DD237001A1

DD237001A1 - Selektionsverfahren

Info

Publication number: DD237001A1
Application number: DD27594385A
Authority: DD
Inventors: Claus-Ruediger Kramer; Horst Arndt; Sabine Witter
Original assignee: Paedagogische Hochschule Wolfg
Priority date: 1985-05-03
Filing date: 1985-05-03
Publication date: 1986-06-25

Abstract

Die Erfindung "Selektionsverfahren fuer Effektoren mittels Ionenumsatzanalysen heterotropher Mikroalgensuspensionen" dient der Suche nach Pflanzenschutzmitteln. Sie verfolgt das Ziel, ein Verfahren vorzuschlagen, das die Erfassung der biologischen Aktivitaet applizierter Substanzen vermittels von Messungen des Ionenumsatzes geeigneter heterotropher Mikroalgensuspensionen schnell, sicher sowie auf einfacher messtechnischer Grundlage an In-vivo-Material zulaesst, Dosis-Wirkungs-Analysen und Zeitverlaufsstudien erlaubt und fuer vertiefende Nachfolgeuntersuchungen wertvolle Hinweise liefert.

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Pflanzenschutzmittelforschung, Suche nach Regulatoren biologischer Prozesse, Naturstoffchemie, Umweltschutz

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die wirkstoffinitiierte Beeinflussung des Wachstums einzelliger Mikroalgensuspensionen kann auf verschiedene Art und Weise erfaßt werden.

So können nach dem Patent DD 94234 mittels autotroph kultivierter einzelliger Algensuspensionen diejenigen Chemikalien aus einer Stichprobe selektiert werden, die den fundamentalen Prozeß des autotrophen Zellwachstums, die Photosynthese, Unmittelbar oder mittelbar beeinträchtigen. Bei diesem Verfahren und den in den Patenten DD 200472, DD 211126 sowie DD 214146 vorgeschlagenen Verfahren werden zur Beurteilung der Wachstumsbeeinflussungen von autotrophen und/oder heterotrophen Mikroalgensuspensionen durch Effektoren die wachstumsproportionalen Be'einflussungen der optischen Eigenschaften der als Testmodell genutzten Zeil- bzw. Organismensuspensionen herangezogen.

Die Patente DD 212985, DD 213949 und DD 213950 beschreiben Verfahren, bei denen zur Beurteilung der Wirkaktivität von Effektoren die Beeinflussung der photosynthetischen und/oder respiratorischen Gaswechselumsätze autotropher und/oder heterotropher Mirkoalgensuspensionen genutzt werden. Besonders die Kombination beider Analysemethoden in möglichst einem Arbeitsgang liefert detaillierte Informationen zur Wirkspezifik der Effektoren und gestattet in diesem Sinne entsprechende Selektionen der Wirkstoffe nach der gezeigten Wirkstoffcharakteristik (DD 216253, DD 216254). Demgegenüber erfordern praxisübliche physiologische, biochemische oder enzymologische Untersuchungen zur Substanzaufnahme oder-abgabe durch Organismen, insbesondere wenn diese durch Wirkstoffe beeinträchtigt oder stimuliert werden, neben entsprechenden umständlichen Bestimmungsverfahren wie das Kjeldahl-Verfahren zur Bestimmung des Stickstoffgehaltes in organischem Material oder photometrische Methoden nach Lowry bzw. das Biuretverfahren zur Proteinbestimmung u.a. in der Regel den Zellaufschluß sowie geeignete Extraktions- und Reinigungsprozeduren. Sie sind sehr geräte-, zeit- und arbeitsaufwendig. Damit ist die Durchführung großer Versuchsserien im Rahmen von Tests zur Wirkung von Phytoeffektoren sowie eine exakte, auf vielen Meßpunkten beruhende Dosis-Wirkungs-Analyse von vornherein stark eingeschränkt.

Wirkungsverlaufsstudien zur Erfassung der Zeitabhängigkeit der Effekte substanzinitiierter Beeinflussungen der Substanzaufnahme und/oder -abgabe durch heterotrophe Organismen sind praktisch unausführbar oder werden infolge eingeschränkter Reproduzierbarkeit der Ergebnisse infolge der notwendigen Zellaufschlüsse modifiziert oder verfälscht. Aufgrund der Nachteile solcher in vitro-Untersuchungen ergibt sich der Wunsch nach einem in vivo-Verfahren, das vermittels einfacher Meßtechnik mit geringem Arbeits- und Zeitaufwand manuell oder automatisiert betreibbar ist und das gestattet, die Wirkung von Phytoeffektoren auf der Grundlage der Analyse des lonenumsatzes wie Nitrat- oder Ammonium ionenauf nah me und/oder Hydroxyd- oder Wasserstoffionenabgabe heterotropher Zeil- oder Organismensuspensionen schnell, sicher und zuverlässig anzeigen kann und sowohl allgemeine Aussagen im Rahmen eines Screenings als auch vertiefende Antworten nach distinkten oder kontinuierlichen Messungen erlaubt und Wirkungsverlaufsstudien zuläßt.

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Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, die Wirkung von Phytoeffektoren auf den lonenumsatz heterotropher Zeil- oder Organismensuspensionen anhand eines einfachen in vivo-Tests auf der Basis der Analyse der Aufnahme und/oder der Abscheidung insbesondere von Nitrat-, Ammonium-, Wasserstoff- bzw. Hydroxylionen etc. in geeigneten Nährmedien zu erfassen, zu quantifizieren und Dosis-Wirkungs-Analysen zu unterziehen, um eine Selektion von Effektoren in solche, die den respiratorischen Stoffwechsel von Pflanzen tangieren oder aber nicht wirken, vornehmen zu können und die Effektoren anhand von Wirkungsverläufen näher charakterisieren und differenzieren zu können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein methodisch einfaches Verfahren vorzuschlagen, welches durch die Wahl geeigneten Testmaterials, geeigneter Testbedingungen und geeigneter Meßverfahren über die Analyse des lonenumsatzes heterotropher Mikroalgensuspensionen die Selektion wirksamer Substanzen und deren zweifelsfreie Abgrenzung von unwirksamen gestattet.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß definierte Mengen chemischer Verbindungen mit heterotroph kultivierten Zellsuspensionen einzelliger Grünalgen in unmittelbaren Kontakt gebracht und diese Proben parallel mit unbehandelten Vergleichskulturen beieinheitlicherTemperaturzwischen20°Cund38°Cim Dunkeln belüftet werden, so daß sie unter Ausschluß der Photosyntheseprozesse wachsen und sich entwickeln.

Zu festgelegten Zeitpunkten oder kontinuierlich werden dann mittels pH-Meßketten der pH-Wert und/oder mittels ionensensitiver Elektroden der Nitrat- und/oder Ammoniumionengehalt der Proben und Vergleichskulturen oder Anteile von beiden analysiert und die dabei gewonnenen Ergebnisse vergleichenden Betrachtunen unterzogen. Die Vorteile dieses Verfahrens im Vergleich zu herkömmlichen Methoden, bei denen die Wachstumserfassung der Algensuspensionen übr Extinktionsmessungen oder durch Analyse des Gaswechselumsatzes mit Hilfe eines Infralyt-Permolyt-Systems oder ähnlichem erfolgt, liegen in der einfachen ökonomischen Meßtechnik, die leicht handhabbar und schnell eichbar ist sowie eine hohe Meßgenauigkeit garantiert. pH-Messungen eignen sich gut für Screeningtests und zeigen Wirkungen sicher und schnell, unmittelbar oder mittelbar an. Es gibt keinen unmittelbaren Einfluß von trübenden oder färbenden Substanzen auf die Meßgröße wie etwa bei photometrischen Verfahren. In vivo-Messungen, die auf lonenumsatzanalysen basieren, können leicht automatisiert gestaltet werden.

Ausführungsbeispiele

Frisch geschlüpfte Aplanosporen synchroner Kulturen einzelliger Grünalgen der Species Chlorella vulgaris var. vulgaris, Stamm . Böhm und Borns 1972/1, werden in ein anorganisches Nährmedium so überführt, daß jeder Kubikzentimeter der Suspension etwa 7 bis 7,5 Millionen Algenzellen enthält

1 Liter der Kultur-Nährlösung N setzt sich dabei aus den drei Teilnährlösungen N₁, N₂ und N₃ zusammen:

1 000cm³ N = 998cm³ N, + 1 cm³ N₂ + 1 cm³ N₃

Die Nährlösungen N₁, N₂ und N₃ enthalten folgende Substanzen: Nährlösung N₁

Für die Nährlösung Ni werden zunächst die Stammlösurigen 1 bis 4 durch Auffüllen der genannten Substanzmengen mit Aqua dest. hergestellt:

Stammlösung 1: 10OgKNO₃ZIOOOCm³ Stammlösung 2: 25g CaCI₂ · 6H₂O/1 000cm³ Stammlösung 3: 25OgMgSOWH₂OZIOOOCm³ Stammlösung 4: 160g KH₂PO₄ZI 000cm³

Aus je 5cm³ der Stammlösung 1,0,5cm³ der Stammlösung 2,1 cm³ der Stammlösung 3 und 5 cm³ der Stammlösung 4 werden durch Auffüllen mit destilliertem Wasser 1 000cm³ der Nährlösung N₁ hergestellt. Nährlösung N₂

Die Nährlösung N₂ enthält in 1 000cm³ Lösung 61 mg H₃BO₃, 169 mg MnSO₄ H₂O, 287 mg ZnSO₄- 7 H₂O, 2,5 mg CuSO₄-5 H₂O und 12,4mg (NH₄I₂MoO₄

Nährlösung N₃

Die Nährlösung N₃ enthält in 1 000cm³ Lösung 6,9g FeSO₄- 7H₂O und 9,3g Na-EDTA.

Zu der frisch hergestellten Algensuspension werden dann 0,1 Ma.-% Glukose als organische Kohlenstoffquelid und 20mgZ 1 000cm³ Chloramphenicol gegeben.

Je 80 cm^{3 [}3r so hergestellter:'Suspension werden in je eine Kulturröhre eingebracht, mit je 1 cm³ verschieden konzentrierter Lösung der zu prüfenden Substanzen A, B und C beimpft oder als nur mit dem Lösungsmittel behandelte Kontrollen bei 39°C im Dunkeln mit gereinigter Luft begast, so daß alle erforderlichen Voraussetzungen für das heterotrophe Wachstum gegeben sind. Während die in Nährlösung suspendierten Zellen in den unbehandelten Vergleichskulturen normal wachsen und sich entwickein, werden Wachstum und lonenumsatz der Algen in den mit Chemikalien versetzten Suspensionen mehr oder weniger beeinflußt, wenn verschiedene Substanzkonzentrationen den Atmungsprozeß undZoder den Stickstoffhaushalt mehr oder weniger stören.

In definierter Zeitfolge oder am Testende werden dann von den Vergleichskulturen und den mit den Substanzen A, B und C behandelten Proben die wachstumsbedingten pH-Wertänderungen als Maß für den Stickstoffhaushalt analysiert. Die Ergebnisse der Analysen sind den Fig. 1 und 2 zu entnehmen. Die Fig. 1 enthält die 3 möglichen qualitativ verschiedenen Wirkbilder in Form von Auftragungen der analysierten wachstumsbedingten pH-Werte der kontroll- und wirkstoffbehandelten Suspensionen als Funktionen der Wachstums- bzw. Einwirkzeit.

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Die Fig. 1, A₁ zeigt die Analysenergebnisse der neutralwirkenden Substanz A. Sie enthält die pH-Werte für die unbehandelte Kontrolle K und die mit abgestuft zunehmenden Konzentrationen der Substanz A versetzten Proben 1 bis 6, die von der nullten biszurfünfzehnten Stunde rund alle 45 Minuten gemessen wurden. Deutlich sind die dosisabhängigen, spezifischen Beeinflussungen von Substanz A in Form der entsprechenden pH-Zeit-Kurven K, 1 bis 6 in Fig. 1,A₁ zu erkennen.

Im Vergleich dazu unterscheiden sich die Wirkbilder Fig. 1,B₁ und Ci für die Beeinflussungen der pH-Werte der Suspension en, die durch die Substanzen B und C determiniert wurden.

Über die Analysenergebnisse der fünfzehnstündigen Beeinflussung des Stickstoffhaushalts der Chlorella-Suspensionen durch Substanz B, die im Vergleich zu Substanz A saure Eigenschaften besitzt, informiert Fig. 1, B₁.

Von der Substanz C, deren Analysenergebnise in Fig. 1,C₁ dargestellt sind, wurde der Einfluß der Konzentrationsstufen 1 bis 8 auf die Änderung des Stickstoffhaushaltes der Chlorella-Suspensionen untersucht. Die dosisanhängige Zunahme der AnfangspH-Werte der Dosen 1 bis 8 in Fig. 1, C-, sind in diesem Fall auf die basischen Eigenschaften der Substanz C zurückzuführen. Zur besseren Vergleichbarkeit solcher Wirkbilder gemäß Fig. 1 ist zu empfehlen, die Wirkbilder für sauer oder basisch wirkende Effektoren zu normieren. Das geschieht, indem die pH-Zeit-Kurven für die Dosen 1 bis X parallel zur Zeitachse so verschoben werden, daß die Anfangs-pH-Werte für alle Dosen mit den entsprechenden Werten der unbehandelten Kontrollen übereinstimmen.

Die erzielten Meßdaten bilden die Grundlage für Dosis-Wirkungs-Analysen, deren Ergebnisse exemplarisch am Beispiel der Substanzen A, B und C in Fig. 2 dargestellt sind. Die Fig. 2 zeigt die prozentuale Hemmung gemäß Gl. (1) des heterotrophen Wachstums synchroner Chlorella-Suspensionen als Funktion der negativen dekadischen Logarithmen der molaren Wirkkonzentration (pe) der Substanzen A, B und C.

V_{7 = 1O}o . ff^: „ ff (D

pH₀ = Anfangs-pH-Wert der einzelnen Suspensionen

pH_K = pH-Wert der Kontrollsuspension zur Analysenzeit

pH_w = pH-Wert wirkstoffbehandelter Suspensionen zur Analysenzeit

Die Analysen ρΗκ und pHw können parallel nach einer Testdauer von 8 bis 15 Stunden vorgenommen werden. Aus den Dosis-Wirkungs-Kurven gemäß Fig. 2 können gewünschte Wirkquantitäten für isoaktive Konzentrationen wie pc₅₀ entnommen und für quantitative Struktur-Wirkungs-Analysen genutzt werden. Damit wird illustiert, daß pH-Messungen zur Kennzeichnung der Wirkung von Effektoren auch unter heterotrophen Anzuchtbedingungen beispielsweise in einem Screening-Test gut geeignet sind.

Claims

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Patentanspruch:

1. Selektionsverfahren für Effektoren mittels lonenumsatzanalysen heterotropher Mikroalgensuspensionen, dadurch gekennzeichnet, daß Bestimmungen des Nitrat-, Ammonium- und/oder des Hydroxyd- bzw. Wasserstoffionengehaltes und gegebenenfalls weiterer dissoziierter Bestandteile des Nährmediums heterotroph kultivierter Mikroalgensuspensionen, die mit zu prüfenden Substanzen gegebenenfalls in abgestuften Konzentrationen unter konstanten geeigneten Umweltbedingungen konfrontiert werden, genutzt werden, um aus den substanzinitiierten Unterschieden in den kontinuierlich oder distinkt erfaßten Änderungen des entsprechenden lonenumsatzes durch Vergleich mit denen der unbehandelten Kontrollen Schlußfolgerungen über die Wirksamkeit von Effektoren zu ziehen und eine Selektion in wirksame oder aber nichtwirksame vornehmen zu können.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroalgensuspension alle suspendierbaren, heterotroph anziehbaren eukaryotischen Mikroalgen verwendet werden können.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Änderungen der lonenkonzentrationen in den Suspensionen nach allen gängigen Meßverfahren, wie z. B. pH-Meßketten, andere ionensensitive bzw. ionenselektive Elektroden etc. analysiert werden können.