KR20040037009A - 과산화수소수 분해 능력과 저항성이 이 뛰어난 신규미생물과 이들이 생산하는 카타라아제 - Google Patents
과산화수소수 분해 능력과 저항성이 이 뛰어난 신규미생물과 이들이 생산하는 카타라아제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 과산화수소수 저항성이 우수하며 넓은 온도 범위에서 고농도의 과산화수소수를 단시간에 분해할 수 있는 신규 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 과산화수소에 의한 살균처리의 기준을 설정하는 데 사용될 수 있도록 과산화수소의 농도에 대하여 선형의 생존곡선을 나타내는 신규 미생물에 관한 것이다.
이들 신규 미생물은 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3 (KCCM-IO439) 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5 (KCCM-10438), 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6 (KCCM-IO437), 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9(KCCM-10440) 이다.
본 발명은 위의 미생물 중 한 개 혹은 그 이상의 미생물을 사용하여 과산화수소수를 단시간 내에 처리하는 방법을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 의하면 과산화 수소에 대하여 일정한 저항 기작 및 선형의 생존곡선을 나타내어 살균효과의 검증에 필수적인 지표 미생물로 사용할 수 있는 상기의 미생물을 제공하는 효과가 있다.
본 발명은 상기의 미생물이 생산하는 카타라아제에 관한 것이다
Description
과산화수소수는 다른 이온을 생산하여 부식을 초래하는 염소계 세척수와는 달리 부식이 적어 초순수 물 배관과 항공기 겉 표면 세척 등은 물론 콘택트 렌즈 살균 세척등에도 다양하게 사용되고 있다. 하지만 잔여 과산화수소수는 환경 오염을 발생시키며 콘택트렌즈 등 피부 접촉 물품 세척후 남을 경우 피부에 문제를 일으킨다. 따라서 잔여 과산화수소수를 제거하기 위한 방법이 필요하다.
폐수 처리장의 경우 외부에 노출되고 환경적인 영향, 특히 우리나라의 경우 계절별 온도편차가 커서 미생물 성장과 활성이 낮은 겨울에 폐수 처리 효율이 매우 떨어지게 된다. 이를 위해서는 온도 변이에 영향이 적은 미생물을 이용하는 것이 겨울철 폐수 처리에 관건이다. 현재까지 과산화수소수 처리에 사용되는 수입 미생물 처리제들은 그 구성 미생물에 대한 자료가 부족하며 또한 계절별, 온도별 편차가 심하며 처리 효율과 시간이 장시간 소요되어, 높은 처리 효율과 단기간 처리가 가능한 미생물 개발이 필요하다.
한편 경제적인 면에서 고농도의 과산화수소수에서의 생존율이 높은 미생물로 처리할 경우 전 처리과정으로 과산화수소수를 희석하는 과정의 생략으로 공정의 단순화를 이룰 수 있다.
또한 이들 미생물이 생산하는 카탈라아제는 과산화수소수를 이용한 각종 의복, 도구, 기구 등 소독처리후 잔여 과산화수소수 처리에 사용될 것이다.
따라서 본 발명은 과산화수소 저항성이 우수한 신규 미생물을 제공하는 데에있다.
또한 본 발명은 과산화수소 분해능력이 우수한 신규 미생물을 제공하는 데에 있다.
또한 본 발명은 넓은 온도 범위에서 온도과산화수소 분해 능력이 우수한 신규 미생물을 제공하는데에 있다.
또한 본 발명은 새로운 카탈라아제를 생산하는 신규 미생물을 제공하는 데에 있다.
또한 본 발명은 새로운 카탈라아제를 제공하는 데에 있다.
도 1. 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3, 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5, 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6, 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9 의 그람 염색 사진
도 2. 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3, 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5, 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6, 스타필로코커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9 의 전자현미경 (SEM) 사진
도 3. 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3 의 16S rRNA의 염기서열
도 4. 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5의 16S rRNA의 염기서열
도 5. 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6 의 16S rRNA의 염기서열
도 6. 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9 의 16S RNA 염기서열
도 7. 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3, 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5, 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6, 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9 의 온도별 과산화수소수 파괴능력.
도 8. 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3, 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5, 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6, 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9 의 과산화수소수 저항능력.
도 9. 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3, 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5, 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6, 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9가 생산하는 카탈라아제의 native gel elelctrophoresis와 활성 염색.
도 10. 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3, 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5, 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6, 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9가 생산하는 카탈라아제의 isoelectrophoresis와 활성 염색
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위해 과산화수소수에 대한 저항 기전이 우수한 신규 미생물 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3, 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5, 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6, 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9 을 제공한다.
또한 과산화수소수 분해능력이 뛰어난 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3, 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5, 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6, 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9 을 제공한다.
또한 넓은 온도범위에서 과산화수소수 분해능력을 유지하는 신규 미생물 바실러스 인소리투스(Bacillus insolitus) PLC-3, 바실러스 스패리커스 (Bacillussphaericus) PLC-5, 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6, 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9을 제공한다.
또한 우수한 활성의 새로운 카탈라아제를 생산하는 신규 미생물 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3, 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5, 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6, 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9 을 제공한다.
또한 과산화수소수를 이용한 세척 표준 미생물로 사용할 수 있는 신규 미생물 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3, 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5, 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6, 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9 을 제공한다.
또한 새로운 카탈라아제를 생산하는 신규 미생물 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3, 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5, 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6, 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9 을 제공한다.
또한 신규 미생물 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3, 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5, 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6, 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9 이 생산하는 신규의 카탈라아제를 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 공장 폐수에서 분리된 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3, 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5, 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6, 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9이다.
상기 PL 균주들은 한국미생물보존센터에 국제기탁하여 기탁번호를 부여받았다. 국제기탁번호로는 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3은 KCCM-10439이고, 바실러스 스패리커스(Bacillus sphaericus) PLC-5는 KCCM-10438이고, 스타필로코거스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6는 KCCM-10437이고, 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9는 KCCM-10440이다.
본 발명은 과산화수소수 폐수처리 공정에 사용되는 상기의 미생물 중 1개 혹은 2가지 이상이 복합된 폐수 처리제를 제공한다.
폐수 처리제는 생균, 건조 분말 형태, 폐수처리 벽면의 바이오 필름 형태로 가능하며, 폴리머 등 담체에 고정화된 상태의 형태가 더욱 효과적이다.
콘택트렌즈, 수술기구, 의복 등 인체 접촉물품의 살균처리 후 잔여 과산화수소 처리에는 상기의 균들이 생산하는 카탈라아제 처리가 더욱 효과적이다.
이하, 본 명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 균주의 분리 및 동정
공장 폐수를 serial dilution하여 배지에 접종한 후 단일 콜로니로 분리한 후 과산화수소수를 첨가하여 버블생산이 활발한 집락을 선택하여 동정하였다. 각 집락은 버기스 매뉴얼(Bergy's manual of systematic bacteriology)에 준하여 그람염색후 광학현미경과 관찰한 결과와 전자현미경으로 확인하였고(도 1과 도 2), 생화학적 특성을 조사하였고, 그람염색과 카탈라제 반응을 확인하였고 그람 양성 포도상구균의 경우 API Staph을 이용하였다. 또한 16S rRNA를 Microseq 16S rRNA gene kit (Perkin Elmer Applied Biosystem)로 염기서열을 분석하여 BLAST 검색결과 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)로 동일성을 확인하였다..
PLC-3은 그람 양성 간균 (도 1)으로 1 ×2 um의 크기 (도 2)를 가지고 있으며 aerobic, catalase positive, spore former로 형태, 생리적으로 동정이 불가능한 신종으로 생각된다. 16S rRNA의 염기서열은(도 3)Sporosarcina aquimarina의 16S rRNA의 염기서열과 96.71%,Sporosarcina globisporus의 16S rRNA의 염기서열과 96.57%,Filibacter limicola의 16S rRNA의 염기서열과 96.29%,Sporosarcina psychrophilus의 16S rRNA의 염기서열과 96.08%,Sporosarcina ureae의 16S rRNA의 염기서열과 96.01% 동일하였으며 이들은 구균으로 형태와 맞지 않아 16S rRNA 염기서열 분석으로는 동정이 불가능하다. Bacillus 종 가운데 가장 유사성이 높은 것은Bacillus insolitus로 유사성이 95%로 동일 종으로 판단할 수 없으나 또한 각종 당 동정 결과는 표 1과 같이Bacillus insolitus동일하여 이에 따라 잠정적으로Bacillus insolitusPLC-3로 명명하여 국제기탁하였다 (KCCM-10439).
표 1.
PLC-5은 그람 양성 간균의 spore-former로 (도 1, 도 2), 16s rRNA의 염기서열 (도 4)은Bacillus sphaericus의 표준균주와 100%로 동일하게 나타났다.Bacillus sphaericusPLC-5로 명명하고 국제기탁하였다 (KCCM-10438).
PLC-6은 그람 양성 구균으로 16S rRNA의 염기서열 (도 5)은 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus)의 16S rRNA의 염기서열과 100% 동일하였고 API Staph 결과 (표 1)도 99.4%로 동일하여Staphylococcus lentusPLC-6으로 명명하고 국제기탁하였다 (KCCM-10437).
표 2. Res㎕t of API Staph of PLC-6
PLC-9의 염기서열 (도 6)은Staphylococcus saprophyticus와 99.0% 높은16S rDNA 염기서열을 보였다. 생리생화화학 검사인 API Staph (표 2)검사로 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) 로 동정되었으며, Urease 검사 결과도 Positive로 나타나 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) 와 97.4%로 동일성이 나타나 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9로 명명하여 국제기탁하였다 (KCCM-10440).
표 3. Result of API Staph of PLC-9
실시예2: 과산화수소수 파괴능력 측정 실험
(1) 균주 준비
각각의 균주를 Luria-Bertani 고체배지에서 잘 형성된 집락을 취하여 LB 액체배지에 접종하여 하룻밤 37도에서 진탕배양하였다. 세균을 원심분리로 모은 후 새로운 LB 배지에 0.D.600 가 1이 되도록 농도를 맞추었다.
(2) 과산화수소수 파괴능력 측정
50 ml 비이커에 10% H2O210 ml를 넣고 위에서 준비한 세균 현탁액 1 ml을 첨가하여 10, 20, 30도에서 혼합하면서 시간별로 5 ml의 샘플을 채취하여10 ml의 1M H2SO4를 첨가하고 2% potassium permanganate (KMnO4)를 분홍 또는 갈색으로 발색 될 때까지 한 방울씩 떨어뜨려 적정하였다 (http://www.h2o2.com/intro/iodometric.html). 이때 H2O2standard curve를 작성하여 잔여 H2O2를 측정하였다. 세균별 잔여 H2O2의 양은 도 7과 같다. 도 7에서 보이듯이 3가지 세균 (PLC-3, PLC-6, PLC-9)는 10, 20, 30도에서 10분 이내에 과산화수소수를 100%를 파괴하였으며 PLC-5 의 경우 30도의 파괴능력은 약간 저조하였으나 10도와 20도에서는 다른 세균과 마찬가지로 10분이내에 100% 파괴하였다.
(3) 각 세균이 생산하는 카탈라아제의 활성 측정
상기와 동일한 방법으로 준비된 각각의 세균을 원심분리로 세균을 침전 시킨 후 인산완충용액 (1 mM PMSF, potassium phosphate buffer, pH 8.0) 1ml로 세척하고 다시 인산완충용액 1 ml에 다시 균을 현탁하여 초음파파쇄기 (Sonicator, Fisher, Pittsburg, U.S.A.)로 20000Hz에서 5분간 파쇄하였다. 파쇄되지 않은 세균은 원심분리로 제거하고 상등액을 취하였다. 상등액 600㎕에 각 농도의 H2O260㎕첨가하여 5초 간격으로 240nm에서 흡광도를 측정하였다. 이것을 그래프로 작성한 뒤 초기 직선의 기울기를 계산하여 각 세균의 카탈라아제의 활성으로 결정하였다 (김형표, 이종수, 하영칠, 노정혜, Streptomyces coelicolor의 catalase들의 분석, 1992, J, Microbiol, Vol. 30). Specific activity를 구하기 위하여 파쇄액에 존재하는 단백질의 양은 BCA로 측정하였으며 이때 BSA를 Standard로 사용하였다 (SigmaAldrich co., MO, U.S.A.). 표 2에서 보듯이 각 세균은 1.0 이상의 높은 specific activity을 가지고 있었다.
표 4. 각 균의 hydrogen peroxide 분해능력
실시 예 3. 과산화수소수 저항능력 측정 실험
과산화수소수 저항능력 측정
상기와 동일하여 준비된 각 세균에 1.5%, 3%, 6%, 10% H2O2를 첨가하고 20도에서 혼합 처리하면서 시간별로 샘플을 취하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 세균의 생존을 측정하였다. 도 8에서 보듯이 각 세균은 과산화수소수 10%에서도 생존하여 과산화수소수에 대한 저항능력이 우수한 것으로 판명되었다.
실시 예 4. 각 세균이 생산하는 카타라아제의 종류와 특성 규명
Native gel electrophoresis and catalase activity staining
상기와 같은 방법으로 각각의 세균의 파쇄액을 작제하여 파쇄액의 단백질 양을 BCA assay로 정량한다. 각 단백질 100 ㎍을 8% native gel을 이용하여 50 V, 4시간동안 4℃에서 전기 영동 한다. 활성염색을 수행하기 위하여 먼저 전기영동 후 gel을 4mM H2O2에 10분간 방치한 후 잠시 증류수로 세척한다. 여기에 potassiumferricyanide와 ferric chloride 각각을 2% 되도록 섞고 gel의 background가 초록색이 될 때까지 염색한다. (Heino kuusk, 2001, Purification and characterization of a novel bromoperoxidase-catalase isolated from bacteria found in recycled pulp white pulp, Ezyme and microbial technology, Vol.28) 염색과정을 멈추기 위해 증류수로 세척 후 보관한다. 도 9에서 보이듯이 PLC-3, PLC-5, PLC-6, PLC-9는 각기 다른 분자량을 가진 카탈라아제를 생산하고 있다.
Isoelectrofocusing gel electrophoresis를 이용한 카탈라아제의 등전점 측정
각세균이 생산하는 카탈라아제의 등전점을 측정하기 위하여 각각의 세균의 파쇄액 2㎕을 gel에 loading하고 100V에서 15분, 200V에서 15분, 450V에서 1시간 동안 (Bio-Rad, Richmond, U.S.A.) 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 뒤 gel로부터 gel support film을 분리한 후 상기에 기술한 것과 같은 활성 염색을 수행하였다 (도 10). 각 카탈라아제의 등전점은 isoelectrofucusing marker와 비교하여 구하였다 (표 3).
표 5. 각 PLC 세균이 생산하는 카타라아제의 등전점.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 폐수에서 분리된 바실러스 인소리투스(Bacillus insolitus) PLC-3, 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5, 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6, 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9은 고농도의 과산화수소수 분해능력이 우수하며 저항기전이 우수하다. 또한 넓은 온도에서 활성이 유지되어 폐수처리제로 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 세균을 담체에 고정할 경우 더 높은 효율을 기대할 수 있다. 또한 이들이 생산하는 카타라아제는 각종 과산화수소수를 이용한 멸균처리 후 잔여 과산화수소수를 제거하는 데 사용될 수 있다.
Claims (8)
- 과산화수소수 분해능력이 뛰어난 폐수에서 분리된 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus), 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus), 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) , 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus)
- 제 1항에 있어서 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3 (KCCM-10439) 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5 (KCCM-10438), 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6 (KCCM-10437), 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9 (KCCM-10440).
- 청구항 1항 중 1개 이상의 균이 포함된 과산화수소수 파괴 조성물
- 청구항 2항 중 1개 이상의 균이 포함된 과산화수소수 파괴 조성물
- 과산화수소 저항성을 가지면서 과산화수소의 농도에 대한 사멸율이 선형으로 나타나는 미생물 신규 미생물 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3 (KCCM-10439) 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5 (KCCM-10438), 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6 (KCCM-10437), 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9 (KCCM-10440).
- 청구항 1의 신규 미생물을 이용하여 배관 살균에 적절한 살균방법을 설정하기위한 지표미생물로서 사용됨을 특징으로 하는 살균방법
- 바실러스 인소리투스 (Bacillus insolitus) PLC-3 (KCCM-10439) 바실러스 스패리커스 (Bacillus sphaericus) PLC-5 (KCCM-IO438), 스타필로코커스 렌터스 (Staphylococcus lentus) PLC-6 (KCCM-10437), 스타필로코커스 사프로파이티커스 (Staphylococcus saprophyticus) PLC-9 (KCCM-10440) 을 이용하여 기존의 미생물 담체를 생산하여 과산화수소수 제거 공정에 사용하는 방법.
- 청구항 1항의 신규 미생물로부터 생산되는 과산화수소수 분해능력이 뛰어난 카탈라아제
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