DE3327691C2 - Verfahren zur Ermittlung von Umweltschadstoffen - Google Patents

Verfahren zur Ermittlung von Umweltschadstoffen

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Ermittlung von Umweltschadstoffen, bei dem pflanzliche Zellen einem Schadstoff enthaltenden Medium ausgesetzt und die Einwirkung der Schadstoffe anhand der Veränderungen biochemisch-physiologischer Vorgänge der Zelle festgestellt wird. Ziel ist, ein Verfahren dieser Art mit über längere Zeit zur Verfügung stehenden Zellproben durchführen zu können. Gemäß der Erfindung werden als pflanzliche Zellen Protoplasten eingesetzt, die zur Verzögerung ihrer Seneszenz mit einer gas- und wasserdurchlässigen Matrix, beispielsweise in einer Ca-Alginat-Matrix oder in einer La-Alginat-Matrix, immobilisiert worden sind. Das Mittel zur Durchführung des Verfahrens besteht in in der gas- und wasserdurchlässigen Matrix eingelagerten pflanzlichen Protoplasten. Besondere Verwendungen dieser Mittel sind die Ermittlung der Hemmung der Ribulose-1,5-biphosphat-carboxylase und der Bestimmung der Emissionsrate von Äthan aus den Protoplasten.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Ermittlung von Umweltschadstoffen, bei dem pflanzliche Zellen einem Schadstoffe enthaltenden Medium ausgesetzt und die Intensität von durch die Einwirkung der Schadstoffe veränderten biochemisch-physiologischen Vorgänge der Zellen bestimmt wird.
Es ist bekannt, Schadstoffkonzentrationen mit Hilfe von physikalischen Analysenmethoden zu bestimmen. Die Ergebnisse derartiger Verfahren lassen jedoch keinen direkten Schluß über die biologische Wirkung von Schadstoffen zu, da die Wirkung der Schadstoffe nicht nur von der Konzentration, sondern auch von der Kombination der einzelnen Schadstoffe in der Umwelt und damit in der zu untersuchenden Probe abhängt. Da zudem die Zusammensetzung der Schadstoffe in Umweltproben im allgemeinen sehr komplex ist und die Analysen meist auf die Bestimmung einiger wichtiger Schadstoffe beschränkt werden müssen, ist in der Praxis anhand derartiger Analysenergebnisse keine hinreichende Aussage über die biologische Wirkung bei gegebenen Umweltbedingungen zu machen.
Es ist bekannt, daß lebende Zellen auf eine Änderung der Umweltbedingungen mit einer Änderung von biochemisch-physiologischen Vorgängen reagieren. So zeigt z. B. die Äthanproduktion die physikalische Zerstörung der Zellmembran an. Es sind auch Untersuchungen bekannt, nach denen diese Effekte mit Hilfe von ganzen Pflanzen oder mit Hilfe von in einer Suspension vorliegenden Zellen bzw. Organellen festgestellt werden. Ganze Pflanzen haben jedoch im Hinblick auf ihre Eignung als Testobjekt für Schadstoffe den Nachteil, daß sie relativ unempfindlich gegenüber Schadstoffeinwirkungen sind. In wäßriger Lösung suspendierte Zellen oder Organellen sind dagegen zwar hochempfindlich gegenüber Schadstoffeinwirkungen, haben aber nur eine kurze Lebensdauer und stehen daher nur kurzfristig zur Verfügung.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren der eingangs bezeichneten Art zu schaffen, das — ausgehend von pflanzlichen Zellen — eine empfindliche Bestimmung der Einwirkung von Schadstoffen ennögiicht bei zugleich über längere Zeit zur Verfügung stehenden Zellenproben, worunter auch identische Zellenproben zu verstehen sind.
Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß man als pflanzliche Zellen zur Verzögerung ihrer Seneszenz in einer gas- und wasserdurchlässigen Matrix immobilisierte Protoplasten einsetzt Als Protoplasten können z. B. solche aus ein- oder auch zweikeimblättrigen Pflanzen sowie Hefezellen Verwendung finden.
Zweckmäßig ist, daß man die Protoplasten, eingelagert in einer Ca-Alginat-Matrix oder auch in einer La-Alginat-Matrix, einsetzt Die Alginat-Matrix besteht zu über 90% aus Wasser und weist große Poren auf. Dadurch ist es einerseits möglich, daß Nährlösung ungehindert zu den Protoplasten gelangt Andererseits wird auch der Kontakt der Schadstoffe mit den Protoplasten in keiner Weise eingeschränkt Darüber hinaus hat sich gezeigt daß die Sensitivität der Protoplasten gegenüber den Schadstoffen durch Erhöhung des Alters erheblich verstärkt wird, so daß eine Empfindlichkeitssteigerung der Zellen erreicht wird.
Durch die Immobilisierung selbst und geeigneter Lagerung, die zweckmäßigerweise bei einer Temperatur
jS im Bereich von 2 bis 6°C erfoigt, wird bei in Caiciumaiginat immobilisierten Protoplasten eine Haltbarkeit von 10 bis 14 Tagen, bei in Lanthanalginat immobilisierten Protoplasten eine Haltbarkeit von bis zu drei Monaten erzielt. Protoplasten in Suspension sind dagegen nur für einige Stunden lagerungsfähig.
Die Einwirkung der Schadstoffe auf die Protoplasten kann beispielsweise an dem Maß der Hemmung der Ribulose-l,5-biphosphatcarboxylase, dem wichtigsten Enzym für den Prozeß der Photosynthese (Bindung von CO2) festgestellt werden.
Es wird radiochemisch die l4CO2-Aufnahme bestimmt.
Eine besonders vorteilhafte Variante dv« Verfahrens gemäß der Erfindung besteht darin, daß die Emissions-
rate von Äthan aus den Protoplasten bestimmt wird. Äthan, das als Protiukt der Peroxidation ungesättigter Fettsäuren, die an die Zellmembran gebunden sind, anfällt, läßt sich sehr schnell und einfach gaschromatographisch bestimmen. Umfangreiche Messungen haben zu-
dem gezeigt, daß die Äthanbildung proportional zur Schadstoffkonzentration ist.
Ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung ist ein »Indikator«, der durch in eine gas- und wasserdurchlässige Matrix eingelagerte pflanzliehe Protoplasten gekennzeichnet ist. Als Matrizes sind eine Calcium-Alginat-Matrix, vorzugsweise eine Lanthan-Alginat-Matrix vorgesehen. Selbstverständlich sind auch andere Matrizes einsetzbar, die es zulassen, daß einerseits eine Nährlösung, andererseits aber auch Schadstoffe zu den Protoplasten gelangen.
Der Indikator kann in verschiedenen Formen vorliegen, wobei sich als vorteilhaft und leicht handhabbar erw-esen hat, wenn der Indikator in kleinen Kugeln vor-
liegt, wobei der Durchmesser der Kugeln zweckmäßigerweise etwa 1 bis 5 mm beträgt
Bei einer weiteren Ausführungsform des Indikators liegt dieser bandförmig vor, wobei die Dicke des Bandes etwa 1 bis 2 mm beträgt.
Zur Herstellung eines Indikators kann wie folgt vorgegangen werden:
Ein Aliquot einer frisch hergestellten Protoplastensuspension wird je nach dem zu verwendenden Zelltyp in eine 3- bis 6%ige isotone Na-AIginat-Lösung eingerührt und wahlweise mit Ca2+ oder La3+-Ionen vernetzt
Zur Herstellung des bandförmigen Indikators wird zweckmäßigerwebe die in Na-Alginat befindliche Protoplastensuspension in Streifen auslaufen gelassen und erst danach durch Zugabe der Ionen vernetzt
Zur Herstellung eines kugelförmigen Indikators wird die die Protoplastensuspension enthaltende Alginat-Lö sung zweckmäßigcrweise in die Vernetzerlösung (10 mM CaCb bzw. 10 mM La (NOs)J in isotoner Mannitlösung) eintropfen gelassen.
Der Indikator wird sodann zweckmäßigerweise unter Zusatz von Antibiotika (Penicillin, Streptomycin) in Nährlösung aufbewahrt
Ausführungsbeispiel I
50 mM Na H14 CO3 (spez. Aktivität 7,2 · 105 Bq μ mol-·), 1 mM Ribulosebiphosphat sowie 0,8 M Mannit enthielt Sie wurden dabei 30 Min. mit einer Lichtintensität von 15 000 Ix bestrahlt Anschließend wurde die Lösung abgenommen, mit Methanol (75%) im Volumenverhältnis von 1 :1 abgestoppt Die I4CO2-Aufnahme wurde hiernach mit Hilfe eines Flüssig-Szintiliationszäh'.ers bestimmt Als Maß für die Enzymaktivität wurde die I4CO;rAufnahme in μ mol pro mg Chlorophyll und Stunde gewählt
Ergebnis der Messung:
100 μ mol 14CO2 (mg ChL)-' h~·.
Kontrollprobe (ohne Schadstoff):
1750 μ mol 14CO2(mg ChL)-' h~!.
25
Es wurde ein 7 Tage alter bandförmiger Indikator verwendet dessen Länge etwa 5 cm, dessen Breite etwa 1 cm und dessen Dicke etwa 2 bis 3 mm betrug und der immobilisierte Vicia-Faba-Protoplasten enthielt. Der Indikator wurde für 30 Minuten in eine Lösung gelegt die 0,5 M Mannit als Osmotikum und 14 mM PCP (Pentachlorphenol) als Schadstoff enthielt. Der Indikator wurde anschließend in einer Fernbachflasche 1 Stunde lang bei 22°C unter Licht bestrahlt (200 W/cm2). Danach wurde 1 ml Gasprobe entnommen und diese gaschromatographisch auf Äthan analysiert. Die Äthanproduktion pro Zeiteinheit konnte somit bestimmt werden.
Ein Maß für die eingesetzte Zellzahl war der Chlorophyllgehalt des verwendeten Indikators.
Die Bestimmung des Äthans ergab 135 pmol Äthan (mg ChI)-'h-'.
Eine Kontrollmessung mit dem gleichen, dem Schadstoff jedoch nicht ausgesetzten Indikator ergab 60 pmol Äthan (mg ChI)-'h-'.
Ausführungsbeispiel 2
Entsprechend Ausführungsbeispiel 1 wurden Messungen mit einem Avena-Sativa-Protoplasten enthaltenden Indikator durchgeführt
Die Messung ergab 150 pmol Äthan (mg ChI)-' h-1. Die Kontrollmessung ergab 65 pmol Äthan (mg ChlJ-'h-i.
Ausführungsbeispiel 3
Es wurde ein Indikator entsprechend Ausführungsbeispiel I verwendet. Dieser wurde für 30 Minuten in eine 0,5 M Mannit-Lösung gelegt, die zusätzlich noch 220 μ mol HgCI2 als Schadstoff enthielt. Nach dem Ausbetten der Protoplasten aus der Matrix mit Citratpuffer (20 mM; pH 7,6; in 0,8 Mannit) wurde die Aktivität des Enzyms Ribulose-l^-biphosphatcarboxylase über die l4C-Aufnahme bestimmt. Die Protoplasten wurden dazu in 0,5 ml einer Lösung gegeben, die 0,1 M Tris-HCI-Puffer (pH = 8,3), 5 mM Dithiothreitol, 1OmM MgCl2,

Claims (6)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Ermittlung von Umweltschadstoffen, bei dem pflanzliche Zellen einem Schadstoffe enthaltenden Medium ausgesetzt und die Intensität von durch die Einwirkung der Schadstoffe veränderten biochemisch-physiologischen Vorgänge der Zellen bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man als pflanzliche Zellen zur Verzögerung ihrer Seneszenz in einer gas- und wasserdurchlässigen Matrix immobilisierte Protoplasten einsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Protoplasten, eingelagert in einer Ca-Alginat-Matrix oder in einer La-Alginat-Matrix, einsetzt
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Emissionsrate von Aihan aus den Frotopiasten bestimmt wird.
4. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch in einer gas- und wasserdurchlässigen Matrix eingelagerte pflanzliche Protoplasten.
5. Mittel nach Anspruch 4 zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Protoplasten in einer Ca-Alginat-Matrix oder in einer La-Alginat-Matrix eingelagert sind.
6. Mittel nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die die Protoplasten enthaltende Matrix in Kugelform mit einem Durchmesser der Kugejn von 1 bis 5 mm oder in Bandform mit einer Dicke des Bandes von 1 bis 2 mm vorliegt.
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