DE10164358A1

DE10164358A1 - Charakterisierungsverfahren für funktionalisierte Oberflächen

Info

Publication number: DE10164358A1
Application number: DE10164358A
Authority: DE
Inventors: Christoph Gauer
Original assignee: Advalytix AG
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2001-12-28
Publication date: 2003-07-10
Anticipated expiration: 2021-12-29
Also published as: AU2002352246A1; WO2003056334A3; DE10164358C2; WO2003056334A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung einer zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit funktionalisierten Untersuchungsoberfläche, bei der ein Teilbereich der Oberfläche eines Festkörpers, vorzugsweise eines Festkörperchips, wobei der Teilbereich für eine Reaktion mit einer Probenflüssigkeit funktionalisiert ist, mit einem Tropfen einer Sondenflüssigkeit in Berührung gebracht wird, wobei die Tropfengröße vorzugsweise so ausgewählt ist, daß der Tropfen auf dem funktionalisierten Teilbereich der Oberfläche derart durch seine Oberflächenspannung zusammengehalten wird, daß seine Berührungsfläche etwa der Fläche des funktionalisierten Bereiches entspricht, und die Sondenflüssigkeit derart präpariert ist, daß eine Bindung der Sondenflüssigkeit bzw. darin enthaltenen Materials mit dem funktionalisierten Oberflächenteilbereich stattfinden kann, und ein Parameter, der sich mit der Bindung der Sondenflüssigkeit bzw. darin enthaltenen Materials mit dem funktionalisierten Teilbereich der Oberfläche ändert, gemessen wird, während der Tropfen der Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Teilbereich der Oberfläche in Berührung ist und/oder nachdem der Tropfen der Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Teilbereich der Oberfläche in Berührung war.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung einer zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit funktionalisierten Untersuchungsoberfläche.

In der Chemie oder Biologie muß häufig die Reaktionskinetik zwischen zwei Molekülsorten untersucht werden, von denen eine an einer Oberfläche gebunden ist und die zweite sich in Lösung befindet. Ebenso besteht häufig der Wunsch, die Konzentration von Molekülen an einer Oberfläche zu bestimmen, die für eine Bindung mit anderen Molekülen zur Verfügung stehen, die sich in Lösung befinden. Insbesondere bei sogenannten DNA-Arrays oder Proteinarrays ist eine quantitative Auswertung der Ergebnisse nur eingeschränkt möglich, da im allgemeinen unbekannt ist, wie viele an der Oberfläche gebundene Moleküle für die Bindung mit in Lösung befindlichen Molekülen zur Verfügung stehen.

Bei bekannten Techniken wird zur Bestimmung der Konzentration von an einer Oberfläche z. B. in einem Array gebundenen Molekülen z. B. Ellipsometrie oder spektroskopische Methoden eingesetzt. Mit Hilfe der Ellipsometrie wird die Schichtdicke bzw. die Änderung der Schichtdicke gemessen. Kennt man andererseits die Schichtdicke der Moleküllage, so läßt sich aus der gemessenen Dicke der Bedeckungsgrad der Oberfläche bestimmen. Mit Hilfe spektroskopischer Methoden kann man molekülspezifische Resonanzen quantitativ auswerten, um so den Bedeckungsgrad der Oberfläche zu bestimmen. Die bekannten Methoden haben jedoch den Nachteil, daß der Bedeckungsgrad nur eine obere Grenze für die Zahl der tatsächlich auch für eine weitere Bindung zur Verfügung stehenden Moleküle angibt. So können z. B. sterische Gründe dafür verantwortlich sein, daß nur ein Bruchteil der an der Oberfläche befindlichen Moleküle für eine Bindung mit weiteren z. B. in einer Lösung aufgebrachten Molekülen zur Verfügung steht.

Mit anderen Verfahren läßt sich nicht nur die Zahl der an der Oberfläche gebundenen Moleküle bestimmen, sondern auch noch deren Aktivität, d. h. wie viele der Moleküle für eine Bindung mit anderen Molekülen, die in einer Lösung auf die Oberfläche aufgebracht werden, zur Verfügung stehen. US 5,064,619 beschreibt ein Verfahren, das unter Ausnutzung der Oberflächenplasmonresonanz die Änderung des Winkels der Totalreflexion mißt, die durch die Bindung von sogenannten Sondenmolekülen an den an der Oberfläche bereits gebundenen Probenmolekülen hervorgerufen wird. In der Regel sind dabei die Probenmoleküle an einer Goldoberfläche gebunden. Bei diesem Verfahren des Standes der Technik wird nicht direkt die Anzahl der Moleküle bestimmt, da die Änderung der Oberflächenplasmonresonanz und damit die Änderung des Winkels der Totalreflexion von der Änderung der elektronischen Umgebung der Goldoberfläche abhängt. Diese wird jedoch nicht nur durch die Zahl der gebundenen Moleküle, sondern auch durch ihre elektronischen Eigenschaften bestimmt.

Andere Verfahren bedienen sich der Tatsache, daß sich durch eine Änderung des Bedeckungsgrades der Oberfläche mit Probenmolekülen die mechanischen Eigenschaften des Substrates ändern. US 5,130,257 beschreibt den Einsatz piezoelektrischer Substrate, die mit Oberflächenwellen angeregt werden, während sie sich in einer Lösung befinden. US 5,719,324 beschreibt die Verwendung von sogenannten Micro-Cantilevern, während US 5,552,274 dünn geschliffene Schwingquarze als Detektor einsetzt. Dabei wird die Änderung der Resonanzfrequenz der Oberflächenschallwelle, des Micro-Cantilevers bzw. des Schwingquarzes durch den zusätzlichen Massebelag der gebundenen Probenmoleküle gemessen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren anzugeben, mit dem es möglich ist, auf einfache Weise und mit geringem Materialaufwand die Menge und/oder Art von an einer funktionalisierten Oberfläche für eine Bindung zur Verfügung stehenden Molekülen bestimmen zu können bzw. die Reaktionskinetik solcher Moleküle mit in einer Lösung befindlichen Molekülen anzugeben.

Diese Aufgabe wird mit einem Charakterisierungsverfahren mit den Merkmalen des Anspruches 1 gelöst. Die Unteransprüche sind auf vorteilhafte Ausgestaltungen gerichtet.

Erfindungsgemäß wird ein Tropfen einer Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Bereich einer Festkörperoberfläche in Kontakt gebracht. Die Tropfengröße der Sondenflüssigkeit wird dabei vorzugsweise derart gewählt, daß der Tropfen auf dem funktionalisierten Bereich der Oberfläche derart durch seine Oberflächenspannung zusammengehalten wird, daß seine Berührungsfläche etwa der Fläche des funktionalisierten Bereiches entspricht oder kleiner ist. Die Sondenflüssigkeit ist derart präpariert, daß eine Bindung der Sondenflüssigkeit oder darin enthaltenen Materiales mit dem funktionalisierten Oberflächenbereich stattfinden kann. Während der Berührung oder nach der Berührung wird zumindest ein Parameter überwacht, der sich mit der Bindung der Sondenflüssigkeit bzw. des darin enthaltenen Materiales mit dem funktionalisierten Teilbereich der Oberfläche ändert.

Je nach Anwendung kann die Sondenflüssigkeit reine Flüssigkeit, eine Mischung, eine Dispersion oder eine Suspension, sowie eine Flüssigkeit umfassen, in der sich feste Teilchen befinden. Insbesondere kann die Sondenflüssigkeit auch biologisches Material, wie z. B. Zellen, Makromoleküle, Proteine, Antikörper, Antigene oder DNA enthalten. Die durch die Präparation der Sondenflüssigkeit mögliche Bindung der Sondenflüssigkeit oder des darin enthaltenen Materiales mit dem funktionalisierten Oberflächenbereich kann eine spezifische Bindung und/oder eine Adhäsion umfassen. Der zu überwachende Parameter kann insbesondere ein physikalischer, ein chemischer oder ein biologischer Parameter sein. Für die Zwecke der vorliegenden Schrift bezeichnet der Begriff "Festkörper" sowohl Festkörper aus kristallinem Material, z. B. Lithiumniobat oder Quarz, als auch Strukturen aus anderen Materialien, z. B. Kunststoff.

Durch die erfindungsgemäße Verfahrensführung mit einem Tropfen ist weder ein Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche noch ein Eintauchen der Oberfläche in eine Flüssigkeit notwenig. Vorteilhafterweise wird die Tropfengröße so gewählt, daß die Berührungsfläche des Tropfens mit der Oberfläche etwa der Oberfläche eines funktionalisierten Teilbereiches entspricht. Auf diese Weise kann sehr präzise und exakt genau eine Funktionalisierung charakterisiert werden. Bei entsprechender Verfahrensführung können mit einem Tropfen aber auch mehrere funktionalisierte Oberflächenteilbereiche parallel untersucht werden. Gegebenenfalls kann durch Bewegung des Tropfens von einem funktionalisierten Teilbereich zum nächsten funktionalisierten Teilbereich auch eine serielle Untersuchung unterschiedlicher funktionalisierter Teilbereiche vorgenommen werden.

Ist der Tropfen der Sondenflüssigkeit ausreichend klein oder gering konzentriert, so kann aus der Änderung des Parameters auf die Menge der für eine Reaktion mit der Sondenflüssigkeit bzw. des darin enthaltenen Materiales zur Verfügung stehenden an der Oberfläche des funktionalisierten Teilbereiches befindlichen Moleküle geschlossen werden. Durch die Verwendung von einem Tropfen, der auf der freien Oberfläche ohne seitliche Wandberührung auf den funktionalisierten Teilbereich aufgebracht wird, läßt sich sehr lokal die entsprechende funktionalisierte Oberfläche untersuchen. Es ist nur wenig Material notwendig und die Sondenlösung kann hoch konzentriert sein, auch wenn nur wenig Material zur Verfügung steht. Die Volumina der Sondenlösung sind z. B. im Bereich von einem Pikoliter bis zu mehreren Mikrolitern. Eine typische Größe des funktionalisierten Teilbereiches ist z. B. 100 µm × 100 µm.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind aufgrund des kleinen Volumens der Tropfen die Reaktionszeiten sehr kurz, da die Diffusionslängen klein sind. Das Verfahren eignet sich aufgrund des geringen Stoffmengenverbrauches z. B. für die Qualitätssicherung für DNA- und Proteinchips oder für sogenannte ELISAs (enzyme-linked immunosorbent assays).

Um zu untersuchen, wie die Reaktion zwischen der Sondenflüssigkeit bzw. des darin enthaltenen Materiales mit den Probenmolekülen an dem funktionalisierten Teilbereich abläuft, wird das erfindungsgemäße Verfahren ein- oder mehrfach wiederholt und währenddessen bzw. zwischen den einzelnen Verfahrensschritten der beobachtete Parameter ausgelesen. Um Auskunft über die an dem funktionalisierten Teilbereich für eine Bindung zur Verfügung stehende Molekülanzahl, über die Gleichgewichtskonstante oder über die Anzahl der auf dem funktionalisierten Teilbereich befindlichen reaktiven Moleküle zu erhalten, wird eine kleine Menge Sondenflüssigkeit auf den funktionalisierten Teilbereich aufgebracht, der Parameter gemessen, dann eine weitere Menge der Sondenflüssigkeit aufgebracht. Diese Schritte werden ggf. mehrere Male wiederholt, um festzustellen, bei welcher Menge an Sondenflüssigkeit eine Reaktion stattfindet bzw. in welchem Maße.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren auf einem Festkörperchip durchgeführt, wie er z. B. aus der Halbleitertechnik bekannt ist. Solche Chips lassen sich mit bekannten Techniken sehr einfach prozessieren und erlauben die Aufbringung von z. B. Elektroden oder funktionalisierten Schichten mit bekannten lithographischen Techniken. Solche Chipeinheiten können im Rahmen der lab-on- the-chip-Technologie (vgl. O. Müller, Laborwelt 1/2000, Seiten 36-38) bei der Miniaturisierung chemischer und biologischer Prozesse eingesetzt werden. Auf einem solchen Chip können mehrere Analysestationen angeordnet sein, mit denen das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann, bzw. andere Analyseschritte vorgenommen werden können. Außerdem ist eine Integration mit anderen Einheiten eines lab-on-the-chip leicht realisierbar.

Der beobachtete Parameter kann z. B. die Leitfähigkeit, der pH-Wert, die Dämpfung einer Oberflächenschallwelle, die Ladung oder elektrische oder magnetische Eigenschaften sein. Besonders vorteilhaft läßt sich das Verfahren anwenden, wenn die Untersuchung des Parameters das Auslesen eines Markers umfaßt, der sich an Molekülen in der Sondenlösung befindet, und mit dem funktionalisierten Teilbereich der Oberfläche des Festkörpers eine Bindung eingehen kann, insbesondere eines Fluoreszenzmarkers oder radioaktiven Markers. Sondenflüssigkeit wird als Tropfen auf den funktionalisierten Teilbereich aufgebracht und z. B. bei Verwendung eines Fluorzeszenzmarkers die Fluoreszenz ausgewertet, die sich nach Entfernung der Sondenflüssigkeit zeigt. Auf diese Weise läßt sich Information über das an den Probenmolekülen gebundene Material der Sondenflüssigkeit erhalten.

Alternativ kann z. B. ein Farbumschlag ausgewertet werden, der bei einer Reaktion der Sondenflüssigkeit bzw. darin enthaltenen Materiales mit der funktionalisierten Oberfläche eintritt. Derartige optische Messungen können z. B. in Transmission oder Reflexion durchgeführt werden.

Soll eine spezifische Reaktion zwischen Material in der Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Teilbereich der Oberfläche untersucht werden, so kann nach der Berührung des Tropfens der Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Oberflächenbereich ein Waschschritt durchgeführt werden, um unspezifisch gebundenes oder durch Adhäsion haftendes Material der Sondenflüssigkeit zu entfernen, bevor die Auswertung des Parameters begonnen wird.

Bei einer anderen Verfahrensführung wird das Verfahren mehrfach wiederholt, bis man keine Zunahme des Signales an dem funktionalisierten Teilbereich mehr erhält, nachdem der Sondenflüssigkeitstropfen wieder entfernt worden ist. Bei bekannter Konzentration und Volumen der Tropfen mit der Sondenflüssigkeit kann aus einem Vergleich z. B. des Fluoreszenzsignales am funktionalisierten Teilbereich mit und ohne Tropfen auf die Zahl der gebundenen Moleküle geschlossen werden.

Wiederholt man das Verfahren sukzessiv für mehrere Tropfen mit verschiedenen Reaktionsparametern, so lassen sich aus den Ergebnissen u. a. z. B. die Gleichgewichtskonstante, die Reaktionsordnung, die Reaktionskinetik und die Konzentration der an der Oberfläche des funktionalisierten Teilbereiches befindlichen reaktiven Moleküle bestimmen. Als Reaktionsparameter kommen beispielsweise die Dauer je Reaktionsschritt, die Konzentration der Probe und die Reaktionstemperatur in Betracht.

Über die Reaktionskinetik der Sondenflüssigkeit bzw. des darin befindlichen Materiales mit der funktionalisierten Oberfläche läßt sich unter anderem durch die Messung der Reaktionswärme Information gewinnen.

Um die Reaktion zwischen Sondenflüssigkeit bzw. des darin enthaltenen Materiales mit der funktionalisierten Oberfläche zu befördern bzw. die auf dem funktionalisierten Teilbereich aufgebrachte Flüssigkeit zu durchmischen, wird während der Reaktion vorteilhafterweise eine Oberflächenschallwelle in Richtung des funktionalisierten Teilbereiches geschickt. Der Impulsübertrag einer Oberflächenschallwelle versetzt die Flüssigkeit auf der Oberfläche in Bewegung und führt zu deren Durchmischung. Der Impuls der Oberflächenschallwelle wird dabei durch die mechanische Deformation der Oberfläche oder durch die Wechselwirkung von durch die mechanische Deformation der Oberfläche hervorgerufenen Änderungen des elektrischen Feldes mit ggf. in der Flüssigkeit vorhandenen geladenen oder polarisierbaren Teilchen bewirkt.

Die Sondenflüssigkeit kann tropfenweise mit Hilfe eines Pipettierroboters oder Piezodispensers mit dem funktionalisierten Teilbereich in Verbindung gebracht werden. Besonders einfach und vorteilhaft ist es jedoch, wenn Tropfen der Sondenflüssigkeit auf der Festkörperoberfläche selbst in Richtung des funktionalisierten Teilbereiches bewegt werden. Die Bewegung des Sondenflüssigkeitstropfens in Richtung des funktionalisierten Teilbereiches kann ebenfalls mit Hilfe einer Oberflächenschallwelle ausgelöst werden. Die Bewegung auf der Oberfläche durch den Impulsübertrag einer Oberflächenschallwelle ermöglicht eine besonders gerichtete und definierte Bewegung. Die geeignete Frequenz der Oberflächenschallwelle hängt vom Durchmesser des zu bewegenden Tropfens ab und kann z. B. in Vorversuchen bestimmt werden.

Die zur Durchmischung der Flüssigkeit auf dem funktionalisierten Teilbereich und/oder zur Bewegung des Sondenflüssigkeitstropfens vorteilhafterweise eingesetzten Oberflächenschallwellen können mit Hilfe eines oder mehrerer Interdigitaltransducer auf einer piezoelektrischen Festkörperoberfläche erzeugt werden, deren Abstrahlrichtung der Richtung des gewünschten Impulsübertrages entspricht. Eine solche piezoelektrische Oberfläche kann z. B. aus einen Lithiumniobat- oder Quarzkristall gebildet sein. Ebenso kann auch eine piezoelektrische Beschichtung, z. B. Zinkoxid, auf einem anderen Material vorgesehen sein. Die Oberfläche kann auch mit einer ausreichend dünnen, vorzugsweise biokompatiblen Schutzschicht versehen sein. Allgemein ist die Verwendung von Interdigitaltransducern zur Erzeugung von Oberflächenschallwellen zur Bewegung von kleinen Flüssigkeitsmengen in DE-A-100 55 318 beschrieben.

In einfacher Ausgestaltung dieser bevorzugten Verfahrensführung wird ein Reservoirtropfen der Sondenflüssigkeit auf die Festkörperoberfläche aufgebracht, der aufgrund seiner Oberflächenspannung zusammengehalten wird. Aus diesem Reservoirtropfen wird ein kleinerer Sondenflüssigkeitstropfen abgezogen und dem funktionalisierten Teilbereich zugeführt, wobei sich die kleine Sondenflüssigkeitsmenge auf der Oberfläche bewegt.

Der als Reservoir dienende größere Sondenflüssigkeitstropfen, aus dem der kleine Sondenflüssigkeitstropfen abgezogen wird, der dem funktionalisierten Teilbereich zugeführt wird, kann sich auf einem Ankerpunkt auf der Oberfläche des Festkörpers befinden, der von der Sondenflüssigkeit besser benetzt wird als seine umgebende Festkörperoberfläche. Auf diese Weise wird sichergestellt, daß der größere Reservoirtropfen an einer bestimmten Stelle der Oberfläche verbleibt und diese ohne äußere Krafteinwirkung nicht verläßt.

Der Sondenflüssigkeitstropfen, der dem funktionalisierten Teilbereich zugeführt wird, kann vorteilhafterweise auf der Festkörperoberfläche entlang eines Pfades bewegt werden, wobei zumindest ein Teil seiner Oberfläche von der Sondenflüssigkeit besser benetzt wird als seine umgebende Oberfläche. Die Sondenflüssigkeit bewegt sich vorzugsweise auf diesem Pfad, so daß eine kontrollierte Bewegung sichergestellt ist. Ein solcher Pfad kann z. B. durch eine Modulation der Benetzungseigenschaften erreicht werden, wie sie zur Bewegung von Flüssigkeitsmengen auf Oberflächen in DE-A-100 55 318 beschrieben ist.

Zur Abteilung einer kleinen Menge der Sondenflüssigkeit von dem Reservoirtropfen auf dem Ankerpunkt kann der Reservoirtropfen auf dem Ankerpunkt über einen Pfad geführt werden, der mit dem Ankerpunkt verbunden ist, wobei die Verbindung einen Bereich umfaßt, der so schmal ist, daß der Reservoirtropfen auf dem Ankerpunkt aufgrund seiner Oberflächenspannung den Ankerpunkt ohne äußere Krafteinwirkung nicht verläßt. Wird durch äußere Krafteinwirkung der Reservoirtropfen auf diesem Pfad an diese Engstelle getrieben, so reißt er definiert ab.

Alternativ kann ein Reservoirtropfen, z. B. ebenfalls durch den Impulsübertrag von Oberflächenschallwellen, auf der Oberfläche über einen oder mehrere kleine Oberflächenteilbereiche bewegt werden, die von der Sondenflüssigkeit stärker benetzt werden als ihre Umgebung. Die Fläche eines solchen Oberflächenteilbereiches ist dabei so klein gewählt, daß sie kleiner als die Berührungsfläche des Tropfens mit der Oberfläche ist. Wird der Reservoirtropfen ein- oder mehrmals über einen solchen Oberflächenteilbereich geführt, verbleibt eine kleine Menge der Sondenflüssigkeit auf diesem Haltepunkt zurück und kann zu dem zu charakterisierenden funktionalisierten Teilbereich bewegt werden. So kann auf sehr einfache und reproduzierbare Weise eine kleine Sondenflüssigkeitsmenge abgeteilt werden.

Um zu verhindern, daß die kleine Sondenflüssigkeitsmenge zu schnell verdampft, wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Kontrolle der thermodynamischen Bedingungen vorteilhafterweise in einer Klimakammer durchgeführt.

Der Sondenflüssigkeitstropfen kann von dem funktionalisierten Teilbereich z. B. einfach durch Wegblasen mit Druckluft wieder entfernt werden. Besonders vorteilhaft läßt sich der Sondenflüssigkeitstropfen jedoch durch Applikation einer Oberflächenschallwelle entfernen, die derart gerichtet ist, daß ihr Impulsübertrag auf die auf dem funktionalisierten Teilbereich befindliche Sondenflüssigkeitsmenge zu deren Wegbewegung führt. Ebenso läßt sich ein ggf. durchzuführender Waschschritt zur Entfernung unspezifisch gebundenen Materiales durch Applikation einer Oberflächenschallwelle geeigneter Intensität erreichen.

Die Erfindung wird anhand besonderer Ausgestaltungen, die in den beiliegenden Figuren schematisch und nicht notwendigerweise maßstabsgetreu dargestellt sind, näher erläutert. Dabei zeigt:
Fig. 1 die Durchführung eines erfindungsgemäßen Charakterisierungsverfahrens,
Fig. 2 eine andere Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Charakterisierungsverfahrens, und
Fig. 3 einen Verfahrensschritt bei eine bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Charakterisierungsverfahrens.
Fig. 1 zeigt einen Festkörperchip, z. B. einen piezoelektrischen Lithiumniobatchip 5, auf dessen Oberfläche das erfindungsgemäße Charakterisierungsverfahren durchgeführt wird. Ein Tropfen 1 einer Sondenflüssigkeit in der Größenordnung von 0,5 nl bis 10 nl befindet sich auf einem funktionalisierten Teilbereich 15 der Oberfläche 7. Die angegebene Flüssigkeitsmenge eignet sich z. B. für einen funktionalisierten Teilbereich mit einer Fläche von z. B. 100 µm × 100 µm. Die Sondenflüssigkeit umfaßt z. B. Moleküle mit einem Marker (z. B. Fluoreszenz- oder Radioaktivitätsmarker) und ihre Konzentration in dem Tropfen wird im Vorhinein bestimmt. Die Volumina für den Sondenlösungstropfen liegen je nach Größe des funktionalisierten Bereiches im Bereich von einem Pikoliter bis zu mehreren Mikrolitern.
Der funktionalisierte Bereich 15 umfaßt z. B. eine Oberfläche, an der die Sondenflüssigkeit adsorbiert werden kann. Eine andere Anwendung umfaßt Makromoleküle als Probenmoleküle, die an dem funktionalisierten Teilbereich gebunden sind und für eine spezifische Bindung z. B. mit anderen Makromolekülen zur Verfügung stehen (z. B. für die DNA-Hybridisierung, Antigen-Antikörper-Reaktion u. a.). Die zu untersuchenden Probenmoleküle können z. B. durch einen Pipettierroboter oder einen Piezodispenser aufgebracht worden sein.
Auf einem Ankerpunkt 16 befindet sich ein Reservoirtropfen 3 der Sondenflüssigkeit. Der Ankerpunkt 16 ist derart ausgestaltet, daß er mit der Sondenflüssigkeit stärker benetzt als die umgebende Festkörperoberfläche. Umfaßt die Sondenflüssigkeit z. B. eine wäßrige Lösung, so ist der Ankerpunkt 16 hydrophil im Vergleich zur umgebenden Festkörperoberfläche. Dies kann z. B. dadurch erreicht werden, daß die umgebende Oberfläche durch Silanisierung hydrophob gemacht wird.
Auch der funktionalisierte Bereich 15 kann mit einer entsprechenden Oberfläche ausgestattet sein, die den Sondenflüssigkeitstropfen 1 lokalisiert.
Funktionalisierter Bereich 15 und Ankerpunkt 16 sind über einen Pfad 18 miteinander verbunden, der ebenfalls solche Benetzungseigenschaften aufweist, daß er mit der Sondenflüssigkeitslösung besser benetzt als die umgebende Festkörperoberfläche. Der Pfad 18 ist an den Engstellen 14, 12 derart eingeschränkt, daß die auf dem Ankerpunkt 16 bzw. dem funktionalisierten Bereich 15 befindlichen Tropfen aufgrund ihrer Oberflächenspannung den Ankerpunkt 16 bzw. den funktionalisierten Bereich 15 ohne äußere Krafteinwirkung nicht verlassen.
9, 11 und 13 bezeichnen Interdigitaltransducer, die geeignet sind, Oberflächenschallwellen auf der Oberfläche 7 des Lithiumniobatkristalles 5 anzuregen. Die Interdigitaltransducer bestehen in ihrer einfachsten Form aus zwei Elektroden mit fingerartig ineinander greifenden Fortsätzen. Anlegen eines Wechselfeldes z. B. in der Größenordnung von 100 MHz an die Elektroden des Interdigitaltransducers führt zur Anregung einer Oberflächenschallwelle mit einer Wellenlänge, die dem Fingerabstand der fingerartig ineinander greifenden Elektroden entspricht und deren Ausbreitungsrichtung im wesentlichen senkrecht zu den Fingerelektroden ist. Im Fall der Interdigitaltransducer 9 wird dies beispielsweise durch den Pfeil 10 schematisch angedeutet. Jeder Transducer umfaßt eine große Anzahl von ineinander greifenden Fingern, von denen jeweils nur einige schematisch und nicht maßstabsgetreu dargestellt sind. Es sind auch andere Transducergeometrien einsetzbar, wie sie aus der Technologie der Oberflächenschallwellenfilter bekannt sind.
Die Interdigitaltransducer 9 sind derart ausgerichtet, daß sich eine durch sie angeregte Oberflächenschallwelle in Richtung des funktionalisierten Teilbereiches 15 bewegt. Der Interdigitaltransducer 11 bewirkt eine Oberflächenschallwelle in Richtung 19. Der Interdigitaltransducer 13 bewirkt schließlich eine Oberflächenschallwelle in Richtung 21. Nicht gezeigt sind der Übersichtlichkeit halber die elektrischen Anschlüsse an die Elektroden der Interdigitaltransducer, die in konventioneller Weise vorgesehen sind.
Mit 20 ist ein isolierter Oberflächenbereich bezeichnet, der ebenfalls mit der Sondenflüssigkeit stärker benetzt als die umgebende Festkörperoberfläche. Durch den Impulsübertrag einer ausreichend starken Oberflächenschallwelle, die z. B. mit dem Interdigitaltransducer 11 erzeugt wird, kann ein Tropfen 1 in Richtung des Bereiches 20 transportiert werden und wird dort aufgrund der bevorzugten Benetzung lokalisiert. Eine solche Ausführungsform ist im speziellen dann vorteilhaft, wenn kein Pfad 18 zur Verbindung des Ankerpunktes 16 mit dem funktionalisierten Teilbereich 15 vorgesehen ist und die kleinen Tropfen 17 der Sondenflüssigkeit ohne Pfadführung auf der Oberfläche 7 bewegt werden.
23 zeigt in schematischer Darstellung die Spitze eines an sich bekannten Piezodispensers zur Aufbringung des Reservoirtropfens 3 der Sondenflüssigkeit auf den Ankerpunkt 16. Das Abfließen der Flüssigkeit aus der Dispenserspitze 23 ist durch den Pfeil 24 angedeutet.
Auf der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung kann das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt durchgeführt werden. Zunächst wird der Teilbereich 15 durch Aufbringen von Probenmolekülen z. B. mit Hilfe eines Pipettierroboters oder eines Piezodispensers funktionalisiert.
Mit der Dispenserspitze 23 wird ein Tropfen 3 der Sondenflüssigkeit auf den Ankerpunkt 16 aufgebracht. Aufgrund der speziell gewählten Benetzungseigenschaften (z. B. hydrophil bei einer wäßrigen Sondenlösung) des Ankerpunktes 16 verglichen mit den Benetzungseigenschaften der umgebenden Festkörperoberfläche 7 verläßt der Tropfen 3, der durch seine Oberflächenspannung zusammengehalten wird, den Ankerpunkt 16 nicht.
An den Interdigitaltransducer 13 wird jetzt eine Wechselfrequenz, z. B. einige 100 MHz angelegt, so daß eine Oberflächenschallwelle in Richtung 21 generiert wird. Der Impulsübertrag der Oberflächenschallwelle bewegt den Tropfen 3 in Richtung der Engstelle 14, die den Ankerpunkt 16 mit dem Pfad 18 verbindet. Eine kleine Menge des Tropfens 3 bewegt sich über die Engstelle 14 und reißt bei entsprechender Dimensionierung definiert ab. Die notwendige Verringerung der Breite an der Engstelle 14 kann z. B. durch Vorversuche festgestellt worden sein. Die abgetrennte Sondenflüssigkeitsmenge 17 kann z. B. einige Pikoliter betragen. Der abgezogene Teil 17 der Sondenflüssigkeit bewegt sich ebenfalls durch Impulsübertrag der Oberflächenschallwelle, die mit Hilfe des Interdigitaltransducers 13 erzeugt wird, von dem Ankerpunkt 16 weg. Mit Hilfe eines zweiten Transducers 11 wird die Bewegung der kleinen Sondenflüssigkeitsmenge in Richtung 19 des funktionalisierten Oberflächenbereiches 15 fortgesetzt. Die kleine Sondenflüssigkeitsmenge 17 gelangt auf den funktionalisierten Oberflächenbereich 15. Durch die Engstelle 12 in der Bahn 18 vor dem funktionalisierten Oberflächenbereich 15 wird verhindert, daß sich die Sondenflüssigkeit bei Abwesenheit der vom Transducer 11 erzeugten Oberflächenschallwelle vom funktionalisierten Oberflächenbereich 15 zurückbewegt. Mit Hilfe einer Oberflächenschallwelle, die von einem der Interdigitaltransducer 9 erzeugt wird, kann die Reaktion zwischen Sondenflüssigkeit und darin befindlichem Material und den Probenmolekülen auf der funktionalisierten Oberfläche 15beschleunigt werden. Zur effektiven Durchmischung können auch beide Interdigitaltransducer 9 gleichzeitig eingesetzt werden, um gegenläufige Oberflächenschallwellen in Richtung des funktionalisierten Oberflächenbereiches 15 zu generieren.
Mit einer Oberflächenschallwelle ausreichender Intensität, die von dem Interdigitaltransducer 11 ausgesendet wird, kann der Tropfen 1 von dem funktionalisierten Teilbereich 15 wegbewegt werden. Er wird dann z. B. von dem Oberflächenbereich 20 lokalisiert, der ebenfalls solche Benetzungseigenschaften aufweist, die mit der Sondenflüssigkeit stärker benetzen als die umgebende Festkörperoberfläche. Die Interdigitaltransducer 9 können jetzt eingesetzt werden, um festzustellen, ob Sondenflüssigkeit bzw. darin befindliches Material mit den Probenmolekülen auf dem funktionalisierten Oberflächenbereich 15 verblieben bzw. gebunden sind. Einer der lnterdigitaltransducer 9 generiert dazu eine Oberflächenschallwelle in Richtung des funktionalisierten Bereiches 15. Mit dem zweiten Interdigitaltransducer kann die Oberflächenschallwelle nach dem Durchlaufen des funktionalisierten Bereiches 15 detektiert werden. Durch die Reaktion der Sondenflüssigkeit bzw. des darin befindlichen Materiales mit der funktionalisierten Oberfläche kann sich z. B. die Dämpfung oder die Geschwindigkeit der Oberflächenschallwelle verändert haben, so daß Information über die Reaktion bzw. die verbliebene Menge erhalten werden kann. Außerdem kann durch Vergleich mit entsprechenden Referenzmessungen die genaue Menge des verbliebenen Materiales auf dem funktionalisierten Bereich 15 aus der Dämpfung oder der Geschwindigkeitsänderung einer Oberflächenschallwelle festgestellt werden.
Das beschriebene Verfahren kann durch eine entsprechend gepulste Oberflächenschallwelle, die mit dem lnterdigitaltransducer 13 erzeugt wird, in definierter Weise mehrfach durchgeführt werden, indem mehrere kleine Mengen Sondenflüssigkeit 17 in Richtung des funktionalisierten Oberflächenbereiches 15 bewegt werden. Mit einer solchen Verfahrensführung läßt sich die Reaktion in Abhängigkeit der zugeführten Sondenflüssigkeitsmenge feststellen, wodurch eine genaue quantitative Bestimmung der zur Bindung zur Verfügung stehenden Probenmoleküle auf dem funktionalisierten Bereich 15 ermöglicht wird.
Mehrere entsprechende Vorrichtungen können auf einem Chip parallel vorgesehen sein, so daß eine parallele Durchführung mehrerer Experimente möglich ist.
In Fig. 2 ist ein alternatives Verfahren dargestellt. Der Übersichtlichkeit halber zeigt Fig. 2 nicht die zur Durchmischung ggf. vorgesehenen Transducer. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen gleiche Elemente wie in Fig. 1. Bei dem Verfahren, das in Fig. 2 dargestellt ist, wird zur Untersuchung einer möglichen Reaktion der Sondenflüssigkeit bzw. des darin enthaltenen Materiales mit der funktionalisierten Oberfläche 15 eine optische Messung durchgeführt. Eine Leuchtdiode 31 oder eine andere geeignete Lichtquelle beleuchtet den Festkörperchip 5 von unten. Zum Beispiel mit Hilfe einer Glasfaser 29 wird das optische Signal aufgefangen und an eine nicht gezeigte Auswerteeinrichtung weitergeleitet und in an sich bekannter Weise ausgewertet. Mit dieser Ausführungsform kann z. B. die Fluoreszenz ausgewertet werden, die von fluoreszenzmarkiertem Material in der Sondenflüssigkeit herrührt, das mit dem funktionalisierten Oberflächenbereich 15 reagiert hat und nach dem Entfernen des Sondenflüssigkeitstropfens 1 auf dem funktionalisierten Oberflächenbereich 15 verblieben ist. Wird ein nicht transparentes Substrat eingesetzt, so kann der Lichtweg auch parallel zur Oberfläche 7 des Chips 5 gewählt werden.
Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Ausgestaltungen des Verfahrens nutzen die Engstelle 14, um eine definierte Menge 17 der Sondenflüssigkeit von dem Reservoirtropfen 3 abzuziehen. In Fig. 3 ist eine alternative Möglichkeit zur Abtrennung einer kleinen Flüssigkeitsmenge dargestellt. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen gleiche Elemente wie in den Fig. 1 und 2. Ein Reservoirtropfen 3 befindet sich auf einem der Ankerpunkte 16. Durch Impulsübertrag eine Oberflächenschallwelle, die mit dem Interdigitaltransducer 13, der dem entsprechenden Ankerpunkt 16 am nächsten ist, erzeugt wird, wird der Reservoirtropfen 3 in Richtung des zweiten Ankerpunktes 16 getrieben. Der Impulsübertrag einer anderen Oberflächenschallwelle, die mit dem Interdigitaltransducer 13 erzeugt wird, der dem zweiten Ankerpunkt am nächsten ist, wird der Reservoirtropfen wieder zurückgetrieben. Dabei bewegt er sich entlang der angedeuteten Strecke 43 hin und her. Er überquert dabei ein- oder mehrfach einen Oberflächenbereich 41, dessen Fläche kleiner ist als die Berührungsfläche des Reservoirtropfens 3 mit der Festkörperoberfläche 7. Dieser Oberflächenbereich 41 hat derartige Benetzungseigenschaften, daß die Flüssigkeit des Reservoirtropfens 3 ihn stärker benetzt als seine umgebende Festkörperoberfläche. Nach ein- oder mehrfacher Überquerung des Oberflächenbereiches 41 hat sich aus dem Reservoirtropfen 3 eine kleine Sondenflüssigkeitsmenge 17 abgelöst. Für wäßrige Sondenflüssigkeit wird der Oberflächenbereich 41 z. B. mit hydrophilen Eigenschaften gewählt.
Nachdem die kleine Sondenflüssigkeitsmenge 17 auf diese Weise von dem Reservoirtropfen 3 abgetrennt worden ist, kann mit Hilfe des Impulsübertrages einer Oberflächenschallwelle, die z. B. in Richtung 45 mit dem Interdigitaltransducer 11 erzeugt werden kann, die Sondenflüssigkeitsmenge 17 von dem Oberflächenbereich 41 fortbewegt werden, z. B. in Richtung eines in der Fig. 3 nicht gezeigten funktionalisierten Oberflächenbereiches 15, um die Verfahrensschritte zur Charakterisierung durchzuführen, die mit Bezug zu Fig. 1 und 2 beschrieben sind.
Der Reservoirtropfen 3 und der Sondenflüssigkeitstropfen 17 können dabei entlang von bevorzugt benetzten Pfaden bewegt werden, wie sie bereits mit Bezug zu den Fig. 1 und 2 beschrieben sind und dort mit dem Bezugszeichen 18 bezeichnet sind. Solche Pfade haben vorteilhafterweise eine laterale Ausdehnung, die kleiner ist als der Durchmesser des Oberflächenbereiches 41. Das erfindungsgemäße Verfahren und das beschriebene Abtrennen der kleinen Sondenflüssigkeitsmenge 17 lassen sich jedoch auch ohne derartige Pfade durchführen, so daß diese in Fig. 3 nicht dargestellt sind.
Mit dem in Fig. 3 dargestellten Verfahren lassen sich z. B. 20 Pikoliter kleine Sondenflüssigkeitstropfen 17 von einem Reservoirtropfen 3 mit 50 Nanolitern abtrennen. Es können auf dem Weg des Reservoirtropfens 3 mehrere Oberflächenbereiche 41 vorgesehen sein, wenn mehrere Sondenflüssigkeitsmengen 17 in einem Arbeitsschritt abgetrennt werden sollen. Je nach Eigenschaft der zu manipulierenden Flüssigkeit in dem Reservoirtropfen 3 können durch entsprechende Vorversuche geeignete Geometrien für den Oberflächenbereich 41 festgelegt werden, z. B. kreis- oder ringförmig.
Das in Fig. 3 beschriebene Verfahren zur Abtrennung einer kleinen Sondenflüssigkeitsmenge 17 von einem Reservoirtropfen 3 kann selbstverständlich mit allen oben bereits beschriebenen Verfahrensausgestaltungen zur Charakterisierung eines funktionalisierten Oberflächenbereiches 15 kombiniert werden.

Claims

1. Charakterisierungsverfahren zur Charakterisierung einer zur Untersuchung einer Probenflüssigkeit funktionalisierten Untersuchungsoberfläche, bei dem
zumindest ein Teilbereich (15) der Oberfläche (7) eines Festkörpers, vorzugsweise eines Festkörperchips (5), wobei der Teilbereich (15) für eine Reaktion mit einer Probenflüssigkeit funktionalisiert ist, mit einem Tropfen (1) einer Sondenflüssigkeit in Berührung gebracht wird, wobei die Tropfengröße vorzugsweise so gewählt ist, daß der Tropfen (1) auf dem funktionalisierten Teilbereich (15) bzw. den funktionalisierten Teilbereichen der Oberfläche (7) derart durch seine Oberflächenspannung zusammengehalten wird, daß seine Berührungsfläche etwa der Fläche des funktionalisierten Teilbereiches (15) bzw. der funktionalisierten Teilbereiche entspricht, und die Sondenflüssigkeit derart präpariert ist, daß eine Bindung der Sondenflüssigkeit bzw. darin enthaltenen Materiales mit dem funktionalisierten Teilbereich (15) bzw. den funktionalisierten Teilbereichen stattfinden kann, und
ein Parameter, der sich mit der Bindung der Sondenflüssigkeit bzw. darin enthaltenen Materiales mit dem funktionalisierten Teilbereich (15) bzw. den funktionalisierten Teilbereichen der Oberfläche (7) ändert, gemessen wird, während der Tropfen (1) der Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Teilbereich (15) bzw. den funktionalisierten Teilbereichen der Oberfläche (7) in Berührung ist und/oder nachdem der Tropfen (1) der Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Teilbereich (15) bzw. den funktionalisierten Teilbereichen der Oberfläche (7) in Berührung war.

2. Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren ein- oder mehrfach wiederholt wird, um aus der Untersuchung der Änderung des Parameters mit zunehmender Anzahl der Wiederholungen Information über den zeitlichen Ablauf der Bindung der Sondenflüssigkeit bzw. darin enthaltenen Materiales mit dem funktionalisierten Teilbereich (15) zu erhalten.

3. Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem die Untersuchung des Parameters das Auslesen eines Markers umfaßt, der sich in der Sondenlösung befindet und mit dem funktionalisierten Teilbereich (15) der Oberfläche (7) des Festkörpers (5) eine Bindung eingehen kann bzw. Teil von sich in der Lösung befindlichen Molekülen ist, die mit dem funktionalisierten Teilbereich eine Bindung eingehen können, vorzugsweise eines Fluoreszenzmarkers oder radioaktiven Markers.

4. Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Untersuchung des Parameters die Messung der Reaktionswärme umfaßt, die bei der Reaktion zwischen der Sondenflüssigkeit bzw. des darin enthaltenen Materiales und dem funktionalisierten Teilbereich (15) auftritt.

5. Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das zur Bestimmung der Anzahl von zur Bindung von zweiten Makromolekülen in einer Probenflüssigkeit auf dem funktionalisierten Teilbereich (15) der Oberfläche (7) zur Verfügung stehenden ersten Makromolekülen eingesetzt wird.

6. Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem eine Oberflächenschallwelle (10) in Richtung des funktionalisierten Teilbereiches (15) geschickt wird, um die Reaktion zwischen der Sondenflüssigkeit bzw. darin enthaltenen Materiales und dem funktionalisiertem Teilbereich (15) zu befördern und/oder den Tropfen (1) der Sondenflüssigkeit zu durchmischen.

7. Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 6, bei dem zur Erzeugung der Oberflächenschallwelle bzw. der Oberflächenschallwellen ein oder mehrere lnterdigitaltransducer (9, 11, 13) mit einer Oberflächenschallwellenabstrahlrichtung in Richtung des funktionalisierten Teilbereichs (15) auf einer piezoelektrischen Festkörperoberfläche (7) eingesetzt werden.

8. Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem der Tropfen (1) der Sondenflüssigkeit auf der Oberfläche (7) zu dem funktionalisierten Teilbereich (15) bewegt wird.

9. Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 8, bei dem ein Reservoirtropfen (3) von Sondenflüssigkeit auf die Festkörperoberfläche (7) aufgebracht wird, der aufgrund seiner Oberflächenspannung zusammengehalten wird, aus diesem Reservoirtropfen (3) ein Tropfen (17) von Sondenflüssigkeit abgezogen wird und dem funktionalisierten Teilbereich (15) zugeführt wird.

10. Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 9, bei dem die Bewegung des Tropfens (17) der Sondenflüssigkeit durch den Impulsübertrag einer Oberflächenschallwelle ausgelöst wird.

11. Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 10, bei dem zur Erzeugung der Oberflächenschallwelle bzw. der Oberflächenschallwellen ein oder mehrere Interdigitaltransducer (9, 11, 13) mit einer Oberflächenschallwellenabstrahlrichtung in Richtung der gewünschten Bewegung des Tropfens (17) auf einer piezoelektrischen Festkörperoberfläche (7) eingesetzt werden.

12. Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, bei dem der Reservoirtropfen (3) auf einen Ankerpunkt (16) auf der Oberfläche (7) des Festkörpers (5) aufgebracht wird, der mit der Sondenflüssigkeit besser benetzt als seine umgebende Festkörperoberfläche.

13. Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 12, bei dem die Sondenflüssigkeit von dem auf die Festkörperoberfläche (7) aufgebrachten Reservoirtropfen (3) der Sondenflüssigkeit auf einem Pfad (18) zum funktionalisierten Teilbereich (15) geführt wird, wobei der Pfad (18) derart ausgestaltet ist, daß zumindest ein Teil seiner Oberfläche von der Sondenflüssigkeit besser benetzt wird als seine umgebende Oberfläche.

14. Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 13, bei dem der Tropfen (17) der Sondenflüssigkeit von dem Reservoirtropfen (3) zum funktionalisierten Teilbereich (15) über einen Pfad (18) geführt wird, der mit dem Ankerpunkt (16) und/oder dem funktionalisierten Teilbereich (15) verbunden ist, wobei die Verbindung (14, 12) einen Bereich umfaßt, der so schmal ist, daß der Reservoirtropfen (3) auf dem Ankerpunkt (16) aufgrund seiner Oberflächenspannung den Ankerpunkt (16) ohne äußere Krafteinwirkung nicht verläßt.

15. Charakterisierungsverfahren nach Anspruch 12, bei dem der Reservoirtropfen (3) zumindest einmal über zumindest einen Bereich (41) der Oberfläche (7) bewegt wird, der von der Flüssigkeit stärker benetzt wird als die umgebende Oberfläche, wobei die Fläche dieses Bereiches (41) kleiner ist als die Berührungsfläche des Reservoirtropfens (3) mit der Oberfläche (7), um einen Tropfen (17) der Sondenflüssigkeit von dem Reservoirtropfen (3) abzutrennen.

16. Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, das zur Kontrolle der thermodynamischen Bedingungen in einer Klimakammer durchgeführt wird.

17. Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem eine Oberflächenschallwelle nach Entfernung des Tropfens (1) von dem funktionalisierten Teilbereich (15) in Richtung (10) des funktionalisierten Teilbereiches (15) geschickt wird und die Änderung eines oder mehrerer Parameter der Oberflächenschallwelle gemessen wird, die durch die Reaktion der Sondenflüssigkeit mit dem funktionalisierten Teilbereich (15) ausgelöst worden ist.

18. Charakterisierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem der Tropfen (1) der Sondenflüssigkeit von dem funktionalisierten Teilbereich (15) mit Hilfe des Impulsübertrages einer Oberflächenschallwelle entfernt wird.