DE4440320A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Ermittlung der Umweltbelastung durch Chemikalien in wäßrigen Proben mit Bioindikatoren - Google Patents

Description

Wimpertierchen sind in der Lage, chemische Signale ihrer wäßrigen Umgebung in geringsten Konzentrationen wahrzunehmen. Diese Fähigkeit zum Erkennen chemischer Reize, welche ebenfalls bei signalgesteuerten Prozessen des Menschen - wie etwa der Wund­ heilung oder der Migration von Leukozyten zur Abwehr von Entzündungen und Infektio­ nen - eine entscheidende Rolle spielt, macht die einzelligen Tiere zu einem wertvollen Objekt biologisch-medizinischer Forschung.

Auch hinsichtlich umwelttoxikologischer Untersuchungen sind diese chemosensorischen Leistungen von besonderem Interesse: Sensorische Systeme sind im allgemeinen Substan­ zen aus der Umwelt direkt ausgesetzt und sprechen bereits innerhalb kürzester Zeiträume sehr nachweisempfindlich auf chemische Reize an. Eine Vielzahl von Umweltgiften löst bei den einzelligen Tieren eine typische Flucht- und Vermeidungsreaktion aus. Die Stärke der Reaktion hängt hierbei von der jeweiligen Konzentration des Stoffes ab und wird als Maß des Gefährdungspotentials chemischer Belastung herangezogen (Roberts & Berk 1990, Pauli & Berger 1992, Pauli et al. 1994). Gerade im Bereich Umwelttoxikologie und biologische Schadstoffanalyse bietet sich hier eine Biosonde auf der Basis von Mikroorga­ nismen an, die komplexe sensorische Leistungen von Tieren nutzt, ohne dabei auf höhere Tiere zurückgreifen zu müssen.

Eine Reihe verschiedener Testverfahren wurden für die qualitative sowie quantitative Erfassung der chemosensorischen Reaktionen von Ciliaten entwickelt: Einige basieren auf dem Prinzip kommunizierender Röhren ("Kapillar-Tests": Van Houten et al. 1982, Leick & Helle 1983, Pauli & Berger 1993, Koppelhus et al. 1994), in anderen werden Membran- Filter als Trennschicht zwischen zu untersuchender Probe und Zellsuspension eingesetzt ("Membran-Filter-Test": Leick et al. 1990) oder Zellsuspension und Probelösung direkt übereinander geschichtet ("Zwei-Phasen-Test": Van Houten & Hansma 1975, Hellung- Larsen et al. 1986, Koppelhus et al. 1994). Wieder andere bedienen sich herkömmlicher "Zigmond-Kammern" (Leick 1988) oder beruhen auf der direkten Beobachtung und Ana­ lyse des Schwimmverhaltens in chemischen Gradienten ("Gel-Test", "field-tests": Hellung- Larsen et al. 1986, "Glasschalen-Test": Ueda & Kobatake 1977, "well-test": Van Houten et al. 1982).

Literaturstellen

Hellung-Larsen P, Leick V, Tommerup N (1986). Chemoattraction in Tetrahymena on the role of chemokinesis. Biol Bull 170, 357-367.

Koppelhus U, Hellung-Larsen P, Leick V (1994). An improved quantitative assay for chemokinesis in Tetrahymena. Biol Bull, im Druck.

Leick V, Helle J (1983). A quantitative assay for ciliate chemotaxis. Anal Biochem 135: 466-469.

Leick V (1988). Gliding Tetrahymena thermophila. Europ J Protistol 23, 354-360.

Leick V, Frederiksen K, Lyhne I, Hellung-Larsen P (1990). A paper membrane filter assay for ciliate chemoattraction. Anal Biochem 184, 63-66.

Pauli W, Berger S (1992). Chemosensory and electrophysiological responses in toxicity assessment - investigations with a ciliated protozoon. Bull Environ Contam Toxicol 49: 892-899.

Pauli W, Berger S (1993). Meßkapillare zur Bestimmung der Toxizität von Um­ weltschadstoffen mit Hilfe des chemosensorischen Verhaltens von Einzellern. Ge­ brauchsmustereintragung, Deutsches Patentamt, Patentblatt 18.11.1993.

Pauli W, Berger S, Schmitz S, Jaskulka L (1994). Chemosensory responses of cilia­ tes: a sensitive endpoint in xenobiotic hazard assessment. Environmental Toxicology and Water Quality 9 (4), im Druck.

Roberts R O, Berk S (1990). Development of a protozoan chemoattraction bioassay for evaluating toxicity of aquatic pollutants. Toxicity Assessment 5, 279-292.

Ueda T, Kobatake Y (1977). Hydrophobicity of biosurfaces as shown by chemore­ ceptive thresholds in Tetrahymena, Ph ysariu in and Nitella. J Membrane Biol 34, 351-368.

Van Houten J, Hansma H (1975). Two quantitative assays for chemotaxis in Para­ mecium. J comp Physiol 104, 211-223.

Van Houten J, Martel E, Kasch T (1982). Kinetic analysis of chemokinesis of Paramecium. J Protozooi 29 (2), 226-230.

Probleme

Der in den Schutzansprüchen 1-6 angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, daß

• - eine Reihe herkömmlicher Verfahren nur qualitative bzw. semi-quantitative Messun­ gen des chemosensorischen Verhaltens zulassen, das quantitative Erfassen der Stärke der chemosensorischen Reaktion aber hinsichtlich biologischer, toxikologischer oder pharmokologischer Fragestellungen von entscheidender Bedeutung ist.
• - übliche Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Verhaltensreaktion mit relativ hohem Zeitaufwand verbunden sind, ein hohes Maß an technischer Laborausstattung voraussetzen und in der Handhabung kompliziert sind, so daß chemosensorische Tests nur von biologisch-technisch geschultem Laborpersonal durchgeführt werden können.
• - herkömmliche Verfahren zur quantitativen Bestimmung der chemosensorischen Re­ aktion kostenaufwendig sind und meist auf große Mengen an verfügbarem biologi­ schen Material angewiesen sind.

Aufgabenstellung

Den in den Schutzansprüchen 1-6 aufgeführten Merkmalen liegen also folgende Vor­ gaben zugrunde:

• - Das Verfahren soll eine quantitative Bestimmung des chemosensorischen Verhaltens in einem möglichst kurzen Zeitraum gewährleisten und damit die gesamte Test­ dauer zur spezifisch chemosensorischen Erfassung ökotoxischer Belastungen mittels Wimpertierchen abkürzen helfen.
• - Das Verfahren soll eine leichte, preiswerte sowie gleichzeitig präzise Durchführung chemosensorischer Tests auch außerhalb des Labors gewährleisten. Dies hält die Testkosten niedrig und erlaubt eine breite Anwendung des Verfahrens ohne beson­ dere technische Voraussetzungen sowie durch technisch nicht geschulte Personen.
• - Mit dem Verfahren soll eine Verringerung der Menge an notwendigem biologischen Ausgangsmaterial erreicht werden.

Lösung

Diese Probleme werden mit den in den Patentansprüchen 1 bis 6 aufgeführten Merk­ malen gelöst.

Erreichte Vorteile

Die mit der Erfindung erreichten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß

• - durch Verwendung gewöhnlicher Wattestäbchen als Trägermaterial der zu untersu­ chenden wäßrigen Probelösung die Kosten des Verfahrens sehr gering gehalten, die Bestimmung der chemosensorischen Reaktion auf einen sehr kurzen Zeitraum redu­ ziert sowie das biologische Ausgangsmaterial auf geringe Mengen beschränkt wer­ den kann: Die saugfähige Watte ermöglicht ein schnelles vollständiges Benetzen der Wattestäbchenenden mit Flüssigkeit. Zugleich erlaubt das faserige Baumwollma­ terial der Watte den Einzellern ein schnelles Eindringen in die mit Referenzlösung getränkte Watte (Kontrollprobe) sowie ein leichtes Auswaschen der in die Watte eingedrungenen Organismen. Wattestäbchen sind als Bedarfsartikel des täglichen Lebens praktisch überall sehr preiswert erhältlich. Die sehr gleichmäßige Beschaf­ fenheit von Wattestäbchen, wie sie z. B. im hygienischen und medizinischen Be­ reich Anwendung finden, bedeutet auch eine weitgehend identische Saugleistung der Watte und erlaubt damit eine hohe Meßgenauigkeit des Verfahrens. Durch Eintau­ chen der probegetränkten Wattestäbchen in Wimpertierchen-Suspension und daran anschließendes Auswaschen sowie Bestimmen der Anzahl der in die Watteenden ein­ gedrungenen Wimpertierchen in Relation zur Kontrollprobe kann eine quantitative Messung der chemosensorischen Reaktion innerhalb weniger Minuten ohne besonde­ ren apparativen Aufwand und von technisch nicht geschulten Personen durchgeführt werden.

Weitere Ausgestaltung der Erfindung

Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist in den Patentansprüchen 5 und 6 an­ gegeben. Die Weiterbildung nach den Patentansprüchen 1 bis 4 ermöglicht es, durch einfache Handgriffe

• - mehrere Wattestäbchenenden simultan mit der Referenzlösung (Kontrolle) sowie verschiedenen Probelösungen bzw. Konzentrationen der Probelösung zu benetzen,
• - die Wattestäbchen gemeinsam und ohne Kontakt mit den Behältnissen der Lösungen paßgenau in jeweils getrennte Behältnisse mit Wimpertierchen-Suspension überfüh­ ren und
• - anschließend die Wattestäbchenenden in einem Arbeitsgang getrennt auswaschen zu können.

Ausführungsbeispiel

Erfindungsgemäß hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, die Wattestäbchen mit Hilfe eines Abstandshalters in eine Halterung mit seitlichen Führungsstiften einzusetzen und diese Halterung auf eine 48-well-Mikrotiterplatte aufzustecken, wobei die Führungs­ stifte der Halterung paßgenau in die seitlichen Vertiefungen der Mikrotiterplatte einge­ bracht werden.

In den anliegenden Fig. 1 bis 2 ist die erfindungsgemäße Vorrichtung dargestellt und wird im folgenden näher beschrieben.

Fig. 1 zeigt das Einsetzen der Wattestäbchen (1) in die Ausfräsungen (5) der Watte­ stäbchen (1) -Halterung (3) mit Hilfe eines Abstandshalters (6). Drei Wattestäbchen (1) liegen bereits am Rand des Abstandshalters (6) an. Ihre Enden (2) werden um genau die Tiefe (8) der Aussparungen (7) des Abstandshalters (6) von den Führungsstiften (4) der Wattestäbchen (1) -Halterung (3) überragt.

Fig. 2 schematisiert die Meßvorrichtung im zusammengesetzten Zustand, bestehend aus Wattestäbchen (1), Wattestäbchen(1) -Halterung (3) und 48-well-Mikrotiterplatte mit 6 Reihen (A-F) á 8 Vertiefungen (10) als Bodenplatte (9). (a) Querschnitt, (b) Draufsicht.

Es folgt die Erläuterung der Erfindung anhand der Zeichnungen nach Aufbau und Wirkungsweise der dargestellten Erfindung.

Die Halterung 3 wird zum Einsetzen der Wattestäbchen 1 an einen Abstandshalter 6 mit seitlichen Aussparungen 7 gelegt, so daß beide Führungsstifte 4 in den Aussparungen 7 an den Abstandshalter 6 anstoßen. Die Wattestäbchen 1 werden auf die Ausfräsun­ gen 5 der Halterung 3 aufgelegt und ebenfalls bis an den Rand des Abstandshalters 6 geschoben. Alle Wattestäbchenenden 2 werden damit in gleichem Maße - um die Tiefe 8 der Aussparungen 7 des Abstandshalters 6 - von den Führungsstiften 4 der Halterung 3 überragt. Hierdurch wird erreicht, daß die Wattestäbchenenden 2 nach Aufstecken der Halterung 3 auf die Bodenplatte 9 gleichmäßig tief eintauchen, den Boden 11 der Vertie­ fungen 10 nicht berühren und beim Umsetzen der Halterung 3 nicht in Kontakt mit der Bodenplatte 9 kommen können. Durch leichtes Andrücken werden die Wattestäbchen 1 in die Ausfräsungen 5 der Halterung 3 geklemmt.

Die mit Wattestäbchen 1 bestückte Halterung 3 wird nun senkrecht auf die 48-well- Mikrotiterplatte 9 aufgesteckt, wobei die Führungsstifte 4 der Halterung 3 paßgenau in die seitlichen Vertiefungen 10 der Mikrotiterplatte 9 eingebracht werden können und so ein leichtes Verbinden beider Teile ermöglichen. Zuerst werden die Wattestäbchenenden 2 mit der Referenzlösung und den Probelösungen, die sich in Reihe A der Vertiefungen 10 befinden, vollständig getränkt. Bereits nach wenigen Sekunden kann die Halterung in Reihe B der Vertiefungen 10 umgesetzt werden. In Reihe B befindet sich die Zellsus­ pension. Hier können die Wimpertierchen auf die Lösungen in den Wattestäbchenenden 2 chemosensorisch reagieren und innerhalb weniger Sekunden entweder in die faserige Struktur der Watte eindringen oder mit einer Meide- und Fluchtreaktion gegenüber der Probelösung in der Watte antworten. In der Folge einer Flucht- und Vermeidungsreaktion befinden sich im Vergleich zur Referenzlösung der Kontrollprobe weniger Organismen in der Watte der Wattestäbchen.

Zum Auswaschen der in die probegetränkte Watte eingedrungenen Organismen wer­ den die Wattestäbchen 1 mit Hilfe der Halterung 3 in Reihe C der Bodenvertiefungen 10 umgesetzt. Durch mehrmaliges Auf- und Abwärtsbewegen der Halterung 3 lassen sich die Einzeller in die mit Waschlösung gefüllte Reihe C der Bodenvertiefungen 10 überführen. Die Zahl der Zellen pro Vertiefung kann nun als Maß für die Stärke des chemosensori­ schen Verhaltens herangezogen werden. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgt hierbei in bekannter Weise, beispielsweise durch direkte oder indirekte photometrische Messung, durch elektronische Zellzählung oder durch mikroskopische Zählung fixierter Zellen.

Durch Drehen der Wattestäbchen-Halterung 3 um 180° und Verwendung der Reihen D bis F der 48-well-Mikrotiterplatte 9 kann der gesamte Testlauf ein zweites Mal mit neuen Lösungen und den noch unbenutzten Wattestäbchenenden durchgeführt werden.

Durch Verwendung handelsüblicher 48-well-Mikrotiterplatten als Bodenplatte 9 und Behältnis für die wäßrigen Lösungen (Probelösung, Zellsuspension, Waschlösung) kann für diesen Bestandteil der Meßvorrichtung auf einen sehr preiswerten Laborartikel zurückge­ griffen werden. 48-well-Mikrotiterplatten bieten mit ihren 6 Reihen á 8 Vertiefungen eine große Aufnahmekapazität für eine Vielzahl von Proben. Das geringe Volumen der ein­ zelnen Vertiefungen 10 gewährleistet zudem ein vollständiges Eintauchen der mit Watte umwickelten Wattestäbchenenden 2 bereits bei kleinen Einfüllmengen und hilft so die Menge an biologischem Ausgangsmaterial gering zu halten.

Claims (7)

1. Verfahren und Vorrichtung zur Ermittlung der Umweltbelastung durch Chemikalien in wäßrigen Proben mit Bioindikatoren, dadurch gekennzeichnet, daß

• - standardisierbare Bioindikatoren in Form von Wimpertierchen in Reinkultur eingesetzt werden, mit dem Ziel, eine vorhandene Toxizität auch unbekannter und niedriger Schadstoffkonzentrationen anhand der chemosensorischen Reak­ tion der Testorganismen nachzuweisen,
• - die chemosensorische Reaktion exponierter Testorganismen im Vergleich zu nichtexponierten Testorganismen (Kontrollproben) ermittelt wird,

wobei gilt, daß

• (a) das Watteende (2) von Wattestäbchen (1) mit der wäßrigen Probelösung bzw. der wäßrigen Lösung eines zu untersuchenden Stoffes oder Stoffgemisches voll­ ständig getränkt wird,
• (b) suspendierte Wimpertierchen dem Wattestäbchenende (2) exponiert werden,
• (c) anschließend die in die Watte eingedrungenen Wimpertierchen ausgewaschen werden, und
• (d) ihre Zahl in an sich bekannter Weise gemessen und zur Bestimmung der Um­ weltbelastung durch Chemikalien herangezogen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Expositionszeitraum (Verfahrensschritt b) jeweils gleich bemessen ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Wattestäbchenende (2) vollständig sowie gleichmäßig tief in die Wimpertierchen-Suspension eintaucht (Verfahrensschritt b) und gemäß den Verfahrensschritten a bis c nur mit dem jewei­ ligen wäßrigen Medium (Probelösung, Wimpertierchen-Suspension, Waschlösung) und nicht mit den Behältern für diese Medien in Berührung kommt.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Verfah­ rensschritte a bis c simultan mit mehreren Probelösungen bzw. Schadstoffkonzen­ trationen und gemeinsam mit der Kontrollprobe durchgeführt werden, um das to­ xikologische Potential einer größeren Anzahl von Proben gleichzeitig erfassen und Konzentrations-Wirkungsbeziehungen simultan ermitteln zu können, wobei die Be­ stimmungen mit dem gleichen Kulturansatz erfolgen.

5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 - 4, gekenn­ zeichnet durch

• - eine Bodenplatte (9) mit in drei Reihen angeordneten, oben geöffneten Kam­ mern (10) zur Aufnahme der Lösungen, wobei die Kammern (10) der ersten Reihe jeweils mit den Probelösungen sowie der Kontrollprobe, die Kammern (10) der zweiten Reihe mit Wimpertierchen-Suspension und die Kammern (10) der dritten Reihe mit Waschlösung gefüllt sind, und
• - eine auf die Bodenplatte (9) aufsetzbare Wattestäbchen (1) -Halterung (3).

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mittel zwischen Wattestäbchen (1) -Halterung (3) und Bodenplatte (9) zum senkrechten Führen der Wattestäbchen (1) in und aus den Lösungen sowie zum selektiven Fixieren der Positionen der Wattestäbchen (1) in den Lösungen gemäß den Verfahrensschritten a-c wirksam ist.