ES2255298T3 - Biochip y dispositivo de lectura de un biochip que comprende una pluralidad de zonas de reconocimiento molecular. - Google Patents
Biochip y dispositivo de lectura de un biochip que comprende una pluralidad de zonas de reconocimiento molecular.Info
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Abstract
Dispositivo de lectura en tiempo real de un biochip que comprende una pluralidad de zonas (110) de reconocimiento y una pluralidad de marcas (122, 124, 124a, 221, 222, 223, 225, 227) ópticas de posicionamiento, comprendiendo las zonas de reconocimiento fragmentos de ADN o ARN y ocupando, con respecto a las marcas ópticas de posicionamiento, emplazamientos predeterminados, comprendiendo el dispositivo: - una cabeza (20) óptica apta para proyectar una luz incidente sobre el biochip, - medios (14 y/o 24) de desplazamiento relativo de la cabeza y de dicho biochip, aptos para efectuar un barrido del biochip, y comprendiendo medios (14) de desplazamiento macroscópico (a gran escala) y medios (24) de desplazamiento microscópico (a pequeña escala), - un primer sistema (40) óptico, llamado sistema de análisis, asociado a dicha cabeza óptica para proyectar sobre al menos un primer detector (42) electro-óptico una luz susceptible de proceder de las zonas de reconocimiento, - un segundo sistema (60)óptico, llamado sistema de posicionamiento, asociado a la cabeza óptica para proyectar sobre al menos un segundo detector (62) electro-óptico una luz susceptible de proceder de al menos una marca de posicionamiento, y - servomecanismos (70) de los medios de desplazamiento de dicha cabeza óptica para controlar los medios de desplazamiento en función de señales eléctricas del detector electro-óptico del sistema (62) óptico de posicionamiento, estando conectados los servomecanismos (70) a los medios (24) de desplazamiento microscópico, caracterizado porque la cabeza (20) óptica comprende una lente (22) de focalización y al menos un accionador (24) de desplazamiento axial y/o lateral de enfoque de la lente (22), y comprendiendo un tercer sistema (80) óptico, llamado de enfoque, asociado a la cabeza (20) óptica, para proyectar sobre un tercer detector electro-óptico una luz procedente de la reflexión de la luz incidente sobre el biochip, y servomecanismos (70) de enfoque asociados al accionador(24) para controlar el desplazamiento de enfoque de la lente.
Description
Biochip y dispositivo de lectura de un biochip
que comprende una pluralidad de zonas de
\hbox{reconocimiento
molecular.}
La presente invención se refiere a un biochip que
comprende una pluralidad de zonas de reconocimiento molecular y a
un dispositivo de lectura de un biochip así. Se entiende por
biochip, un chip o un soporte que presenta en su superficie una o
varias zonas, llamada zonas de reconocimiento, equipadas con
moléculas que presentan propiedades de reconocimiento. En el resto
del texto, y por extensión de lenguaje, el término biochip se
utiliza indistintamente de la finalidad del chip para un análisis
químico o biológico.
Las moléculas de reconocimiento pueden ser, por
ejemplo, oligonucleótidos, polinucleótidos, proteínas tales como
anticuerpos o péptidos, lectinas o cualquier otro sistema de tipo
ligando-receptor. En particular, las moléculas de
reconocimiento pueden comprender fragmentos de ADN o de ARN.
Cuando el biochip se pone en contacto con una
muestra que ha de analizarse, las moléculas de reconocimiento son
susceptibles de interaccionar, por ejemplo por complejación o por
hibridación con las moléculas llamadas "moléculas objetivo" de
la muestra. Así, al equipar un biochip con una pluralidad de zonas
de reconocimiento con diferentes moléculas de reconocimiento
selectivamente sensibles a diferentes moléculas objetivo, es posible
detectar y eventualmente cuantificar una gran variedad de moléculas
contenidas en la muestra. Cada zona de reconocimiento comprende un
solo tipo de moléculas idénticas.
Los complejos formados sobre el biochip pueden
localizarse mediante una marcación fluorescente aplicada a las
moléculas objetivo de la muestra.
El dispositivo de lectura objeto de la invención
está destinado a facilitar la operación de lectura de las moléculas
marcadas o no, susceptibles de estar presentes en las zonas de
reconocimiento de un chip.
En efecto, la lectura de zonas de reconocimiento
puede realizarse también sin presencia de un marcador, conociéndose
bien una tecnología de este tipo en el estado de la técnica. Entre
los métodos directos de detección de hibridadción, pueden
distinguirse especialmente la detección de la variación de la masa,
de la variación del espesor y de la variación de índice. Se conocen
igualmente métodos fototérmicos que se describen en el documento (1)
cuya referencia se precisa al final de la descripción. Finalmente,
Boccara et al. describen en los documentos (2) y (3) una
técnica de deflexión fototérmica. Perfeccionamientos de esta técnica
son posteriormente los aparatos del documento (4). Las referencias
de estos documentos se precisan al final de la descripción.
Así, la invención encuentra aplicación en los
campos del análisis biológico y químico.
Aplicaciones particulares en el campo del
análisis biológico pueden ser la búsqueda de polimorfismos y
mutaciones, la secuenciación por hibridación y el seguimiento de la
expresión de genes.
El número de zonas de reconocimiento de un chip
es variable en función del tipo de análisis que se desee realizar.
Además, se distinguen los chips llamados de "baja densidad" que
comprenden de algunas decenas a algunas centenas de zonas de
reconocimiento y los chips llamados "de alta densidad" que
pueden comprender de varios millares a varias centenas de millares
de tales zonas.
Sobre los chips de alta densidad, las zonas de
reconocimiento presentan tamaños reducidos. En efecto, la extensión
de las zonas es inferior a 100 \mum, e incluso inferior a 10
\mum.
Como se ha indicado anteriormente, la marcación
de complejos formados sobre un biochip recurre a marcadores
fluorescentes. Los marcadores, por ejemplo, la fluoresceína o la
ficoeritrina, pueden acoplarse directamente sobre las moléculas
objetivo de la muestra que va a analizarse. Las moléculas objetivo
pueden marcarse también por medio de agrupamientos de
reconocimiento indirecto, tales como biotina o digoxigenina.
Así, cuando las moléculas de reconocimiento de
una zona de reconocimiento dada han interaccionado o se han
hibridado con las moléculas objetivo marcadas, el marcador
fluorescente se encuentra fijado a estas zonas.
La lectura de un biochip comprende la excitación
de los marcadores fluorescentes bajo el efecto de una luz llamada
luz de excitación dirigida sobre el chip, y el registro, para cada
zona de reconocimiento, de la fluorescencia provocada por la luz de
excitación.
La detección de una fluorescencia en una zona de
reconocimiento permite, conociendo el tipo de molécula de
reconocimiento presente en esta zona, concluir la presencia en la
muestra que ha de analizarse de moléculas objetivo (marcadas)
susceptibles de interaccionar con la molécula de reconocimiento
conocida. Eventualmente puede medirse la intensidad de la
fluorescencia para deducir la concentración de moléculas objetivo en
cuestión de la muestra.
A modo de ilustración de estas técnicas,
especialmente en los campos de la biología genética, se puede
remitir a los documentos (6), (7) y (8) cuyas referencias se
precisan al final de la presente descripción.
Para los biochips de baja densidad, la lectura de
las zonas de reconocimiento puede realizarse con estaciones de
formación de imágenes equipadas con cámaras de acoplamiento de carga
(CCD). No obstante, estas estaciones están mal adaptadas a los
chips de alta densidad. En efecto, las cámaras CCD deberían
presentar un número considerable de píxeles de detección y, dado
que los flujos de luz de fluorescencia son particularmente fiables
para los chips de alta densidad, las cámaras deberían además
refrigerarse para mejorar su razón de señal con respecto a
ruido.
ruido.
Así, para los chips de alta densidad, se recurre
a escáneres de fluorescencia que permiten barrer el chip para
analizar sucesivamente las zonas de reconocimiento.
Estos escáneres están equipados con un sistema
óptico confocal, asociado a un detector fotoeléctrico, para
registrar la fluorescencia de cada zona. El escáner permite observar
objetos con una muy buena resolución espacial (de 1 a 10 \mum) y
el sistema óptico confocal permite sortear los efectos de emisiones
luminosas parásitas (autofluorescencia, reflexión
especular...).
A modo de ilustración de un escáner para chips de
alta densidad, se puede remitir al documento (4) cuya referencia se
indica igualmente al final de la descripción.
Los escáneres de fluorescencia emiten señales
eléctricas que se captan para formar una imagen, en dos dimensiones,
del biochip. Las señales se aprovechan también para reconocer la
estructura espacial de la superficie del biochip y para localizar y
delimitar las zonas de reconocimiento que en él se encuentran.
Finalmente, la intensidad de la señal para cada
zona de reconocimiento se registra como resultado del análisis.
Estos resultados de análisis pueden
posteriormente ser objeto de un tratamiento informático adaptado
para concluir una información biológica o químicamente
pertinente.
Parece que el tratamiento de las señales indicado
anteriormente presenta el inconveniente de precisar un gran número
de puntos de medición, o píxeles, para cada zona de
reconocimiento.
En efecto, la delimitación precisa de cada zona
de reconocimiento precisa disponer de una densidad de
píxeles-imágenes suficiente para cada zona de
reconocimiento.
Se observa que, en la práctica, para realizar un
tratamiento de la señal en condiciones aceptables, se precisa un
número de píxeles del orden de 36 a 64 para cada zona de
reconocimiento, según su tamaño.
Así, el tratamiento de la señal para biochips de
alta densidad requiere medios informáticos de tratamiento y de
memorización considerables. Por tanto el tratamiento es costoso.
Además, la segmentación de la imagen según las
zonas de reconocimiento no es perfectamente fiable.
Los documentos (9) y (10), cuyas referencias se
precisan al final de la presente descripción, describen otras
posibilidades de lectura de un biochip que permiten evitar en cierta
medida las dificultades anteriores.
El documento (9) prevé disponer sobre el chip
elementos de reconocimiento y de localización que permiten facilitar
la lectura, y permiten considerar la lectura de biochips utilizando
dispositivos de lectura tales como los lectores de discos ópticos
compactos (CD-ROM).
En efecto, en el documento (9), los autores
describen un tratamiento bioquímico de biochips con el fin de
hacerlos legibles en un dispositivo de lectura de difusión general
(especialmente los lectores de discos ópticos compactos
CD-ROM). Antes del análisis de la muestra que
contiene las moléculas objetivo que han de analizarse, las zonas de
reconocimiento molecular del biochip se recubren de una película
reflectante formada por bolas metálicas fijadas a su superficie por
moléculas "puente". Estas bolas reflectantes están
funcionalizadas para poder fijar igualmente moléculas objetivo de
la muestra. Durante la hibridación, una misma molécula objetivo
debe por tanto fijarse a dos puntos: por un lado a la superficie del
biochip, en las zonas de reconocimiento molecular, y por otro lado
a la superficie de una de las bolas metálicas situada por encima de
esta zona de reconocimiento. Tras la hibridación, un tratamiento
químico apropiado rompe las moléculas puente que fijan las bolas
metálicas a la superficie, y se aclara la superficie del biochip.
Tan solo quedan presentes las bolas metálicas retenidas entonces en
la superficie por un número mínimo de moléculas objetivo, y se
forman los mismos "bits" de información biológica.
Con el tratamiento propuesto en el documento (9),
es necesaria una etapa bioquímica suplementaria para el análisis.
Ésta consiste en la escisión de las moléculas puente. Además, la
hibridación de las moléculas objetivo sobre las zonas de
reconocimiento se ralentiza mucho por la presencia de las bolas
metálicas que disminuyen considerablemente la velocidad de difusión
de las moléculas objetivo hacia la superficie que soporta las zonas
de reconocimiento. Entonces el análisis corre el riesgo de ser muy
lento. Además, la relación que existe entre el número de bolas
metálicas que quedan finalmente agarradas a la superficie y la
concentración inicial de moléculas objetivo en la muestra no es una
relación que permita una fácil cuantificación. Se trata más bien de
una relación escalonada. (Por debajo de un umbral, las bolas no se
quedan agarradas; por encima, se quedan agarradas. La gama dinámica
en la que el número de bolas que quedan es intermediario, y por
tanto en la que es posible una cuantificación, es probablemente
muy
débil).
débil).
Según el documento (10), el biochip está equipado
con marcas asociadas a las zonas de reconocimiento. No obstante,
estas marcas son distintas de las moléculas de reconocimiento y
están separadas físicamente de las zonas de reconocimiento. Las
marcas pueden detectarse independientemente de una reacción de
hibridación o de complejación durante el barrido del biochip.
Una vez conocida la posición de las marcas, puede
medirse el tiempo transcurrido entre la detección sucesiva de dos
marcas para establecer una función que asocie la posición relativa
del escáner sobre el biochip. Esta función puede servir para
determinar con más precisión el lugar de las zonas de reconocimiento
sobre el biochip.
El uso de marcas sobre el biochip permite, en
definitiva, mejorar la localización de las zonas de medición y
facilitar así la lectura.
Sin embargo, para guiar con precisión el sistema
óptico del escáner sobre las zonas de reconocimiento conviene
controlar de forma suficientemente fina el desplazamiento relativo
del biochip y/o del sistema óptico de lectura del escáner.
Este control no supone demasiadas dificultades
cuando las zonas de reconocimiento son suficientemente grandes y
poco numerosas. El desplazamiento relativo del biochip y del sistema
óptico puede realizarse de forma eficaz con medios mecánicos
relativamente poco costosos.
Por el contrario, para chips de alta densidad
cuyas zonas de reconocimiento presentan dimensiones que no superan
algunas micras, son indispensables medios mecánicos extremadamente
precisos para garantizar un barrido correcto de las zonas de
reconocimiento, y la obtención de una imagen clara y no
deformada.
También son indispensables medios mecánicos
extremadamente precisos para obtener un barrido con una velocidad
regular de las zonas de reconocimiento de tamaño pequeño para poder
corregir la imagen obtenida y aprovechar la imagen en función del
desplazamiento.
A modo de ilustración, para un chip de alta
densidad, que comprende por ejemplo 300 x 300 zonas de
reconocimiento adyacentes con 20 \mum de lado, y para un muestreo
de medición típico de 7 x 7 puntos, se necesita una resolución de
desplazamiento de 3 \mum, una precisión de este desplazamiento de
1 \mum (\pm 0,5 \mum) y una repetibilidad del posicionamiento
de 1 \mum (\pm 0,5 \mum). La velocidad de desplazamiento debe
ser constante y el paralelismo de los desplazamientos para el
barrido debe garantizarse a \pm 0,3 mrad. Un mecanismo de bajo
coste no presenta estas características.
Por otro lado, para garantizar el enfoque del
sistema óptico, antes de la lectura del chip, hay que orientar el
chip en el espacio y desplazarlo con una resolución de 10 \mum,
una precisión de aproximadamente 5 \mum y una repetibilidad del
orden de 10 \mum. Estas características se indican para una
profundidad de sección de 100 \mum del sistema óptico. La
reducción de la profundidad de sección a 10 \mum impone por tanto,
para el enfoque, una resolución mínima de 2,5 \mum, una precisión
de 0,5 \mum y una repetibilidad de 1 \mum.
La exigencia de medios mecánicos de precisión
hace que los dispositivos de lectura de biochips sean
particularmente costosos.
Además, como la superficie de las zonas de
reconocimiento de los biochips de alta densidad es débil, es
necesario realizar el barrido de los biochips de forma lenta para
recoger una cantidad de energía luminosa suficiente para cada
muestreo de cada zona de reconocimiento.
Ahora bien, un barrido lento hace que el análisis
del biochip sea exageradamente largo puesto que implica un número
elevado de zonas de reconocimiento.
La cantidad de luz producida por la fluorescencia
puede aumentarse ligeramente excitando los marcadores de las
moléculas objetivo por medio de láseres potentes. No obstante, la
utilización de tales equipos aumenta aún más el coste de los
dispositivos de lectura.
El estado de la técnica se ilustra también en los
documentos (11), (12) y (13). El documento (11) se refiere a la
detección y a la cuantificación de células, pero no al
reconocimiento molecular. Los documentos (12) y (13) describen
sistemas de lectura con mecanismos de posicionamiento lentos que no
suponen problemas de una lectura "en tiempo real".
Un objetivo de la presente invención es proponer
un dispositivo de lectura de biochips que no presente las
dificultades mencionadas anteriormente.
Un objetivo particular es proporcionar un
dispositivo de este tipo que sea de un coste reducido y que permita
leer biochips de alta densidad.
También es un objetivo proponer un dispositivo de
este tipo que permita realizar un barrido más rápidamente de los
biochips, y reducir así el tiempo de análisis, sin comprometer la
calidad de las mediciones.
Otro objetivo es además proponer un dispositivo
capaz de localizar rápidamente la posición y la orientación de una
zona de reconocimiento sin realizar una adquisición de sobremuestreo
de la imagen del chip.
La invención tiene igualmente como objetivo
proponer un biochip adaptado a dicho dispositivo de lectura para
reducir al máximo el coste de los mecanismos de barrido.
Para alcanzar estos objetivos, la invención tiene
más precisamente como objeto un dispositivo de lectura en tiempo
real de un biochip que comprende una pluralidad de zonas de
reconocimiento y una pluralidad de marcas ópticas de
posicionamiento, comprendiendo las zonas de reconocimiento
fragmentos de ADN o de ARN y ocupando con respecto a las marcas
ópticas de posicionamiento, emplazamientos predeterminados,
comprendiendo los dispositivos:
- -
- una cabeza óptica apta para proyectar sobre el biochip una luz incidente,
- -
- medios de desplazamiento relativo de la cabeza y de dicho biochip, aptos para realizar un barrido del biochip y que comprenden medios de desplazamiento macroscópico (a gran escala) y medios de desplazamiento microscópico (a pequeña escala),
- -
- un primer sistema óptico, llamado sistema de análisis, asociado a dicha cabeza óptica para proyectar sobre al menos un primer detector electro-óptico una luz susceptible de proceder de las zonas de reconocimiento,
- -
- un segundo sistema óptico, llamado sistema de posicionamiento, asociado a la cabeza óptica para proyectar sobre al menos un segundo detector electro-óptico una luz susceptible de proceder de al menos una marca de posicionamiento, y
- -
- servomecanismos de los medios de desplazamiento de dicha cabeza óptica para controlar los medios de desplazamiento en función de señales eléctricas del detector electro-óptico del sistema óptico de posicionamiento, estando los servomecanismos conectados a los medios de desplazamiento microscópico, caracterizado por el hecho de que la cabeza (20) óptica comprende una lente (22) de focalización y al menos un accionador (24) de desplazamiento axial y/o lateral de enfoque de la lente (22), y comprendiendo un tercer sistema (80) óptico, llamado de enfoque, asociado a la cabeza (20) óptica, para proyectar sobre un tercer detector electro-óptico una luz procedente de la reflexión de la luz incidente sobre el biochip, y servomeca- nismos (70) de enfoque unidos al accionador (24) para controlar el desplazamiento de enfoque de la lente.
En lo sucesivo en el texto, la expresión "luz
susceptible de proceder de las moléculas marcadas..." se empleará
por comodidad para designar la luz susceptible de emitirse en
fluorescencia, o reflejada, o difundida, o refractada desde las
zonas de reconocimiento, en respuesta a la luz incidente, por
ejemplo por agrupamientos específicos que equipan las moléculas
marcadas o no.
Los desplazamientos microscópicos se utilizan
para afinar la posición de la cabeza óptica según al menos uno de
los tres ejes. (Un primer eje que corresponde al eje óptico del
primer sistema óptico, y dos ejes perpendiculares al primer
eje).
Se entiende por zona de reconocimiento una parte
del biochip que presenta en su superficie moléculas que presentan
una propiedad de reconocimiento de un tipo dado de moléculas
objetivo.
El servomecanismo del barrido de la cabeza óptica
por las señales eléctricas del sistema de posicionamiento permite
corregir en tiempo real el desplazamiento relativo del chip y de la
cabeza óptica, y obtener un posicionamiento extremadamente preciso
con medios mecánicos de desplazamiento poco costosos. En particular,
se hace posible utilizar medios mecánicos tales como los
accionadores que equipan normalmente los lectores de discos
compactos.
El servomecanismo permite además obtener un
desplazamiento relativo homogéneo en velocidad en vista a una
lectura en continuo de la fluorescencia de las zonas de
reconocimiento.
Resulta conveniente, a este respecto, precisar
que el sistema óptico de posicionamiento, asociado a los
servomecanismos, constituye un medio que permite la lectura en
tiempo real del biochip. En otras palabras, este medio permite
conocer en tiempo real la posición de lectura con respecto a las
zonas de reconocimiento y/o marcas ópticas de posicionamiento.
Además, la precisión del enfoque obtenida por el
servomecanismo permite utilizar un sistema óptico confocal con una
débil profundidad de sección para reducir la influencia de una luz
parásita procedente del sustrato del biochip. Así, puede obtenerse
una mejor dinámica de señal.
Los sistemas ópticos del dispositivo de lectura,
libres de la luz parásita, gracias a una débil profundidad de
sección, pueden realizarse con una abertura numérica más grande y
recoger en consecuencia más cantidad de luz. Por consiguiente, una
lectura más rápida es posible y/o la fuente de luz incidente puede
ser menos potente.
Gracias a los servomecanismos del enfoque, la
lectura de las zonas de reconocimiento puede realizarse de forma
continua al mismo tiempo que el enfoque. Esta característica permite
además no perder la marca sobre el biochip y permite aumentar la
precisión de las mediciones, independientemente de las condiciones
de barrido.
Según una realización particular simplificada del
dispositivo, éste puede comprender un sistema óptico único que
incluye el primer y el segundo sistema óptico y al menos un detector
electro-óptico común al primer y al segundo sistema óptico,
recibiendo dicho detector óptico común no sólo la luz procedente de
las zonas de reconocimiento molecular, sino además la luz
procedente de las marcas de posicionamiento. El detector común está
por tanto unido a un sistema de tratamiento de señal y a
servomecanismos del barrido de la cabeza óptica.
En esta realización, el detector óptico común
emite por consiguiente señales que sirven al mismo tiempo para el
análisis de la fluorescencia y para el servomecanismo de
desplazamiento relativo del chip y de la cabeza óptica
(barrido).
La invención se refiere igualmente a un biochip
que comprende una pluralidad de zonas de reconocimiento y una
pluralidad de marcas ópticas de posicionamiento.
Según la invención, las zonas de reconocimiento
se superponen, total o parcialmente, a las marcas ópticas de
posicionamiento recubriendo todas o parte de dichas marcas.
Las marcas ópticas de posicionamiento asociadas a
las zonas de reconocimiento comprenden, por ejemplo, intervalos que
reflejan la luz de excitación. Permiten orientar el biochip,
localizar los emplazamientos de las zonas de reconocimiento y
realizar un barrido preciso, independientemente del hecho de que
haya tenido lugar una hibridación o no. Las marcas ópticas de
posicionamiento pueden presentarse particularmente en forma de
pistas, llamadas pistas de guiado.
Según un aspecto particular, las marcas de
posicionamiento pueden concebirse de modo que presenten para la luz
de lectura incidente una cierta reflectividad, diferente de la de
las zonas de reconocimiento adyacentes.
Según una posibilidad particular de realización
del chip, una marca óptica puede estar asociada, respectivamente, a
cada zona de reconocimiento. De este modo, no es necesario formar
una imagen del conjunto del biochip para conocer el emplazamiento
de cada zona.
Así, la posibilidad de determinar con precisión
el emplazamiento de las zonas de reconocimiento permite realizar
mediciones precisas, sin sobremuestreo, y con un número de píxeles
reducido para cada zona de reconocimiento.
Además, puesto que cada zona de reconocimiento
está marcada, es posible realizar un análisis local para una o
varias zonas dadas desplazando la cabeza óptica o el chip, con el
fin de dirigir directamente la cabeza frente a la o las zonas
deseadas.
Se ofrecen varias posibilidades para registrar la
luz procedente de las zonas de reconocimiento del chip.
Según una primera posibilidad puede inmovilizarse
la cabeza óptica frente a una zona de reconocimiento y realizar una
adquisición de la señal durante un tiempo determinado, después pasar
a una zona siguiente.
Como se ha indicado anteriormente, las marcas
ópticas y los servomecanismos permiten posicionar la
cabeza con suficiente precisión para que pueda realizarse un análisis fiable. Además, las marcas ópticas permiten localizar con precisión una zona de reconocimiento incluso en un caso en el que ésta no emita nada de luz de
fluorescencia.
cabeza con suficiente precisión para que pueda realizarse un análisis fiable. Además, las marcas ópticas permiten localizar con precisión una zona de reconocimiento incluso en un caso en el que ésta no emita nada de luz de
fluorescencia.
Las señales de los detectores también pueden
adquirirse "al vuelo", desplazando de forma continua la cabeza
óptica a lo largo de una pluralidad de zonas de reconocimiento
situadas una al lado de otra, de tal manera que las zonas de
reconocimiento constituyen un recubrimiento de la superficie activa
del biochip, por ejemplo por yuxtaposición. En este caso se
integran las señales para determinar la cantidad de luz recibida
durante el tiempo empleado para barrer una o varias zonas de
reconocimiento.
No obstante, las fluctuaciones de la velocidad de
desplazamiento son susceptibles de afectar al análisis de la
cantidad de luz emitida por unidad de tiempo por las zonas de
reconocimiento.
Así, según una segunda posibilidad de análisis,
pueden normalizarse las señales adquiridas en función de un tiempo
transcurrido entre el paso de la cabeza óptica frente a las marcas
de posicionamiento sucesivas asociadas a las zonas de
reconocimiento recorridas.
Según una tercera posibilidad que corresponde
igualmente a una adquisición "al vuelo", puede controlarse por
servomecanismos de forma continua la velocidad de desplazamiento
relativo de la cabeza óptica y del chip cronometrando el tiempo
transcurrido entre el paso de la cabeza frente a las marcas
sucesivas.
La invención se refiere también a un biochip apto
para leerse por un dispositivo tal como se describe anteriormente,
en el que las zonas de reconocimiento molecular están superpuestas
total o parcialmente a las marcas de posicionamiento, de forma que
las recubren total o parcialmente.
Esta característica es particularmente ventajosa
porque evita una saturación de la superficie del biochip por las
marcas de posicionamiento. Permite en efecto dejar una mayor parte,
incluso la totalidad, de la superficie del chip disponible para las
zonas de reconocimiento molecular.
Las marcas de posicionamiento permiten orientar
el biochip pero también localizar e identificar las zonas de
reconocimiento. Para ello ocupan preferiblemente, con respecto a las
marcas de posicionamiento, emplazamientos predeterminados.
Pueden ser suficientes marcas de posicionamiento
muy finas para posicionar el biochip y/o identificar las zonas de
reconocimiento.
Sin embargo, resulta que sólo se obtiene una
buena precisión con marcas de posicionamiento cuya superficie no es
insignificante en comparación con las de las zonas de reconocimiento
molecular a las que están asociadas.
La característica según la cual las marcas de
posicionamiento están dispuestas de manera que se solapen total o
parcialmente por las zonas de reconocimiento molecular permite
aumentar su superficie, y así mejorar el servomecanismo de
posicionamiento del biochip con respecto al dispositivo de lectura.
La precisión de la lectura aumenta igualmente.
Cuando las marcas de posicionamiento se presentan
en forma de pistas de guiado destinadas a ser seguidas por un haz
de luz incidente para el servomecanismo de posicionamiento, es
deseable que la longitud de la pista no sea insignificante en
comparación con la longitud del haz de luz.
Un marcado de la pista con una excelente posición
puede obtenerse con marcas de posicionamiento cuya superficie ocupa
del orden del 30% al 100% de la superficie total del chip.
Debido al coste de fabricación de los biochips,
con respecto a su superficie útil, el solapamiento de las zonas de
reconocimiento y las marcas de posicionamiento se presenta además
como una ventaja económica.
Además, el aumento de la superficie de las marcas
de posicionamiento facilita la lectura y permite utilizar
dispositivos de lectura con una potencia luminosa menor y con una
menor sensibilidad.
Esto reduce entonces igualmente el coste de los
dispositivos de lectura.
Finalmente, la posibilidad de utilizar una fuente
de luz de menor intensidad para el posicionamiento, reduce los
riesgos de inhibir o quemar los marcadores fluorescentes
susceptibles de estar presentes en las zonas de reconocimiento
molecular.
Además, las marcas de posicionamiento pueden
concebirse para ser sensiblemente transparentes al menos a una luz
de fluorescencia susceptible de emitirse desde las zonas de
reconocimiento en respuesta a al menos una luz incidente de
lectura.
Cuando el haz láser efectúa una lectura por la
cara posterior, la reflectividad de las marcas de posicionamiento
y/o de un interfaz entre el material de revestimiento de las zonas
de reconocimiento y las marcas de posicionamiento puede
seleccionarse para ser superior al 0%, preferiblemente comprendida
entre el 1 y el 10% y más precisamente entre el 1 y el 5%.
Cuando el haz láser efectúa una lectura por la
cara anterior, la reflectividad de las marcas de posicionamiento
y/o de una interfaz entre el material de revestimiento de las zonas
de reconocimiento y las marcas de posicionamiento puede
seleccionarse para ser superior al 0%, es decir entre el 1 y el
100%.
Se entiende por cara anterior y posterior del
biochip, respectivamente, la cara revestida por moléculas de
reconocimiento en las zonas de reconocimiento (cara anterior) y la
cara libre opuesta (cara posterior).
Por otro lado, el biochip puede comprender entre
las marcas de posicionamiento y las zonas de reconocimiento una
capa intercalada de un material que presenta una reflectividad
diferente de la de las marcas de posicionamiento. La cara
intercalada permite entonces obtener una reflexión determinada de la
luz incidente sobre las marcas de posicionamiento,
independientemente del revestimiento de las zonas de reconocimiento
molecular, e independientemente del medio líquido o gaseoso con el
que se pone en contacto el biochip.
Se pueden concebir diferentes posibilidades para
la realización de marcas de posicionamiento. Éstas pueden
comprender en particular una sucesión de regiones que presentan
alternativamente diferentes propiedades para la luz incidente.
Según una primera posibilidad, las regiones
adyacentes de las marcas de posicionamiento pueden representar
respectivamente una diferencia de camino óptico para la luz
incidente. La diferencia de camino óptico puede obtenerse en
particular realizando las regiones adyacentes con materiales
diferentes y/o con espesores diferentes, y/o con dopajes
diferentes. La elección del material o de los dopajes diferentes
para las regiones adyacentes, les confieren índices de refracción
diferentes.
Según otra posibilidad para la realización de
marcas de posicionamiento, éstas pueden comprender intervalos de
material birrefringente susceptibles de modificar la orientación de
la polarización de una luz de lectura incidente polarizada.
Según otra posibilidad más, las regiones
adyacentes de las marcas de posicionamiento pueden realizarse
respectivamente con materiales que presentan reflectividades
diferentes.
Otras características y ventajas de la presente
invención se deducirán mejor de la descripción que sigue, en
referencia a las figuras de los dibujos adjuntos. Esta descripción
se da a título puramente ilustrativo y no limitativo.
- La figura 1 es una representación esquemática
simplificada de un dispositivo de lectura según la invención.
- La figura 2 es una representación esquemática
particular de un detalle de la figura 1.
- La figura 3 es una vista desde abajo,
esquemática y simplificada, de un biochip según la invención apto
para leerse por el dispositivo de la figura 1.
- La figura 4 es una vista desde abajo,
esquemática y simplificada, de un biochip según la invención, e
ilustra un ejemplo de secuencia de lectura de tal biochip.
- Las figuras 5 a 9 son cortes esquemáticos de
partes de biochips según la invención, que ilustran otras
posibilidades de realización.
La referencia 10 en la figura 1 designa un
biochip que comprende una pluralidad de zonas de reconocimiento
dotadas de moléculas de reconocimiento específicas, y eventualmente
de pistas de guiado y/o de marcas ópticas de posicionamiento
asociadas a las zonas de reconocimiento. Estos elementos se
describen más detalladamente a continuación en el texto y no se
presentan en la figura 1 por motivos de simplicidad.
En el ejemplo descrito, las moléculas de
reconocimiento específicas están marcadas por agrupamientos
fluorescentes, pero éstos pueden sustituirse por agrupamientos que
puedan reflejar, difundir o difractar la luz, sin salirse del marco
de la invención.
El chip se dispone frente a un dispositivo 12 de
lectura. Este dispositivo está destinado a barrer las zonas de
reconocimiento para excitar las moléculas, que llevan marcadores
fluorescentes, fijadas sobre las zonas de reconocimiento, y para
registrar una luz de fluorescencia producida por estas
moléculas.
El barrido de las zonas de reconocimiento se
realiza por un desplazamiento relativo entre el dispositivo 12 de
lectura o una parte de éste y el biochip 10.
En el ejemplo de la figura 1, el desplazamiento
macroscópico relativo se obtiene por medio de accionadores 14, por
ejemplo, accionadores a motor que desplazan el biochip 10. Un
desplazamiento microscópico de la lente 22 se obtiene por medio de
un accionador 24 electromagnético. El biochip, de forma rectangular,
se desplaza en un plano perpendicular a un eje \Omega óptico del
dispositivo de lectura.
Este plano es igualmente perpendicular al plano
de la figura.
El desplazamiento puede tener lugar según dos
direcciones x e y perpendiculares indicadas en la figura.
El dispositivo 12 de lectura comprende una cabeza
20 óptica con una lente 22 de focalización que presenta un eje
\Omega óptico. La lente de la cabeza óptica tiene una doble
función: dirigir hacia el biochip una luz de excitación y recoger
una luz de fluorescencia emitida en respuesta a la luz de
excitación.
La luz de excitación es una luz monocromática que
presenta una primera longitud de onda, por ejemplo del orden de 633
nm. Se proporciona por un láser 30 cuyo haz se dirige hacia la
cabeza 20 óptica por medio de un espejo 32 dicroico. La lente 22 de
focalización está prevista para focalizar el haz sobre una cara 18
posterior, llamada cara activa, del biochip.
El espejo 32 dicroico refleja una parte
mayoritaria (del 80 al 95%) de la luz del láser hacia la lente de
focalización. La parte restante de la luz (del 5 al 20%) atraviesa
el espejo 32 para recogerse por un detector 33 electro-óptico
llamado detector de referencia.
El detector 33 de referencia permite medir las
fluctuaciones temporales de la intensidad del haz emitido por el
láser 30. Esta medición se tiene en cuenta para el análisis de la
fluorescencia emitida por el biochip con el fin de sortear el
análisis de las variaciones de intensidad debidas al láser.
Un primer sistema 40 óptico de análisis está
asociado a la cabeza óptica, y alineado sobre el eje \Omega óptico
para proyectar una luz de fluorescencia producida por las moléculas
marcadas excitadas, eventualmente presentes sobre el biochip, sobre
un (o varios) detector(es) 42 electro-óptico(s)
llamado(s) detector(es) de análisis en lo sucesivo en
el texto.
De forma más precisa, la luz de fluorescencia se
recoge y se colima por la lente 22 de focalización de la cabeza 20
óptica para formar un haz. Este haz atraviesa el espejo 32 dicroico
y después atraviesa una lente 44 de convergencia que le hace
converger sobre un diafragma 46. El diafragma puede formarse
practicando un pequeño orificio en una pantalla opaca. Permite
realizar una filtración espacial según el eje \Omega óptico y
confiere al sistema óptico un carácter confocal.
En efecto, el diafragma, junto con el objeto
iluminado puntualmente, sólo deja pasar la luz que sale de la zona
iluminada (por la luz de excitación) en una fina "lámina"
asimilable a un plano objeto. El atractivo de un sistema confocal
es evidente especialmente para la lectura de chips de ADN. La
posibilidad de definir una "lámina" del espacio objeto se
aprovecha para aislar un plano de interés que contiene las zonas de
reconocimiento molecular, del resto del chip (soporte de vidrio,
tampones). La luz recibida está por tanto libre de una luz parásita
procedente de eventuales centros coloreados del soporte, y libre de
un fondo continuo luminoso.
El fenómeno de fluorescencia de los marcadores
fluorescentes, llevados por las moléculas objetivo retenidas en las
zonas de reconocimiento, se traduce por una conversión de la luz de
excitación en una luz que presenta una longitud de onda superior a
la de la luz de excitación.
La longitud de onda de la luz de fluorescencia
es, por ejemplo, de 670 nm en el ejemplo descrito.
Un filtro 48 de interferencia se dispone entre la
lente 22 de focalización de la cabeza óptica y la lente 44 de
convergencia. Permite aislar en la luz recibida por el sistema
óptico de análisis una banda espectral que corresponde
sensiblemente a la banda espectral de fluorescencia. Las luces
parásitas se eliminan de este modo adicionalmente.
La referencia 50 designa una unidad de
tratamiento de señales emitidas por el detector 42 de análisis. En
el ejemplo descrito, el detector 42 de análisis es un detector con
fotomultiplicador que emite una señal analógica proporcional a la
intensidad de la luz de fluorescencia recibida.
La señal del detector de análisis puede
integrarse durante un periodo de tiempo durante el cual la cabeza
óptica recibe la luz de una zona de reconocimiento dada. Como se ha
indicado anteriormente, la señal puede registrase igualmente en un
procedimiento de medición "al vuelo" durante un barrido del
chip. La señal también puede digitalizarse de manera que pueda
tratarse según algoritmos adaptados al tipo de análisis
realizado.
Se observa que la unidad 50 de tratamiento recibe
igualmente una señal de referencia procedente del detector 33 de
referencia. El hecho de tener en cuenta la señal de referencia
permite normalizar las señales emitidas por el detector de análisis
que están, como se ha indicado anteriormente, libres de las
fluctuaciones de la intensidad del láser.
El espejo 32 dicroico, asociado a un cubo 34
separador, permite dirigir hacia un segundo sistema 60 óptico la
luz procedente de una reflexión, o difracción, o refracción o una
difusión de la luz incidente del láser sobre el biochip. Esta luz
reflejada procede, por ejemplo, de las pistas de guiado y/o de las
marcas de posicionamiento colocadas sobre el biochip. En el caso en
el que el biochip no comprende pistas de guiado, el biochip puede
depositarse sobre una platina que comprende pistas de guiado.
El segundo sistema 60 óptico, llamado sistema de
posicionamiento, comprende una lente 64 que permite focalizar la
luz recibida en al menos un detector 62 electro-óptico, tal como
detectores de cuatro cuadrantes o de múltiples cuadrantes,
asociados a un sistema óptico astigmático de análisis del haz. El
detector 62 electro-óptico también puede comprender una red de CCD,
o una fotorresistencia diferencial o cualquier sistema de medición
de posicionamiento.
El detector electro-óptico del sistema de
posicionamiento está unido a una unidad 70, llamada unidad de
servomecanismo. La unidad de servomecanismo permite, por ejemplo,
decodificar las señales del detector para detectar el paso de la
cabeza óptica frente a una marca de posicionamiento, contar las
marcas de posicionamiento encontradas, y dirigir el desplazamiento
del barrido para seguir una serie de marcas que corresponden a una
serie de zonas de reconocimiento. Para ello, la unidad 70 de
servomecanismo está conectada a los accionadores 14 y/o 24 para
controlar los movimientos del biochip y/o de la lente 22. También
permite mantener dinámicamente la cabeza óptica a lo largo de una
trayectoria de barrido impuesta por las marcas dispuestas sobre el
biochip.
A modo de ejemplo, los accionadores pueden
controlarse de tal manera que la intensidad de la luz recibida por
el detector del sistema óptico de posicionamiento esté comprendida
en un intervalo de valores determinados. El punto de funcionamiento
corresponde a un estado de equilibrio. Se da una orden de posición y
el servomecanismo mantiene esta orden. Se buscará por ejemplo que
el reparto de la intensidad de luz sobre el detector de múltiples
cuadrantes sea siempre el mismo.
Un segundo cubo 36 separador, dispuesto en el
segundo sistema óptico, permite dirigir una parte de la luz de este
sistema óptico a un tercer sistema 80 óptico, llamado sistema de
enfoque.
El sistema 80 óptico de enfoque comprende una
lente 84 para focalizar la luz recibida en un detector 82
electro-óptico, tal como un detector de cuatro cuadrantes o de
múltiples cuadrantes, asociado a un sistema óptico astigmático de
análisis del haz, o una red de CCD, o una fotorresistencia
diferencial o cualquier sistema de medición de
posición.
posición.
La luz dirigida sobre el detector del sistema
óptico de enfoque procede de una reflexión de la luz del láser
sobre el biochip. Puede proceder en particular de las marcas de
posicionamiento o de una reflexión vítrea sobre la cara activa del
biochip.
El detector 82 del sistema 80 óptico de enfoque
está igualmente unido la unidad 70 de servomecanismo. Esta unidad
está concebida para dirigir un accionador 24 solidario a la lente 22
de la cabeza 20 óptica. El accionador 24 permite desplazar la lente
22 según su eje \Omega para corregir de forma continua el enfoque
de los sistemas ópticos sobre el biochip, o más precisamente sobre
ciertas partes del biochip.
A modo de ejemplo, la unidad de servomecanismo
puede estar prevista para provocar un desplazamiento de la lente 22
de la cabeza óptica de tal manera que la superficie de una mancha de
focalización sobre el detector del sistema de enfoque se controle
con respecto a la superficie (forma y/o posición) de una mancha de
referencia (por ejemplo circular).
Según un modo de realización simplificado, el
detector electro-óptico del primer sistema 40 óptico, es decir el
sistema óptico de análisis, puede utilizarse al mismo tiempo para
emitir señales eléctricas correspondientes a la luz procedente de
las zonas de reconocimiento y señales correspondientes a la luz
reflejada o difundida por las pistas de guiado y/o marcas de
posicionamiento.
En este caso, el detector está unido no sólo a la
unidad 50 de tratamiento de las señales, sino también, tal como se
muestra en la figura con líneas discontinuas, a la unidad 70 de
servomecanismo, para dirigir el desplazamiento relativo del chip y
de la cabeza óptica, y eventualmente para el enfoque de la lente de
la cabeza óptica.
En este modo de realización, el dispositivo de
lectura comprende un sistema óptico único que incluye de forma
funcional el primer, el segundo (y eventualmente el tercer) sistema
óptico descritos anteriormente.
La figura 2 muestra una realización particular
del sistema óptico de análisis.
Por motivos de simplicidad, la figura 2 sólo
representa un detalle del dispositivo, siendo el resto de elementos
idénticos a los descritos en referencia a la figura 1.
El sistema 40 óptico de análisis de la figura 2
comprende un filtro 48 de interferencia y un objetivo 44a de
focalización previsto para focalizar un haz de luz de fluorescencia
recibido de la cabeza 20 óptica sobre un primer extremo de una
fibra 47 óptica.
Un segundo extremo de la fibra 47 óptica está
unido a un detector 42 electro-óptico, para un fotomultiplicador o
un fotodiodo de avalancha. La fibra 47 óptica (débilmente multimodo)
desempeña el papel del diafragma 46 confocal que se puede ver en la
figura 1.
Los sistemas ópticos de análisis de las figuras 1
y 2 son, tal como se ha indicado anteriormente, sistemas
confocales.
Las principales cualidades de un sistema confocal
son su gran resolución espacial y su gran resolución axial. La
resolución axial traduce la capacidad del sistema para aislar un
volumen muy pequeño de observación alrededor del plano de
focalización, es decir, la capacidad de eliminar las luces parásitas
del exterior de este volumen. Se caracteriza por una "profundidad
de sección" del sistema denominada Pds.
La profundidad de sección Pds, ya mencionada
anteriormente, puede expresarse según la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Pds =
0,443\cdot\lambda / (1 - cos \
u)
en la que \lambda es la longitud
de onda expresada en micrómetros y u el semiángulo del cono de
abertura numérica del sistema
óptico.
Las lentes empleadas para realizar el sistema
óptico de análisis presentan aberturas numéricas del orden de 0,4 a
0,5. Así, pueden obtenerse profundidades de sección del orden de 1,8
a 2,8 \mum. Además, de un 16 a un 22% del flujo luminoso emitido
por el biochip se recoge en la lente.
Resulta conveniente ahora describir más
detalladamente un ejemplo de realización de un biochip adaptado al
dispositivo de lectura.
La figura 3 muestra un biochip de este tipo. El
biochip 10 comprende un soporte 100 sobre el que se colocan zonas
110 de reconocimiento. Las zonas 110 coinciden por ejemplo con
electrodos formados en la superficie del soporte. Estos electrodos
se han revestido selectivamente con un revestimiento susceptible de
interaccionar con un compuesto químico o biológico dado. Tal como
se ha comentado en la parte introductoria del texto, el
revestimiento puede comprender en particular moléculas de
reconocimiento susceptibles de hibridar con moléculas
objetivo.
objetivo.
Las diferentes zonas 110 de reconocimiento están
revestidas respectivamente por moléculas de reconocimiento
diferentes, específicas para moléculas objetivo dadas.
Cada zona de reconocimiento incluye un solo tipo
de moléculas idénticas. Las moléculas de una misma zona son
preferiblemente diferentes de las moléculas de todas las demás
zonas.
Se observa que las zonas 110 de reconocimiento,
de forma rectangular, están dispuestas en líneas y en columnas. No
obstante, se pueden concebir otros motivos de reparto en la
superficie del sustrato, por ejemplo en círculo.
El biochip 10 incluye igualmente una red 120 de
marcas ópticas de posicionamiento, asociada a las zonas de
reconocimiento. En el ejemplo ilustrado, esta red comprende pistas
122 de guiado en forma de bandas rectilíneas que se extienden
respectivamente entre líneas sucesivas de zonas de
reconocimiento.
Las pistas de guiado son pistas reflectantes o
parcialmente reflectantes, fluorescentes o difusoras, que pueden
devolver hacia el dispositivo una parte de la luz de excitación.
Igualmente puede ser de desfase, es decir, que crean una diferencia
de marcha durante la propagación de la onda de retorno. La luz de
excitación reenviada hacia el dispositivo se analiza por el segundo
y eventualmente el tercer sistema óptico para determinar y
localizar las líneas de zonas de reconocimiento y para garantizar el
barrido del biochip. Las pistas reflectantes pueden igualmente
comprender una superficie estructurada con grabados de desfase
susceptibles de formar figuras de interferencia, o introducir un
desfase en la luz de excitación. Estas figuras de interferencia o de
desfase, recibidas por el sistema óptico de posicionamiento del
dispositivo de lectura pueden igualmente servir para la
localización o el servomecanismo de
barrido.
barrido.
Las marcas de posicionamiento comprenden
igualmente intervalos 124 ópticos denominados codificadores.
Los codificadores 124 están situados
preferiblemente sobre las pistas 122 de guiado al inicio y al final
de cada zona de reconocimiento según un paso correspondiente al
tamaño de dichas zonas.
En una realización particular, los codificadores
pueden concebirse para reflejar débilmente la luz.
Los codificadores son, por ejemplo, intervalos
que corresponden a una interrupción del material reflectante o a
una interrupción de la superficie estructurada de las pistas 122 de
guiado.
Según otra posibilidad adicional, las pistas
pueden ser débilmente reflectantes y extenderse a lo largo de
hileras de zonas de reconocimiento. Comprenden, por ejemplo,
intervalos (o codificadores) no reflectantes.
Se considera que una superficie es débilmente
reflectante cuando el porcentaje de luz reflejada es inferior al
50% y preferiblemente inferior al 5%.
Según una variante, el chip puede igualmente
estar dotado únicamente de pistas de guiado que son entonces
intervalos reflectantes, por ejemplo.
La asociación de codificadores o más generalmente
de marcas ópticas en cada zona de reconocimiento permite una
determinación particularmente rápida y precisa de las zonas.
No obstante, es posible igualmente asociar una
única marca a un conjunto de zonas de reconocimiento; por ejemplo
una marca para cada línea o columna de zonas de reconocimiento.
La fabricación de las marcas recurre a técnicas
clásicas de la microelectrónica. Comprende por ejemplo el depósito
en toda la placa de una capa metálica reflectante tal como una capa
de aluminio, níquel o cromo, y la conformación por fotolitograbado
de esta capa según un motivo correspondiente a los emplazamientos
deseados de las marcas de posicionamiento.
A modo de ejemplo, la capa metálica puede estar
grabada según un procedimiento de grabado químico en fase líquida o
un procedimiento de grabado con plasma en fase gaseosa, y según un
motivo de grabado determinado por una máscara de grabado en
resina.
Después del grabado y la eliminación de la
resina, puede formarse una fina capa de sílice sobre el soporte con
el fin mejorar la compatibilidad de la superficie con el injerto de
moléculas biológicas.
Conviene precisar que las zonas de reconocimiento
no son necesariamente adyacentes y que las marcas ópticas no están
posicionadas necesariamente en la periferia de las zonas de
reconocimiento.
Según una posibilidad de disposición, no
representada, las marcas ópticas reflectantes pueden colocarse en
el interior de las zonas de reconocimiento.
Una configuración de este tipo no es un
inconveniente cuando la luz procedente de las zonas de
reconocimiento es una luz de fluorescencia. En efecto, en la medida
en que la distinción entre la luz de fluorescencia y la luz
reflejada por las zonas de reconocimiento se realiza sobre basada en
la diferencia de longitud de onda entre estas
luces.
luces.
En el caso de una detección de moléculas no
fluorescentes, pero por ejemplo difusoras o difractantes, la
distinción puede realizarse por una codificación de las señales en
frecuencia o realizando la medición con un ángulo diferente del
utilizado por los servomecanismos de posición.
Una vez acabadas las marcas ópticas, las zonas de
reconocimiento pueden revestirse con moléculas de reconocimiento.
La síntesis de estas moléculas y su fijación sobre las zonas de
reconocimiento tienen lugar según técnicas de síntesis por
fotolitografía conocidas en sí mismas.
Se puede observar que la superficie del biochip
no es perfectamente plana. Presenta un sobreespesor del orden de 50
nm a 200 nm en el lugar de los intervalos reflectantes de las marcas
ópticas.
Tales diferencias de espesor siguen siendo
débiles en comparación con la profundidad de sección del sistema
óptico de análisis propuesto.
La realización de las marcas ópticas y la
síntesis de las moléculas de reconocimiento son operaciones que
pueden tener lugar colectivamente para una pluralidad de biochips
sobre una plaqueta de silicio o de vidrio ("wafer"). Esta
plaqueta se recorta a continuación para individualizar los biochips
fabricados simultáneamente.
La figura 4 representa igualmente un biochip 10
con pistas 122 de guiado y marcas de posicionamiento ópticas en
forma de codificadores 124a de un material reflectante (Cr por
ejemplo) colocadas a lo largo de las pistas 122.
Sobre la superficie del chip se puede distinguir
una pluralidad de zonas de reconocimiento o células 110, de forma
cuadrada, marcadas por líneas discontinuas. Cada zona de
reconocimiento está atravesada por cuatro pistas de
guiado.
guiado.
De forma esquemática se indica en la figura 4,
con líneas a puntos y rayas, las posiciones sucesivas de un punto
de luz de excitación. Las posiciones están marcadas por las letras
del abecedario de la A a la G.
Los medios de desplazamiento del chip
(accionador) son tales que el movimiento del punto de luz puede
descomponerse según un movimiento siguiendo un primer eje x,
llamado eje rápido, y siguiendo un segundo eje y, llamado eje
lento.
Un ejemplo de procedimiento de lectura de un
biochip se indica en la tabla I que debe leerse junto con las
letras de indicación de posición del punto en la figura 4.
La tabla I indica, en particular para cada
posición, el movimiento realizado y precisa la activación de las
funciones de enfoque, de posicionamiento y de lectura
(análisis).
| Funciones | ||||
| Operaciones | Descripción | Servomecanismo | Servomecanismo | Medición |
| de enfoque | de posicionamiento | |||
| A | Translación siguiendo el eje lento | |||
| Punto sobre una esquina del chip | No \rightarrow Sí | No | No | |
| Búsqueda del enfoque | ||||
| B | Traslación siguiendo el eje lento | Sí | No \rightarrow Sí | No |
| Búsqueda del inicio de la pista nº 1 | ||||
| C | Traslación siguiendo el eje rápido | |||
| Localización del inicio de la célula | Sí | Sí | No \rightarrow Sí | |
| nº 1 \rightarrow inicio de la medición | ||||
| D | Traslación siguiendo el eje rápido | |||
| Localización del final de la célula | Sí | Sí | Sí \rightarrow No | |
| nº 1 \rightarrow fin de la medición | ||||
| E | Traslación siguiendo el eje rápido | |||
| Medición de la fluorescencia en | Sí | Sí | Sí | |
| la célula nº 2 | ||||
| F | Traslación siguiendo el eje lento | Sí | No \rightarrow Sí | No |
| Búsqueda de la pista 2 | ||||
| G | Posicionamiento sobre una pista dada | |||
| Traslación siguiendo el eje lento | Sí | No \rightarrow Sí | No | |
| Recuento del número de pistas que pasan |
Las indicaciones "pista 1", "pista 2"
indican el orden de las pistas 122 en la dirección y a partir de la
parte inferior de la figura, y las indicaciones "célula nº 1",
"célula nº 2" indican las zonas de reconocimiento sucesivas en
la dirección x a partir de la parte izquierda de la figura.
Las referencias 152, 154 en las figuras
representan a modo indicativo una señal susceptible de generarse por
el detector del sistema de posicionamiento durante un barrido del
punto por encima de los codificadores 124a, respectivamente según
las direcciones x e y.
La figura 5 es un corte esquemático de una parte
de biochip en la que las referencias 201 y 202 designan,
respectivamente, caras de un sustrato 200 denominadas cara anterior
y posterior, por comodidad.
El sustrato 200 es de un material transparente a
una luz incidente de lectura, tal como el vidrio. Está recubierto
sobre su cara 201 anterior por una primera capa 220.
La primera capa 220 comprende una alternancia de
regiones 221 y 222 yuxtapuestas, respectivamente, de un primer
material y un segundo material. El primer material, por ejemplo
nitruro de silicio, presenta una primera reflectividad para una luz
incidente, y el segundo material, por ejemplo óxido de silicio,
presenta una segunda reflectividad para esta misma luz incidente,
diferente de la primera reflectividad. La diferencia entre la
primera y la segunda reflectividad es del orden del 1 al 5%, por
ejemplo del 2%.
Las regiones 221 y 222 de la primera capa pueden
disponerse para formar una pista de guiado y constituyen marcas de
posicionamiento.
Una segunda capa 210 es una capa funcional que
comprende reactivos, y forma las zonas de reconocimiento. A este
respecto puede hacerse referencia a la descripción anterior.
En este modo de realización, como en los otros
modos de realización de las figuras 6 a 9, las regiones 221 y 222
son sensiblemente transparentes, es decir, que los rayos incidentes
las atraviesan y que éstos últimos permiten una lectura de las
zonas de reconocimiento. Las regiones 221 y 222 se superponen con
las zonas de reconocimiento y las marcas de posicionamiento en sí
mismas sensiblemente transparentes.
La capa 210 puede formarse directamente sobre la
primera capa o, preferiblemente, sobre una capa 211 de agarre,
destinada a fijar las moléculas de reconocimiento.
Las moléculas de reconocimiento se seleccionan
entre compuestos químicos o biológicos tales como sondas de ADN,
anticuerpos o antígenos.
El hecho de utilizar un soporte 200 transparente
permite aplicar una luz de lectura desde la cara 202 posterior y
facilita así la puesta en contacto de la cara anterior con un medio
para analizar. Los rayos que se reflejan respectivamente sobre las
regiones 221, 222 se representan a modo de ilustración en forma de
flechas.
La figura 6 muestra otra posibilidad de
realización que constituye una variante con respecto a la figura
5.
Una capa de nitruro de silicio se deposita sobre
el soporte 200 y se graba para definir unas primeras regiones 221
disyuntivas. Una capa 224 de óxido de silicio se deposita a
continuación para envolver y recubrir las primeras regiones 221. La
capa de óxido de silicio constituye de este modo las segundas
regiones 222 que se alternan con las primeras regiones 221 y que
presentan una reflectividad diferente de éstas.
Una capa 210 funcional recubre la capa 224 de
óxido de silicio.
Otra posibilidad de realización de las marcas de
posicionamiento del biochip se ilustra en la figura 7.
En esta figura, el soporte 200, de vidrio, está
dopado localmente desde la cara 201 anterior de modo que se
practican regiones 223 dopadas disyuntivas.
Las regiones 223 dopadas se alternan de este modo
con regiones del soporte intencionadamente no dopadas, o dopadas
con una concentración diferente.
La diferencia de dopado entre las regiones 223 y
el resto del sustrato introduce una diferencia de índice y, por
tanto, una diferencia de marcha óptica entre los rayos luminosos
incidentes que alcanzan, respectivamente las regiones dopadas o
no.
La diferencia de marcha, proporcional a la
diferencia de índice entre las regiones dopadas y las regiones no
dopadas, introduce en los rayos incidentes un desfase. Este desfase
crea un contraste de fase entre las diferentes regiones dopadas y
no dopadas. Puede detectarse y aprovecharse por el dispositivo de
lectura para el posicionamiento relativo del chip y la localización
de las zonas de reconocimiento.
Las regiones 223 dopadas constituyen por tanto
marcas de posicionamiento en el sentido de la invención.
En el ejemplo de la figura, los rayos incidentes
se reflejan sobre la cara superior del sustrato recubierta por una
capa 210 funcional.
Para mejorar la reflexión, o al menos para
garantizar una reflexión independiente de la capa funcional y del
medio con la que es susceptible de ponerse en contacto, una capa 226
de reflexión intercalada, por ejemplo de aluminio, puede preverse
entre el soporte y la capa funcional. El índice y el espesor de esta
capa se seleccionan de tal manera que el apilado de las capas 200,
223, 226 y 210 ópticas delgadas, forma un espejo dicroico, cuya
reflectividad se controla según las técnicas conocidas de depósito
de capas ópticas delgadas. Se seleccionará por ejemplo un índice
para la capa 226 superior al de las marcas y al del soporte.
La capa intercalada puede igualmente servir de
capa de agarre o estar asociada a una capa de enganche para los
reactivos de las zonas de reconocimiento molecular.
Otra posibilidad más de realización de las marcas
de posicionamiento del biochip se ilustra en la figura 8.
En el ejemplo de esta figura, las marcas de
posicionamiento se obtienen por grabado de depresiones 225
disyuntivas en el soporte 200, desde su cara 201 superior.
Preferiblemente, la profundidad e de las depresiones es fija tal
que e = \lambda/4n, en la que \lambda es una longitud de onda de
la luz incidente y n el índice óptico del soporte 200.
Los rayos de luz reflejados sobre la cara
superior, respectivamente, en las regiones que corresponden a las
depresiones y las regiones no grabadas, atraviesan espesores de
materia diferentes y presentan así una diferencia de marcha.
La diferencia de marcha es proporcional a la
profundidad de los grabados y provoca un desfase entre los
rayos.
De forma comparable al ejemplo de la figura 7, el
desfase crea un contraste de fase detectable por un dispositivo de
lectura.
Una capa 210 funcional, que constituye las zonas
de reconocimiento, recubre la cara 210 superior.
De la manera descrita anteriormente, una capa
intercalada y/o una capa de agarre pueden preverse entre el soporte
y la capa funcional.
Un último ejemplo de realización de las marcas de
posicionamiento del biochip se da en la figura 9.
En este ejemplo, las marcas de posicionamiento no
se detectan a partir de una diferencia de reflectividad o de una
diferencia de marcha óptica, sino por una modificación de la
polarización de la luz que generan.
Una capa de material birrefringente, de tipo
rotador o de cuarto de onda, se forma sobre la cara 201 superior
del soporte y se graba para obtener las marcas de posicionamiento en
forma de regiones 227 disyuntivas.
Cuando un rayo de luz incidente polarizado según
una primera dirección alcanza una región 227 de material
birrefringente y la atraviesa o se refleja en ella, su dirección de
polarización se modifica por rotación. Por el contrario, un rayo
polarizado que alcanza el vidrio desnudo del soporte 200 conserva su
polarización inalterada después de la reflexión.
Las marcas de posicionamiento pueden de este modo
detectarse insertando en el sistema óptico de posicionamiento del
dispositivo de lectura un componente que seleccione la dirección de
polarización inicial o modificada. Este componente es, por ejemplo,
un analizador.
De manera ventajosa, al neutralizar o retirar el
analizador, las marcas de posicionamiento se vuelven
"invisibles".
Al igual que en los ejemplos anteriores, el
sustrato está revestido con una capa 210 funcional. También puede
estar dotado de una capa intercalada tal como se ha descrito
anteriormente.
(1) "Photothermal spectroscopy methods for
chemical analysis", S.E. Bialkowski, vol. 137 en
"chemical analysis: a series of monographs on analytical chemistry
and its applications", Wiley.
(2) J. Appl. Phys. Lett. 36, 130
(1979),
(3) El documento
US-A-4 299 494.
(4) Fotiou y Morris, Appl.
Spectrosc. 40, 704 (1986).
(5) El documento
US-A-5 646 411
(6) "La puce ADN: un multiréacteur de
paillasse" de M. Bellis y P. Casellas, en
Médecine/Sciences, nº 11, vol. 13, 1997, páginas 1317
à 1324
(7) "DNA sequencing by hybridization - a
megasequencing method and diagnostic tool?" de A.D.
Mirzabekov en TIBTECH, vol. 12, enero 1994,
páginas 27-32, Elsevier Science.
(8) "DNA chips: An array possibilities" de
A. Marshall y J. Hodgson en Nature
Biotechnology, vol. 16, enero 1998, páginas
27-31.
(9) El documento
WO-A-98 01533
(10) El documento
US-A-5 721 435
(11) El documento WO-98/28623
(12) El documento WO-98/38490
(13) El documento
EP-A-0 640 826
Claims (31)
1. Dispositivo de lectura en tiempo real de un
biochip que comprende una pluralidad de zonas (110) de
reconocimiento y una pluralidad de marcas (122, 124, 124a, 221,
222, 223, 225, 227) ópticas de posicionamiento, comprendiendo las
zonas de reconocimiento fragmentos de ADN o ARN y ocupando, con
respecto a las marcas ópticas de posicionamiento, emplazamientos
predeterminados, comprendiendo el dispositivo:
- una cabeza (20) óptica apta para proyectar una
luz incidente sobre el biochip,
- medios (14 y/o 24) de desplazamiento relativo
de la cabeza y de dicho biochip, aptos para efectuar un barrido del
biochip, y comprendiendo medios (14) de desplazamiento macroscópico
(a gran escala) y medios (24) de desplazamiento microscópico (a
pequeña escala),
- un primer sistema (40) óptico, llamado sistema
de análisis, asociado a dicha cabeza óptica para proyectar sobre al
menos un primer detector (42) electro-óptico una luz susceptible de
proceder de las zonas de reconocimiento,
- un segundo sistema (60) óptico, llamado sistema
de posicionamiento, asociado a la cabeza óptica para proyectar
sobre al menos un segundo detector (62) electro-óptico una luz
susceptible de proceder de al menos una marca de posicionamiento,
y
- servomecanismos (70) de los medios de
desplazamiento de dicha cabeza óptica para controlar los medios de
desplazamiento en función de señales eléctricas del detector
electro-óptico del sistema (62) óptico de posicionamiento, estando
conectados los servomecanismos (70) a los medios (24) de
desplazamiento microscópico,
caracterizado porque la cabeza (20) óptica
comprende una lente (22) de focalización y al menos un accionador
(24) de desplazamiento axial y/o lateral de enfoque de la lente
(22), y comprendiendo un tercer sistema (80) óptico, llamado de
enfoque, asociado a la cabeza (20) óptica, para proyectar sobre un
tercer detector electro-óptico una luz procedente de la reflexión
de la luz incidente sobre el biochip, y servomecanismos (70) de
enfoque asociados al accionador (24) para controlar el
desplazamiento de enfoque de la lente.
2. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque el sistema (40) óptico de análisis es un
sistema óptico confocal.
3. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el primer
detector electro-óptico, que recibe una luz emitida por las
moléculas objetivo presentes en las zonas de reconocimiento, es
sensible a una luz de fluorescencia, una luz de reflexión, una luz
de detección de hibridación por variación de la masa, del espesor
y/o del índice, y/o una luz representativa de efectos
fototérmicos.
4. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el primer
detector (42) electro-óptico está ópticamente unido al primer
sistema óptico por medio de una fibra (47) óptica.
5. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el primer y el
segundo sistema óptico están acoplados a la cabeza óptica por medio
de una lámina (32) dicroica.
6. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende un sistema óptico único que
incluye el primer y el segundo sistema óptico, y al menos un
detector electro-óptico común al primer y al segundo sistema
óptico, recibiendo dicho detector óptico común la luz procedente de
las zonas de reconocimiento molecular y la luz procedente de al
menos una marca óptica de posicionamiento, y estando unido a los
servomecanismos de barrido de la cabeza óptica.
7. Dispositivo de lectura en tiempo real de un
biochip que comprende una pluralidad de zonas (110) de
reconocimiento y una pluralidad de marcas (122, 124, 124a, 221,
222, 223, 225, 227) ópticas de posicionamiento, comprendiendo las
zonas de reconocimiento fragmentos de ADN o ARN y ocupando, con
respecto a las marcas ópticas de posicionamiento, emplazamientos
predeterminados, comprendiendo el dispositivo:
- una cabeza (20) óptica apta para proyectar una
luz incidente sobre el biochip,
- medios (14 y/o 24) de desplazamiento relativo
de la cabeza y de dicho biochip, aptos para efectuar un barrido del
biochip, y comprendiendo medios (14) de desplazamiento macroscópico
(a gran escala) y medios (24) de desplazamiento microscópico (a
pequeña escala),
- un primer sistema (40) óptico, llamado sistema
de análisis, asociado a dicha cabeza óptica para proyectar sobre al
menos un primer detector (42) electro-óptico una luz susceptible de
proceder de las zonas de reconocimiento,
- un segundo sistema (60) óptico, llamado sistema
de posicionamiento, asociado a la cabeza óptica para proyectar
sobre al menos un segundo detector (62) electro-óptico una luz
susceptible de proceder de al menos una marca de posicionamiento,
y
- servomecanismos (70) de los medios de
desplazamiento de dicha cabeza óptica para controlar los medios de
desplazamiento en función de señales eléctricas del detector
electro-óptico del sistema (62) óptico de posicionamiento, estando
conectados los servomecanismos (70) a los medios (24) de
desplazamiento microscópico,
caracterizado porque comprende un sistema
óptico único que incluye el primer y el segundo sistema óptico, y
al menos un detector electro-óptico común al primer y al segundo
sistema óptico, recibiendo dicho detector óptico común la luz
procedente de las zonas de reconocimiento molecular y la luz
procedente de al menos una marca óptica de posicionamiento, y
estando unido a los servomecanismos de barrido de la cabeza
óptica.
8. Dispositivo según la reivindicación 7,
caracterizado porque el sistema (40) óptico de análisis es un
sistema óptico confocal.
9. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque el primer
detector electro-óptico, que recibe una luz emitida por las
moléculas objetivo presentes en las zonas de reconocimiento, es
sensible a una luz de fluorescencia, una luz de reflexión, una luz
de detección de hibridación por variación de la masa, del espesor
y/o del índice, y/o una luz representativa de efectos
fototérmicos.
10. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque el primer
detector (42) electro-óptico está ópticamente unido al primer
sistema óptico por medio de una fibra (47) óptica.
11. Biochip que comprende una pluralidad de zonas
(110) de reconocimiento molecular y una pluralidad de marcas (122,
124, 124a, 221, 222, 223, 225, 227) ópticas de posicionamiento,
caracterizado porque las zonas de reconocimiento molecular
se superponen total o parcialmente a las marcas ópticas de
posicionamiento de manera que recubren total o parcialmente dichas
marcas.
12. Biochip según la reivindicación 11,
caracterizado porque las marcas de posicionamiento son
transparentes al menos a una luz de fluorescencia susceptible de
emitirse desde las zonas de reconocimiento, en respuesta a al menos
una luz incidente de lectura.
13. Biochip según una de las reivindicaciones 11
ó 12, caracterizado porque las zonas de reconocimiento
molecular ocupan, con respecto a las marcas ópticas de
posicionamiento, emplazamientos predeterminados.
14. Biochip según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque una marca
(124, 124a) óptica está asociada, respectivamente, a cada zona de
reconocimiento molecular.
15. Biochip según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque las zonas
(110) de reconocimiento molecular están dispuestas en líneas y
columnas y porque al menos una marca (124) óptica está asociada a
cada línea y/o a cada columna de zonas de reconocimiento
molecular.
16. Biochip según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque las marcas
ópticas comprenden intervalos aptos para reflejar una luz
incidente, siendo un porcentaje de luz reflejada inferior al 50% y
preferiblemente inferior al 5%.
17. Biochip según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque las marcas
ópticas comprenden intervalos con una superficie estructurada apta
para introducir un desfase en la luz incidente.
18. Biochip según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 17, caracterizado porque las marcas
ópticas comprenden pistas de posicionamiento de un material difusor
o fluorescente que se extiende a lo largo de filas de zonas de
reconocimiento, e intervalos reflectantes dispuestos sobre dichas
pistas de posicionamiento.
19. Biochip según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 17, caracterizado porque las marcas
ópticas incluyen pistas (122) débilmente reflectantes con un
coeficiente de reflexión inferior al 50%, preferiblemente inferior
al 5%, que se extienden a lo largo de filas de zonas (110) de
reconocimiento, presentando las pistas localmente intervalos (124)
no reflectantes.
20. Biochip según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 19, caracterizado porque las regiones
adyacentes de las marcas de posicionamiento presentan,
respectivamente, una diferencia de camino óptico para la luz
incidente.
21. Biochip según una de las reivindicaciones 11
a 20, caracterizado porque las marcas (221, 222) de
posicionamiento adyacentes están realizadas, respectivamente, con
materiales que presentan reflectividades débiles inferiores al 50%
y preferiblemente inferiores al 5%, y diferentes entre ellas.
22. Biochip según la reivindicación 21,
caracterizado porque las regiones adyacentes de las marcas de
posicionamiento presentan, respectivamente, espesores físicos
diferentes.
23. Biochip según la reivindicación 21,
caracterizado porque las regiones adyacentes de las marcas de
posicionamiento presentan dopados diferentes.
24. Biochip según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 23, que comprende entre las marcas de
posicionamiento y un revestimiento de las zonas de reconocimiento,
una capa (226) intercalada, seleccionándose el índice y la
reflectividad de dicha capa intercalada para formar un espejo
dicroico.
25. Biochip según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 24, caracterizado porque la
reflectividad de las marcas de posicionamiento y/o de un interfaz
entre las zonas de reconocimiento y las marcas de posicionamiento
está comprendida entre el 1 y el 10% para un haz de luz que alcanza
el biochip por una cara, llamada posterior, opuesta a una cara
dotada de moléculas de reconocimiento.
26. Biochip según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 24, caracterizado porque la
reflectividad de las marcas de posicionamiento y/o de un interfaz
entre un material de revestimiento de las zonas de reconocimiento y
las marcas de posicionamiento está comprendida entre el 1 y el 100%
para un haz de luz que alcanza una cara (anterior) del biochip
recubierta por un material de revestimiento.
27. Biochip según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 26, caracterizado porque las marcas de
posicionamiento comprenden regiones (227) de material
birrefringente susceptibles de modificar la orientación de la
polarización de una luz de lectura incidente polarizada.
28. Biochip según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 27, caracterizado porque las zonas de
reconocimiento molecular presentan una capa (211) de agarre
transparente.
29. Biochip según una de las reivindicaciones 11
a 28, caracterizado porque las zonas de reconocimiento están
revestidas con reactivos seleccionados entre reactivos químicos y
biológicos tales como sondas de ADN, anticuerpos, antígenos.
30. Procedimiento de lectura mediante un
dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, de
un biochip según una de las reivindicaciones 11 a 29.
31. Procedimiento de lectura mediante un
dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, de
un biochip según una de las reivindicaciones 11 a 29.
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Families Citing this family (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6130745A (en) * | 1999-01-07 | 2000-10-10 | Biometric Imaging, Inc. | Optical autofocus for use with microtiter plates |
| FR2799281B1 (fr) * | 1999-09-30 | 2002-04-26 | Commissariat Energie Atomique | Procede et dispositif de detection d'une reaction de reconnaissance moleculaire |
| JP4622052B2 (ja) * | 2000-06-29 | 2011-02-02 | 株式会社ニコン | 光測定方法及びマイクロプレート |
| JP4845307B2 (ja) * | 2000-09-25 | 2011-12-28 | オリンパス株式会社 | 立体基体を用いた検出用アレイ |
| WO2002101339A2 (en) * | 2000-10-12 | 2002-12-19 | Amnis Corporation | Imaging and analyzing parameters of small moving objects such as cells |
| AU2001297843A1 (en) | 2000-10-12 | 2002-12-23 | Amnis Corporation | Imaging and analyzing parameters of small moving objects such as cells |
| DE10113712A1 (de) * | 2001-03-16 | 2002-09-26 | Lifebits Ag | Verfahren zum Aufbringen chemischer Substanzen |
| JP4220251B2 (ja) * | 2001-05-11 | 2009-02-04 | パナソニック株式会社 | 生体分子基板ならびにそれを利用した検査および診断の方法および装置 |
| US7211430B2 (en) * | 2001-08-03 | 2007-05-01 | Becton, Dickinson And Company | System for stirring growth medium |
| US20030031596A1 (en) * | 2001-08-09 | 2003-02-13 | Yokogawa Electric Corporation | Biochip reader and fluorometric imaging apparatus |
| FR2831275B1 (fr) * | 2001-10-18 | 2004-01-30 | Commissariat Energie Atomique | Substrat revetu d'un film organique transparent et procede de fabrication |
| FR2838133B1 (fr) * | 2002-04-03 | 2004-09-17 | Bruno Jean Marie Aubert | Procede de detection rapide de micro-organismes sur un cd et dispositif de mise en oeuvre sur un lecteur de cd-rom ou dvd |
| US7214492B1 (en) | 2002-04-24 | 2007-05-08 | The University Of North Carolina At Greensboro | Nucleic acid arrays to monitor water and other ecosystems |
| US8048623B1 (en) | 2002-04-24 | 2011-11-01 | The University Of North Carolina At Greensboro | Compositions, products, methods and systems to monitor water and other ecosystems |
| US9126165B1 (en) | 2002-04-24 | 2015-09-08 | The University Of North Carolina At Greensboro | Nucleic acid arrays to monitor water and other ecosystems |
| US8383342B2 (en) | 2002-04-24 | 2013-02-26 | The University Of North Carolina At Greensboro | Compositions, products, methods and systems to monitor water and other ecosystems |
| AU2003241607B2 (en) * | 2002-05-24 | 2007-09-06 | Nimblegen Systems, Inc. | Microarrays and method for running hybridization reaction for multiple samples on a single microarray |
| JP4652049B2 (ja) * | 2002-05-28 | 2011-03-16 | オウトジエノミクス・インコーポレーテツド | 自動解析装置用レベル制御ピペット |
| JP4193421B2 (ja) | 2002-06-06 | 2008-12-10 | ソニー株式会社 | バイオアッセイ装置及びその製造方法、並びにバイオアッセイ方法 |
| US20040224332A1 (en) * | 2003-01-29 | 2004-11-11 | Affymetrix, Inc. | System and method for calibration and focusing a scanner instrument using elements associated with a biological probe array |
| FR2854240B1 (fr) * | 2003-04-23 | 2006-08-18 | Commissariat Energie Atomique | Biopuce a zones de reconnaissance et format optique independants et sa lecture flottante |
| CA2526368A1 (en) | 2003-05-20 | 2004-12-02 | Fluidigm Corporation | Method and system for microfluidic device and imaging thereof |
| US7524455B2 (en) * | 2003-11-24 | 2009-04-28 | General Electric Company | Methods for deposition of sensor regions onto optical storage media substrates and resulting devices |
| FR2864550B1 (fr) | 2003-12-29 | 2006-02-24 | Commissariat Energie Atomique | Puce d'analyse avec gamme etalon, trousses et procedes d'analyse. |
| JP3885058B2 (ja) * | 2004-02-17 | 2007-02-21 | 株式会社日立製作所 | 植物成育解析システム及び解析方法 |
| US7247494B2 (en) * | 2004-02-27 | 2007-07-24 | Agilent Technologies, Inc. | Scanner with array anti-degradation features |
| JP4504089B2 (ja) * | 2004-05-10 | 2010-07-14 | 富士通株式会社 | マイクロインジェクション装置およびマイクロインジェクション方法 |
| FR2881363B1 (fr) * | 2005-02-02 | 2008-03-14 | Commissariat Energie Atomique | Dispositif d'analyses biologiques avec detecteur integre |
| JP4701781B2 (ja) * | 2005-03-28 | 2011-06-15 | カシオ計算機株式会社 | 生体高分子分析装置及び生体高分子分析方法 |
| JP5069220B2 (ja) * | 2005-04-12 | 2012-11-07 | カリパー・ライフ・サイエンシズ・インク． | マイクロ流体デバイス用の小型光学検出システム |
| WO2006130111A1 (en) * | 2005-05-31 | 2006-12-07 | Gyros Patent Ab | Spinner home sequence |
| JP4711125B2 (ja) * | 2005-09-27 | 2011-06-29 | 横河電機株式会社 | バイオチップ、バイオチップ読み取り装置、およびバイオチップ読み取り方法 |
| JP4955244B2 (ja) * | 2005-09-27 | 2012-06-20 | 横河電機株式会社 | バイオチップ読み取り装置およびバイオチップ読み取り方法 |
| WO2008012724A2 (en) * | 2006-07-20 | 2008-01-31 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Optical tracking and position determination for detection methods and systems |
| JP2008241425A (ja) * | 2007-03-27 | 2008-10-09 | Kobe Steel Ltd | 光熱変換測定装置 |
| JP5205798B2 (ja) | 2007-04-27 | 2013-06-05 | 富士通株式会社 | マイクロインジェクション装置、捕捉プレート、およびマイクロインジェクション方法 |
| JP2008295376A (ja) * | 2007-05-31 | 2008-12-11 | Fujitsu Ltd | 細胞捕捉プレート、マイクロインジェクション装置、および細胞捕捉プレートの製造方法 |
| WO2009076323A2 (en) | 2007-12-06 | 2009-06-18 | Genalyte Inc. | Monitoring enzymatic process |
| EP2347247B1 (en) | 2008-10-27 | 2019-06-26 | Genalyte, Inc. | Biosensors based on optical probing and sensing |
| US8449842B2 (en) * | 2009-03-19 | 2013-05-28 | Thermo Scientific Portable Analytical Instruments Inc. | Molecular reader |
| US9767342B2 (en) | 2009-05-22 | 2017-09-19 | Affymetrix, Inc. | Methods and devices for reading microarrays |
| US9671344B2 (en) * | 2010-08-31 | 2017-06-06 | Complete Genomics, Inc. | High-density biochemical array chips with asynchronous tracks for alignment correction by moiré averaging |
| US9880089B2 (en) | 2010-08-31 | 2018-01-30 | Complete Genomics, Inc. | High-density devices with synchronous tracks for quad-cell based alignment correction |
| EP3266881B1 (en) | 2010-11-05 | 2019-12-25 | Genalyte, Inc. | Optical analyte detection systems and methods of use |
| KR101799518B1 (ko) | 2011-05-03 | 2017-11-21 | 삼성전자 주식회사 | 형광 검출 광학계 및 이를 포함하는 다채널 형광 검출 장치 |
| FR3000209B1 (fr) | 2012-12-26 | 2017-02-24 | Biomerieux Sa | Procede et systeme pour detecter et mesurer des signaux de fluorescence |
| US9983206B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-05-29 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Methods and compositions for enhancing immunoassays |
| EP4296654A3 (en) * | 2017-03-03 | 2024-02-28 | Pacific Biosciences of California, Inc. | High speed scanning system with acceleration tracking |
| DE102017222530A1 (de) * | 2017-12-12 | 2019-06-13 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Anordnung zum Ermitteln von Stoffwechselendprodukten in der Haut |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2458069A1 (fr) | 1979-05-22 | 1980-12-26 | Anvar | Perfectionnements aux procedes et dispositifs de mesure de coefficient d'absorption d'echantillons |
| US5790710A (en) * | 1991-07-12 | 1998-08-04 | Jeffrey H. Price | Autofocus system for scanning microscopy |
| US5397709A (en) | 1993-08-27 | 1995-03-14 | Becton Dickinson And Company | System for detecting bacterial growth in a plurality of culture vials |
| GB9418981D0 (en) * | 1994-09-21 | 1994-11-09 | Univ Glasgow | Apparatus and method for carrying out analysis of samples |
| US5646411A (en) | 1996-02-01 | 1997-07-08 | Molecular Dynamics, Inc. | Fluorescence imaging system compatible with macro and micro scanning objectives |
| US5721435A (en) * | 1996-04-09 | 1998-02-24 | Hewlett Packard Company | Methods and apparatus for measuring optical properties of biological and chemical substances |
| WO1998001533A1 (en) | 1996-07-08 | 1998-01-15 | Burstein Laboratories, Inc. | Cleavable signal element device and method |
| AU5895898A (en) * | 1996-12-20 | 1998-07-17 | Gamera Bioscience Corporation | An affinity binding-based system for detecting particulates in a fluid |
| EP0983498B1 (en) * | 1997-02-27 | 2004-05-26 | Cellomics, Inc. | A system for cell-based screening |
-
1999
- 1999-07-23 FR FR9909588A patent/FR2784189B3/fr not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-04 DE DE69929075T patent/DE69929075T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-04 JP JP2000574928A patent/JP4588216B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-04 CA CA002345372A patent/CA2345372A1/fr not_active Abandoned
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