biofilme, die auf der Oberfläche der Anlagen zur Herstellung des ultrareinen Wassers, des Leitungssystems des ultrareinen Wassers, der Produktionsanlagen oder den Halbleitermaterialien im Herstellungsprozeß wachsen.

Der Biofilm kann in ultrareinem Wasser mit 18 MΩ.cm entstehen. Es ist anzumerken, daß der Biofilm eine große Anzahl von Mikroorganismen mit 10⁷ bis 10¹¹ Zellen/ml der Biofilmmasse enthält, obwohl mit 1 bis 10 CFU/ml nur wenige Mikroorganismen in der wäßrigen Phase leben.

Üblicherweise wird ein biozides Mittel verwendet, um das Problem der Mikroorganismen zu lösen. Eine einfache Sterilisation ist aufgrund des Biofilms, wie oben beschrieben, keine ausreichende Lösung. Physiologisch inaktive Mikroorganismen werden leicht auf der Oberfläche eines Gegenstandes adsorbiert, wobei ein neuer Biofilm gebildet wird.

Der inaktive Mikroorganismus dient seinerseits als Oberfläche zur Absorption von neu eingeführten Mikroorganismen. Die Mikroorganismen auf der Oberfläche eines Biofilms sind im Vergleich mit einzelnen in Lösung befindlichen Mikroorganismen schwierig zu sterilisieren, da sie eine Matrix ausbilden.

Unabhängig von der Anzahl von Mikroorganismen, die sich im Wasser befinden, erfährt der Biofilm Umwandlungen. Die Faktoren, die die Mikroorganismen und die Größe des Biofilms beeinflussen, sind Art und Menge der Nährstoffe, die Scherkräfte des Wassers und dergleichen. Es sollte bemerkt werden, daß die Entfernung der Mikroorganismen, die den Biofilm bilden, schwierig, aber genauso wichtig wie die Sterilisation der Mikroorganismen ist.

Die Ablagerung von Mikroorganismen wird in einem zweistufigen Verfahren entfernt: chemische Verfahren unter Verwendung oxidierender Agenzien, Biodispergenzien, Tensiden und Enzymen, um die Wechselwirkung zwischen der Oberfläche eines Gegenstandes und der Biofilmmatrix herabzusetzen, chemische Verfahren, die den zu behandelnden Gegenstand nicht in Mitleidenschaft ziehen; und anschließend physikalische Verfahren wie Scherkräfte, mechanische Verfahren und Anwendungen von Ultraschallenergie, um die Oberfläche des Gegenstandes von den Ablagerungen der Mikroorganismen, einschließlich des Biofilms zu entfernen.

Das chemische biozide Mittel muß die Mikroorganismen vor ihrer schnellen Vermehrung wirksam entfernen. Das Mittel selbst kann eine Kontamination darstellen, wenn es nicht nach der Sterilisation entfernt wird. Die Anlagen oder Leitungen werden mit ultrareinem Wasser gereinigt, das mit dem chemischen Mittel behandelt worden ist, wobei die Konzentration des verbleibenden chemischen Mittel vorzugsweise direkt online gemessen werden.

Das chemische Mittel muß einfach und sicher in der Handhabung sein, und darf ferner die Komponenten der zu sterilisierenden Anlage weder physikalisch noch chemisch beschädigen. Das bevorzugte chemische biozide Mittel ist Wasserstoffperoxid.

Die Versorgungsleitungen für ultrareines Wasser in den Fertigungsbetrieben von Halbleiter herstellenden Unternehmen werden üblicherweise mit Wasserstoffperoxid sterilisiert. Da Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff zersetzt wird, verbleibt es nach der Sterilisation weder in den Leitungen noch verursacht es deren Korrosion. Die Sterilisation würde weitaus effektiver sein, wenn Wasserstoffperoxid hoher Konzentration bei hohen Temperaturen angewendet würde.

Die Sterilisationstemperatur liegt üblicherweise bei 30°C, da bei höheren Temperaturen die Materialien der Leitungen beschädigt werden und organisches oder anorganisches Material aus den Drainagerohren ausgetragen wird.

Die Verwendung von hoch konzentriertem Wasserstoffperoxid ist nicht nur teuer, sondern erfordert auch einen hohen Zeitaufwand für seine Entfernung nach der Sterilisation. Wasserstoffperoxid wird im allgemeinen bei einer niedrigen Konzentration von 1% eingesetzt, um eine Gasbildung durch die Reaktion von Wasserstoffperoxid mit organischem Material zu verhindern. Jedoch gibt es für die Sterilisation unter Verwendung von Wasserstoffperoxid keine Standards für die einzusetzende Konzentration, die erforderliche Zeit oder die Anwendungsdauer.

Es müssen einige "trial and error" Versuche durchgeführt werden, um optische Standards zur Sterilisation mit Wasserstoffperoxid zu etablieren. Dies ist sehr ineffizient, da eine veränderte Produktionsanlage auch ein verändertes Sterilisationsverfahren erfordert. Bis zur Etablierung der Sterilisationsmethoden wird der Betrieb der Halbleiterproduktionsanlage mehrfach unterbrochen. Bei Variation der Konzentration oder Menge an Wasserstoffperoxid sowie der Zeitdauer des Prozesses werden Proben bei den jeweils geänderten Bedingungen den Leitungen entnommen, um die Anzahl der überlebenden Mikroorganismen zu untersuchen und den Einfluß der Sterilisation gemäß des jeweiligen Zustandes zu überprüfen. Es stellt sich nun die Aufgabe, diesen wie oben beschrieben unpraktischen und wiederholten Prozeß durch einen neuen Indikatororganismus zur Entwicklung eines Standards für die Sterilisation zu ersetzen.

Eine Sterilisation unter Verwendung von Formaldehyd bei niedrigen Temperaturen ist anwendbar bei Materialien wie medizinischen Gerätschaften und Teilen von Halbleitereinheiten, die durch Hitzebehandlung nicht vollkommen sterilisiert werden. Bis zu diesem Zeitpunkt sind noch keine Standards oder physikalische und/oder chemische Methoden gefunden worden, um den Wirkungsgrad der Sterilisation abzuschätzen. Ein Indikator-Mikro organismus zur Etablierung von Standards für Sterilisationsbedingungen ist dringendst erforderlich.

Ein Mikroorganismus, der als Indikator eingesetzt wird, sollte einige Bedingungen zufriedenstellend erfüllen: (1) der Mikroorganismus muß ein aerober Mikroorganismus sein, der leicht zu identifizieren und zu analysieren und widerstandsfähiger gegen Wasserstoffperoxid oder Formaldehyd als andere kontaminierende Mikroorganismen ist; (2) der Indikator muß eine reproduzierbare vorzugsweise lineare Überlebenskurve gegenüber Wasserstoffperoxid oder Formaldehyd zeigen; (3) der Indikator muß ein Mikroorganismus sein, der einfach auf zubewahren und zu vermehren ist, und (4) der Indikator darf seine biologischen Eigenschaften während seiner Aufbewahrung nicht verändern.

Nachdem in den 70er Jahren dieses Jahrhunderts große Anstrengungen unternommen worden sind, einen geeigneten Mikroorganismus, der die oben genannten Eigenschaften erfüllt, zu finden, wurden neue Organismen wie beispielsweise Bacillus stearothermophilus NCIMB 8224 durch Wright 1996 eingeführt. Es ist jedoch notwendig, andere neuartige Mikroorganismen zu entwickeln, die eine stärker lineare Überlebenskurve gegenüber Wasserstoffperoxid zeigen.

Demzufolge ist die vorliegende Erfindung auf einen neuartigen Mikroorganismus gerichtet, der widerstandsfähig gegenüber Wasserstoffperoxid ist, und der im wesentlichen eines oder mehrere der Probleme, die sich durch die im Stand der Technik bekannten Einschränkungen und Nachteile ergeben, überwindet.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen neuartigen Mikroorganismus bereit zustellen, der widerstandsfähig gegen Wasserstoffperoxid ist.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung dargelegt und werden teilweise durch die Beschreibung ersichtlich oder ergeben sich durch die Anwendung der Erfindung. Die Ziele und anderen Vorteile der Erfindung, die verwirklicht sind, werden durch den Aufbau, insbesondere in der Beschreibung und den dazugehörigen Ansprüchen sowie in den beigefügten Abbildungen herausgestellt.

Zu diesem Zweck wird erfindungsgemäß und in Übereinstimmung mit der Aufgabe der vorliegenden Erfindung, wie in den Ausführungsformen gezeigt und detailliert beschrieben, ein neuartiger Mikroorganismus Micrococcus luteus HN-2-11 bereitgestellt, der einen Mechanismus zur Widerstandsfähigkeit gegenüber Wasserstoffperoxid besitzt und eine lineare halblogarithmische Überlebenskurve gegenüber der Sterilisationstemperatur und der Konzentration von Wasserstoffperoxid zeigt. Aus diesem Grund stellt der Mikroorganismus einen nützlichen Indikator-Mikroorganismus dar, um die Standards für die Sterilisation in Anlagen, wie die Leitungen für ultrareines Wasser in Halbleiter herstellenden Betrieben, die frei von Mikroorganismen sein müssen, zu etablieren. Es sollte selbstverständlich sein, daß sowohl die vorangehende allgemeine Beschreibung als auch die folgende detaillierte Beschreibung beispielhaft und erklärend sind, und zum Zweck der näheren Erklärung der Erfindung wie beansprucht dienen.

Die Zeichnungen, die zum näheren Verständnis der Erfindung beigefügt sind und einen Teil der Beschreibung darstellen, veranschaulichen Ausführungsformen dieser Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung zur Erklärung der Prinzipien der Erfindung.

Fig. 1 zeigt eine Tabelle für die Identifizierung von HN2-11, der durch ein biologisches Identifikationssystem erhalten wurde;

Fig. 2 zeigt einen Graph, der durch die Auftragung der Überlebensrate von Micrococcus luteus HN2-11 gegen verschiedene Konzentrationen von Wasserstoffperoxid (0,5 und 1%) bei verschiedenen Temperaturen (30°C, 40°C, 50°C) erhalten wurde;

Fig. 3 zeigt einen Graph, der durch die Auftragung der Überlebensrate von Micrococcus luteus HN2-11 gegen verschiedene Konzentrationen von Wasserstoffperoxid (0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75% und 1%) bei 40°C erhalten wurde; und

Fig. 4 zeigt einen Graph, der durch die Auftragung der Überlebensrate von Micrococcus luteus HN2-11 gegen verschiedene Konzentrationen von Wasserstoffperoxid (0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75% und 1%) bei 50°C erhalten wurde.

Im folgenden wird detailliert auf die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eingegangen, deren Beispiele in den beiliegenden Abbildungen illustriert werden.

Ein neuartiger Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung ist Micrococcus luteus HN2-11, der beim Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology am 13. Januar 1997 unter der Hinterlegungsnummer KCTC 8770P, am 8. August 1997 unter der Nummer KCTC 0369BP gemäß dem Budapester Vertrag registriert, hinterlegt worden ist, der gegen Wasserstoffperoxid widerstandsfähig ist und eine lineare Überlebenskurve gegenüber der Konzentration von Wasserstoffperoxid zeigt.

Der Mikroorganismus wurde durch ein Screening-Verfahren zur Trennung eines gegen Wasserstoffperoxid widerstandsfähigen Mikroorganismus in einer ultrareinen Anlage, die in der Halbleiterfabrik der Anmelderin der vorliegenden Erfindung angebracht ist, erhalten. Nach seiner Trennung und Unterscheidung wurde Micrococcus luteus HN-2-11 einer dem KAIST (Korea Advanced Institute of Science and Technology) angegliederten Genbank zum Zweck der Identifikation und Analyse des Mikroorganismus übergeben. Die vorliegende Erfindung wurde durch die Untersuchung des Mikroorganismuses auf die Widerstandsfähigkeit gegenüber Wasserstoffperoxid, die Überlebensrate und den Mechanismus der Widerstandsfähigkeit vervollständigt.

Der neuartige Mikroorganismus wurde aus Mikroorganismen selektiert, die unter den durch die Verwendung von Wasserstoffperoxid erhaltenen keimfreien Bedingungen überlebten, wodurch gezeigt wurde, daß er Widerstandsfähigkeit gegenüber Wasserstoffperoxid aufweist und eine Überlebensrate zeigt, die proportional der Konzentration von Wasserstoffperoxid abnimmt. Der neuartige Mikroorganismus ist in der Praxis anwendbar für die Etablierung von Standards für den Sterilisationsprozeß mit Wasserstoffperoxid.

AUSFÜHRUNGSFORM 1 SELEKTION DES MIKROORGANISMUS

Der gegen Wasserstoffperoxid widerstandsfähige Mikroorganismus wurde aus Mikroorganismen selektiert, die im ultrafiltrierten ionisierten Wasser und im deionisierten Wasser eines Bades, das an einer ultrareinen Anlage eines Halbleiter produzierenden Betriebes der Anmelderin der vorliegenden Erfindung angebracht war, lebten.

Ein sterilisiertes Nährmedium (NB) wurde im Verhältnis 1 : 100 und 1 : 10.000 dem deionisierten Wasser zugefügt, das der obigen ultrareinen Anlage entnommen worden war. Das Nährmedium wurde im Wasser für drei Tage bei 30°C kultiviert. Nach der Zugabe von Wasserstoffperoxid zu einer Konzentration von 1% und weiterer Inkubation bei 30°C für eine Stunde wurde auf einem NB/100 Agarmedium für drei Tage bei 30°C kultiviert. Die Kolonien, die auf dem NB/100 Agarmedium gewachsen waren, wurden jeweils noch drei weitere Male auf NB/100 und NB/10 Agarmedium inkubiert, um einzelne Kolonien auszuwählen. Anschließend wurden die ersten 25 ausgewählten Mikroorganismen auf NB/10 und NB/100 Agarmedium für 18 bis 30 Stunden inkubiert. Dabei wurde überprüft, daß die kultivierten Mikroorganismen eine Konzentration von 10⁸ Zellen/ml aufwiesen und sie wurden mit 1%igem Wasserstoffperoxid bei 30°C behandelt. Anschließend wurde eine quantitative Auswertung der Überlebensrate des Mikroorganismus in bezug auf die Behandlungszeit mit Wasserstoffperoxid durchgeführt. Die kinetischen Parameter, die analysiert wurden, waren die Inaktivierungsrate k (Einheit: h^-1) und der D-Wert (Einheit: h).

Um die Widerstandfähigkeit der Mikroorganismen gegenüber Wasserstoffperoxid zu untersuchen, wurden die Mikroorganismen in einem Schüttler inkubiert und mit 0,1 N Phosphatpuffer-Lösung (pH 7) auf eine Konzentration von 10⁸ CFU/ml verdünnt. Die verdünnte Lösung der Mikroorganismen mit einem Volumen von 30 ml wurde in ein 50 ml Röhrchen überführt und mit Wasserstoffperoxid bis zur jeweils in Volumenprozent angegebenen Konzentration versetzt. Nachdem das Röhrchen in ein auf 30°C temperiertes Wasserbad überführt worden war, wurde der Lösung in Zeitintervallen Proben entnommen, um die Anzahl der überlebenden Mikroorganismen zu bestimmen. Um die Anzahl der Kolonien zu bestimmen, wurde die Lösung mit einer physiologischen Salzlösung verdünnt und auf dem Nähragarmedium für drei Tage inkubiert. Alle weiteren Tests auf die Widerstandfähigkeit wurden nach der gleichen Methode wie hier beschrieben ausgeführt. Die Inaktivierungsrate k zeigt den Überlebensgrad der Mikroorganismen pro Stunde an und ist durch die folgenden Gleichungen 1 und 2 definiert.

Gleichung 1

N₂

/N₁

= e^-kt

,

wobei N₁ und N₂ die Anzahl der zum Zeitpunkt t₁ bzw. Zeitpunkt t₂ überlebenden Mikroorganismen darstellen.

Gleichung 2

k = -ln(N₂

/N₁

)/(t₂

-t₁

)

Der D-Wert (Einheit: h) ist eine zur Verringerung der Zahl an überlebenden Mikroorganismen benötigte Zeit und ist durch die folgende Gleichung 3 definiert. Er kann als Parameter benutzt werden, der die Eigenschaften des Indikatororganimusses anzeigt.

Gleichung 3

D = -ln(N₂

/N₁

)/k, N₂

/N₁

= 1/10,

wobei N₁ und N₂ die Anzahl der zum Zeitpunkt t₁ bzw. Zeitpunkt t₂ überlebenden Mikroorganismen darstellt.

Sechs Mikroorganismen, die eine starke Widerstandsfähigkeit gegenüber Wasserstoffperoxid aufwiesen, wurden aus den ersten 25 Mikroorganismen ausgewählt. Ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber Wasserstoffperoxid ist in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Eigenschaften der sechs gegenüber Wasserstoffperoxid widerstandsfähigen Mikroorganismen, die den im ultrareinem Wasser überlebenden Mikroorganismen entnommen wurden

Von den sechs Mikroorganismen, wurde HN2-11, der die stärkste Widerstandsfähigkeit gegenüber Wasserstoffperoxid aufwies, als Indikatormikroorgamismus für die Sterilisation mit Wasserstoffperoxid bei niedriger Temperatur ausgewählt. HN2-11 wurde eine, dem KAIST (Korea Advanced Institute of Science and Technology) angegliederten Genbank als Stamm mit der Hinterlegungsnummer KCTC 8770P anvertraut.

Ausführungsform 2 Untersuchung und Analyse der Eigenschaften des Mikroorganismus

HN2-11, der die stärkste Widerstandsfähigkeit gegenüber Wasserstoffperoxid aufwies, vermehrte sich im großen Maße im NB/100 Agarmedium und zeigte eine maximale proportionale Wachstumsrate von 1,244B h^-1 und eine Verdopplungszeit der Biomasse von 33,4 Minuten. Der Mikroorganismus zeigte zudem eine lineare halblogarithmische Überlebenskurve, die bei Behandlung mit Wasserstoffperoxid reproduzierbar ist. Diese Eigenschaften von HN2-11 zeigen, daß er ein geeigneter Indikatormikroorganismus für die Sterilisation mit Wasserstoffperoxid bei niedrigen Temperaturen darstellt.

Nach der Identifizierung des Mikroorganismus unter Verwendung eines biologischen Nachweisverfahrens wurden Artrobacter oder Micrococcus in gleichen Ausmaß vermutet. In Anbetracht seiner morphologischen und ökologischen Merkmale, wie in Abb. 1 gezeigt, wurde der Mikroorganismus als Micrococcus luteus identifiziert und als Micrococcus luteus HN2-11 benannt.

In einer Mikrophotographie der Oberfläche von Micrococcus luteus HN2-11, der auf dem NB/100 Agarmedium für 18 Stunden kultiviert worden war, war Micrococcus luteus HN2-11 bedeckt mit Polymeren, die die organischen Körper, die Ausstülpungen mit einer Länge von 0,4 µm besaßen, verbanden.

Ausführungsform 3 Analyse der Widerstandsfähigkeit von Micrococcus luteus HN2-11 gegenüber Wasserstoffperoxid durch Wachstumsstufen

Micrococcus luteus HN2-11 wurde mit Wasserstoffperoxid bei verschiedenen Temperaturen (30°C, 40°C und 50°C) basierend auf der Sterilisation unter Verwendung von Wasserstoffperoxid behandelt, dabei wurde die Konzentration von Wasserstoffperoxid von 1,5% auf 1% verändert. Die Überlebensrate von Micrococcus luteus HN-2-11 ist in Fig. 2 gezeigt.

Bei Behandlung mit 1%igem Wasserstoffperoxid bei 30°C zeigt Micrococcus luteus HN2-11 eine Inaktivierungsrate von 0,9936. 38% der ursprünglich vorhandenen Mikroorganismen überleben nach einer Stunde und 22% überleben nach zwei Stunden. Als Ergebnis zeigt es sich, daß die jetzige Methode der einstündigen Sterilisation mit 1%igem Wasserstoffperoxid bei 30°C nicht für die Mikroorganismen, die in den ultrareinen Leitungen einer Anlage eines Halbleiter herstellenden Betriebes leben, angewandt werden kann. Dieselben Ergebnisse wurden für die Leitung für deionisiertes Wasser, die mit Wasserstoffperoxid behandelt wurde, erhalten.

Wurde Micrococcus luteus HN2-11 mit Wasserstoffperoxid bei 40°C und 50°C behandelt, erhöhte sich die Inaktivierungskonstante entsprechend der Zunahme der Temperatur.

Fig. 3 zeigt die Überlebenskurve von Micrococcus luteus HN2-11 bei 40°C, aufgetragen bei verschiedenen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid (0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75% und 1%). Micrococcus luteus HN-2-11 zeigte bei allen Wasserstoff peroxid-Konzentrationen eine lineare halblogarithmische Überlebenskurve. Die Inaktivierungsrate betrug in Abhängigkeit von der Konzentration von Wasserstoffperoxid 0,916 (0,1%), 1,005 (0,25%), 1,5847 (0,5%), 2,443 (0,75%) und 3,808 (1%). Es zeigte sich, daß eine Sterilisation mit 0,25% Wasserstoffperoxid bei 40°C effektiver war als eine Sterilisation mit 1,0% Wasserstoffperoxid bei 30°C. Bei der Sterilisation mit 1%igem Wasserstoffperoxid bei 40°C betrug die Inaktivierungsrate 3,808 und der D-Wert betrug 0,6 Stunden (36 Minuten). Dies bedeutet, daß ungefähr 97% der Mikroorganismen durch einstündige Sterilisation zerstört wurden. Theoretisch werden 99,999% der Mikroorganismen nach einer Sterilisation für eine Stunde und 49 Minuten zerstört und 99,99951% nach zweistündiger Sterilisation.

Tabelle 2 zeigt die vom Wachstumszyklus abhängige Inaktivierungsraten und D-Werte, wenn Micrococcus luteus HN-2-11 bei 40°C mit 1%igem Wasserstoffperoxid sterilisiert wird.

Tabelle 2

Vom Wachstumszyklus abhängige Inaktivierungsraten und D-Werte bei Sterilisation von Micrococcus luteus HN-2-11 mit 1%igem Wasserstoffperoxid bei 40°C

Fig. 4 zeigt die Überlebensrate von Micrococcus luteus HN2-11 bei 50°C, aufgetragen bei verschiedenen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid (0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75% und 1%). Bei allen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid zeigte Micrococcus luteus HN2-11 eine lineare halblogarithmische Überlebenskurve. Die Inaktivierungsraten in Abhängigkeit von der Konzentration von Wasserstoffperoxid betrugen 18.7478 (0.1%), 28.415 (0.25%), 53.916 (0.5%), 86.076 (0.75%) und 221.380 (1%). Es zeigte sich, daß eine Sterilisation mit 0,1%igem Wasserstoffperoxid bei 50°C ein 19mal höhere Effektivität bei der Zerstörung des Organismus ergab als die Sterilisation mit 1%igem Wasserstoffperoxid bei 30°C. Bei Sterilisation mit 1%igem Wasserstoffperoxid bei 50°C betrug die Inaktivierungsrate 18,7478 und der D-Wert betrug 0,123 h (7,4 Minuten). Dies bedeutete daß ungefähr 99,997% der Mikroorganismen durch Sterilisation für 30 Minuten zerstört wurden. Theoretisch werden 99,999% der Mikroorganismen nach einer Sterilisation für 22,1 Minuten und 99,9999999928% nach einstündiger Sterilisation zerstört.

Ausführungsform 4 Mechanismus der Widerstandsfähigkeit gegen Wasserstoffperoxid von Micrococcus luteus HN2-11 in Abhängigkeit von der Wachstumsphase

Enzyme, die an dem Mechanismus der Widerstandsfähigkeit gegenüber Wasserstoffperoxid von Micrococcus luteus HN2-11 beteiligt sind, schließen Katalase, Peroxidase, Superoxid-Dismutase, Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Glutathion-Reduktase und dergleichen ein. Der Mechanismus setzt ein, sobald oxidativer Streß wie durch Wasserstoffperoxid die Produktion der Enzyme zur Eliminierung von Sauerstoffradikalen induziert. Es zeigt sich, daß Micrococcus luteus HN2-11 eine große Menge von Katalase in der stationären Wachstumsphase produziert, weshalb man annimmt, daß Katalase teilweise für die vom Wachstumszyklus abhängige Widerstandsfähigkeit gegenüber Wasserstoffperoxid verantwortlich ist. Die Katalase kann aus einer durch Zentrifugation mit einer Umdrehungszahl von 3000 Umdrehungen pro Minute abgetrennten Suspension der Micrococcus luteus HN2-11 Kulturlösung erhalten werden. Die Katalase wird anschließend über ein herkömmliches Verfahren wie Filtration, Aussalzen und Ultrafiltration konzentriert.

Auf einer Mikrophotographie der Oberfläche von HN2-11, die vor der Sterilisation angefertigt wurde, bedeckten in der stationären Wachstumsphase Polymere, die die Zellkörper miteinander verbanden, die Mikroorganismen, die Ausstülpungen mit einer Länge von 0,4 µm besaßen. Wenn mit Wasserstoffperoxid behandelt, verschwanden die Polymere von der Oberfläche der Mikroorganismen, und deren prozentuale Überlebensrate nahm ab.

Demzufolge nimmt man an, daß die Polymere eine Funktion bei der Widerstandsfähigkeit gegenüber Wasserstoffperoxid besitzen.

Tabelle 3 zeigt den Vergleich der Inaktivierungsraten und D-Wert zwischen Micrococcus luteus HN2-11 und anderen bekannten Mikroorganismen. Wie in Tabelle 3 gezeigt, weist Micrococcus luteus HN2-11 eine bemerkenswert niedrige Inaktivierungsrate, jedoch einen sehr hohen D-Wert auf.

Tabelle 3

Vergleich der Inaktivierungsraten und D-Werte zwischen Micrococcus luteus HN2-11 und anderen bekannten Mikroorganismen

Demzufolge weist der neuartige Mikroorganismus Micrococcus luteus HN2-11 einen Mechanismus der Widerstandsfähigkeit gegenüber Wasserstoffperoxid auf und zeigt eine lineare halblogarithmische Überlebenskurve gegenüber der Sterilisationstemperatur und der Konzentration von Wasserstoffperoxid. Er stellt einen nützlichen Indikatormikroorganismus zur Etablierung von Standards für die Sterilisation in Anlagen wie die ultrareinen Leitungen in Halbleiter herstellenden Betrieben, die frei von Mikroorganismen sein müssen, dar. Ein geeignetes Verfahren zur Sterilisation kann mit Hilfe der vorliegenden Erfindung gefunden werden.

Es ist für den Fachmann ersichtlich, daß verschiedene Modifikationen oder Veränderungen in diesem neuartigen gegenüber Wasserstoffperoxid widerstandsfähigen Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, ohne vom Geist oder Umfang der Erfindung abzuweichen. Demzufolge schließt die vorliegende Erfindung Modifikationen und Variationen dieser Erfindung ein, sofern sie vom Schutzumfang der beigefügten Ansprüche und deren Äquivalenten erfaßt werden.

Claims

1. Micrococcus luteus HN2-11 (KCTC 0369BP), der widerstandsfähig gegenüber Wasserstoffperoxid ist und eine lineare Überlebenskurve gegenüber der Konzentration von Wasserstoffperoxid zeigt.

2. Verwendung von Micrococcus luteus HN2-11 gemäß Anspruch 1 als Indikatormikroorganismus für die Sterilisation mit Wasserstoffperoxid durch Ermitteln seiner Überlebensraten bei verschiedenen Konzentrationen an Wasserstoffperoxid und Sterilisationstemperaturen.

3. Oberflächenpolymer aus Micrococcus luteus HN2-11 gemäß Anspruch 1, das in einer stationären Wachstumsphase gebildet wird und das einen Mechanismus der Widerstandsfähigkeit gegenüber Wasserstoffperoxid besitzt.

4. Katalase aus Micrococcus luteus HN2-11 gemäß Anspruch 1 mit einem Mechanismus der Widerstandsfähigkeit gegenüber Wasserstoffperoxid.