DD287276A5 - Verfahren zur toxikologischen in-vitro-untersuchung von inhaltsstoffen waessriger loesungen bzw. von wassergeloesten reinsubstanzen unter verwendung von zellinien - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur toxikologischen in-vitro-Untersuchung von Inhaltsstoffen waeszriger Loesungen bzw. von wassergeloesten Reinsubstanzen unter Verwendung von Zellinien. Sie schreibt ein toxikologisches in-vitro-Verfahren zur Bestimmung der Wirkung von wasserloeslichen Xenobiotika, z. B. von Wasserschadstoffen oder Pharmazeutika, auf tierische oder menschliche Zellen und zur Einschaetzung des Gesundheitsrisikos fuer den Menschen. Sie findet Anwendung in der Umwelttoxikologie, fuer das Umweltmonitoring und in der toxikologischen Produktenpruefung. Erfindungsgemaesz wird die damit verbundene Aufgabenstellung dadurch geloest, dasz nach einer Inkubation von Zellkulturen mit den die Untersuchungsproben enthaltenden Kulturmedien ein in diesen Kulturen vermehrungsfaehiger Virusstamm aufgebracht wird. Unter normierten Bedingungen wird der Wert der Virusvermehrungshemmung als Ausdruck der Zytotoxizitaet bestimmt.{Umwelttoxikologie; Umweltmonitoring; toxikologische Produktenpruefung; Xenobiotika; Wasserschadstoffe; toxikologisches in-vitro-Verfahren; Zytotoxizitaet; Zellkulturen; tierische oder menschliche Zellen; Viren; Virusvermehrung}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung! ist einsetzbar auf den Gebieten der Umwelttoxikologie, des Umweltmonitorings und der Produktenprüfung. Insbesondere ist die Methode geeignet zur Untersuchung und Überwachung der Qualität von Wasservorkommen (Oberflächen-, Grund- und Bodenwasser sowie Uferfiltrat) und zur Einschätzung des Gesundheitsrisikos von industriellen, landwirtschaftlichen und kommunalen Abwässern für den Menschen. Bei Inbetriebnahme bzw. während des Betriebes von Kläranlagen und Trinkwasseraufbereitungswerken kann mittels der erfindungsgemäßen Methode eine Überprüfung der Leistungsparameter aus toxikologischer Sicht vorgenommen werdon. Weiterhin eignet sich die Erfindung zur toxikologischen Prüfung von Pharmazeutika sowie Produkten und Zwischenprodukten der chemischen Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Toxikologischen Untersuchungen von Xenobiotica bezüglich ihrer Wirkung auf den Menschen werden in zunehmendem Maße nicht mehr ausschließlich Im Tierexperiment an Nagern durchgeführt. Die Vorteile alternativer Verfahrensweisen sind bekannt (Halle, W.: Grundlagen der Zytotoxizität in vitro und ihre Bedeutung für die toxikologische Prüfung von Antiseptika. In: A. Kramer, G.Berneciu: W.Weuffen (Hrsgb.): Handbuch der Antiseptik 1/5. VEB Verlag Volkund Gesundheit, Berlin 1985, S.84-112) Insbesondere gilt dies für toxikologische Untersuchungen in Umweltmedien, vor allem in Wasservorkommen, aber auch für den Einsatz in der Produktentestung (Pharmazie, Industrietoxikologie). Vor allem für die toxikologische Untersuchung von Wasserproben wurden jedoch bisher überwiegend Verfahren angewandt, die verschiedenste Wasserorganismen (z.B. Wasserbakterien, Algen, Kleinkrebse, Fische) als Testobjekte verwenden. Die dabei gewonnenen Resultate ergeben eine Aussage zur möglichen Beeinträchtigung des ökologischen Gleichgewichtes bezüglich der Wasserpflanzen und -tiere biw. zur Beeinflussung des bakteriellen Selbstreinigungsvermögens des Gewässers, erlauben jedoch keine direkten Schlußfolgerungen auf das Gesundheitsrisiko für den Menschen.

Im Gegensatz dazu konnte bei Verwendung tierischer Zellkulturen ein hoher Korrelationsgrad der im Zellkulturtest erhaltenen Resultate im Vergleich zu den im konventionellen Tierversuch erzielten Ergebnissen nachgewiesen werden (Patentschrift DD 241750 C2). Für den dem vorgenannten Patent zugrunde liegenden Test wurde eine Kälbernortenzelliniefürdie Bestimmung der allgemeinen Zytotoxizität in vitro verwendet. Dabei kam serumarmes Medium zum Einsatz. Durch einen bestimmten Auswertungsmodus konnte eine gute Korrelation zwischen den in vitro erzielten Meßgrößen (IC₆₀ - 50%lge Inhibitionskonzentration/in mol pro Liter Medium) und den in vitro erhältlichen Daten (LD₆C = S0%ig letale Dosis/in mol pro Kilogramm Körpermasse des Versuchstieres) erreich', werde::, wobei der Zellkulturtest bezogen auf die angegebenen Maßeinheiten um zwei Größenordnungen empfindlicher war.

Wesentliche Nachteile der im angeführten Patent verwendeten Variante des Zellkulturproliferationstests (vgl. a. Halle, W., S. B. Savoly, G. Herder, W.-E. Siems u. T. Rösner: Zur Wirkung von Corpus-Iuteum-Präparationen auf die Proliferationskinetik von Endothelzellen aus Kälberaorten in der Zellkultur. Act blol. med. germ. 4) sind:

- Es bestehen noch Möglichkeiten einer Empfindlichkeitssteigerung, welches für die geplante Verwendung des Verfahrens (Auffinden gering foxischer Stoffe, vor allem in Umweltmedien) bedeutsam ist.

- Für eine Einschätzung des Gesundheitsrisikos für den Menschen ist die Verwendung einer tierischen Zellkultur noch nicht optimal.

- Bei der Ergebnisauswertung Ist eine Charakterisierung der Konzentration der Inhaltsstoffe einer Wasserprobe durch die Molarität nicht möglich, da es sich hier um ein Stoffgemisch unbekannter Zusammensetzung handelt.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist ein toxikologisches In-vitro-Verfahren, daß bei der Untersuchung gering toxischer wäßriger Lösungen bezüglich des Gesundheitsrisikos für den Menschen eine höhere Aussagekraft besitzt.

Darlegung dos Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist die Erhöhung der Empfindlichkeit des Tests gegenüber dem bekannten Stand der Technik sowie die Bestimmung der relativen Toxizität von gelösten Stoffgemischen (bezogen auf ihre Konzentration). Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß mit den zu untersuchenden wäßrigen Lösungen nach Sterilfiltration bzw. Antibiotika- und Antimykotikazugabe sowie einer eventuell notwendigen Korrektur von pH-Wert und einer Überprüfung der Salzkonzentration (Einhaltung der Isotonie) ein Kulturmediumkonzentrat auf die Normalkonzentration verdünn! wird oder daß in die vorbereitete Probe die Mediumbestandteile als Trockensubstanzen eingewogen werden. Die erhaltenen Testmedien und mit bidestilliertem Wasser hergestellte Kontrollmedien werden mit Kulturen einer vorzugsweise menschlichen Zellinie in Kontakt gebracht und inkubiert. Um die Empfindlichkeit des Zytotoxizitätstests gegenüber dem bekennten Stand zu steigern, wird als originäre erfindungsgemäße Lösung die zeMspezifische Fähigkeit zur Virusvermehrung als Indikator der Zelltoxität benutzt, so daß zusätzlich zur bekannten Hemmung der Zeilproliferation die Beeinträchtigung der Vermehrung eines nachträglich auf die geschädigte Kultur aufgebrachten Virusstammes zur Wirkung kommt.

Die Vermehrung von Zellen ist ein komplexer Prozeß, der einer Vielzahl von schädigenden Noxen Angriffspunkte bietet. Ebenso wird bei der Vermehrung von Viren, insbesondere von solchen, die sich im Zellkern vermehren, die Leistung aller Zellkompartimente gefordert, was wiederum toxischen Substanzen Einflußmöglichkeiten verschafft. Bei der Bestimmung der Virusmehrungshemmung gegenüber einer unbeeinflußten Kontrolle nach Ablauf der Inkubationszeit wird das Produkt aus beiden genannten Effekten erfaßt. Als Maß der zytotoxischen Einflüsse wird die Hemmung der Virusvermehrung H_y nach der Beziehung

H_v = IUO -

berechnet.

Der erwünschte Effekt wird erreicht durch den Einsatz der aus dem menschlichen Amnion stammenden FL-Zellinie und det> sich

auf dL-er Zellinie vermehrenden Virusstammes Adenovirus 5.

Durch das Mitführen von Positivkontrollen kann eine Normierung der Ergebnisse vorgenommen werden, so daß die Resultate

unterschiedlicher Versuchstage unter Ausschluß systematischer Fehler gut vergleichbar sind.

Die Einordnung der relativen toxischen Wirkungen von Substanzgemischen erfolgt erfindungsgemäß auf der Basis von

mengenäquivalenten Summenparametern (CSVc₁, TOC), wodurch ein sinnvoller Veigleich zwischen derartigen Proben verschiedener Herkunft erst möglich wird.

Vorteile des orfindungsgemäßen Verfahrens sind:

- erhöhte Empfindlichkeit durch Erfassung der Zeil- und der Virusvermehrungshemmung

- bessere Aussagemöglichkeit für das menschliche Gesundheitsrisiko durch die Verwendung einer menschlichen statt einer tierischen Zellinie

- Möglichkeit, die Auswertung nicht sofort vornehmen zu müssen, da die Test- bzw. Kontrollkulturen nach Abschluß der Inkubationszeit bis zur quantitativen Bestimmung der Viruskonzentration eingefroren gelagert werden können τ Vorhandensein erprobter und rationeller virologischer Bestimmungsverfahren (Mikromethoden)

- Möglichkeit, durch die Verwendung der Werte für den CSVo (chemischer Sauerstoffverbrauch/Chromat) oder den TOC (Gesamter organischer Kohlenstoff) anstelle der Molarität die konzentrationsunabhängige relative Zytotoxizität auch für Lösungen unbekannter Zusammensetzung und solche aus mehreren verschiedenen Substanzen bestimmen zu können.

Ausführungsbeispiele

1. Toxikologische Untersuchung einer Waiserprohe

In Vorbereitung des Tests werden in die zu untersuchende Wasserprobe die Mediumbestandteile (10% Medium 199 nach Parker: 90% Laktalbuminhydrolysst) trocken eingewogen, so daß der Anteil der Probe an der Gesamtflüssigkeit 100% beträgt. Das Medium darf nur 1 bis 2 % Serum enthalten und muß bei geschlossener Inkubation mit der Salzmischung nach Hanks, bei offener Kultur in einer CO₂-Atmosphäre mit der Salzlösung nach Earle gepuffert sein.

Eine andere Variante besteht darin, daß ein Mediumkonzentrat (Wassergehalt a 20% des Normalgehaltes) so mit der zu untersuchenden Wasserprobe verdünnt wird, daß der für die Zellkultivierung erforderliche Gesamtwassergehalt eingehalten wird. Der Gehalt der Wasserprobe an der Gesamtflüssigkeit beträgt dann folglich :s 80%. Um eine mikrobielle Kontamination des Zellzuchtmediums zu verhindern, wird die Wasserprobe zuvor entweder mittels eines geeigneten Filters sterilfiltriert oder mit einer ausreichenden Menge Antibiotika und Antimykotika versetzt. Außerdem muß bei stärker salzhaltigen Proben die Erhöhung des osmotischen Drucks geprüft und erforderlichenfalls korrigiert werden. Für beide Varianten wird parallel dazu ein Kontrollmedium - unter Verwendung von bidestilliertem Wasser anstelle der Wasserprobe - hergestellt.

Bei Notwendigkeit, ζ. B. bei stark toxischen Wasserproben und zur exakten Bestimmung der IC₆₀ (d.i. die 50%ige Inhibitionskonzentration einer Probe in der Zellkultur), müssen von den Wasserproben Verdünnungen (minimal 3 Stufen) mit bidestilliertem Wasser angelegt werden.

Anschließend wird die vom menschlichen Amnion stammende FL-Zellinie durch die bekannten Verfahren in eine Suspension von Einzelzellen überführt, die eine hohe Zellzahl pro Volumeneinheit aufweist. 1 Teil dieser Suspension wird mit 9 Teilen des die zu untersuchende Wasserprobe enthaltenden Mediums bzw. mit Kontrollmedium gemischt und in die Kulturgefäße eingebracht. Dabei ist die zu erreichende Endkonzentration der Zellen im Medium abhängig vom Zeitregime des Versuches und von anderen Kulturbedingungen. Eine andere Variante besteht darin, bei jungen, bereits angewachsenen Zellkulturen (ca. 24 Stunden alt), die sich noch am Beginn der logarithmischen Wachstumsphase befinden, das Wachstumsmedium gegen das die zu untersuchende Wasserprobe enthaltend» Medium bzw. Kontrollmedium auszutauschen. Wie auch bei der ersten Variante müssen pro Probe und Verdünnung bzw. pro Kontrollkultur mehrere Parallelansätze (optimal 5 bis V) angelegt werden.

Bei beiden Varianten schließt sich daran eine ca. 24stündige Inkubation an. Danach wird unter sterilen Bedingungen das Medium von dan Kulturen entfernt und für jeden Ansatz getrennt aufbewahrt. Anschließend wird in jede Kultur eine genau definierte Menge der Suspension eines Virusstammes eingebracht, zu dessen Vermehrung die verwendete Zellkultur befähigt ist (z.B. Adenovirus 5 bei Verwendung der FL-Zellinie). Nach einer Inokulationszeit von 2-4 Stunden (abhängig von Zellinie und Virusstamm) wird das aufbewahrte Medium wieder aufgebracht. Die Menge der Viruspartikel muß so bemessen sein, daß nach Abschluß der darauffolgenden Inkubationszeit in den Kontrollkulturen eine maximale Virusvermehrung erfolgt ist. Die Dauer der Inkubation bis zur Testauswertung wird von den Vermehrungseigenschaften des benutzten Virusstammes in der zugehörigen Zellinie bestimmt (3 Tage für den Stamm Adenovirus 5 in der FL-Zellinie). Nach Beendigung der Inkubationszeit werden alle Kulturen zwecks vollständiger Virusfreisetzung durch einen (mindestens dreimaligen) Frier-Tau-Prozeß aufgeschlossen. Danach wird durch die an sich bekannten Verfahren die Viruskonzentration in jedem Parallolansatz bestimmt (Chang, S. L., G.Berg, K. A. Busch, R. E. Stevenson, N. A. Clarke u. P.W. Kabler: Application of the .Most Probable Number" method for estimating of animal viruses by the tissue technique. Virology β [1958] S. 27-42)

Die Hemmung der Virusvermehrung H, in einem Versuchsansatz im Verhältnis zum Kontrollansatz ergibt sich aus folgender Beziehung:

f * 1

H = 100 - —ι — * 100 I K J

Hv = Hemmung der Virusvermehrung V = arithmetisches Mittel aller Parallelen eines Versuchsansatzes R = arithmetisches Mittel aller Parallelen des Kontrollansatzes Für die notwendigen zufallskritischen Untersuchungen kommt ein parameterfreior Signifikanztest (z. B. Rangsummentest) zum Einsatz. Bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von S 5% werden die beobachteten Differenzen zwischen R und V als signifikant

angesehen.

Zum Ausschluß von systematischen Fehlern für eine sichere Ergebnisreproduktion bei Wiederh olung des Tests ist in jedem Fall

eine Positivkontrolle mitzuführen, die analog zu Versuchs· und Kontrollansätzen behandelt wird. Als Positivkontrollen können bekannte Wasserschadstoffe (z. B. Phenol) in Reinsubstanz und definierter Konzentration dienen, deren

Virusvermehrungshemmung in Vorversuchen bestimmt wurde. In der Art eines Standards werden diese Positivkontrollen in

jedem Test zur Normierung der Resultate eingesetzt.

Zur Ermittlung der relativen Toxizität einer untersuchten Wasserprobe (Bestimmung der 50%igen In'iibitionskonzentration IC_M)

let es in Abweichung von dem an sich bekannten Verfahren (Patentschrift DD 241750 C2) erforderlich, zur Erfassung der Menge der Wasserinhaltsstoffe sich auf solche Summenparameter wie den Chemischen Sauerstoffverbrauch /Chromat (CSVc₁) oder den Gesamten organischen Kohlenstoff (TOC) zu beziehen, da der Bezug auf dio Molarität wegen des Vorliegens eines unbekannten Stoffgemisches nicht möglich ist.

2. Toxikologische Untersuchung von Wasserschadstoffen In Reinsubstanz, Pharmazeutlka u.a. chemischen Produkten bzw. Zwischenprodukten

Bei der toxikologischen Untersuchung von Produkten der pharmazeutischen und chemischen Industrie, darunter auch Wasserschadstoffen, wird das Im Ausführungsbeispiel 1 angegebene Verfahren modifiziert angewandt. Die zu untersuchenden Reinsubstanzen werden im ersten Verfahrensschritt als Trockensubstanzen in das fertige Medium eingewogen. Alle weiteren Schritte erfolgen wie unter 1. angegeben. Die abschließende Berechnung der relativen Toxizität (als IC_M) wird jedoch unter Bezug auf die Molarität vorgenommen. Aus den ermittelten normierten Werten für die untersuchten Reinsubstanzen wird ein Katalog der Zytotoxizität erstellt.

Claims (5)

1. Verfahren zur toxikologischen In-vitro-Untersuchung von Inhaltsstoffen wäßriger Lösungen bzw. von wassergelösten Reinsubstanzen unter Verwendung von Zellinien, gekennzeichnet dadurch, daß mit den zu untersuchenden Proben hergestellte Kulturmedien auf tierische oder menschliche Zellinien einwirken, aufweiche nach einer Inkubationszeit zellspezifische V'ren aufgebracht werden, deren Vermehrungshemmung in einer weiteren Inkubationszeit gegenüber einem Kontrollansatz als Maß der Zytotoxizität der untersuchten Proben und ihres Gesundheitsrisikos für den Menschen bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Zellinie die aus dem menschlichen Amnion stammende FL-Zellinie und als Virusstamm der auf dieser Zellinie sich vermehrende Stamm Adenovirus 5 verwendet werden.

3. Vorfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Vermehrungshemmung nach der Beziehung

f * Ί

H = 1.00 - —ξ— * 100

t κ J

ermittelt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß durch Mitführen einer Substanz bekannter Zytotoxizität, die als Positivkontrolle in der Funktion eines Standards fungiert, eine Normierung im mathematischen Sinn für die Werte der Vermehrungshemmung realisiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß bei Proben mit mehreren verschiedenen Inhaltsstoffen bzw. unbekannter Zusammensetzung als Bezugswert für die relative Zytotoxizität nicht die Molarität, sondern die Werte für den CSV_Cr oder den TOC verwendet werden.