DE102004034486A1

DE102004034486A1 - Verfahren zum Nachweis von Lumineszenzlicht aus einer porösen Trägerstruktur

Info

Publication number: DE102004034486A1
Application number: DE102004034486A
Authority: DE
Inventors: Stephan Dertinger; Marco KLÜHR
Original assignee: Infineon Technologies AG
Current assignee: Infineon Technologies AG
Priority date: 2004-07-16
Filing date: 2004-07-16
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2024-07-17
Also published as: DE102004034486B4; US20060014198A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis chemischer und/oder biochemischer Reaktionen und/oder Bindungen mit den Schritten: DOLLAR A - Bereitstellen einer flächig ausgebildeten Trägerstruktur, welche über zumindest einen Oberflächenbereich verteilt eine Vielzahl von Poren (10) aufweist, welche sich von einer Oberfläche (12) der Trägerstruktur zu der gegenüberliegenden Oberfläche (14) durchgängig erstrecken, DOLLAR A - wobei die Poren (10) durch Porenbegrenzungsflächen (18) von in der Trägerstruktur ausgebildeten Porenwänden (16) begrenzt sind und DOLLAR A - die Porenwände (16) einen Brechungsindex n¶Porenwand¶ bei einer Wellenlänge lambda aufweisen; DOLLAR A - Einleiten einer Flüssigkeit (20) in zumindest eine der Poren (10) der Trägerstruktur, wobei für den Brechungsindex n¶Flüssigkeit¶ der Flüssigkeit (20) bei der Wellenlänge lambda die Beziehung 0,90 È n¶Porenwand¶ n¶Flüssigkeit¶ 1,10 È n¶Porenwand¶ gilt; DOLLAR A - Auskoppeln von Licht einer zu untersuchenden Substanz, welche in der zumindest einen Pore (10) vorliegt, aus der Pore (10) und DOLLAR A - Detektieren des Lichts der zu untersuchenden Substanz.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis chemischer und/oder biochemischer Reaktionen und/oder Bindungen anhand einer Detektion von Lumineszenzlicht aus einer porösen Trägerstruktur.

In der Molekularbiologie finden heute in zunehmendem Maße Biochips Verwendung, mit denen auf schnelle Art und Weise Erkenntnisse über Organismen und Gewebe gewonnen werden. Für die Biowissenschaften und die medizinische Diagnostik ist die Detektion (bio)chemischer Reaktionen, d.h. die Detektion biologisch relevanter Moleküle in definiertem Untersuchungsmaterial von herausragender Bedeutung. In diesem Rahmen wird die Entwicklung von sogenannten BioChips stetig vorangetrieben. Bei derartigen BioChips handelt es sich üblicherweise um miniaturisierte hybride Funktionselemente mit biologischen und technischen Komponenten, insbesondere auf einer Oberfläche eines BioChip-Grundmoduls immobilisierten Biomolekülen, die als spezifische Interaktionspartner dienen. Häufig weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf. Man spricht dann von sogenannten „Mikroarrays". Da tausende von biologischen bzw. biochemischen Funktionselementen auf einem Chip angeordnet sein können, werden diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt.

Als biologische und biochemische Funktionselemente kommen insbesondere DNA, LNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten können z.B. Einzelstränge wie Oligonukleotide, Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen), Saccharide, Peptide, Proteine (z.B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren), Derivate der kombinatorischen Chemie (z.B. organische Moleküle), Zellbestandteile (z.B. Organellen), einzelne Zellen, mehrzellige Organismen sowie Zellverbände in Frage.

Die am weitesten verbreitete Variante von Biochips sind die sogenannten Microarrays. Dies sind kleine Plättchen ("Chips") aus beispielsweise Glas, Gold, Kunststoff oder Silizium. Zum Nachweis entsprechender biologischer oder biochemischer (Bindungs)Reaktionen werden beispielsweise kleine Mengen an solubilisierten unterschiedlichen Fängermolekülen, z.B. eine bekannte Nukleinsäuresequenz, in Form von kleinsten Tröpfchen punktförmig und matrizenartig, sogenannte Dots, auf der Oberfläche des BioChip-Grundmoduls fixiert.

In der Praxis werden einige hundert bis einige tausend Tröpfchen pro Chip verwendet. Anschließend wird ein zu untersuchender Analyt, der beispielsweise fluoreszenzmarkierte Zielmoleküle enthalten kann, über diese Oberfläche gepumpt. Dabei kommt es im allgemeinen zu unterschiedlichen chemischen (Bindungs) Reaktionen zwischen den im Analyt enthaltenen Zielmolekülen und den fixierten bzw. immobilisierten Fängermolekülen. Wie bereits angeführt, werden zur Beobachtung dieser Reaktionen oder Bindungen die Zielmoleküle mit Farbstoffmolekülbausteinen, üblicherweise Fluorochromen markiert. Das Vorhandensein und die Intensität von Licht, das von den Fluorochromen emittiert wird, gibt Aufschluß über den Verlauf der Reaktion oder Bindung in den einzelnen Tröpfchen auf dem Substrat, so daß Rückschlüsse auf das Vorhandensein und/oder die Eigenschaft der Zielmoleküle und/oder Fängermoleküle gezogen werden können. Wenn sich die entsprechenden fluoreszenzmarkierten Zielmoleküle des Analyten mit bzw. an den an der Oberfläche des Trägersubstrats immobilisierten Fängermolekülen umsetzen bzw. binden, kann durch optische Anregung mit einem Laser und Messung des entsprechenden Fluoreszenzsignals diese Reaktion bzw. Bindung nachgewiesen werden.

Substrate mit hoher, aber definierter Porosität weisen als Basis für derartige BioChips mehrere Vorteile gegenüber planaren Substraten auf. Auf der stark vergrößerten Oberfläche können mehr Nachweisreaktionen stattfinden. Dadurch steigt die Nachweisempfindlichkeit für biologische Assays. Durch Pumpen der im Analyt gelösten Zielmoleküle durch die Kanäle zwischen Vorder- und Rückseite des porösen Substrates werden diese in nahen räumlichen Kontakt mit der Oberfläche des Substrates gebracht (< 10 μm). Auf dieser Größenskala ist die Diffusion ein sehr effektiver Transportprozeß, der innerhalb kurzer Zeit die Distanzen zwischen nachzuweisendem Zielmolekül und dem auf der Oberfläche immobilisierten Fängermolekül überbrückt. Die Geschwindigkeit der Bindungsreaktion kann dadurch erhöht und damit die Dauer des Nachweisverfahrens deutlich verkürzt werden.

Ein Beispiel für ein Substrat mit derartiger definierter Porösität ist elektrochemisch hergestelltes poröses Silizium (vgl. DE 42 02 454 , EP 0 553 465 oder DE 198 20 756 ).

Ein großer Teil der heute verwendeten analytischen Methoden in der Wirkstoff-Forschung und klinischen Diagnostik setzt optische Verfahren zum Nachweis von Bindungsereignissen zwischen nachzuweisender Substanz und Fängermolekülen ein (z.B.

DNA-Hybridisierungen, Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen und Protein-Wechselwirkungen). Die nachzuweisende Substanz wird hierbei mit einem Marker versehen, der nach Anregung mit Licht geeigneter Wellenlänge fluoresziert (Fluoreszenzverfahren) oder der eine chemische Reaktion auslöst, die wiederum Licht erzeugt (Chemilumineszenzverfahren). Bindet die nachzuweisende Substanz, d.h. das Zielmolekül, mit dem immobilisierten Fängermolekül auf der Oberfläche, so kann dies optisch, z.B. über Lumineszenz, nachgewiesen werden. Unter dem Begriff "Lumineszenz" wird hierbei die spontane Emission von Photonen im ultravioletten bis infraroten Spektralbereich bezeichnet. Anregungsmechanismen der Lumineszenz können optischer oder nicht-optischer Natur sein, beispielsweise elektrische, chemische, biochemische und/oder thermische Anregungsprozesse. Somit sollen insbesondere Chemi-, Bio- und Elektrolumineszenz sowie Fluoreszenz und Phosphoreszenz unter den Begriff "Lumineszenz" im Sinne dieser Erfindung fallen.

Poröse Substrate mit hoher optischer Dichte und geringer Reflektivität, wie beispielsweise poröses Silizium, dessen Reflektivität im sichtbaren Bereich des Spektrums 50 bis 70 beträgt, liefern in Verbindung mit Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzverfahren jedoch nicht die erwarteten Ergebnisse, insofern die experimentell beobachtete Lichtsignalausbeute bei weitem nicht an die theoretisch erreichbaren Werte heranreicht. Der Grund für die gegenüber den theoretischen Werten verringerte, experimentell beobachtete Lichtsignalausbeute beim Einsatz derartiger poröser Substrate liegt zum einen in Problemen bei der Auskopplung des Lumineszenzlichts der zu untersuchenden Substanz bzw. Bindung und zum anderen – wenn ein Fluoreszenzverfahren vorliegt – in Problemen bei der optischen Anregung der Fluoreszenz begründet.

In der WO03/089931A1 desselben Anmelders ist eine Vorrichtung, welche sich als „BioChip-Grundmodul" eignet, sowie ein Nachweisverfahren für chemische bzw. biochemische Reaktionen und/oder Bindungen beschrieben. Um das Lumineszenzlicht der zu untersuchenden Substanz effektiv aus dem porösen Trägermaterial auszukoppeln, wurde vorgeschlagen, das Lumineszenzlicht als Wellenleitermode in einer Wellenleiterstruktur in dem Trägermaterial zu führen. Die hierdurch bewirkte Auskoppeleffizienz des Lumineszenzlichts führt zu einer Steigerung der Nachweisempfindlichkeit.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweis chemischer und/oder biochemischer Reaktion und/oder Bindungen anzugeben, welches trotz einfacher Durchführbarkeit eine hohe Nachweisempfindlichkeit bietet.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den in Anspruch 1 angegebenen Schritten gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.

Gemäß der Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Nachweis chemischer und/oder biochemischer Reaktionen und/oder Bindungen die Schritte:

– Bereitstellen einer flächig ausgebildeten Trägerstruktur, welche über zumindest einen Oberflächenbereich verteilt eine Vielzahl von Poren aufweist, welche sich von einer Oberfläche der Trägerstruktur zu der gegenüberliegenden Oberfläche durchgängig erstrecken,
– wobei die Poren durch Porenbegrenzungsflächen von in der Trägerstruktur ausgebildeten Porenwänden begrenzt sind, und
– die Porenwände einen Brechungsindex n_Porenwand bei einer Wellenlänge λ aufweisen;
– Einleiten einer Flüssigkeit beinhaltend zumindest eine zu untersuchende Substanz in zumindest eine der Poren der Trägerstruktur, wobei für den Brechungsindex n_Flüssigkeit der Flüssigkeit bei der Wellenlänge λ die Beziehung 0,90·n_Porenwand ≤ n_Flüssigkeit ≤ 1,10·n_Porenwand gilt;
– Auskoppeln von Licht der zu untersuchenden Substanz aus der zumindest einen Pore; und
– Detektieren des Lichts der zu untersuchenden Substanz.

Die Trägerstruktur ist somit von einer Vielzahl von Poren durchsetzt, welche sich in der Trägerstruktur erstrecken und den Durchtritt von beispielsweise einem flüssigen Analyten von einer der Oberflächen der Trägerstruktur zu der gegenüberliegenden Oberfläche gestatten. Die Poren sind entlang ihrer Porenlängsachsen von Porenbegrenzungsflächen begrenzt, welche in den Porenwänden in der Trägerstruktur ausgebildet sind. Die Porenbegrenzungsflächen stellen somit die Außenflächen der Porenwände dar, d.h. die Grenzflächen zwischen dem Trägermaterial der Trägerstruktur und den zu befüllenden Poren.

Im Vergleich zu der eingangs genannten WO 03/089931A1 verfolgt das erfindungsgemäße Verfahren zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit für Licht von der zu untersuchenden Substanz einen grundlegend andersartigen Ansatz, welcher auf folgenden Überlegungen beruht.

Bei herkömmlichen Trägerstrukturen existiert ein oftmals ausgeprägter Brechungsindexsprung zwischen den befüllten Poren und den Porenwänden bei der relevanten Wellenlänge, d.h. der zu detektierenden Lumineszenzwellenlänge). Dieser Brechungsindexsprung bewirkt als „optische Rauhigkeit" der Porenbegrenzungsflächen eine starke Streuung sowohl des einfallenden Anregungslichts als auch des zu detektierenden Lichts. Eine derartige Streuung von Licht in der porösen Trägerstruktur ist besonders nachteilig, wenn die im allgemeinen schwachen Signale von Bindungsreaktionen von Molekülen an eine immobilisierte „Substanzbibliothek" über Licht nachgewiesen werden soll. Die Streuung führt zu einem erhöhten Hintergrundsignal, welches sich dem zu detektierenden Licht der zu untersuchenden Substanz sowie gegebenenfalls aus dem gestreuten Anregungslicht zusammensetzt. Ferner führt die Streuung auch zu einem niedrigeren Lichtsignal aufgrund von Streuung des Lichts an den Porenbegrenzungsflächen und erhöhter Absorption in der porösen Trägerstruktur. Hierdurch verringert sich der Signal-zu-Hintergrundabstand, welches eine Verringerung der Nachweisempfindlichkeit des Verfahrens impliziert.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Poren der porösen Trägerstruktur mit einer Flüssigkeit gefüllt, welche bei einer vorbestimmten Wellenlänge λ einen Brechungsindex n_Flüssigkeit aufweist, welcher in einem Bereich von ± 10% des Brechungsindex n_Porenwand der an die Pore angrenzenden Porenwand der Trägerstruktur bei der vorbestimmten Wellenlänge λ liegt. Durch die "Nivellierung" des Brechungsindexhubs |n_Porenwand – n_Flüssigkeit| zwischen Porenwand und in die Pore eingeleiteter Flüssigkeit wird eine unerwünschte Streuung von Anregungs- bzw. Licht an den Porenbegrenzungsflächen der Porenwände wirksam unterdrückt.

Mit anderen Worten wird durch den ähnlichen und vorzugsweise im wesentlichen gleichen Brechungsindex der Porenwand im Vergleich zu demjenigen der Flüssigkeit weder einfallendes noch zu detektierendes, austretendes Licht an den Porenbegrenzungsflächen reflektiert noch gestreut. Wenn die Trägerstruktur eine immobilisierte „Substanzbibliothek" bereitstellt und Bindungsereignisse über ein Lichtsignal detektiert werden sollen, führt die Reduzierung und vorzugsweise Minimierung des Brechungsindexhubs zu einer Verkleinerung der Streuung von Licht in der Trägerstruktur, wodurch ein höheres absolutes Lichtsignal erzielbar ist, da weniger Licht in der Trägerstruktur absorbiert wird.

Das Licht von der zu untersuchenden Substanz kann ein durch Absorption oder Reflektion von Anregungslicht erzeugtes Lichtsignal, ein Lumineszenzlichtsignal und/oder ein Chemolumineszenzlichtsignal sein.

Die Detektion eines Lichtsignals der zu untersuchenden Substanz, welches durch Absorption oder Reflektion eines Anregungslichts erzeugt wird, ist insbesondere für Nachweisverfahren, welche auf Präzipitation oder Staining basieren, vorteilhaft. Hierbei wird durch Detektion des Lichtsignals insbesondere das Ergebnis einer Ausfällungs- oder einer Anfärbungsreaktion erfaßt.

Die zu untersuchende Substanz kann bereits in einem vorgelagerten Verfahrensschritt vor dem Befüllen der Pore mit der Flüssigkeit in die Pore eingebracht werden. Die zu untersuchende Substanz kann beispielsweise mittels einer Substanzflüssigkeit, welche die zu untersuchende Substanz enthält, in die Pore eingebracht worden sein und ist gegebenenfalls zumindest teilweise an eine immobilisierte „Substanzbibliothek" bzw. Fängermoleküle an den Porenbegrenzungsflächen gebunden. Die zu untersuchende Substanz kann auch das Produkt von Nachweisreaktionen einer in die zumindest eine Pore eingebrachten Substanz sein, die zu untersuchen ist.

Nachfolgend wird die Substanzflüssigkeit aus der Pore entfernt. Vor der Detektion von Licht der zu untersuchenden Substanz wird die Flüssigkeit in die zumindest eine Pore eingeleitet, für Welche die Beziehung 0,90·n_Porenwand ≤ n_Flüssigkeit ≤ 1,10·n_Porenwand gilt.

Insbesondere für Nachweisverfahren, welche auf der Auskopplung und Detektion von Chemolumineszenz beruhen, ist diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens von Vorteil. In diesem Fall beinhaltet die Flüssigkeit vorzugsweise ein entsprechendes Chemolumineszenzsubstrat für die zu untersuchende Substanz.

Auch für erfindungsgemäße Verfahren, welche auf Ausfällungs- und Anfärbeverfahren basieren, kann diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens vorteilhaft sein.

Es ist jedoch ebenfalls möglich, die zu untersuchende Substanz gleichzeitig mit der Flüssigkeit, für welche die Beziehung 0,90 ·n_Porenwand ≤ n_Flüssigkeit ≤ 1,10·n_Porenwand gilt, in die zumindest eine Pore einzubringen, so daß auf den vorgelagerten Verfahrensschritt des Einleitens einer Substanzflüssigkeit verzichtet werden kann.

Für ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren auf Basis eines Auskoppelns und Detektierens eines Lumineszenzsignals kann somit zunächst eine Einleitung der zu untersuchenden Substanz in die zumindest eine Pore, ein nachfolgendes Anpassen des Brechungsindexhubs zwischen Porenwand und Pore durch Einleiten der Flüssigkeit und nachfolgendes Auskoppeln und Detektieren des Lumineszenzsignal vorteilhaft sein. Alternativ kann das Einleiten der zu untersuchenden Substanz und das Anpassen des Brechungsindexhubs auch gleichzeitig durch Einleiten der Flüssigkeit, welche die zu untersuchende Substanz enthält, erfolgen. Gegebenenfalls wird nicht die eingeleitete zu untersuchende Substanz, sondern Produkte von Nachweisreaktionen dieser Substanz, optisch untersucht. Diese Produkte stellen in diesem Fall die zu untersuchende Substanz dar.

Für ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren auf Basis eines Auskoppelns und Detektierens eines Chemolumineszenzsignals erfolgt vorzugsweise zunächst eine Einleitung der zu untersuchenden Substanz in die zumindest eine Pore und ein nachfolgendes Anpassen des Brechungsindexhubs zwischen Porenwand und Pore durch Einleiten der Flüssigkeit und gleichzeitiges Auslesen des Chemolumineszenzsignals.

Für ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren auf Basis einer Präzipitation oder eines Stainings (Ausfällungs- oder Anfärbereaktion) kann zunächst eine Einleitung der zu untersuchenden Substanz in die zumindest eine Pore, eine nachfolgende Entwicklung zur Durchführung der Ausfällungs- oder Anfärbereaktion, ein nachfolgendes Anpassen des Brechungsindexhubs zwischen Porenwand und Pore durch Einleiten der Flüssigkeit und nachfolgendes Auskoppeln und Detektieren des Lichtsignals zum Nachweis der Ausfällungs- oder Anfärbereaktion vorteilhaft sein. Der Entwicklungsschritt zur Durchführung der Ausfällungs- oder Anfärbereaktion kann auch gleichzeitig mit dem Anpassen des Brechungsindexhubs erfolgen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich in besonderer Weise zum Nachweis biochemischer Reaktion und/oder Bindungen sowie hierfür insbesondere zur Untersuchung von enzymatischen Reaktionen, Nukleinsäure-Hybridisierungen, Protein-Protein-Wechselwirkungen und Protein-Liganden-Wechselwirkungen. Das zu detektierende Licht kann von Reaktions- bzw. Bindungsereignissen der zu untersuchenden Substanz mit Bindungs- bzw. Reaktionspartnern herrühren. Insbesondere kann es sich um ein Fluoreszenz- oder Chemolumineszenzsignal handeln.

Vorzugsweise gilt für den Brechungsindex n_Flüssigkeit der Flüssigkeit bei der Wellenlänge λ die Beziehung 0,95·n_Porenwand ≤ n_Flüssigkeit ≤ 1,05·n_Porenwand und vorzugsweise die Beziehung 0,99 ·n_Porenwand ≤ n_Flüssigkeit ≤ 1,01·n_Porenwand. Besonders bevorzugt ist der Brechungsindex n_Flüssigkeit der Flüssigkeit bei der Wellenlänge λ im wesentlichen gleich zu dem Brechungsindex n_Porenwand der Porenwand.

Die Trägerstruktur besteht vorzugsweise zumindest abschnittsweise aus einem Material, dessen Brechungsindex bei der Wellenlänge λ gleich zu n_Porenwand ist. Anregungs- bzw. Detektionslicht in einem derartigen Abschnitt bzw. Kompartment erfährt aufgrund des kleinen bzw. verschwindenden Brechungsindexhubs |n_Porenwand – n_Flüssigkeit| zwischen Trägermaterial und Flüssigkeit keine nennenswerte Streuung bzw. Brechung, so daß ein einfaches Einkoppeln von Anregungslicht und Auskoppeln von zu detektierendem Licht möglich ist. Unterschiedliche Abschnitte bzw. Kompartments können durch lichtundurchlässige Kompartmentgrenzen voneinander optisch isoliert sein.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind an zumindest einer der Porenbegrenzungsflächen zumindest bereichsweise Fängermoleküle, gegebenenfalls über Linkermoleküle, immobilisiert. Die Fängermoleküle sind vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus DNA, Proteinen und Liganden ausgewählt. Vorzugsweise sind die Fängermoleküle Oligonukleotidsonden, die über endständige Amino- oder Thiolgruppen an Linkermoleküle gebunden sind, die wiederum über kovalente und/oder ionische Gruppen an die Porenbegrenzungsfläche gebunden sind.

Die Linkermoleküle sind üblicherweise auf der Basis einer bifunktionellen Silizium-organischen Verbindung. Derartige bifunktionelle Silizium-organische Verbindungen können beispielsweise Alkoxysilan-Verbindungen mit einer oder mehreren terminalen funktionalen Gruppen, ausgewählt aus Epoxy, Glycidyl, Chlor, Mercapto oder Amino, sein. Vorzugsweise ist die Alkoxysilan-Verbindung ein Glycidoxyalkylalkoxysilan, wie z.B. 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan, ein Mercaptoalkylalkoxysilan, wie z.B. γ-Mercaptopropyltrimethoxysilan, oder ein Aminoalkylalkoxysilan, wie z.B. N-β-(aminoethyl) γ-aminopropyltrimethoxysilan. Die Länge der als Spacer zwischen der funktionellen Gruppe, wie z.B. Epoxy bzw. Glycidoxy, welche mit dem eigentlichen Fängermolekül bzw. der Sonde bindet, und der Trialkoxysilangruppe wirkenden Alkylenreste unterliegt dabei keiner Beschränkung. Derartige Spacer können auch Polyethylenglykolreste sein. Die als Fängermoleküle beispielsweise verwendbaren Oligonukleotide können unter Verwendung der Synthesestrategie, wie in Tet. Let. 22, 1981, Seiten 1859 bis 1862, beschrieben, hergestellt werden. Die Oligonukleotide können dabei während des Herstellungsverfahrens entweder an der 5-oder der 3-Endstellung mit terminalen Aminogruppen derivatisiert werden. Eine weitere Möglichkeit der Anbindung solcher Fängermoleküle kann durchgeführt werden, indem zunächst die Porenbegrenzungsflächen bzw. die erste Schicht mit einer Chlorquelle, wie Cl₂, SOCl₂, COCl₂ oder (COCl)₂, gegebenenfalls unter Verwendung eines Radikalinitiators wie Peroxide, Azoverbindungen oder Bu₃SnH, behandelt wird und anschließend eine Umsetzung mit einer entsprechenden nucleophilen Verbindung, wie insbesondere mit Oligonukleotiden bzw. DNA-Molekülen, die terminale primäre Aminogruppen oder Thiolgruppen aufweisen, erfolgt (siehe WO 00/33976). Somit ist es möglich, umfangreiche „Substanzbibliotheken" an den Porenbegrezungsflächen zu immobilisieren.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Trägerstruktur Silizium, Siliziumoxid und/oder Aluminiumoxid. Insbesondere können makroporöse Siliziumstrukturen zum Einsatz kommen. Bevorzugt ist auch die Ausbildung als Mikro-Kanal-Platte aus Glas.

Bevorzugt umfaßt die Flüssigkeit Polyethylenglycol (PEG). Besonders bevorzugt kommt eine Mischung von zumindest zwei Polyethylenglycolen mit unterschiedlichen Kettenlängen zum Einsatz, wobei der Brechungsindex n_Flüssigkeit durch das Mischungsverhältnis der beiden Polyethylenglycole einstellbar ist. Beispielsweise ist für ein partiell oxidiertes Siliziumsubstrat (vgl. insbesondere im Hinblick auf partiell oxidierte Siliziumsubstrate die WO 03/089931 sowie WO 03/089925, welche in diesem Zusammenhang integraler Offenbarungsbestandteil der vorliegenden Anmeldung sind) eine Mischung von Polyethylenglycol mit Molekulargewicht 200 g/mol und Polyethylenglycol mit Molekulargewicht 300 g/mol im Mischungsverhältnis von 1/1 oder 3/4 vorteilhaft. Eine derartige Mischung von PEG200/PEG300 in dem angegebenen Verhältnis weist einen Brechungsindex in dem betreffenden optischen Wellenlängenbereich auf, welcher demjenigen des partiell oxidierten Siliziumsubstrats nahekommt.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Flüssigkeit wasserlösliche Kohlenhydrate und deren Derivate, insbesondere eine Saccharoselösung oder eine Sorbinsäureäthylesterlösung, wobei der Brechungsindex n_Flüssigkeit vorzugsweise über die Konzentration der wasserlöslichen Kohlenhydrate einstellbar ist. Besonders bevorzugt sind beispielsweise für partiell oxidierte Siliziumsubstrate 66 bis 70% Saccharoselösungen, welche Brechungsindices von n = 1,4558 bis 1,4655 aufweisen. Im besonderen Maße ist eine 68,1% Zuckerlösung geeignet, deren Brechungsindex in dem relevanten Wellenlängenbereich n_Flüssigkeit= 1,46085 beträgt und somit im wesentlichen demjenigen des partiell oxidierten Siliziumsubstrats (partOx-Substrat) entspricht. Ferner können mit Vorteil Kleber für die Faseroptik, Medizintechnik und optische Kommunikation als Flüssigkeit Verwendung finden, deren Brechungsindices an die speziellen Bedürfnisse angepaßt werden können. Marktgängige optische Klebstoffe weisen typischerweise einen Brechungsindex von n_Flüssigkeit= 1,46 bis 1,58 auf.

Weiterhin kann als Flüssigkeit Glycerin Verwendung finden, dessen Brechungsindex n_Flüssigkeit= 1,4550 beträgt . Zum Einsatz können auch Silikone kommen, welche beispielsweise als Vergußmassen in der Medizintechnik verwendet werden. Auch organische Substanzen wie beispielsweise Dimethylformamid (Brechungsindex n_Flüssigkeit= 1,42938) und Schwermetallsalze, insbesondere Thallium, können verwendet werden. Diese sind jedoch nur bedingt kompatibel mit "BioChips" oder Microarray-Anwendungen. Generell muß die Abhängigkeit des Brechungsindex von der Wellenlänge des betreffenden Lichts bei der Brechungsindexanpassung berücksichtigt werden.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden weiteren Schritte:

– Anregen von Fluoreszenzlicht der zu untersuchenden Substanz durch Beleuchten der zu untersuchenden Substanz in der zumindest einen Pore entlang eines Anregungsstrahlengangs, bei welchem Anregungslicht im wesentlichen in einem vorbestimmten Anregungswinkelbereich von α bis 180°–α und/oder 180°+α bis –α gemessen von einer Normalenrichtung der flächig ausgebildeten Trägerstruktur auf die Trägerstruktur fällt;
– Detektieren des angeregten Fluoreszenzlichts der zu untersuchenden Substanz entlang eines Detektionsstrahlengangs, bei welchem Fluoreszenzlicht im wesentlichen in einem vorbestimmten Detektionswinkelbereich von –α bis α und/oder 180°–α bis 180°+α gemessen von der Normalenrichtung detektiert wird.

Im Gegensatz zu experimentellen Aufbauten, wie sie herkömmlicherweise für das Auslesen von Fluoroszenzsignalen von Microarrays verwendet wurden (abbildende Fluoreszenzmikroskopie und Laser-Scanning-Mikroskopie) laufen bei der obigen besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens Anregungs- und Detektionsstrahlengang nicht parallel zueinander. Während herkömmlicherweise Anregungs- und Detektionsstrahlengang dasselbe Linsensystem nutzen, um die Trägerstruktur zu beleuchten und das Fluoreszenzlicht zu sammeln, findet bei der obigen erfindungsgemäßen Ausführungsform eine physikalische Trennung der Strahlengänge statt. Durch die bevorzugte erfindungsgemäße Beleuchtungsanordnung, welcher der klassischen Dunkelfeldbeleuchtung ähnlich ist und bei der Anregungs- und Emissionswege physikalisch voneinander getrennt sind, ist garantiert, daß Anregungslicht weder direkt noch über Reflektionen an Oberflächen, insbesondere Porenbegrenzungsflächen, der Trägerstruktur auf den Detektor fallen kann. Durch die geometrische Trennung von Anregungs- und Detektionsstrahlengang in Kombination mit der Minimierung des Brechungsindexhubs zwischen Porenwand und Flüssigkeit kann das Hintergrundsignal, insbesondere das reflektierte Anregungslicht, beim Auslesen der Trägerstruktur nochmals wesentlich vermindert werden. In besonderer Weise eignet sich die vorstehende Ausführungsvariante für Microarrays auf Basis von partiell oxidiertem Silizium.

Neben der weiteren Minimierung des Hintergrundsignals, insbesondere des reflektierten Anregungslichts, zeichnet sich die bevorzugte Ausführungsvariante durch einen mechanisch robusten und einfach zu realisierenden optischen Aufbau aus. Eine Fluoreszenzanregung ist in einfacher Weise mit Hochleistungs-LEDs möglich, welche üblicherweise eine seitliche Abstrahlcharakteristik aufweisen, so daß bei einem geringen Stromverbrauch einfache und kostengünstige portable "Reader" mit hoher Nachweisempfindlichkeit möglich sind.

Durch die "seitliche" Bestrahlung der Trägerstruktur mit Anregungslicht und das Detektieren des Lichts im wesentlichen senkrecht zur Trägerstruktur (d.h. in dessen Normalenrichtung) über einen derartigen Öffnungswinkel, daß kein direktes Licht aus dem Anregungsstrahlengang in das Detektionsobjektiv treten kann, ermöglicht eine nochmals verbesserte Nachweisempfindlichkeit.

Vorzugsweise beträgt der vorbestimmte Anregungswinkelbereich α bis 90° und/oder 270° bis 270°+α. Hierdurch ist eine Anregung als Auflicht-Dunkelfeldanregung möglich. Alternativ oder zusätzlich beträgt der vorbestimmte Anregungswinkelbereich 90° bis 180°–α und/oder 180°+α bis 270°, so daß eine Durchlicht-Dunkelfeldanregung möglich ist.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand begleitender Zeichnungen bevorzugter Ausführungsformen beispielhaft beschrieben. Es zeigt:
1(A) bis (D) schematische Schnittansichten von bevorzugten flächig ausgebildeten Trägerstrukturen mit einer Vielzahl von Poren, in welche eine Flüssigkeit beinhaltend zumindest eine zu untersuchende Substanz eingeleitet ist;
2(A) eine schematische Darstellung von Anregungswinkel- und Detektionswinkelbereich für eine bevorzugte Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß einer Auflicht-Dunkelfeldanregung; und
2(B) eine schematische Ansicht der Anregungswinkel- und Detektionswinkelbereiche für eine bevorzugte Ausführungsvariante eines erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß einer Durchlicht-Dunkelfeldanregung.
1(A) bis (D) zeigen stark schematisierte Schnittansichten durch bevorzugte flächig ausgebildete Trägerstrukturen, welche sich für ein erfindungsgemäßes Nachweisverfahren eignen. Die Schnittebenen verlaufen jeweils parallel zu einer Normalenrichtung N durch die Trägerstruktur. Die flächig ausgebildete Trägerstruktur umfaßt eine Vielzahl von Poren 10, welche sich von einer Oberfläche 12 zur einer der Trägerstruktur gegenüberliegenden Oberfläche 14 durchgängig erstrecken. Benachbarte Poren 10 sind durch Porenwände 16 voneinander getrennt, deren der Pore 10 zugewandte Außenflächen als Porenbegrenzungsflächen 18 bezeichnet werden. Der Brechungsindex n_Porenwand der Porenwand 16 ist vorzugsweise gleich oder ähnlich zu dem Brechungsindex n_Flüssigkeit einer schematisch dargestellten Flüssigkeit 20, welche zumindest eine zu untersuchende Substanz beinhaltet und welche in die Poren 10 der Trägerstruktur eingeleitet ist. Die zu untersuchende Substanz kann auch bereits in einem vorgelagerten Verfahrensschritt in die zumindest eine Pore 10 eingebracht und zumindest teilweise an entsprechende Fängermoleküle an den Porenbegrenzungsflächen 18 immobilisiert sein.
Durch die Minimierung des Brechungsindexhubs zwischen Porenwand 16 und der mit der Flüssigkeit 20 gefüllten Pore 10 kommt es an den Porenbegrenzungsflächen 18 nur zu einer geringen bzw. vernachlässigbaren optischen Streuung bzw. Brechung, wodurch Anregungs- bzw. Detektionslicht effektive ein- bzw. ausgekoppelt werden kann. Dies führt zu einer Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit für die (schwachen) Lumineszenzsignale.
Bei der in 1(A) dargestellten Ausführungsform können die Porenwände 16 beispielsweise aus Siliziumdioxid bestehen. Die Poren 10 weisen vorzugsweise einen Porendurchmesser im Bereich von 500 nm bis 100 μm auf. Vorzugsweise weist das Trägermaterial eine Dicke in Normalenrichtung N von 100 bis 5000 μm auf. Vorzugsweise liegt die Porendichte der Poren 10 im Bereich von 10⁴ bis 10⁸/cm².
1(B) zeigt eine weitere bevorzugte Trägerstruktur für ein erfindungsgemäßes Nachweisverfahren. Bei der in 1(B) gezeigten Trägerstruktur ist zusätzlich eine Kompartmenttrennwand 22 vorgesehen, welche aus einem in dem betreffenden Wellenlängenbereich optisch nicht transparenten Material besteht. Beispielsweise kann die Kompartmenttrennwand 22 Silizium umfassen. Die Kompartmenttrennwand 22 trennt optisch zwei Abschnitte bzw. Kompartments, welche jeweils eine Vielzahl von Poren 10 umfassen können, optisch voneinander.
1(c) zeigt eine weitere bevorzugte Trägerstruktur für ein erfindungsgemäßes Nachweisverfahren. Bei dieser Ausführungsvariante sind die Porenwände 16 unregelmäßig in ihrer Oberfächengestaltung ausgebildet, ohne dabei jedoch Verbindungen zweier benachbarter Poren 10 zuzulassen. Als Materialien kommen wiederum beispielsweise makroporöses Silizium, poröses Siliziumdioxid oder Aluminiumoxid in Betracht. 1(D) zeigt eine weitere bevorzugte Trägerstruktur für ein erfindungsgemäßes Nachweisverfahren, bei welcher die Porenwände 16 Porenverbindungen 24 zwischen benachbarten Poren 10 zulassen. Derartige Porenwände 16 können beispielsweise aus Al₂O₃ ausgebildet sein.
Als Flüssigkeit 20 sind grundsätzlich alle Füllmaterialien geeignet, deren Brechungsindex n_Flüssigkeit an denjenigen der porösen Trägerstruktur angepaßt werden kann, keine Autofluoreszenz zeigt und mit deren Nachweisreaktion in der insbesondere eine Substanzbibliothek tragenden Trägerstruktur kompatibel ist.
2 zeigt schematisch Anregungs- bzw. Detektionsstrahlengänge, welche in Zusammenhang mit einem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren mit reduziertem Brechungsindexhubs mit besonderem Vorteil verwendet werden können. 2(A) zeigt in schematischer Ansicht den Strahlengangsverlauf für eine bevorzugte Auflicht-Dunkelfeldanregung. Die Oberfläche 12 der flächig ausgebildeten Trägerstruktur ist als Referenzebene gemeinsam mit deren Normalenrichtung N dargestellt. Alle Winkelangaben sind bezüglich zu der Normalenrichtung N aufgetragen, wobei eine Winkelauslenkung im Uhrzeigersinn positiv gemessen wird. Insofern entspricht einem Winkel α=0° die Normalenrichtung N. Bei der in 2(A) dargestellten Auflicht-Dunkelfeldanregung erfolgt die Anregung des Fluoreszenzlichts in den Anregungswinkelbereichen A, welche sich von α–90° bzw. 270° bis –α erstrecken. Die Anregung kann hierbei in einem oder in beiden Anregungswinkelbereichen A vorgenommen werden. Der Detektionsstrahlengang ist vom Anregungsstrahlengang physikalisch getrennt, indem lediglich Fluoreszenzlicht in einem Detektionswinkelbereich D von –α bis α, insbesondere bei 0°, gesammelt wird.
2(B) zeigt einen alternativen Anregungsstrahlengang. Bei dieser als Durchlicht-Dunkelfeldanregung bezeichneter Ausführungsvariante findet eine Anregung des Fluoreszenzlichts in einem Anregungswinkelbereich A zwischen 90° und 180°–α bzw. zwischen 180°+α und 270° statt. Wiederum können einer oder beide der Anregungswinkelbereiche A gewählt werden. Die Detektion ist wiederum in einem Detektionswinkelbereich D zwischen –α und α gewählt und ist somit im "Dunkelfeld" der Anregungswinkelbereiche A.
Durch die seitliche Bestrahlung der flächigen Trägerstruktur mit Anregungslicht und Sammeln des Fluoreszenzsignals senkrecht zur Trägerstruktur über einen derartigen Öffnungswinkelbereich, daß kein direktes Licht aus dem Anregungsstrahlengang in das Objektiv treten kann, hat in Kombination mit der Nivellierung des Brechungsindexhubs zwischen Porenwand und Flüssigkeit erhebliche Vorteile im Hinblick auf die erzielbare Nachweisempfindlichkeit. Die vorgestellten Ausführungsvarianten von Auflicht- und Durchlicht-Dunkelfeldanregung können beispielsweise mit einem Lichtmikroskop mit entsprechender Ausstattung (Fluoreszenzfiltern, Dunkelfeldobjektiven, Dunkelfeldkondensor, Beleuchtungsquelle wie Quecksilberdampflampe und LEDs) realisiert werden. Als Beleuchtungsquelle kann ebenso ein Laser dienen. Eine Köhlerbeleuchtung der Trägerstruktur ist bevorzugt. Jedoch können auch andere Beleuchtungsarten, wie beispielsweise die sogenannte kritische Beleuchtung, gewählt werden. In diesem Zusammenhang wird auf die Ausführungen in "Principles Of Optics" von Max Born und Emil Wolf, 7. Auflage, Cambridge Univerity Press, Seiten 595–599 verwiesen, welche insoweit integraler Offenbarungsbestandteil der vorliegenden Anmeldung sind.
Durch die bevorzugte Dunkelfeldanregung ergeben sich gegenüber herkömmlichen experimentellen Aufbauten für das Auslesen von Fluoreszenzsignalen von Microarrays, wie beispielsweise abbildende Fluoreszenzmikroskopie und Laser-Scanning Mikroskopie, erhebliche Empfindlichkeitsvorteile. Bei herkömmlichen experimentellen Aufbauten verlaufen Anregungs- und Detektionsstrahlengang parallel. Beide Strahlengänge nutzen zumeist dasselbe Linsensystem, um die Trägerstruktur zu beleuchten und das Fluoreszenzlicht zu sammeln. Es müssen entsprechend optische Filtersysteme verwendet werden, um Anregungs- und Fluoreszenzlicht wirkungsvoll voneinander zu trennen. Durch die hohe Intensität des Anregungslichts gelangt jedoch bei diesen herkömmlichen experimentellen Aufbauten immer ein Teil des Anregungslichts, das vom Microarraysubstrat reflektiert und gestreut wird, durch das Trägersystem auf den Detektor. Dieser Anteil erhöht das Hintergrundsignal und verschlechtert damit das Fluoreszenzsignal-zu-Hintergrund-Verhältnis.
Durch den erfindungsgemäßen "Dunkelfeld-Aufbau" findet eine physikalische Trennung zwischen dem Anregungs- und dem Detektionsstrahlengang statt. Der Detektionsstrahlengang liegt in dem sogenannten Dunkelfeld des Anregungsstrahlengangs, so daß kein Anregungslicht direkt in den Detektionsstrahlengang gelangen kann.

10: Pore
12: Oberfläche der Trägerstruktur
14: gegenüberliegende Oberfläche der Trägerstruktur
16: Porenwand
18: Porenbegrenzungsfläche
20: Flüssigkeit
22: Kompartmenttrennwand
24: Porenverbindungen
A: Anregungswinkelbereich
D: Detektionswinkelbereich
N: Normalenrichtung der Trägerstruktur

Claims

Verfahren zum Nachweis chemischer und/oder biochemischer Reaktionen und/oder Bindungen mit den Schritten: – Bereitstellen einer flächig ausgebildeten Trägerstruktur, welche über zumindest einen Oberflächenbereich verteilt eine Vielzahl von Poren (10) aufweist, welche sich von einer Oberfläche (12) der Trägerstruktur zu der gegenüberliegenden Oberfläche (14) durchgängig erstrecken, – wobei die Poren (10) durch Porenbegrenzungsflächen (18) von in der Trägerstruktur ausgebildeten Porenwänden (16) begrenzt sind, und – die Porenwände (16) einen Brechungsindex n_Porenwand bei einer Wellenlänge λ aufweisen; – Einleiten einer Flüssigkeit (20) in zumindest eine der Poren (10) der Trägerstruktur, wobei für den Brechungsindex n_Flüssigkeit der Flüssigkeit (20) bei der Wellenlänge λ die Beziehung 0,90·n_Porenwand ≤ n_Flüssigkeit ≤ 1,10·n_Porenwand gilt; – Auskoppeln von Licht von einer zu untersuchenden Substanz, welche in der zumindest einen Pore (10) vorliegt, aus der Pore (10); und – Detektieren des Lichts der zu untersuchenden Substanz.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Licht von der zu untersuchenden Substanz ein durch Absorption oder Reflektion von Anregungslicht erzeugtes Lichtsignal, ein Lumineszenzlichtsignal und/oder ein Chemolumineszenzlichtsignal ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei für den Brechungsindex n_Flüssigkeit der Flüssigkeit (20) bei der Wellenlänge λ die Beziehung 0,95·n_Porenwand ≤ n_Flüssigkeit ≤ 1,05· n_Porenwand und vorzugsweise die Beziehung 0,99·n_Porenwand ≤ n_Flüssigkeit ≤ 1,01·n_Porenwand gilt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei an zumindest einer der Porenbegrezungsflächen (18) zumindest bereichsweise Fängermoleküle, gegebenenfalls über Linkermoleküle, immobilisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Fängermoleküle aus der Gruppe bestehend aus DNA, Proteinen und Liganden ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Fängermoleküle Oligonukleotidsonden sind, die über endständige Amino- oder Thiolgruppen an Linkermoleküle gebunden sind, die wiederum über kovalente und/oder ionische Gruppe an die Porenbegrenzungsfläche (18) gebunden sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Trägerstruktur Silizium, Siliziumoxid und/oder Aluminiumoxid umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Flüssigkeit (20) Polyethylenglycol umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Flüssigkeit (20) eine Mischung von zumindest zwei Polyethylenglycolen mit unterschiedlichen Kettenlängen umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Flüssigkeit (20) wasserlösliche Kohlenhydrate und deren Derivate umfaßt, wobei der Brechungsindex n_Flüssigkeit über die Konzentration der wasserlöslichen Kohlenhydrate einstellbar ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche mit den weiteren Schritten: – Anregen von Fluoreszenzlicht der zu untersuchenden Substanz durch Beleuchten der zu untersuchenden Substanz in der zumindest einen Pore (10) entlang eines Anregungsstrahlengangs, bei welchem Anregungslicht im wesentlichen in einem vorbestimmten Anregungswinkelbereich (A) von α bis 180°–α und/oder 180°+α bis –α gemessen von einer Normalenrichtung (N) der flächig ausgebildeten Trägerstruktur auf die Trägerstruktur fällt; – Detektieren des angeregten Fluoreszenzlichts der zu untersuchenden Substanz entlang eines Detektionsstrahlengangs, bei welchem Fluoreszenzlicht im wesentlichen in einem vorbestimmten Detektionswinkelbereich (D) von –α bis α und/oder 180°–α bis 180°+α gemessen von der Normalenrichtung (N) detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der vorbestimmte Anregungswinkelbereich (A) α bis 90° und/oder 270° bis 270°+α beträgt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der vorbestimmte Anregungswinkelbereich (A) 90° bis 180°–α und/oder 180°+α bis 270° beträgt.