JP4588216B2 - 複数の分子認識領域を備えたバイオチップならびにこのようなバイオチップの読取デバイス - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の分子認識領域を備えたバイオチップ、ならびに、このようなバイオチップの読取デバイスに関するものである。バイオチップとは、認識特性を有した分子を搭載している１つまたは複数の領域（認識領域と称される）を表面上に備えている任意のチップまたは支持体を意味している。本明細書においては、バイオチップという用語は、チップが化学分析や生物分析のために使用されるかどうかにかかわらず、使用される。
【０００２】
例えば、認識分子は、トレースヌクレオチドや、ポリヌクレオチドや、抗体やペプチドといったようなタンパク質や、レクチンや、他の任意の配位子受容タイプのシステムとすることができる。特に、認識分子は、ＤＮＡやＲＮＡのフラグメントとすることができる。
【０００３】
バイオチップが、分析対象をなす試料に対して接触されたときには、認識分子は、試料中の『ターゲット分子』と、例えば錯体化やハイブリッド化といったような相互作用を起こすことができる。よって、様々なターゲット分子をそれぞれ選択的に検出可能な複数の認識分子を有した複数の認識領域を、バイオチップに設けておくことにより、試料中に含有されている様々な分子を、検出することができ、可能であれば定量分析することができる。各認識領域は、ただ１つのタイプの同一分子を有している。
【０００４】
バイオチップ上に形成された錯体は、試料中のターゲット分子に対して付与された蛍光マーキングによって、認識することができる。
【０００５】
本発明による読取デバイスは、チップ認識領域内に存在しているかもしれないマーキングされたまたはマーキングされていない分子を読み取るための操作を容易とすることを意図したものである。
【０００６】
認識領域は、マーカーの存在なしに読み取ることができる。このタイプの技術は、従来技術において既に公知である。特に、ハイブリッド体を検出するためのいくつかの直接法としては、質量変化の検出や、厚さ変化の検出や、屈折率変化の検出、がある。光熱法も、また、公知であり、本明細書の最後に列挙した参考文献における文献１に記載されている。最後に、Boccara 氏他は、文献２，３において、光熱的な偏向法を開示している。この技術の改良は、文献４に開示されている。これら文献は、本明細書の最後に列挙されている。
【０００７】
かくして、本発明は、生物学的分析や科学的分析の分野に応用するために使用される。
【０００８】
生物学的分析という分野における好適な応用としては、多型性の研究や、変異の研究や、ハイブリッド化によるシークエンシングや、遺伝子発現の観測、がある。
【０００９】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
チップ内における認識領域の数は、実行すべき分析のタイプに依存する。ここで、数十〜数百個の認識領域を有した『低密度』チップと、数千〜数十万個の認識領域を有した『高密度』チップと、が区別される。
【００１０】
高密度チップ上における認識領域のサイズは、小さい。これら領域の寸法は、１００μｍ未満であり、場合によっては、１０μｍ未満であることもある。
【００１１】
上述のように、バイオチップ上に形成された錯体は、蛍光マーカーを使用してマーキングされる。例えば、フルオロセインやフィコエリトリンといったようなマーカーは、分析対象をなす試料中のターゲット分子に対して直接的に結合することができる。また、ターゲット分子も、ビオチンやジゴキシゲニンといったような間接認識基を使用してマーキングすることができる。
【００１２】
よって、与えられた認識領域に対する認識分子が、マーキングされたターゲット分子と相互作用を起こしたりまたはハイブリッド化を起こしたときには、蛍光マーカーが、これら領域に固定される。
【００１３】
バイオチップの読取に際しては、励起光と称される光をチップに向けて照射することによって蛍光マーカーを励起し、各認識領域において励起光によって引き起こされた蛍光を記録する。
【００１４】
認識領域内における蛍光の検出は、分析対象をなす試料中の、この領域内に存在している既知のタイプの認識分子と相互作用し得るターゲット分子（マーキングされた分子）の存在の決定を可能とする。蛍光強度を観測することにより、試料内における興味のあるターゲット分子の濃度を決定することができる。
【００１５】
このような技術に関しては、特に、遺伝生物学への応用に関しては、例えば文献６，７，８といったような文献を参照することができる。これら文献は、本明細書の最後に列挙されている。
【００１６】
低密度バイオチップにおいては、認識領域は、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）を備えた撮像ステーションによって読取を行うことができる。このようなステーションは、高密度チップには、うまく適用することができない。それは、ＣＣＤカメラは、多数の検出画素を有しているべきであるからであり、高密度チップにおいては蛍光の光束が特に小さいため、信号雑音比を向上させるためにカメラを冷却する必要があるからである。
【００１７】
よって、高密度チップの場合には、チップを走査することによって認識領域を順次的に分析可能とするために、蛍光スキャナが使用される。
【００１８】
このようなスキャナには、各領域における蛍光を記録するために、光電センサに関連した共焦光学システムが設けられる。スキャナは、非常に良好な空間的解像度（１〜１０μｍ）でもって対象物を観測するために使用することができ、共焦光学システムは、寄生光発光効果（自動蛍光、スペクトル反射、等）を克服するための手段である。
【００１９】
高密度チップに対するスキャナの例示としては、文献４を参照することができる。この文献は、本明細書の最後に列挙されている。
【００２０】
蛍光スキャナは、電気信号を出力する。出力信号が集められて、バイオチップの２次元像が形成される。また、出力信号を使用して、バイオチップ表面の空間構造が認識され、バイオチップ上に配置されている複数の認識領域が識別されて規定される。
【００２１】
最後に、確認式領域からの出力信号強度が、分析結果として記録される。
【００２２】
さらに、これら分析結果に適切なコンピュータ処理を施すことによって、生物学的にまたは化学的に有益な情報を得ることができる。
【００２３】
上記のような信号処理が、各認識領域に対して多数の測定ポイントまたは画素を必要とするという欠点があるということがわかっている。
【００２４】
各認識領域の正確な決定には、各認識領域に対して十分に多数の画素像密度が必要とされる。
【００２５】
実際に、許容可能な条件で信号処理を実行可能とするためには、認識領域のサイズに依存して、各認識領域あたりに３６個〜６４個という程度の数の画素が必要であることがわかっている。
【００２６】
よって、高密度バイオチップの信号処理には、大容量のコンピュータデータ処理手段および格納手段が必要とされる。したがって、処理が高価なものとなる。
【００２７】
さらに、認識領域をベースとした像のセグメント化が、完全に信頼性のあるものではない。
【００２８】
本明細書の最後に列挙されているうちの文献９，１０には、上記のいくつかの困難性を回避し得るような他の可能なバイオチップ読取手段が開示されている。
【００２９】
文献９には、読取を容易とするために、チップ上の認識素子およびマーキング素子の配置方法が開示されている。この場合、例えばコンパクト光ディスクプレーヤ（ＣＤ−ＲＯＭ）といったような読取デバイスを使用したバイオチップの読取が考えられる。
【００３０】
文献９においては、一般大衆が使用可能な読取デバイス（特に、ＣＤ−ＲＯＭコンパクト光ディスクプレーヤ）によってバイオチップを読取可能とするための、バイオチップに対しての化学処理が記載されている。分析対象をなすターゲット分子を含有した試料の分析を開始する前に、バイオチップ上の分子認識領域が、『架橋』分子によって表面に対してアンカー止めされた金属ボールによって形成されている反射性フィルムによってカバーされる。これら反射性ボールは、試料中のターゲット分子に対して結合し得るように機能付加されている。したがって、ハイブリッド化時には、同一のターゲット分子が２つの箇所において結合される必要がある。つまり、第１に、分子認識領域上のバイオチップ表面に対して結合される必要があり、第２に、この認識領域の上方に配置された金属ボールの表面に対して結合される必要がある。ハイブリッド化の後に、適切な化学処理を施すことによって、表面に対して金属ボールをアンカー止めしている架橋分子を解離させ、バイオチップの表面が洗浄される。この時点で、最少数のターゲット分子によって表面に保持されている金属ボールだけが、存在しており、生物学的情報をなす『ビット』を形成している。
【００３１】
文献９によって提案された処理の後に、分析のためには、さらなる生化学的なステップが必要である。このステップとは、架橋分子の分解である。さらに、認識領域上におけるターゲット分子のハイブリッド化は、金属ボールの存在のために、非常に遅いものである。それは、金属ボールが、認識領域を支持している表面に向けてのターゲット分子の拡散速度をかなり遅くしてしまうためである。したがって、分析は、非常に遅いものとなってしまう。さらに、表面に対して最終的に結合されて残存している金属ボールの数と、試料中のターゲット分子の初期濃度と、の間に存在する関係が、容易には定量化することができない。これは、ステップタイプの関係といったものである。（金属ボールが結合し得ない下限しきい値と、金属ボールが結合し得る上限しきい値と、が存在する。中程度の数の金属ボールが結合するような動的範囲、すなわち、定量化可能な数の動的範囲は、極めて小さい。）
【００３２】
文献１０においては、バイオチップには、認識領域に関連してマークが付されている。しかしながら、これらマークは、認識分子とは区別され、認識領域から物理的に離間されている。マークは、バイオチップを走査したときに、ハイブリッド化反応または錯体化反応とは独立に検出することができる。
【００３３】
マークの位置が検出されるとすぐに、２つのマークの順次的な検出に要した時間を、測定することができ、これにより、バイオチップ上のスキャナの相対位置を決定するという機能を確立することができる。この機能を使用することにより、バイオチップ上の認識領域の位置を、より正確に決定することができる。
【００３４】
バイオチップ上におけるマークの使用は、測定領域の配置を改良するための恒久的手段であり、よって、読取を容易とするための恒久的手段である。
【００３５】
しかしながら、バイオチップとスキャナ光学読取システムとの間の相対変位は、認識領域上における光学スキャナシステムの案内を正確に行うためには、十分に正確に制御される必要がある。
【００３６】
この制御は、認識領域が十分に大きくかつ認識領域の数がそれほど多くないときには、そんなに困難なことではない。バイオチップと光学システムとの間の相対変位は、比較的安価な機械的手段を使用することによって、効果的に行うことができる。
【００３７】
しかしながら、認識領域の寸法が数ミクロン以下であるような高密度チップの場合には、認識領域の十分な走査を行って先鋭な歪みのない像を得るためには、極めて正確な機械的手段が、必須とされる。
【００３８】
極めて正確な機械的手段は、また、一定の速度で小さな認識領域を走査する際にも必要とされる。これにより、得られた像を修正することができ、像を、変位の機能のために使用することができる。
【００３９】
具体例で説明するならば、例えば一辺の長さが２０μｍとされた３００×３００個の隣接する認識領域を想定する。典型的な７×７個の測定試料に対しては、３μｍという変位解像度が必要とされ、この変位の精度は、１μｍ（±０．５μｍ）でなければならず、配置の繰返し精度は、１μｍ（±０．５μｍ）でなければならない。変位速度は、一定でなければならず、走査変位は、０．３ｍｒａｄ以内で平行でなければならない。安価な機械では、このような特性を得ることはできない。
【００４０】
さらに、チップの読取前に光学システムを焦点合わせするためには、チップを空間内で配向させる必要があるとともに、１０μｍという解像度でかつ約５μｍという精度でかつ１０μｍという繰返し精度で、変位させる必要がある。このような特性は、光学システムの１００μｍという区画深さに対して得られる。１０μｍへと区画深さを小さくするには、焦点合わせ時に、２．５μｍという最小解像度かつ約０．５μｍという精度かつ１μｍという繰返し精度が必要とされる。
【００４１】
高精度の機械的手段が要求されることが、バイオチップ読取デバイスを特に高価なものとしている理由である。
【００４２】
さらに、高密度バイオチップ認識領域の表面積が小さいことにより、バイオチップは、各認識領域内の各試料に対して十分な量の光エネルギーを集め得るよう、ゆっくりと走査する必要がある。
【００４３】
しかしながら、ゆっくりとした走査は、多数の認識領域が存在する場合には常に、バイオチップの分析を過度に長いものとしてしまう。
【００４４】
蛍光によって生成される光量は、高出力レーザーによってターゲット分子マーカーを励起することにより、わずかに増大させることができる。しかしながら、このタイプの装置の使用は、読取デバイスのコストをさらに増大させてしまう。
【００４５】
文献１１，１２，１３には、さらなる従来技術が記載されている。文献１１は、細胞（セル）の検出および定量化に関するものであって、分子認識に関するものではない。文献１２，１３は、ゆっくりとした位置決め機構を使用した読取システムに関するものであって、『リアルタイム』での読取に関する問題点を解決するものではない。
【００４６】
【課題を解決するための手段】
本発明のある目的は、上述の困難性を有していないようなバイオチップ読取デバイスを提案することである。
【００４７】
特に、本発明のある目的は、低コストでもって高密度バイオチップを読み取り得るような、そのようなデバイスを提案することである。
【００４８】
本発明の他の目的は、より迅速にチップ走査を行うことができて、測定品質を低下させることなく分析時間を短縮し得るような、そのようなデバイスを提案することである。
【００４９】
本発明のさらに他の目的は、チップ像を過剰に撮像しすぎることなく認識領域の位置および配向を迅速に識別し得るような、デバイスを提案することである。
【００５０】
本発明の別の目的は、走査機構のコストを最小化するために、そのような読取デバイスに適合したバイオチップを提案することである。
【００５１】
上記目的を達成するために、本発明の目的は、より詳細には、複数の認識領域と複数の光学的位置決めマークとを具備しているバイオチップを、リアルタイムで読み取るためのデバイスであって、認識領域が、ＤＮＡまたはＲＮＡのフラグメントを備えているとともに、光学的位置決めマークに対しての所定位置に配置されている場合において、
デバイスが、
−バイオチップ上に入射光を投影し得る光学ヘッドと、
−バイオチップ上にわたっての走査を可能とし得るよう、光学ヘッドとバイオチップとの間の相対変位を引き起こすための相対変位手段と、
−光学ヘッドと協働することによって、光を可能であれば認識領域からの光を、少なくとも１つの第１電気光学的センサ上に投影する、分析システムと称される第１光学システムと、
−光学ヘッドと協働することによって、少なくとも１つの位置決めマークからの光を、少なくとも１つの第２電気光学的センサ上に投影する、位置決めシステムと称される第２光学システムと、
−光学的位置決めシステム内の電気光学的センサからの電気出力信号の関数として相対変位手段を制御し得るよう、光学ヘッドの相対変位手段をサーボ制御するためのサーボ制御手段と、
を具備し、
−相対変位手段が、巨視的（大スケールでの）変位手段と微視的（小スケールでの）変位手段とを備え、
−サーボ制御手段が、微視的変位手段に対して接続されているようなデバイスである。
【００５２】
本明細書においては、『マーキングされた分子からの光』といったような表現は、便宜的に、入射光に応答して認識領域から蛍光または反射光または拡散光または屈折光として放出される光を示すために使用される。このような光は、例えば、マーキングされたまたはマーキングされていない分子上において使用された特定基によってもたらされる。
【００５３】
微視的変位は、３つの軸のうちの少なくとも１つの軸に沿った光学ヘッドの位置を修正するために使用される。（第１軸は、第１光学システムの光学軸に対応するものであり、他の２つの軸は、この第１軸に対して垂直な軸である。）
【００５４】
認識領域とは、バイオチップの表面のうちの、与えられたタイプのターゲット分子を認識し得るような性質を有した分子が存在している部分を意味している。
【００５５】
位置決めシステムの電気信号による光学ヘッド走査のサーボ制御は、バイオチップと光学ヘッドとの間の相対変位をリアルタイムで修正するための手段である。これにより、安価な機械的変位手段でもって、極めて正確な制御を得ることができる。特に、通常コンパクトディスプレイプレーヤに搭載されるようなアクチュエータといったような機械的手段を使用することができるようになる。
【００５６】
サーボ制御を行うことにより、さらに、比較的一様な速度での変位を得ることができる。これにより、認識領域からの蛍光を連続的に読み取ることができる。
【００５７】
この観点において、サーボ制御手段に関連した光学的位置決めシステムが、バイオチップのリアルタイムでの読取手段をなすことは、言うまでもないことである。つまり、認識領域および／または位置決めマークに対しての読取位置をリアルタイムで知るための手段をなすことは、言うまでもないことである。
【００５８】
さらに、サーボ制御によって得られる焦点合わせ精度は、浅い区画深さを有した共焦光学システムの使用を可能とする。これにより、バイオチップ基体に起因する寄生光の影響を、低減することができる。よって、より良好な信号動特性を得ることができる。
【００５９】
区画深さが浅いことのために寄生光の影響を受けないような、読取デバイス内の光学システムは、より大きなデジタル開口を有して形成することができ、したがって、より多くの光を収集する。そのため、より高速の読取が可能となり、また、入射光源を、出力の小さなものとすることができる。
【００６０】
本発明のある見地においては、相対変位手段は、巨視的（大スケールでの）変位手段と微視的（小スケールでの）変位手段とを備えることができる。この場合、上述のように、サーボ制御手段は、微視的変位手段を制御する。
【００６１】
本発明の他の有利な見地においては、光学ヘッドは、焦点合わせ用レンズと、このレンズの焦点合わせのためにこのレンズを軸方向に変位させるための少なくとも１つのアクチュエータと、を備えることができる。焦点合わせシステムと称される第３光学システムを、光学ヘッドと協働して使用することによって、入射光のバイオチップ上における反射によって生成された光を、第３電気光学的センサ上に投影することができる。焦点合わせ用レンズの変位を制御するために、アクチュエータに対して接続された焦点合わせ用サーボ制御手段を設けることができる。
【００６２】
焦点合わせ用サーボ制御手段により、焦点合わせを行いつつ、同時に、認識領域の連続的な読取を行うことができる。この特徴点は、測定精度を走査条件とは独立に向上させ得るよう、バイオチップ上のマーキングを見失わないための手段をもたらす。
【００６３】
本発明のある特に簡単化された実施形態においては、デバイスは、第１および第２光学システムと、第１および第２光学システムに共通した少なくとも１つの電気光学的センサと、を備えてなる単一の光学システムを具備し、共通の光学センサが、分子認識領域からの光だけではなく、少なくとも１つの位置決めマークからの光をも収集する。この場合、共通のセンサは、信号処理システムと、光学ヘッド走査のためのサーボ制御手段と、に対して接続される。
【００６４】
したがって、この実施形態においては、共通の光学センサは、蛍光分析のために使用される信号と、バイオチップと光学ヘッドとの間の相対変位（走査）のサーボ制御のための信号と、を出力する。
【００６５】
本発明は、また、複数の認識領域と、複数の光学的位置決めマークと、を具備してなるバイオチップに関するものである。
【００６６】
本発明による認識領域は、位置決めマークの全部またはいくつかをカバーし得るよう、全体的にまたは部分的に、位置決めマークに重ね合わされている。
【００６７】
例えば、認識領域に関連した光学的位置決めマークは、励起光を反射する領域を備えることができる。これにより、バイオチップの向きの制御が補助され、認識領域の位置が識別され、さらに、ハイブリッド化が起こったかどうかにかかわらず正確な走査を行うことができる。特に、光学的位置決めマークは、ガイドトラックと称されるトラックの形態で存在することができる。
【００６８】
ある格別の見地においては、位置決めマークは、隣接領域の反射率とは異なるような、入射光に対して特定の反射率を有するように構成することができる。
【００６９】
バイオチップの他の格別の可能な実施形態においては、各認識領域に、特定の光学的マークを配置することができる。よって、各認識領域の位置を決定する目的でバイオチップ全体の像を形成する必要がない。
【００７０】
よって、認識領域の位置を正確に決定し得る可能性は、各認識領域に対して少数の画素だけで済み、過度にサンプリングを行うことなく正確な測定を行う手段をもたらす。
【００７１】
さらに、各認識領域が識別されるとすぐに、光学ヘッドまたはバイオチップを移動させることによって、１つまたは複数の所定領域に対しての局所的分析を行うことができる。この場合、光学ヘッドは、所望領域に対して直接的に対向している。
【００７２】
認識領域からの光を記録する際の態様には、いくつもの可能な形態が存在する。
【００７３】
第１の態様においては、光学ヘッドを認識領域に対向させつつ移動不可能に保持することができ、次なる領域に向かう前の所定時間にわたって信号の獲得を行うことができる。
【００７４】
上述したように、光学的マークとサーボ制御手段とは、十分な精度でもってヘッドを位置決めするために使用される。これにより、信頼性の高い分析を行うことができる。さらに、光学的マークを使用することにより、認識領域が蛍光を発していない場合であっても、認識領域を正確に位置決めすることができる。
【００７５】
複数の認識領域がバイオチップの活性面をカバーするようにして例えば並置といったような態様で互いにサイドバイサイドに並べられた複数の認識領域にわたって連続的に光学ヘッドを変位させることにより、停止することなく、複数のセンサ信号を獲得することができる。この場合、信号を積分することにより、１つまたは複数の認識領域を走査するのに要した時間中に受領された光量を決定することができる。
【００７６】
しかしながら、変位速度の変動が、認識領域から単位時間あたりに放出される光量の分析に影響を与え得る。
【００７７】
よって、分析の第２態様においては、走査される認識領域に関連している互いに近接する２つの位置決めマークの間を光学ヘッドが通過する通過時間の関数として、獲得信号を規格化することができる。
【００７８】
第３態様においては、停止することなく信号獲得が行われ、連続する２つのマークの前方を光学ヘッドが通過する通過時間を測定することにより、光学ヘッドとバイオチップとの間の相対変位速度を連続的にサーボ制御する。
【００７９】
本発明は、また、上述のようなデバイスによって読み取ることができるバイオチップであって、分子認識領域が、位置決めマークの全部またはいくつかをカバーし得るよう、全体的にまたは部分的に、位置決めマークに重ね合わされているようなバイオチップに関するものである。
【００８０】
この特徴点は、位置決めマークによるバイオチップ表面の過密が防止されるという点において、特に有利である。これは、バイオチップの大部分のまたはすべての全体表面を、分子認識領域のための利用することができることを意味している。
【００８１】
位置決めマークは、バイオチップの向きの制御するために、また、認識領域をマーキングして識別するために、使用される。これは、認識領域が、好ましくは位置決めマークに対しての所定位置に配置されているからである。
【００８２】
バイオチップの位置決めを行うためには、および／または、認識領域の識別を行うためには、非常に薄い位置決めマークであっても、十分である。
【００８３】
しかしながら、位置決めマークの表面積が、当該位置決めマークに関連する分子認識領域の表面積と比較して無視できないものである場合にのみ、良好な精度が得られることがわかっている。
【００８４】
位置決めマークが分子認識領域と部分的にまたは完全にオーバーラップするようにして位置決めマークが配置されているというこの特徴点は、位置決めマークの設置領域を増やすことができること、および、これにより、読取デバイスに対してのバイオチップの位置の制御性が改良されること、を意味している。
【００８５】
位置決めマークが、位置のサーボ制御のために入射光ビームが通過するガイドトラックの形態とされているときには、トラックの幅が、光ビームの幅と比較して無視できないものであることが望ましい。
【００８６】
トラックは、バイオチップの全面積の３０〜１００％の程度の表面を占めるような位置決めマークを使用することにより、優秀な精度でもってマーキングすることができる。
【００８７】
認識領域と位置決めマークとのオーバーラップは、有効単位面積あたりのバイオチップの製造コストを考慮した場合、経済的に有利である。
【００８８】
さらに、位置決めマークの面積増加は、マークの読取を容易なものとする。これは、読取デバイスを、より小さな光強度で使用できること、および、より低い感度で使用できること、を意味している。
【００８９】
このことは、また、読取デバイスのコストを低減する。
【００９０】
位置決めのために強度のより小さな光源を使用できることは、分子認識領域上に位置しているかもしれない蛍光マーカーの燃焼というリスクを低減することができる。
【００９１】
さらに、位置決めマークは、少なくとも１つの読取用入射光に応答して認識領域から放出される少なくとも１つの蛍光に対して、ほぼ透明であるように構成することができる。
【００９２】
レーザービームが背面を通して読取を行う場合には、位置決めマークの反射率、および／または、認識領域と位置決めマークとの間の境界部の反射率は、０％より大きなものとされ、好ましくは１〜１０％のものとされ、さらに好ましくは１〜５％のものとされる。
【００９３】
レーザービームが前面から読取を行う場合には、位置決めマークの反射率、および／または、認識領域上のコーティング材料と位置決めマークとの間の境界部の反射率は、０％より大きなものとされ、特に１〜１００％のものとされる。
【００９４】
バイオチップの前面とは、認識領域において認識分子でもってコーティングされている面を意味しており、バイオチップの背面とは、前面とは反対側のコーティングされていない面を意味している。
【００９５】
さらに、バイオチップは、位置決めマークと認識領域との間に、位置決めマークの反射率とは異なる反射率の材料から形成された中間層を備えることができる。この場合、中間層は、分子認識領域のコーティングとは無関係に、また、バイオチップに接触している液体媒体または気体媒体とは無関係に、位置決めマークのところにおいて入射光を所定に反射することができる。
【００９６】
他の可能性においては、位置決めマークを形成することが考えられる。特に、位置決めマークは、入射光に対しての特性が互いに異なる領域を交互に配列することによって、形成することができる。
【００９７】
第１の態様においては、位置決めマークがなす領域とその隣接領域とは、入射光に対しての光学経路が異なるものとすることができる。光学経路の違いは、特に、互いに隣接するこれら領域を互いに異なる材料から形成することにより、および／または、互いに隣接するこれら領域を厚さが互いに異なるものとして形成することにより、および／または、互いに隣接するこれら領域を互いにドーピング程度が異なるものとして形成することにより、得ることができる。互いに隣接するこれら領域についての異なる材料の選択または異なるドーピング程度の選択は、各領域における屈折率を相違させることを意味している。
【００９８】
位置決めマーク形成の他の可能な手段においては、位置決めマークは、偏光されている読取用入射光の偏光方向を変換し得る複屈折性材料からなるストリップから形成することができる。
【００９９】
さらに他の態様においては、位置決めマーク領域とその隣接領域とは、互いに異なる反射率の材料から形成することができる。
【０１００】
【発明の実施の形態】
本発明の他の特徴点および利点は、添付図面を参照しつつ以下の説明を読むことにより、明瞭となるであろう。以下の説明は、例示の目的のためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０１】
図１における符号（１０）は、バイオチップを示している。バイオチップ（１０）は、特定の認識分子を有した複数の認識領域を備えており、可能であれば、複数の認識領域に関連したガイドトラックおよび／または光学的位置決めマークを備えている。これら構成要素については、簡略化のために図１には示されていないものの、詳細に後述する。
【０１０２】
この例においては、特定の認識分子は、蛍光基によってマークされている。ただし、これら蛍光基は、本発明の範囲を逸脱することなく、光を反射させたりあるいは拡散させたりあるいは屈折させたりし得る基によって、置換することができる。
【０１０３】
バイオチップは、読取デバイス（１２）に対向して配置されている。読取デバイスは、認識領域上に固定されている、蛍光マーカー付きの分子を励起するようにして、認識領域を走査するためのものである。バイオチップは、また、分子によって生成された蛍光を記録するためのものである。
【０１０４】
認識領域は、読取デバイス（１２）またはその一部と、バイオチップ（１０）と、の間の相対変位によって、走査される。
【０１０５】
図１の例においては、巨視的な相対変位は、アクチュエータ（１４）によって得られる。このアクチュエータは、例えば、バイオチップ（１０）を移動させるモータ駆動型のアクチュエータである。レンズ（２２）の微視的移動は、電磁アクチュエータ（２４）によって得られる。矩形形状とされたバイオチップは、読取デバイスの光学軸（Ω）に対して垂直な平面内において移動を受ける。
【０１０６】
この平面は、また、図面がなす平面に対しても垂直である。
【０１０７】
変位は、図１に示す２つの直交方向（ｘ，ｙ）に沿って起こるものとされている。
【０１０８】
読取デバイス（１２）は、光学ヘッド（２０）を備えている。光学ヘッド（２０）には、光学軸（Ω）を有した焦点合わせ用レンズ（２２）が設けられている。光学ヘッドレンズ（２２）は、バイオチップに向けて励起光を案内するという機能と、励起光に応答して放出される蛍光を収集するという機能と、の２つの機能を果たす。
【０１０９】
励起光は、例えば６３３ｎｍといったような第１波長を有した単色光とされる。励起光は、レーザー（３０）によって生成される。このレーザーからのビームは、二色性ミラー（３２）を経由することにより、光学ヘッド（２０）に向けて案内される。焦点合わせ用レンズ（２２）は、バイオチップのうちの、活性面と称される背面（１８）上にビームを焦点合わせする。
【０１１０】
二色性ミラー（３２）は、レーザーからの光の大部分（８０〜９５％）を、焦点合わせ用レンズへと反射する。残りの光（５〜２０％）は、ミラー（３２）を透過して、参照センサと称される電気光学的センサ（３３）によって収集される。
【０１１１】
参照センサ（３３）は、レーザー（３０）から放出されるビームの強度の時間変動を測定する。この測定結果は、バイオチップによって放出される蛍光の分析のために使用される。これにより、蛍光分析結果を、レーザー強度の変動とは無関係に行うことができる。
【０１１２】
光学ヘッド（２０）と関連して、第１光学分析システム（４０）が設けられている。第１光学分析システム（４０）は、光学的中心線（Ω）に対して軸合わせされている。このため、バイオチップ上に存在しているであろうマークされた励起分子によって生成された蛍光を、以降分析センサと称される１つまたは複数の電気光学的センサ（４２）上に投影することができるようになっている。
【０１１３】
より詳細には、蛍光は、光学ヘッド（２０）の焦点合わせ用レンズ（２２）により収集されてコリメートされ、これにより、ビームが形成される。このビームは、二色性ミラー（３２）を透過し、さらに、収束用レンズ（４４）を透過することによって、ダイヤフラム（４６）上に収束される。ダイヤフラムは、不透明スクリーンに小穴を開けることによって形成することができる。このダイヤフラムは、光学的中心線（Ω）に沿った空間的フィルタリングという機能を果たし、光学システムを共焦的なものとする。
【０１１４】
ダイヤフラムは、断続的に照光される対象物と組み合わせることにより、対象平面を表す薄い『スライス』内において、（励起光によって）照光された領域からの光だけを、通過させることができる。このタイプの共焦システムの利点は、特にＤＮＡチップの読取に関しては、明らかである。対象空間の『スライス』を規定できるという可能性を使用することにより、分子認識領域を含有している興味のある平面を、チップの残部（ガラス支持体、バッファ）から、分離することができる。したがって、受領光は、支持体上の色中心に基づく寄生光を一切含有しておらず、また、背景に基づく連続光を含有していない。
【０１１５】
認識領域上に保持されているターゲット分子が付帯している蛍光マーカーの蛍光発光現象は、励起光を、励起光の波長よりも長い波長を有した光へと、変換する。
【０１１６】
例えば、この例においては、蛍光の波長は、６７０ｎｍである。
【０１１７】
干渉フィルタ（４８）が、光学ヘッドの焦点合わせ用レンズ（２２）と、収束用レンズ（４４）と、の間に配置されている。この干渉フィルタは、光学分析システムが受領した受領光内における蛍光スペクトルバンドにほぼ対応したスペクトルバンドを分離する。これにより、寄生光が、より良好に除去される。
【０１１８】
符号（５０）は、分析センサ（４２）からの出力信号を処理するための処理ユニットを示している。この例においては、分析センサ（４２）は、受領した蛍光の強度に比例したアナログ信号を出力するような、光増倍型センサとされている。
【０１１９】
分析センサからの出力信号は、ある与えられた認識領域からの光を光学ヘッドが受領している期間にわたって集積（積分）することができる。上述のように、信号は、また、バイオチップを走査しつつ、停止することなく測定プロセスにおいて記録することもできる。この信号は、また、デジタル化することもできる。この場合には、行うべき分析タイプに適合したアルゴリズムを使用して、信号の処理を行うことができる。
【０１２０】
処理ユニット（５０）が、また、参照センサ（３３）からの参照信号も、受領することが示されている。上述したように、この参照信号が、分析センサからの出力信号を規格化するための手段であり、これにより、レーザー強度の変動の影響が除去されることに注意されたい。
【０１２１】
二色性ミラー（３２）は、光分離キューブ（３４）と協働することにより、レーザーからの入射光の、バイオチップ上における反射や回折や屈折や分散に起因する光を、第２光学システム（６０）へと、導く。例えば、この反射光は、バイオチップ上に設けられているガイドトラックおよび／または位置決めマークに起因するものであるかもしれない。バイオチップがガイドトラックを備えていない場合には、バイオチッを、ガイドトラックを備えているプレート上に載置することができる。
【０１２２】
位置決めシステムと称される第２光学システム（６０）は、受領光を少なくとも１つの電気光学センサ（６２）上へと焦点合わせするレンズ（６４）を備えている。ここで、電気光学センサ（６２）は、例えば、４つの四分円を有したあるいは多分割円を有した検出器であり、非点収差を補正するビーム分析光学システムが付設されたものとされている。電気光学的センサ（６２）には、また、ＣＣＤモジュールや、差分光学抵抗や、他の任意の位置決め測定システムを付設することができる。
【０１２３】
位置決めシステムの電気光学的センサは、サーボ制御ユニットと称されるユニット（７０）に対して接続されている。例えば、サーボ制御ユニットを使用することにより、光学ヘッドが位置決めマークの前方を通過する時点を検出するためにセンサ信号を解読し、発見された位置決めマークをカウントし、一連の認識領域に対応した一連のマークに従うように走査変位を制御することができる。サーボ制御ユニット（７０）は、この目的のために、アクチュエータ（１４および／または２４）に対して接続され、バイオチップおよび／またはレンズ（２２）の移動を制御する。サーボ制御ユニット（７０）は、また、バイオチップ上に配置されたマークによって指示された走査軌跡に沿った経路上に光学ヘッドを動的に維持するために、使用することができる。
【０１２４】
例えば、アクチュエータは、光学的位置決めシステム内のセンサによって受領される光強度が所定範囲内の値となるように、制御することができる。動作位置は、平衡状態に対応している。位置の設定値が与えられ、サーボ制御システムが、この設定値を維持する。例えば、多分割円形検出器上の光強度の分布が常に同一であることを確保するように、制御することができる。
【０１２５】
第２光学システムに設けられた第２光分離キューブ（３６）は、第２光学システムへの入射光の一部を、焦点合わせシステムと称される第３光学システム（８０）へと案内する。
【０１２６】
光学的焦点合わせシステム（８０）は、受領光を電気光学センサ（８２）上へと焦点合わせするレンズ（８４）を備えている。ここで、電気光学センサ（８２）は、例えば、４つの四分円を有したあるいは多分割円を有した検出器であり、非点収差を補正するビーム分析光学システムや、ＣＣＤモジュールや、差分光学抵抗や、他の任意の位置決め測定システム、が付設されたものとされている。
【０１２７】
光学的焦点合わせシステムへと導かれる光は、バイオチップ上において反射されたレーザー光に基づくものである。特に、このシステムへと導かれる光は、バイオチップの活性面上における位置決めマークまたはガラス状反射に基づくものである。
【０１２８】
光学的焦点合わせシステム（８０）内のセンサ（８２）も、また、サーボ制御ユニット（７０）に対して接続されている。サーボ制御ユニットは、光学ヘッド（２０）のレンズ（２２）に対して固定されたアクチュエータ（２４）を制御し得るように構成されている。アクチュエータ（２４）は、軸（Ω）に沿ってレンズ（２２）を移動させ、これにより、バイオチップ内の光学システムの連続的な適切な焦点合わせを行う。より詳細には、バイオチップのいくつかの部分上において、光学システムの連続的な適切な焦点合わせを行う。
【０１２９】
例えば、サーボ制御ユニットは、焦点合わせ用システムのセンサ上における焦点合わせスポットの面積が、参照スポット（例えば円形）の表面（形状および／または位置）に対して制御されるようにして、光学ヘッドのレンズ（２２）を変位させるように構成することができる。
【０１３０】
ある単純化された実施形態においては、第１光学システム（４０）すなわち光学分析システムの電気光学センサを使用することにより、認識領域に起因する光に対応した電気信号と、ガイドトラックおよび／または位置決めマークにより反射されたまたは拡散された光に対応した電気信号と、を出力することができる。
【０１３１】
この場合、このセンサは、信号処理ユニット（５０）に対してだけでなく、（図１において破線で示すように）サーボ制御ユニット（７０）に対しても接続されており、このため、バイオチップと光学ヘッドとの間の相対変位を制御できるようになっている。また、可能であれば、光学ヘッドレンズの焦点合わせを制御できるようになっている。
【０１３２】
この実施形態においては、読取デバイスは、上述のような第１および第２（および、可能であれば第３も）光学システムを機能的に含有する、単一の光学システムを備えている。
【０１３３】
図２は、光学分析システムの特定の実施形態を示している。
【０１３４】
簡単化のために、図２は、デバイスの細部だけを示しており、他の構成部材は、図１を参照して説明したものと同じである。
【０１３５】
図２における光学分析システム（４０）は、干渉フィルタ（４８）と焦点合わせ用対物レンズ（４４ａ）とを備えている。対物レンズは、光学ヘッド（２０）から受領した蛍光ビームを、光ファイバ（４７）の第１端上に焦点合わせし得るように構成されている。
【０１３６】
光ファイバ（４７）の第２端は、光増倍管またはアバランシェ光ダイオードとされた電気光学センサ（４２）に対して接続されている。光ファイバ（４７）（わずかにマルチモード）は、図１における共焦ダイヤフラム（４６）として機能する。
【０１３７】
図１および図２に示す光学分析システムは、上述のように、共焦システムである。
【０１３８】
共焦システムの主要特質は、空間解像度が優秀であることと、軸方向解像度が優秀であることと、である。軸方向解像度とは、焦点面周辺の微小観測体積を分離できるような、システムの能力のことである。つまり、焦点面周辺の微小観測体積外からの寄生光を除去できる能力のことである。軸方向解像度は、システムの『区画深さ』によって特徴づけられ、区画深さは、Ｐｄｓとして表される。
【０１３９】
上記区画深さＰｄｓは、λを単位をμｍとして表したときの波長、ｕを光学システムのデジタル開口円錐の２分の１角度とすれば、Ｐｄｓ＝０．４４３×λ／（１−cos ｕ）として表される。
【０１４０】
光学分析システムを構成するために使用されているレンズは、０．４〜０．５という程度のデジタル開口を有している。よって、１．８〜２．８μｍという程度の区画深さを得ることができる。さらに、バイオチップから放出される光束の１６〜２２％が、レンズによって収集される。
【０１４１】
次に、読取デバイスに対して適用されるバイオチップの実施形態について、詳細に説明する。
【０１４２】
図３は、そのようなバイオチップを示している。バイオチップ（１０）は、支持体（１００）を備えており、この支持体（１００）上に、複数の認識領域（１１０）が形成されている。例えば、認識領域（１１０）は、支持体の表面上に形成された電極と一致している。これら電極には、与えられた化学的または生物学的化合物と相互作用し得るコーティングが、選択的に施されている。本明細書の導入部分において上述したように、このコーティングは、特に、ターゲット分子とハイブリッド化を起こし得るような認識分子とすることができる。
【０１４３】
様々な認識領域（１１０）は、与えられたターゲット分子に対して特定の様々な認識分子によってコーティングされる。
【０１４４】
各認識領域は、単一タイプの複数の同一分子を有している。単一領域内の分子は、好ましくは、他のすべての領域内の分子とは異なるものとされる。
【０１４５】
矩形形状とされた認識領域（１１０）が、行列配置とされていることがわかる。例えば円形といったような、基体表面上における他の分布パターンとすることもできる。
【０１４６】
バイオチップ（１０）は、さらに、認識領域に関連した光学的位置決めマークからなるネットワーク（１２０）を備えている。この例においては、このネットワーク（１２０）は、互いに隣接した認識領域列どうしの間に延在する直線状ストリップの形態とされたガイドトラック（１２２）を有している。
【０１４７】
ガイドトラックは、読取デバイスに対して励起光の一部を戻し得るような、反射性または部分的に反射性のあるいは蛍光性のあるいは拡散性の、トラックである。しかしながら、トラックは、さらに、位相をシフトさせることもできる。つまり、戻り光の伝搬時に光学経路差を形成することができる。読取デバイスへと戻される励起光は、第２光学システムによってまた可能であれば第３光学システムによって分析され、認識領域列を位置決めしてマークすることができ、バイオチップを走査することができる。反射性トラックは、さらに、干渉パターンを形成し得るようなすなわち励起光の位相をシフトさせ得るような、位相シフトエッチングによる所定生地表面を有することができる。読取デバイスの光学的位置決めシステムに導入されたこのような干渉パターンすなわち位相シフトパターンを使用することにより、マーキングやサーボ制御走査を行うことができる。
【０１４８】
位置決めマークは、さらに、エンコーダと称される光学的ストリップ（１２４）を備えることができる。
【０１４９】
エンコーダ（１２４）は、好ましくは、各認識領域の最初と最後のところに、各認識領域のサイズに対応したピッチでもって、ガイドトラック（１２２）上に配置される。
【０１５０】
ある特定の実施形態においては、これらエンコーダは、ごくわずかに光を反射するように構成することができる。
【０１５１】
例えば、エンコーダは、反射性材料の中断に対応したストリップの形態、すなわち、ガイドトラック（１２２）の所定生地領域の中断に対応したストリップの形態、とされる。
【０１５２】
他の可能な例においては、トラックは、わずかに反射性とすることができ、認識領域列に沿って延在することができる。例えば、トラックは、非反射性のストリップ（すなわち、エンコーダ）を備えることができる。
【０１５３】
表面がわずかに反射性というのは、反射光の比率が５０％未満であること、好ましくは、５％未満であること、を意味している。
【０１５４】
ある変形例においては、チップには、反射性ストリップからなるガイドトラックだけを設けることができる。
【０１５５】
各認識領域に、エンコーダを設けることにより、より一般的には、光学的マークを設けることにより、特に、高速かつ正確な認識領域の位置決めが可能とされる。
【０１５６】
しかしながら、１組をなす認識領域に対してただ１つのマークを設けることもできる。例えば、複数の認識領域からなる各列ごとに１つのマークを設けることができる。または、複数の認識領域からなる各行ごとに１つのマークを設けることができる。
【０１５７】
従来のマイクロエレクトロニクス技術を使用して、マークを形成することができる。例えば、固体プレートとしてアルミニウムやニッケルやクロムといったような金属反射層を成膜し、その後、位置決めマークの所望配置に対応したパターンに従って光リソグラフィーエッチングを行うことによって金属反射層を成形する、ことによりマークを形成することができる。
【０１５８】
例えば、金属層は、液相化学エッチングプロセスや気相プラズマエッチングプロセスを使用することにより、樹脂エッチングマスクによって決められたエッチングパターンに従ってエッチングすることができる。
【０１５９】
エッチング後に樹脂を除去した後に、生物学的分子の懸架に対しての表面適合性を改良するために、支持体上に薄いシリカ層を形成することができる。
【０１６０】
認識領域どうしが必ずしも互いに隣接している必要がないこと、また、光学的マークが必ずしも認識領域の周縁部付近に配置される必要がないこと、に注意されたい。
【０１６１】
ある可能な構成においては、図示していないものの、光学的反射性マークは、認識領域の内部に形成することができる。
【０１６２】
このタイプの構成は、認識領域からの光が蛍光であるときには、認識領域からの蛍光と反射光とが波長に違いに基づいて識別できる限りにおいては、問題とはならない。
【０１６３】
蛍光性ではなく（例えば）拡散性または回折性の分子が検出された場合には、信号の周波数の符号化によって、あるいは、サーボ制御の位置決めのために使用される角度に対しての角度差の検出によって、識別を行うことができる。
【０１６４】
光学的マークが形成された後に、認識領域を、認識分子でもってコーティングすることができる。これら認識分子は、公知技術である光リソグラフィー合成技術を使用することによって、合成されて認識領域に対して取り付けられる。
【０１６５】
バイオチップの表面が完全に平面ではないことに注意されたい。光学的マークをなす反射性ストリップが配置されているところは、他の部分よりも、５０〜２００ｎｍほど厚くなっている。
【０１６６】
この程度の厚さの違いは、提案された光学分析システムの区画深さよりも、小さいものである。
【０１６７】
光学的マークの形成および認識分子の合成は、シリコンウェハ上のまたはガラスウェハ上の多数のバイオチップに対して、大量生産的に行うことができる。その後、ウェハがカットされ、個々のバイオチップが同時に形成される。
【０１６８】
図４は、また、ガイドトラック（１２２）と、ガイドトラック（１２２）に沿って形成された反射性金属（例えばＣｒ）からなるエンコーダ（１２４ａ）の形態とされた光学的位置決めマークと、を備えたバイオチップ（１０）を示している。
【０１６９】
多数の矩形形状の認識領域すなわちセル（１１０）が、バイオチップの表面上において、破線によって示されている。各認識領域に対して、４つのガイドトラックが通過している。
【０１７０】
図４においては、一点鎖線でもって、励起光スポットの一連の位置が、概略的に示されている。これら位置は、記号（Ａ〜Ｇ）によって示されている。
【０１７１】
チップ変位手段（アクチュエータ）は、光スポットの移動を、高速軸と称される第１軸（ｘ）と低速軸と称される第２軸（ｙ）とに沿った移動とする。
【０１７２】
バイオチップの読取のための手順例が、表I に示されている。この表は、図４に示されたスポット位置表示記号を見ながら、参照されたい。
【０１７３】
表I は、移動状況を示しており、また、各位置における焦点合わせや位置決めや読取機能を規定している。
【表１】
【０１７４】
『トラック１』および『トラック２』という表示は、図の下側からｙ方向に数えたときの、トラックの順序を示している。また、『セルＮｏ．１』および『セルＮｏ．２』という表示は、図の左側からｘ方向に数えたときの、認識領域の順序を示している。
【０１７５】
読者の情報のために、符号（１５２，１５４）は、スポットがｘ方向およびｙ方向のそれぞれに沿ってエンコーダ（１２４ａ）上を走査される際に、センサによって生成される信号を示している。
【０１７６】
図５は、バイオチップの一部についての概略的な断面図である。符号（２０１，２０２）は、それぞれ便宜的に前面および背面と称される基板（２００）の各面を示している。
【０１７７】
基板（２００）は、例えばガラスといったような、入射読取光に対して透明な材質から形成されている。基板の前面（２０１）は、第１層（２２０）によってカバーされている。
【０１７８】
第１層（２２０）は、互いに交互に隣接配置された、第１材料からなる領域（２２１）および第２材料からなる領域（２２２）を備えている。例えば窒化シリコンとされる第１材料は、入射光に対して第１反射率を有しており、例えば酸化シリコンとされる第２材料は、同じ入射光に対して、第１反射率とは異なる第２反射率を有している。第１反射率と第２反射率との相違は、１〜５％の程度であり、例えば２％である。
【０１７９】
第１層内の領域（２２１，２２２）は、ガイドトラックを形成し得るようにまた位置決めマークを形成し得るように、配置されている。
【０１８０】
第２層（２１０）は、反応剤を備えた機能層であって、反応領域を形成している。この層に関してのさらなる情報は、上記の説明に与えられている。
【０１８１】
この実施形態においては、図６〜図９における他の実施形態の場合と同様に、領域（２２１，２２２）が、ほぼ透明である、つまり、入射光を透過させることができる。これら入射光は、認識領域を読み取るために使用される。領域（２２１，２２２）は、認識領域と重ね合わされており、位置決めマークは、実際には透明である。
【０１８２】
層（２１０）は、第１層上に直接的に形成することができる。あるいは、層（２１０）は、好ましくは、認識分子を固定することを意図した接着層（２１１）上に形成することができる。
【０１８３】
認識分子は、例えばＤＮＡプローブや抗体や抗原といったような化学的または生物学的化合物の中から選択される。
【０１８４】
透明支持体（２００）を使用するということは、読取光を背面（２０２）側から適用できて、これにより、分析対象をなす媒体に対して前面を接触状態とすることを容易とし得ることを、意味している。領域（２２１，２２２）による反射光が、矢印によって例示のために図示されている。
【０１８５】
図６は、図５の変形例としての他の可能な実施形態を示している。
【０１８６】
窒化シリコン層が、支持体（２００）上に成膜され、第１不連続領域（２２１）を形成するようにエッチングされている。酸化シリコン層（２２４）が、第１領域（２２１）をコーティングしてカバーするようにして、成膜されている。このようにして、酸化シリコン層が第２領域（２２２）を構成し、第１領域（２２１）と交互配置される。この場合、これら領域は、互いに異なる反射率を有している。
【０１８７】
機能層（２１０）が、酸化シリコン層（２２４）をカバーしている。
【０１８８】
バイオチップ上における位置決めマークの他の可能な実施形態が、図７に示されている。
【０１８９】
図７においては、ガラス支持体（２００）が、前面（２０１）から深さ方向に局所的にドーピングされており、これにより、不連続なドーピング領域（２２３）が形成されている。
【０１９０】
これらドーピング領域（２２３）は、支持体の非ドーピング領域と交互配置されている。あるいは、異なる濃度でもってドーピングされた領域どうしを交互配置することもできる。
【０１９１】
領域（２２３）と基板残部との間のドーピング程度の差により、屈折率の差がもたらされ、これにより、ドーピング領域に到達する入射光と非ドーピング領域に到達する入射光との間に光学経路差が生じる。
【０１９２】
経路差は、ドーピング領域と非ドーピング領域との屈折率差に比例するものであり、これにより、入射光に位相シフトがもたらされる。この位相シフトは、ドーピング領域と非ドーピング領域との間に位相コントラストを生成する。読取デバイスは、この位相シフトを読み取ることができ、読み取った位相シフトを使用することにより、チップと認識領域のマーキングとの間の相対的位置決めを行うことができる。
【０１９３】
したがって、ドーピング領域（２２３）は、本発明における意味合いにおいて、位置決めマークを形成する。
【０１９４】
図に示す例においては、入射光は、機能層（２１０）によってカバーされている基板上面において反射される。
【０１９５】
反射を改良するために、あるいは、機能層および機能層と接触している媒体とは無関係に反射することを少なくとも保証するために、（例えば、アルミナから形成された）反射性中間層（２２６）を、支持体と機能層との間に設けることができる。この反射性中間層の屈折率および厚さは、光学的薄層（２００，２２３，２２６，２１０）からなる積層が二色性ミラーを形成するように、選択される。反射性中間層の反射率は、公知の光学的薄層成膜技術によって制御される。例えば、層（２２６）の屈折率は、マークおよび支持体の屈折率よりも大きなものであるように、選択される。
【０１９６】
中間層は、また、分子認識領域内の反応剤のための接着層としても機能することができる。あるいは、中間層は、分子認識領域内の反応剤のための接着層に関連することができる。
【０１９７】
バイオチップ上における位置決めマークの他の可能な形成方法が、図８に示されている。
【０１９８】
この図に示す例においては、位置決めマークは、上面（２０１）から深さ方向に支持体（２００）をエッチングして不連続凹所（２２５）を形成することにより、得られている。凹所の深さ（ｅ）は、λを入射光の波長とし、ｎを支持体（２００）の屈折率としたときに、ｅ＝λ／（４ｎ）であるように固定されることが好ましい。
【０１９９】
凹所に対応した領域と非エッチング領域に対応した領域とのそれぞれにおいて上面によって反射される各光線は、互いに異なる厚さの材料を透過する。このため、互いに異なる経路長さを有している。
【０２００】
経路長さの差は、エッチングの深さに比例し、各光線間の位相シフトをもたらす。
【０２０１】
図７の例と同様にして、位相シフトは、読取デバイスによって検出可能な位相コントラストをもたらす。
【０２０２】
認識領域を形成する機能層（２１０）が、上面（２０１）をカバーしている。
【０２０３】
上記と同様にして、中間層および／または接着層を、支持体と機能層との間に設けることができる。
【０２０４】
図９は、バイオチップ位置決めマークの最後の例をなす実施形態を示している。
【０２０５】
この例においては、位置決めマークは、反射率の違いや光学経路長の違いによってではなく、偏光の変換制御によって検出される。
【０２０６】
回転タイプのまたは４分の１波長タイプの複屈折性材料からなる層が、支持体の上面（２０１）上に形成され、エッチングされることによって、不連続領域（２２７）の形態で位置決めマークを形成している。
【０２０７】
第１方向に偏光した入射光線が複屈折材料領域（２２７）に到達して、この領域を透過したときにはまたはこの領域によって反射されたときには、偏光方向が回転によって変換される。これに対して、ガラス支持体（２００）に到達した偏光光線の偏光は、反射後においても不変である。
【０２０８】
よって、読取デバイスの光学的位置決めシステム内に、初期偏光方向または変換後の偏光方向を選択肢得る部材を挿入することにより、位置決めマークを検出することができる。例えば、この部材は、検光子とすることができる。
【０２０９】
有利には、検光子が中性化されたときまたは除去されたときには、位置決めマークが、『見えないもの』となる。
【０２１０】
上記の例と同様に、基板には、機能層（２１０）がコーティングされる。上記と同様に、中間層を設けることもできる。
【０２１１】
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diagnostic tool ?”, A.D. Mirzabekov, TIBTECH, vol. 12, January 1994,
pages 27-32, Elsevier Science
（８）“DNA chips: An array possibilities”, A. Marshall and J. Hodgson,Nature Biotechnology, vol. 16, January 1998, pages 27-31
（９）国際特許出願明細書第９８ ０１５３３号
（１０）米国特許明細書第５ ７２１ ４３５号
（１１）国際特許出願明細書第９８／２８６２３号
（１２）国際特許出願明細書第９８／３８４９０号
（１３）欧州特許出願明細書第０ ６４０ ８２６号
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明による読取デバイスを簡略化して示す図である。
【図２】 図１の細部を示す図である。
【図３】 図１のデバイスによって読取可能な、本発明によるバイオチップを簡略化して示す平面図である。
【図４】 本発明によるバイオチップを簡略化して示す平面図であって、このようなバイオチップの読取シークエンスの一例を示している。
【図５】 本発明におけるバイオチップの一部を簡略化して示す断面図であって、他の可能な実施形態を示している。
【図６】 本発明におけるバイオチップの一部を簡略化して示す断面図であって、他の可能な実施形態を示している。
【図７】 本発明におけるバイオチップの一部を簡略化して示す断面図であって、他の可能な実施形態を示している。
【図８】 本発明におけるバイオチップの一部を簡略化して示す断面図であって、他の可能な実施形態を示している。
【図９】 本発明におけるバイオチップの一部を簡略化して示す断面図であって、他の可能な実施形態を示している。
【符号の説明】
１０ バイオチップ
１４ アクチュエータ（相対変位手段）
２０ 光学ヘッド
２２ 焦点合わせ用レンズ
２４ アクチュエータ（相対変位手段）
３２ 二色性ミラー（二色性スライド）
４０ 光学分析システム、第１光学システム
４２ 第１電気光学的センサ
４７ 光ファイバ
６０ 位置決めシステム、第２光学システム
６２ 第２電気光学的センサ
７０ サーボ制御ユニット（サーボ制御手段）
８０ 焦点合わせシステム、第３光学システム
８２ 第３電気光学的センサ
１１０ 認識領域
１２２ ガイドトラック（光学的位置決めマーク）
１２４ エンコーダ（光学的位置決めマーク）
１２４ａ エンコーダ（光学的位置決めマーク）
２１１ 接着層
２２１ 領域（光学的位置決めマーク）
２２２ 領域（光学的位置決めマーク）
２２３ ドーピング領域（光学的位置決めマーク）
２２５ 凹所（光学的位置決めマーク）
２２６ 中間層
２２７ 複屈折材料領域（光学的位置決めマーク）
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の分子認識領域を備えたバイオチップ、ならびに、このようなバイオチップの読取デバイスに関するものである。バイオチップとは、認識特性を有した分子を搭載している１つまたは複数の領域（認識領域と称される）を表面上に備えている任意のチップまたは支持体を意味している。本明細書においては、バイオチップという用語は、チップが化学分析や生物分析のために使用されるかどうかにかかわらず、使用される。
【０００２】
例えば、認識分子は、トレースヌクレオチドや、ポリヌクレオチドや、抗体やペプチドといったようなタンパク質や、レクチンや、他の任意の配位子受容タイプのシステムとすることができる。特に、認識分子は、ＤＮＡやＲＮＡのフラグメントとすることができる。
【０００３】
バイオチップが、分析対象をなす試料に対して接触されたときには、認識分子は、試料中の『ターゲット分子』と、例えば錯体化やハイブリッド化といったような相互作用を起こすことができる。よって、様々なターゲット分子をそれぞれ選択的に検出可能な複数の認識分子を有した複数の認識領域を、バイオチップに設けておくことにより、試料中に含有されている様々な分子を、検出することができ、可能であれば定量分析することができる。各認識領域は、ただ１つのタイプの同一分子を有している。
【０００４】
バイオチップ上に形成された錯体は、試料中のターゲット分子に対して付与された蛍光マーキングによって、認識することができる。
【０００５】
本発明による読取デバイスは、チップ認識領域内に存在しているかもしれないマーキングされたまたはマーキングされていない分子を読み取るための操作を容易とすることを意図したものである。
【０００６】
認識領域は、マーカーの存在なしに読み取ることができる。このタイプの技術は、従来技術において既に公知である。特に、ハイブリッド体を検出するためのいくつかの直接法としては、質量変化の検出や、厚さ変化の検出や、屈折率変化の検出、がある。光熱法も、また、公知であり、本明細書の最後に列挙した参考文献における文献１に記載されている。最後に、Boccara 氏他は、文献２，３において、光熱的な偏向法を開示している。この技術の改良は、文献４に開示されている。これら文献は、本明細書の最後に列挙されている。
【０００７】
かくして、本発明は、生物学的分析や科学的分析の分野に応用するために使用される。
【０００８】
生物学的分析という分野における好適な応用としては、多型性の研究や、変異の研究や、ハイブリッド化によるシークエンシングや、遺伝子発現の観測、がある。
【０００９】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
チップ内における認識領域の数は、実行すべき分析のタイプに依存する。ここで、数十〜数百個の認識領域を有した『低密度』チップと、数千〜数十万個の認識領域を有した『高密度』チップと、が区別される。
【００１０】
高密度チップ上における認識領域のサイズは、小さい。これら領域の寸法は、１００μｍ未満であり、場合によっては、１０μｍ未満であることもある。
【００１１】
上述のように、バイオチップ上に形成された錯体は、蛍光マーカーを使用してマーキングされる。例えば、フルオロセインやフィコエリトリンといったようなマーカーは、分析対象をなす試料中のターゲット分子に対して直接的に結合することができる。また、ターゲット分子も、ビオチンやジゴキシゲニンといったような間接認識基を使用してマーキングすることができる。
【００１２】
よって、与えられた認識領域に対する認識分子が、マーキングされたターゲット分子と相互作用を起こしたりまたはハイブリッド化を起こしたときには、蛍光マーカーが、これら領域に固定される。
【００１３】
バイオチップの読取に際しては、励起光と称される光をチップに向けて照射することによって蛍光マーカーを励起し、各認識領域において励起光によって引き起こされた蛍光を記録する。
【００１４】
認識領域内における蛍光の検出は、分析対象をなす試料中の、この領域内に存在している既知のタイプの認識分子と相互作用し得るターゲット分子（マーキングされた分子）の存在の決定を可能とする。蛍光強度を観測することにより、試料内における興味のあるターゲット分子の濃度を決定することができる。
【００１５】
このような技術に関しては、特に、遺伝生物学への応用に関しては、例えば文献６，７，８といったような文献を参照することができる。これら文献は、本明細書の最後に列挙されている。
【００１６】
低密度バイオチップにおいては、認識領域は、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）を備えた撮像ステーションによって読取を行うことができる。このようなステーションは、高密度チップには、うまく適用することができない。それは、ＣＣＤカメラは、多数の検出画素を有しているべきであるからであり、高密度チップにおいては蛍光の光束が特に小さいため、信号雑音比を向上させるためにカメラを冷却する必要があるからである。
【００１７】
よって、高密度チップの場合には、チップを走査することによって認識領域を順次的に分析可能とするために、蛍光スキャナが使用される。
【００１８】
このようなスキャナには、各領域における蛍光を記録するために、光電センサに関連した共焦光学システムが設けられる。スキャナは、非常に良好な空間的解像度（１〜１０μｍ）でもって対象物を観測するために使用することができ、共焦光学システムは、寄生光発光効果（自動蛍光、スペクトル反射、等）を克服するための手段である。
【００１９】
高密度チップに対するスキャナの例示としては、文献４を参照することができる。この文献は、本明細書の最後に列挙されている。
【００２０】
蛍光スキャナは、電気信号を出力する。出力信号が集められて、バイオチップの２次元像が形成される。また、出力信号を使用して、バイオチップ表面の空間構造が認識され、バイオチップ上に配置されている複数の認識領域が識別されて規定される。
【００２１】
最後に、確認式領域からの出力信号強度が、分析結果として記録される。
【００２２】
さらに、これら分析結果に適切なコンピュータ処理を施すことによって、生物学的にまたは化学的に有益な情報を得ることができる。
【００２３】
上記のような信号処理が、各認識領域に対して多数の測定ポイントまたは画素を必要とするという欠点があるということがわかっている。
【００２４】
各認識領域の正確な決定には、各認識領域に対して十分に多数の画素像密度が必要とされる。
【００２５】
実際に、許容可能な条件で信号処理を実行可能とするためには、認識領域のサイズに依存して、各認識領域あたりに３６個〜６４個という程度の数の画素が必要であることがわかっている。
【００２６】
よって、高密度バイオチップの信号処理には、大容量のコンピュータデータ処理手段および格納手段が必要とされる。したがって、処理が高価なものとなる。
【００２７】
さらに、認識領域をベースとした像のセグメント化が、完全に信頼性のあるものではない。
【００２８】
本明細書の最後に列挙されているうちの文献９，１０には、上記のいくつかの困難性を回避し得るような他の可能なバイオチップ読取手段が開示されている。
【００２９】
文献９には、読取を容易とするために、チップ上の認識素子およびマーキング素子の配置方法が開示されている。この場合、例えばコンパクト光ディスクプレーヤ（ＣＤ−ＲＯＭ）といったような読取デバイスを使用したバイオチップの読取が考えられる。
【００３０】
文献９においては、一般大衆が使用可能な読取デバイス（特に、ＣＤ−ＲＯＭコンパクト光ディスクプレーヤ）によってバイオチップを読取可能とするための、バイオチップに対しての化学処理が記載されている。分析対象をなすターゲット分子を含有した試料の分析を開始する前に、バイオチップ上の分子認識領域が、『架橋』分子によって表面に対してアンカー止めされた金属ボールによって形成されている反射性フィルムによってカバーされる。これら反射性ボールは、試料中のターゲット分子に対して結合し得るように機能付加されている。したがって、ハイブリッド化時には、同一のターゲット分子が２つの箇所において結合される必要がある。つまり、第１に、分子認識領域上のバイオチップ表面に対して結合される必要があり、第２に、この認識領域の上方に配置された金属ボールの表面に対して結合される必要がある。ハイブリッド化の後に、適切な化学処理を施すことによって、表面に対して金属ボールをアンカー止めしている架橋分子を解離させ、バイオチップの表面が洗浄される。この時点で、最少数のターゲット分子によって表面に保持されている金属ボールだけが、存在しており、生物学的情報をなす『ビット』を形成している。
【００３１】
文献９によって提案された処理の後に、分析のためには、さらなる生化学的なステップが必要である。このステップとは、架橋分子の分解である。さらに、認識領域上におけるターゲット分子のハイブリッド化は、金属ボールの存在のために、非常に遅いものである。それは、金属ボールが、認識領域を支持している表面に向けてのターゲット分子の拡散速度をかなり遅くしてしまうためである。したがって、分析は、非常に遅いものとなってしまう。さらに、表面に対して最終的に結合されて残存している金属ボールの数と、試料中のターゲット分子の初期濃度と、の間に存在する関係が、容易には定量化することができない。これは、ステップタイプの関係といったものである。（金属ボールが結合し得ない下限しきい値と、金属ボールが結合し得る上限しきい値と、が存在する。中程度の数の金属ボールが結合するような動的範囲、すなわち、定量化可能な数の動的範囲は、極めて小さい。）
【００３２】
文献１０においては、バイオチップには、認識領域に関連してマークが付されている。しかしながら、これらマークは、認識分子とは区別され、認識領域から物理的に離間されている。マークは、バイオチップを走査したときに、ハイブリッド化反応または錯体化反応とは独立に検出することができる。
【００３３】
マークの位置が検出されるとすぐに、２つのマークの順次的な検出に要した時間を、測定することができ、これにより、バイオチップ上のスキャナの相対位置を決定するという機能を確立することができる。この機能を使用することにより、バイオチップ上の認識領域の位置を、より正確に決定することができる。
【００３４】
バイオチップ上におけるマークの使用は、測定領域の配置を改良するための恒久的手段であり、よって、読取を容易とするための恒久的手段である。
【００３５】
しかしながら、バイオチップとスキャナ光学読取システムとの間の相対変位は、認識領域上における光学スキャナシステムの案内を正確に行うためには、十分に正確に制御される必要がある。
【００３６】
この制御は、認識領域が十分に大きくかつ認識領域の数がそれほど多くないときには、そんなに困難なことではない。バイオチップと光学システムとの間の相対変位は、比較的安価な機械的手段を使用することによって、効果的に行うことができる。
【００３７】
しかしながら、認識領域の寸法が数ミクロン以下であるような高密度チップの場合には、認識領域の十分な走査を行って先鋭な歪みのない像を得るためには、極めて正確な機械的手段が、必須とされる。
【００３８】
極めて正確な機械的手段は、また、一定の速度で小さな認識領域を走査する際にも必要とされる。これにより、得られた像を修正することができ、像を、変位の機能のために使用することができる。
【００３９】
具体例で説明するならば、例えば一辺の長さが２０μｍとされた３００×３００個の隣接する認識領域を想定する。典型的な７×７個の測定試料に対しては、３μｍという変位解像度が必要とされ、この変位の精度は、１μｍ（±０．５μｍ）でなければならず、配置の繰返し精度は、１μｍ（±０．５μｍ）でなければならない。変位速度は、一定でなければならず、走査変位は、０．３ｍｒａｄ以内で平行でなければならない。安価な機械では、このような特性を得ることはできない。
【００４０】
さらに、チップの読取前に光学システムを焦点合わせするためには、チップを空間内で配向させる必要があるとともに、１０μｍという解像度でかつ約５μｍという精度でかつ１０μｍという繰返し精度で、変位させる必要がある。このような特性は、光学システムの１００μｍという区画深さに対して得られる。１０μｍへと区画深さを小さくするには、焦点合わせ時に、２．５μｍという最小解像度かつ約０．５μｍという精度かつ１μｍという繰返し精度が必要とされる。
【００４１】
高精度の機械的手段が要求されることが、バイオチップ読取デバイスを特に高価なものとしている理由である。
【００４２】
さらに、高密度バイオチップ認識領域の表面積が小さいことにより、バイオチップは、各認識領域内の各試料に対して十分な量の光エネルギーを集め得るよう、ゆっくりと走査する必要がある。
【００４３】
しかしながら、ゆっくりとした走査は、多数の認識領域が存在する場合には常に、バイオチップの分析を過度に長いものとしてしまう。
【００４４】
蛍光によって生成される光量は、高出力レーザーによってターゲット分子マーカーを励起することにより、わずかに増大させることができる。しかしながら、このタイプの装置の使用は、読取デバイスのコストをさらに増大させてしまう。
【００４５】
文献１１，１２，１３には、さらなる従来技術が記載されている。文献１１は、細胞（セル）の検出および定量化に関するものであって、分子認識に関するものではない。文献１２，１３は、ゆっくりとした位置決め機構を使用した読取システムに関するものであって、『リアルタイム』での読取に関する問題点を解決するものではない。
【００４６】
【課題を解決するための手段】
本発明のある目的は、上述の困難性を有していないようなバイオチップ読取デバイスを提案することである。
【００４７】
特に、本発明のある目的は、低コストでもって高密度バイオチップを読み取り得るような、そのようなデバイスを提案することである。
【００４８】
本発明の他の目的は、より迅速にチップ走査を行うことができて、測定品質を低下させることなく分析時間を短縮し得るような、そのようなデバイスを提案することである。
【００４９】
本発明のさらに他の目的は、チップ像を過剰に撮像しすぎることなく認識領域の位置および配向を迅速に識別し得るような、デバイスを提案することである。
【００５０】
本発明の別の目的は、走査機構のコストを最小化するために、そのような読取デバイスに適合したバイオチップを提案することである。
【００５１】
上記目的を達成するために、本発明の目的は、より詳細には、複数の認識領域と複数の光学的位置決めマークとを具備しているバイオチップを、リアルタイムで読み取るためのデバイスであって、認識領域が、ＤＮＡまたはＲＮＡのフラグメントを備えているとともに、光学的位置決めマークに対しての所定位置に配置されている場合において、
デバイスが、
−バイオチップ上に入射光を投影し得る光学ヘッドと、
−バイオチップ上にわたっての走査を可能とし得るよう、光学ヘッドとバイオチップとの間の相対変位を引き起こすための相対変位手段と、
−光学ヘッドと協働することによって、光を可能であれば認識領域からの光を、少なくとも１つの第１電気光学的センサ上に投影する、分析システムと称される第１光学システムと、
−光学ヘッドと協働することによって、少なくとも１つの位置決めマークからの光を、少なくとも１つの第２電気光学的センサ上に投影する、位置決めシステムと称される第２光学システムと、
−光学的位置決めシステム内の電気光学的センサからの電気出力信号の関数として相対変位手段を制御し得るよう、光学ヘッドの相対変位手段をサーボ制御するためのサーボ制御手段と、
を具備し、
−相対変位手段が、巨視的（大スケールでの）変位手段と微視的（小スケールでの）変位手段とを備え、
−サーボ制御手段が、微視的変位手段に対して接続されているようなデバイスである。
【００５２】
本明細書においては、『マーキングされた分子からの光』といったような表現は、便宜的に、入射光に応答して認識領域から蛍光または反射光または拡散光または屈折光として放出される光を示すために使用される。このような光は、例えば、マーキングされたまたはマーキングされていない分子上において使用された特定基によってもたらされる。
【００５３】
微視的変位は、３つの軸のうちの少なくとも１つの軸に沿った光学ヘッドの位置を修正するために使用される。（第１軸は、第１光学システムの光学軸に対応するものであり、他の２つの軸は、この第１軸に対して垂直な軸である。）
【００５４】
認識領域とは、バイオチップの表面のうちの、与えられたタイプのターゲット分子を認識し得るような性質を有した分子が存在している部分を意味している。
【００５５】
位置決めシステムの電気信号による光学ヘッド走査のサーボ制御は、バイオチップと光学ヘッドとの間の相対変位をリアルタイムで修正するための手段である。これにより、安価な機械的変位手段でもって、極めて正確な制御を得ることができる。特に、通常コンパクトディスプレイプレーヤに搭載されるようなアクチュエータといったような機械的手段を使用することができるようになる。
【００５６】
サーボ制御を行うことにより、さらに、比較的一様な速度での変位を得ることができる。これにより、認識領域からの蛍光を連続的に読み取ることができる。
【００５７】
この観点において、サーボ制御手段に関連した光学的位置決めシステムが、バイオチップのリアルタイムでの読取手段をなすことは、言うまでもないことである。つまり、認識領域および／または位置決めマークに対しての読取位置をリアルタイムで知るための手段をなすことは、言うまでもないことである。
【００５８】
さらに、サーボ制御によって得られる焦点合わせ精度は、浅い区画深さを有した共焦光学システムの使用を可能とする。これにより、バイオチップ基体に起因する寄生光の影響を、低減することができる。よって、より良好な信号動特性を得ることができる。
【００５９】
区画深さが浅いことのために寄生光の影響を受けないような、読取デバイス内の光学システムは、より大きなデジタル開口を有して形成することができ、したがって、より多くの光を収集する。そのため、より高速の読取が可能となり、また、入射光源を、出力の小さなものとすることができる。
【００６０】
本発明のある見地においては、相対変位手段は、巨視的（大スケールでの）変位手段と微視的（小スケールでの）変位手段とを備えることができる。この場合、上述のように、サーボ制御手段は、微視的変位手段を制御する。
【００６１】
本発明の他の有利な見地においては、光学ヘッドは、焦点合わせ用レンズと、このレンズの焦点合わせのためにこのレンズを軸方向に変位させるための少なくとも１つのアクチュエータと、を備えることができる。焦点合わせシステムと称される第３光学システムを、光学ヘッドと協働して使用することによって、入射光のバイオチップ上における反射によって生成された光を、第３電気光学的センサ上に投影することができる。焦点合わせ用レンズの変位を制御するために、アクチュエータに対して接続された焦点合わせ用サーボ制御手段を設けることができる。
【００６２】
焦点合わせ用サーボ制御手段により、焦点合わせを行いつつ、同時に、認識領域の連続的な読取を行うことができる。この特徴点は、測定精度を走査条件とは独立に向上させ得るよう、バイオチップ上のマーキングを見失わないための手段をもたらす。
【００６３】
本発明のある特に簡単化された実施形態においては、デバイスは、第１および第２光学システムと、第１および第２光学システムに共通した少なくとも１つの電気光学的センサと、を備えてなる単一の光学システムを具備し、共通の光学センサが、分子認識領域からの光だけではなく、少なくとも１つの位置決めマークからの光をも収集する。この場合、共通のセンサは、信号処理システムと、光学ヘッド走査のためのサーボ制御手段と、に対して接続される。
【００６４】
したがって、この実施形態においては、共通の光学センサは、蛍光分析のために使用される信号と、バイオチップと光学ヘッドとの間の相対変位（走査）のサーボ制御のための信号と、を出力する。
【００６５】
本発明は、また、複数の認識領域と、複数の光学的位置決めマークと、を具備してなるバイオチップに関するものである。
【００６６】
本発明による認識領域は、位置決めマークの全部またはいくつかをカバーし得るよう、全体的にまたは部分的に、位置決めマークに重ね合わされている。
【００６７】
例えば、認識領域に関連した光学的位置決めマークは、励起光を反射する領域を備えることができる。これにより、バイオチップの向きの制御が補助され、認識領域の位置が識別され、さらに、ハイブリッド化が起こったかどうかにかかわらず正確な走査を行うことができる。特に、光学的位置決めマークは、ガイドトラックと称されるトラックの形態で存在することができる。
【００６８】
ある格別の見地においては、位置決めマークは、隣接領域の反射率とは異なるような、入射光に対して特定の反射率を有するように構成することができる。
【００６９】
バイオチップの他の格別の可能な実施形態においては、各認識領域に、特定の光学的マークを配置することができる。よって、各認識領域の位置を決定する目的でバイオチップ全体の像を形成する必要がない。
【００７０】
よって、認識領域の位置を正確に決定し得る可能性は、各認識領域に対して少数の画素だけで済み、過度にサンプリングを行うことなく正確な測定を行う手段をもたらす。
【００７１】
さらに、各認識領域が識別されるとすぐに、光学ヘッドまたはバイオチップを移動させることによって、１つまたは複数の所定領域に対しての局所的分析を行うことができる。この場合、光学ヘッドは、所望領域に対して直接的に対向している。
【００７２】
認識領域からの光を記録する際の態様には、いくつもの可能な形態が存在する。
【００７３】
第１の態様においては、光学ヘッドを認識領域に対向させつつ移動不可能に保持することができ、次なる領域に向かう前の所定時間にわたって信号の獲得を行うことができる。
【００７４】
上述したように、光学的マークとサーボ制御手段とは、十分な精度でもってヘッドを位置決めするために使用される。これにより、信頼性の高い分析を行うことができる。さらに、光学的マークを使用することにより、認識領域が蛍光を発していない場合であっても、認識領域を正確に位置決めすることができる。
【００７５】
複数の認識領域がバイオチップの活性面をカバーするようにして例えば並置といったような態様で互いにサイドバイサイドに並べられた複数の認識領域にわたって連続的に光学ヘッドを変位させることにより、停止することなく、複数のセンサ信号を獲得することができる。この場合、信号を積分することにより、１つまたは複数の認識領域を走査するのに要した時間中に受領された光量を決定することができる。
【００７６】
しかしながら、変位速度の変動が、認識領域から単位時間あたりに放出される光量の分析に影響を与え得る。
【００７７】
よって、分析の第２態様においては、走査される認識領域に関連している互いに近接する２つの位置決めマークの間を光学ヘッドが通過する通過時間の関数として、獲得信号を規格化することができる。
【００７８】
第３態様においては、停止することなく信号獲得が行われ、連続する２つのマークの前方を光学ヘッドが通過する通過時間を測定することにより、光学ヘッドとバイオチップとの間の相対変位速度を連続的にサーボ制御する。
【００７９】
本発明は、また、上述のようなデバイスによって読み取ることができるバイオチップであって、分子認識領域が、位置決めマークの全部またはいくつかをカバーし得るよう、全体的にまたは部分的に、位置決めマークに重ね合わされているようなバイオチップに関するものである。
【００８０】
この特徴点は、位置決めマークによるバイオチップ表面の過密が防止されるという点において、特に有利である。これは、バイオチップの大部分のまたはすべての全体表面を、分子認識領域のための利用することができることを意味している。
【００８１】
位置決めマークは、バイオチップの向きの制御するために、また、認識領域をマーキングして識別するために、使用される。これは、認識領域が、好ましくは位置決めマークに対しての所定位置に配置されているからである。
【００８２】
バイオチップの位置決めを行うためには、および／または、認識領域の識別を行うためには、非常に薄い位置決めマークであっても、十分である。
【００８３】
しかしながら、位置決めマークの表面積が、当該位置決めマークに関連する分子認識領域の表面積と比較して無視できないものである場合にのみ、良好な精度が得られることがわかっている。
【００８４】
位置決めマークが分子認識領域と部分的にまたは完全にオーバーラップするようにして位置決めマークが配置されているというこの特徴点は、位置決めマークの設置領域を増やすことができること、および、これにより、読取デバイスに対してのバイオチップの位置の制御性が改良されること、を意味している。
【００８５】
位置決めマークが、位置のサーボ制御のために入射光ビームが通過するガイドトラックの形態とされているときには、トラックの幅が、光ビームの幅と比較して無視できないものであることが望ましい。
【００８６】
トラックは、バイオチップの全面積の３０〜１００％の程度の表面を占めるような位置決めマークを使用することにより、優秀な精度でもってマーキングすることができる。
【００８７】
認識領域と位置決めマークとのオーバーラップは、有効単位面積あたりのバイオチップの製造コストを考慮した場合、経済的に有利である。
【００８８】
さらに、位置決めマークの面積増加は、マークの読取を容易なものとする。これは、読取デバイスを、より小さな光強度で使用できること、および、より低い感度で使用できること、を意味している。
【００８９】
このことは、また、読取デバイスのコストを低減する。
【００９０】
位置決めのために強度のより小さな光源を使用できることは、分子認識領域上に位置しているかもしれない蛍光マーカーの燃焼というリスクを低減することができる。
【００９１】
さらに、位置決めマークは、少なくとも１つの読取用入射光に応答して認識領域から放出される少なくとも１つの蛍光に対して、ほぼ透明であるように構成することができる。
【００９２】
レーザービームが背面を通して読取を行う場合には、位置決めマークの反射率、および／または、認識領域と位置決めマークとの間の境界部の反射率は、０％より大きなものとされ、好ましくは１〜１０％のものとされ、さらに好ましくは１〜５％のものとされる。
【００９３】
レーザービームが前面から読取を行う場合には、位置決めマークの反射率、および／または、認識領域上のコーティング材料と位置決めマークとの間の境界部の反射率は、０％より大きなものとされ、特に１〜１００％のものとされる。
【００９４】
バイオチップの前面とは、認識領域において認識分子でもってコーティングされている面を意味しており、バイオチップの背面とは、前面とは反対側のコーティングされていない面を意味している。
【００９５】
さらに、バイオチップは、位置決めマークと認識領域との間に、位置決めマークの反射率とは異なる反射率の材料から形成された中間層を備えることができる。この場合、中間層は、分子認識領域のコーティングとは無関係に、また、バイオチップに接触している液体媒体または気体媒体とは無関係に、位置決めマークのところにおいて入射光を所定に反射することができる。
【００９６】
他の可能性においては、位置決めマークを形成することが考えられる。特に、位置決めマークは、入射光に対しての特性が互いに異なる領域を交互に配列することによって、形成することができる。
【００９７】
第１の態様においては、位置決めマークがなす領域とその隣接領域とは、入射光に対しての光学経路が異なるものとすることができる。光学経路の違いは、特に、互いに隣接するこれら領域を互いに異なる材料から形成することにより、および／または、互いに隣接するこれら領域を厚さが互いに異なるものとして形成することにより、および／または、互いに隣接するこれら領域を互いにドーピング程度が異なるものとして形成することにより、得ることができる。互いに隣接するこれら領域についての異なる材料の選択または異なるドーピング程度の選択は、各領域における屈折率を相違させることを意味している。
【００９８】
位置決めマーク形成の他の可能な手段においては、位置決めマークは、偏光されている読取用入射光の偏光方向を変換し得る複屈折性材料からなるストリップから形成することができる。
【００９９】
さらに他の態様においては、位置決めマーク領域とその隣接領域とは、互いに異なる反射率の材料から形成することができる。
【０１００】
【発明の実施の形態】
本発明の他の特徴点および利点は、添付図面を参照しつつ以下の説明を読むことにより、明瞭となるであろう。以下の説明は、例示の目的のためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０１】
図１における符号（１０）は、バイオチップを示している。バイオチップ（１０）は、特定の認識分子を有した複数の認識領域を備えており、可能であれば、複数の認識領域に関連したガイドトラックおよび／または光学的位置決めマークを備えている。これら構成要素については、簡略化のために図１には示されていないものの、詳細に後述する。
【０１０２】
この例においては、特定の認識分子は、蛍光基によってマークされている。ただし、これら蛍光基は、本発明の範囲を逸脱することなく、光を反射させたりあるいは拡散させたりあるいは屈折させたりし得る基によって、置換することができる。
【０１０３】
バイオチップは、読取デバイス（１２）に対向して配置されている。読取デバイスは、認識領域上に固定されている、蛍光マーカー付きの分子を励起するようにして、認識領域を走査するためのものである。バイオチップは、また、分子によって生成された蛍光を記録するためのものである。
【０１０４】
認識領域は、読取デバイス（１２）またはその一部と、バイオチップ（１０）と、の間の相対変位によって、走査される。
【０１０５】
図１の例においては、巨視的な相対変位は、アクチュエータ（１４）によって得られる。このアクチュエータは、例えば、バイオチップ（１０）を移動させるモータ駆動型のアクチュエータである。レンズ（２２）の微視的移動は、電磁アクチュエータ（２４）によって得られる。矩形形状とされたバイオチップは、読取デバイスの光学軸（Ω）に対して垂直な平面内において移動を受ける。
【０１０６】
この平面は、また、図面がなす平面に対しても垂直である。
【０１０７】
変位は、図１に示す２つの直交方向（ｘ，ｙ）に沿って起こるものとされている。
【０１０８】
読取デバイス（１２）は、光学ヘッド（２０）を備えている。光学ヘッド（２０）には、光学軸（Ω）を有した焦点合わせ用レンズ（２２）が設けられている。光学ヘッドレンズ（２２）は、バイオチップに向けて励起光を案内するという機能と、励起光に応答して放出される蛍光を収集するという機能と、の２つの機能を果たす。
【０１０９】
励起光は、例えば６３３ｎｍといったような第１波長を有した単色光とされる。励起光は、レーザー（３０）によって生成される。このレーザーからのビームは、二色性ミラー（３２）を経由することにより、光学ヘッド（２０）に向けて案内される。焦点合わせ用レンズ（２２）は、バイオチップのうちの、活性面と称される背面（１８）上にビームを焦点合わせする。
【０１１０】
二色性ミラー（３２）は、レーザーからの光の大部分（８０〜９５％）を、焦点合わせ用レンズへと反射する。残りの光（５〜２０％）は、ミラー（３２）を透過して、参照センサと称される電気光学的センサ（３３）によって収集される。
【０１１１】
参照センサ（３３）は、レーザー（３０）から放出されるビームの強度の時間変動を測定する。この測定結果は、バイオチップによって放出される蛍光の分析のために使用される。これにより、蛍光分析結果を、レーザー強度の変動とは無関係に行うことができる。
【０１１２】
光学ヘッド（２０）と関連して、第１光学分析システム（４０）が設けられている。第１光学分析システム（４０）は、光学的中心線（Ω）に対して軸合わせされている。このため、バイオチップ上に存在しているであろうマークされた励起分子によって生成された蛍光を、以降分析センサと称される１つまたは複数の電気光学的センサ（４２）上に投影することができるようになっている。
【０１１３】
より詳細には、蛍光は、光学ヘッド（２０）の焦点合わせ用レンズ（２２）により収集されてコリメートされ、これにより、ビームが形成される。このビームは、二色性ミラー（３２）を透過し、さらに、収束用レンズ（４４）を透過することによって、ダイヤフラム（４６）上に収束される。ダイヤフラムは、不透明スクリーンに小穴を開けることによって形成することができる。このダイヤフラムは、光学的中心線（Ω）に沿った空間的フィルタリングという機能を果たし、光学システムを共焦的なものとする。
【０１１４】
ダイヤフラムは、断続的に照光される対象物と組み合わせることにより、対象平面を表す薄い『スライス』内において、（励起光によって）照光された領域からの光だけを、通過させることができる。このタイプの共焦システムの利点は、特にＤＮＡチップの読取に関しては、明らかである。対象空間の『スライス』を規定できるという可能性を使用することにより、分子認識領域を含有している興味のある平面を、チップの残部（ガラス支持体、バッファ）から、分離することができる。したがって、受領光は、支持体上の色中心に基づく寄生光を一切含有しておらず、また、背景に基づく連続光を含有していない。
【０１１５】
認識領域上に保持されているターゲット分子が付帯している蛍光マーカーの蛍光発光現象は、励起光を、励起光の波長よりも長い波長を有した光へと、変換する。
【０１１６】
例えば、この例においては、蛍光の波長は、６７０ｎｍである。
【０１１７】
干渉フィルタ（４８）が、光学ヘッドの焦点合わせ用レンズ（２２）と、収束用レンズ（４４）と、の間に配置されている。この干渉フィルタは、光学分析システムが受領した受領光内における蛍光スペクトルバンドにほぼ対応したスペクトルバンドを分離する。これにより、寄生光が、より良好に除去される。
【０１１８】
符号（５０）は、分析センサ（４２）からの出力信号を処理するための処理ユニットを示している。この例においては、分析センサ（４２）は、受領した蛍光の強度に比例したアナログ信号を出力するような、光増倍型センサとされている。
【０１１９】
分析センサからの出力信号は、ある与えられた認識領域からの光を光学ヘッドが受領している期間にわたって集積（積分）することができる。上述のように、信号は、また、バイオチップを走査しつつ、停止することなく測定プロセスにおいて記録することもできる。この信号は、また、デジタル化することもできる。この場合には、行うべき分析タイプに適合したアルゴリズムを使用して、信号の処理を行うことができる。
【０１２０】
処理ユニット（５０）が、また、参照センサ（３３）からの参照信号も、受領することが示されている。上述したように、この参照信号が、分析センサからの出力信号を規格化するための手段であり、これにより、レーザー強度の変動の影響が除去されることに注意されたい。
【０１２１】
二色性ミラー（３２）は、光分離キューブ（３４）と協働することにより、レーザーからの入射光の、バイオチップ上における反射や回折や屈折や分散に起因する光を、第２光学システム（６０）へと、導く。例えば、この反射光は、バイオチップ上に設けられているガイドトラックおよび／または位置決めマークに起因するものであるかもしれない。バイオチップがガイドトラックを備えていない場合には、バイオチッを、ガイドトラックを備えているプレート上に載置することができる。
【０１２２】
位置決めシステムと称される第２光学システム（６０）は、受領光を少なくとも１つの電気光学センサ（６２）上へと焦点合わせするレンズ（６４）を備えている。ここで、電気光学センサ（６２）は、例えば、４つの四分円を有したあるいは多分割円を有した検出器であり、非点収差を補正するビーム分析光学システムが付設されたものとされている。電気光学的センサ（６２）には、また、ＣＣＤモジュールや、差分光学抵抗や、他の任意の位置決め測定システムを付設することができる。
【０１２３】
位置決めシステムの電気光学的センサは、サーボ制御ユニットと称されるユニット（７０）に対して接続されている。例えば、サーボ制御ユニットを使用することにより、光学ヘッドが位置決めマークの前方を通過する時点を検出するためにセンサ信号を解読し、発見された位置決めマークをカウントし、一連の認識領域に対応した一連のマークに従うように走査変位を制御することができる。サーボ制御ユニット（７０）は、この目的のために、アクチュエータ（１４および／または２４）に対して接続され、バイオチップおよび／またはレンズ（２２）の移動を制御する。サーボ制御ユニット（７０）は、また、バイオチップ上に配置されたマークによって指示された走査軌跡に沿った経路上に光学ヘッドを動的に維持するために、使用することができる。
【０１２４】
例えば、アクチュエータは、光学的位置決めシステム内のセンサによって受領される光強度が所定範囲内の値となるように、制御することができる。動作位置は、平衡状態に対応している。位置の設定値が与えられ、サーボ制御システムが、この設定値を維持する。例えば、多分割円形検出器上の光強度の分布が常に同一であることを確保するように、制御することができる。
【０１２５】
第２光学システムに設けられた第２光分離キューブ（３６）は、第２光学システムへの入射光の一部を、焦点合わせシステムと称される第３光学システム（８０）へと案内する。
【０１２６】
光学的焦点合わせシステム（８０）は、受領光を電気光学センサ（８２）上へと焦点合わせするレンズ（８４）を備えている。ここで、電気光学センサ（８２）は、例えば、４つの四分円を有したあるいは多分割円を有した検出器であり、非点収差を補正するビーム分析光学システムや、ＣＣＤモジュールや、差分光学抵抗や、他の任意の位置決め測定システム、が付設されたものとされている。
【０１２７】
光学的焦点合わせシステムへと導かれる光は、バイオチップ上において反射されたレーザー光に基づくものである。特に、このシステムへと導かれる光は、バイオチップの活性面上における位置決めマークまたはガラス状反射に基づくものである。
【０１２８】
光学的焦点合わせシステム（８０）内のセンサ（８２）も、また、サーボ制御ユニット（７０）に対して接続されている。サーボ制御ユニットは、光学ヘッド（２０）のレンズ（２２）に対して固定されたアクチュエータ（２４）を制御し得るように構成されている。アクチュエータ（２４）は、軸（Ω）に沿ってレンズ（２２）を移動させ、これにより、バイオチップ内の光学システムの連続的な適切な焦点合わせを行う。より詳細には、バイオチップのいくつかの部分上において、光学システムの連続的な適切な焦点合わせを行う。
【０１２９】
例えば、サーボ制御ユニットは、焦点合わせ用システムのセンサ上における焦点合わせスポットの面積が、参照スポット（例えば円形）の表面（形状および／または位置）に対して制御されるようにして、光学ヘッドのレンズ（２２）を変位させるように構成することができる。
【０１３０】
ある単純化された実施形態においては、第１光学システム（４０）すなわち光学分析システムの電気光学センサを使用することにより、認識領域に起因する光に対応した電気信号と、ガイドトラックおよび／または位置決めマークにより反射されたまたは拡散された光に対応した電気信号と、を出力することができる。
【０１３１】
この場合、このセンサは、信号処理ユニット（５０）に対してだけでなく、（図１において破線で示すように）サーボ制御ユニット（７０）に対しても接続されており、このため、バイオチップと光学ヘッドとの間の相対変位を制御できるようになっている。また、可能であれば、光学ヘッドレンズの焦点合わせを制御できるようになっている。
【０１３２】
この実施形態においては、読取デバイスは、上述のような第１および第２（および、可能であれば第３も）光学システムを機能的に含有する、単一の光学システムを備えている。
【０１３３】
図２は、光学分析システムの特定の実施形態を示している。
【０１３４】
簡単化のために、図２は、デバイスの細部だけを示しており、他の構成部材は、図１を参照して説明したものと同じである。
【０１３５】
図２における光学分析システム（４０）は、干渉フィルタ（４８）と焦点合わせ用対物レンズ（４４ａ）とを備えている。対物レンズは、光学ヘッド（２０）から受領した蛍光ビームを、光ファイバ（４７）の第１端上に焦点合わせし得るように構成されている。
【０１３６】
光ファイバ（４７）の第２端は、光増倍管またはアバランシェ光ダイオードとされた電気光学センサ（４２）に対して接続されている。光ファイバ（４７）（わずかにマルチモード）は、図１における共焦ダイヤフラム（４６）として機能する。
【０１３７】
図１および図２に示す光学分析システムは、上述のように、共焦システムである。
【０１３８】
共焦システムの主要特質は、空間解像度が優秀であることと、軸方向解像度が優秀であることと、である。軸方向解像度とは、焦点面周辺の微小観測体積を分離できるような、システムの能力のことである。つまり、焦点面周辺の微小観測体積外からの寄生光を除去できる能力のことである。軸方向解像度は、システムの『区画深さ』によって特徴づけられ、区画深さは、Ｐｄｓとして表される。
【０１３９】
上記区画深さＰｄｓは、λを単位をμｍとして表したときの波長、ｕを光学システムのデジタル開口円錐の２分の１角度とすれば、Ｐｄｓ＝０．４４３×λ／（１−cos ｕ）として表される。
【０１４０】
光学分析システムを構成するために使用されているレンズは、０．４〜０．５という程度のデジタル開口を有している。よって、１．８〜２．８μｍという程度の区画深さを得ることができる。さらに、バイオチップから放出される光束の１６〜２２％が、レンズによって収集される。
【０１４１】
次に、読取デバイスに対して適用されるバイオチップの実施形態について、詳細に説明する。
【０１４２】
図３は、そのようなバイオチップを示している。バイオチップ（１０）は、支持体（１００）を備えており、この支持体（１００）上に、複数の認識領域（１１０）が形成されている。例えば、認識領域（１１０）は、支持体の表面上に形成された電極と一致している。これら電極には、与えられた化学的または生物学的化合物と相互作用し得るコーティングが、選択的に施されている。本明細書の導入部分において上述したように、このコーティングは、特に、ターゲット分子とハイブリッド化を起こし得るような認識分子とすることができる。
【０１４３】
様々な認識領域（１１０）は、与えられたターゲット分子に対して特定の様々な認識分子によってコーティングされる。
【０１４４】
各認識領域は、単一タイプの複数の同一分子を有している。単一領域内の分子は、好ましくは、他のすべての領域内の分子とは異なるものとされる。
【０１４５】
矩形形状とされた認識領域（１１０）が、行列配置とされていることがわかる。例えば円形といったような、基体表面上における他の分布パターンとすることもできる。
【０１４６】
バイオチップ（１０）は、さらに、認識領域に関連した光学的位置決めマークからなるネットワーク（１２０）を備えている。この例においては、このネットワーク（１２０）は、互いに隣接した認識領域列どうしの間に延在する直線状ストリップの形態とされたガイドトラック（１２２）を有している。
【０１４７】
ガイドトラックは、読取デバイスに対して励起光の一部を戻し得るような、反射性または部分的に反射性のあるいは蛍光性のあるいは拡散性の、トラックである。しかしながら、トラックは、さらに、位相をシフトさせることもできる。つまり、戻り光の伝搬時に光学経路差を形成することができる。読取デバイスへと戻される励起光は、第２光学システムによってまた可能であれば第３光学システムによって分析され、認識領域列を位置決めしてマークすることができ、バイオチップを走査することができる。反射性トラックは、さらに、干渉パターンを形成し得るようなすなわち励起光の位相をシフトさせ得るような、位相シフトエッチングによる所定生地表面を有することができる。読取デバイスの光学的位置決めシステムに導入されたこのような干渉パターンすなわち位相シフトパターンを使用することにより、マーキングやサーボ制御走査を行うことができる。
【０１４８】
位置決めマークは、さらに、エンコーダと称される光学的ストリップ（１２４）を備えることができる。
【０１４９】
エンコーダ（１２４）は、好ましくは、各認識領域の最初と最後のところに、各認識領域のサイズに対応したピッチでもって、ガイドトラック（１２２）上に配置される。
【０１５０】
ある特定の実施形態においては、これらエンコーダは、ごくわずかに光を反射するように構成することができる。
【０１５１】
例えば、エンコーダは、反射性材料の中断に対応したストリップの形態、すなわち、ガイドトラック（１２２）の所定生地領域の中断に対応したストリップの形態、とされる。
【０１５２】
他の可能な例においては、トラックは、わずかに反射性とすることができ、認識領域列に沿って延在することができる。例えば、トラックは、非反射性のストリップ（すなわち、エンコーダ）を備えることができる。
【０１５３】
表面がわずかに反射性というのは、反射光の比率が５０％未満であること、好ましくは、５％未満であること、を意味している。
【０１５４】
ある変形例においては、チップには、反射性ストリップからなるガイドトラックだけを設けることができる。
【０１５５】
各認識領域に、エンコーダを設けることにより、より一般的には、光学的マークを設けることにより、特に、高速かつ正確な認識領域の位置決めが可能とされる。
【０１５６】
しかしながら、１組をなす認識領域に対してただ１つのマークを設けることもできる。例えば、複数の認識領域からなる各列ごとに１つのマークを設けることができる。または、複数の認識領域からなる各行ごとに１つのマークを設けることができる。
【０１５７】
従来のマイクロエレクトロニクス技術を使用して、マークを形成することができる。例えば、固体プレートとしてアルミニウムやニッケルやクロムといったような金属反射層を成膜し、その後、位置決めマークの所望配置に対応したパターンに従って光リソグラフィーエッチングを行うことによって金属反射層を成形する、ことによりマークを形成することができる。
【０１５８】
例えば、金属層は、液相化学エッチングプロセスや気相プラズマエッチングプロセスを使用することにより、樹脂エッチングマスクによって決められたエッチングパターンに従ってエッチングすることができる。
【０１５９】
エッチング後に樹脂を除去した後に、生物学的分子の懸架に対しての表面適合性を改良するために、支持体上に薄いシリカ層を形成することができる。
【０１６０】
認識領域どうしが必ずしも互いに隣接している必要がないこと、また、光学的マークが必ずしも認識領域の周縁部付近に配置される必要がないこと、に注意されたい。
【０１６１】
ある可能な構成においては、図示していないものの、光学的反射性マークは、認識領域の内部に形成することができる。
【０１６２】
このタイプの構成は、認識領域からの光が蛍光であるときには、認識領域からの蛍光と反射光とが波長に違いに基づいて識別できる限りにおいては、問題とはならない。
【０１６３】
蛍光性ではなく（例えば）拡散性または回折性の分子が検出された場合には、信号の周波数の符号化によって、あるいは、サーボ制御の位置決めのために使用される角度に対しての角度差の検出によって、識別を行うことができる。
【０１６４】
光学的マークが形成された後に、認識領域を、認識分子でもってコーティングすることができる。これら認識分子は、公知技術である光リソグラフィー合成技術を使用することによって、合成されて認識領域に対して取り付けられる。
【０１６５】
バイオチップの表面が完全に平面ではないことに注意されたい。光学的マークをなす反射性ストリップが配置されているところは、他の部分よりも、５０〜２００ｎｍほど厚くなっている。
【０１６６】
この程度の厚さの違いは、提案された光学分析システムの区画深さよりも、小さいものである。
【０１６７】
光学的マークの形成および認識分子の合成は、シリコンウェハ上のまたはガラスウェハ上の多数のバイオチップに対して、大量生産的に行うことができる。その後、ウェハがカットされ、個々のバイオチップが同時に形成される。
【０１６８】
図４は、また、ガイドトラック（１２２）と、ガイドトラック（１２２）に沿って形成された反射性金属（例えばＣｒ）からなるエンコーダ（１２４ａ）の形態とされた光学的位置決めマークと、を備えたバイオチップ（１０）を示している。
【０１６９】
多数の矩形形状の認識領域すなわちセル（１１０）が、バイオチップの表面上において、破線によって示されている。各認識領域に対して、４つのガイドトラックが通過している。
【０１７０】
図４においては、一点鎖線でもって、励起光スポットの一連の位置が、概略的に示されている。これら位置は、記号（Ａ〜Ｇ）によって示されている。
【０１７１】
チップ変位手段（アクチュエータ）は、光スポットの移動を、高速軸と称される第１軸（ｘ）と低速軸と称される第２軸（ｙ）とに沿った移動とする。
【０１７２】
バイオチップの読取のための手順例が、表I に示されている。この表は、図４に示されたスポット位置表示記号を見ながら、参照されたい。
【０１７３】
表I は、移動状況を示しており、また、各位置における焦点合わせや位置決めや読取機能を規定している。
【表１】
『トラック１』および『トラック２』という表示は、図の下側からｙ方向に数えたときの、トラックの順序を示している。また、『セルＮｏ．１』および『セルＮｏ．２』という表示は、図の左側からｘ方向に数えたときの、認識領域の順序を示している。
【０１７５】
読者の情報のために、符号（１５２，１５４）は、スポットがｘ方向およびｙ方向のそれぞれに沿ってエンコーダ（１２４ａ）上を走査される際に、センサによって生成される信号を示している。
【０１７６】
図５は、バイオチップの一部についての概略的な断面図である。符号（２０１，２０２）は、それぞれ便宜的に前面および背面と称される基板（２００）の各面を示している。
【０１７７】
基板（２００）は、例えばガラスといったような、入射読取光に対して透明な材質から形成されている。基板の前面（２０１）は、第１層（２２０）によってカバーされている。
【０１７８】
第１層（２２０）は、互いに交互に隣接配置された、第１材料からなる領域（２２１）および第２材料からなる領域（２２２）を備えている。例えば窒化シリコンとされる第１材料は、入射光に対して第１反射率を有しており、例えば酸化シリコンとされる第２材料は、同じ入射光に対して、第１反射率とは異なる第２反射率を有している。第１反射率と第２反射率との相違は、１〜５％の程度であり、例えば２％である。
【０１７９】
第１層内の領域（２２１，２２２）は、ガイドトラックを形成し得るようにまた位置決めマークを形成し得るように、配置されている。
【０１８０】
第２層（２１０）は、反応剤を備えた機能層であって、反応領域を形成している。この層に関してのさらなる情報は、上記の説明に与えられている。
【０１８１】
この実施形態においては、図６〜図９における他の実施形態の場合と同様に、領域（２２１，２２２）が、ほぼ透明である、つまり、入射光を透過させることができる。これら入射光は、認識領域を読み取るために使用される。領域（２２１，２２２）は、認識領域と重ね合わされており、位置決めマークは、実際には透明である。
【０１８２】
層（２１０）は、第１層上に直接的に形成することができる。あるいは、層（２１０）は、好ましくは、認識分子を固定することを意図した接着層（２１１）上に形成することができる。
【０１８３】
認識分子は、例えばＤＮＡプローブや抗体や抗原といったような化学的または生物学的化合物の中から選択される。
【０１８４】
透明支持体（２００）を使用するということは、読取光を背面（２０２）側から適用できて、これにより、分析対象をなす媒体に対して前面を接触状態とすることを容易とし得ることを、意味している。領域（２２１，２２２）による反射光が、矢印によって例示のために図示されている。
【０１８５】
図６は、図５の変形例としての他の可能な実施形態を示している。
【０１８６】
窒化シリコン層が、支持体（２００）上に成膜され、第１不連続領域（２２１）を形成するようにエッチングされている。酸化シリコン層（２２４）が、第１領域（２２１）をコーティングしてカバーするようにして、成膜されている。このようにして、酸化シリコン層が第２領域（２２２）を構成し、第１領域（２２１）と交互配置される。この場合、これら領域は、互いに異なる反射率を有している。
【０１８７】
機能層（２１０）が、酸化シリコン層（２２４）をカバーしている。
【０１８８】
バイオチップ上における位置決めマークの他の可能な実施形態が、図７に示されている。
【０１８９】
図７においては、ガラス支持体（２００）が、前面（２０１）から深さ方向に局所的にドーピングされており、これにより、不連続なドーピング領域（２２３）が形成されている。
【０１９０】
これらドーピング領域（２２３）は、支持体の非ドーピング領域と交互配置されている。あるいは、異なる濃度でもってドーピングされた領域どうしを交互配置することもできる。
【０１９１】
領域（２２３）と基板残部との間のドーピング程度の差により、屈折率の差がもたらされ、これにより、ドーピング領域に到達する入射光と非ドーピング領域に到達する入射光との間に光学経路差が生じる。
【０１９２】
経路差は、ドーピング領域と非ドーピング領域との屈折率差に比例するものであり、これにより、入射光に位相シフトがもたらされる。この位相シフトは、ドーピング領域と非ドーピング領域との間に位相コントラストを生成する。読取デバイスは、この位相シフトを読み取ることができ、読み取った位相シフトを使用することにより、チップと認識領域のマーキングとの間の相対的位置決めを行うことができる。
【０１９３】
したがって、ドーピング領域（２２３）は、本発明における意味合いにおいて、位置決めマークを形成する。
【０１９４】
図に示す例においては、入射光は、機能層（２１０）によってカバーされている基板上面において反射される。
【０１９５】
反射を改良するために、あるいは、機能層および機能層と接触している媒体とは無関係に反射することを少なくとも保証するために、（例えば、アルミナから形成された）反射性中間層（２２６）を、支持体と機能層との間に設けることができる。この反射性中間層の屈折率および厚さは、光学的薄層（２００，２２３，２２６，２１０）からなる積層が二色性ミラーを形成するように、選択される。反射性中間層の反射率は、公知の光学的薄層成膜技術によって制御される。例えば、層（２２６）の屈折率は、マークおよび支持体の屈折率よりも大きなものであるように、選択される。
【０１９６】
中間層は、また、分子認識領域内の反応剤のための接着層としても機能することができる。あるいは、中間層は、分子認識領域内の反応剤のための接着層に関連することができる。
【０１９７】
バイオチップ上における位置決めマークの他の可能な形成方法が、図８に示されている。
【０１９８】
この図に示す例においては、位置決めマークは、上面（２０１）から深さ方向に支持体（２００）をエッチングして不連続凹所（２２５）を形成することにより、得られている。凹所の深さ（ｅ）は、λを入射光の波長とし、ｎを支持体（２００）の屈折率としたときに、ｅ＝λ／（４ｎ）であるように固定されることが好ましい。
【０１９９】
凹所に対応した領域と非エッチング領域に対応した領域とのそれぞれにおいて上面によって反射される各光線は、互いに異なる厚さの材料を透過する。このため、互いに異なる経路長さを有している。
【０２００】
経路長さの差は、エッチングの深さに比例し、各光線間の位相シフトをもたらす。
【０２０１】
図７の例と同様にして、位相シフトは、読取デバイスによって検出可能な位相コントラストをもたらす。
【０２０２】
認識領域を形成する機能層（２１０）が、上面（２０１）をカバーしている。
【０２０３】
上記と同様にして、中間層および／または接着層を、支持体と機能層との間に設けることができる。
【０２０４】
図９は、バイオチップ位置決めマークの最後の例をなす実施形態を示している。
【０２０５】
この例においては、位置決めマークは、反射率の違いや光学経路長の違いによってではなく、偏光の変換制御によって検出される。
【０２０６】
回転タイプのまたは４分の１波長タイプの複屈折性材料からなる層が、支持体の上面（２０１）上に形成され、エッチングされることによって、不連続領域（２２７）の形態で位置決めマークを形成している。
【０２０７】
第１方向に偏光した入射光線が複屈折材料領域（２２７）に到達して、この領域を透過したときにはまたはこの領域によって反射されたときには、偏光方向が回転によって変換される。これに対して、ガラス支持体（２００）に到達した偏光光線の偏光は、反射後においても不変である。
【０２０８】
よって、読取デバイスの光学的位置決めシステム内に、初期偏光方向または変換後の偏光方向を選択肢得る部材を挿入することにより、位置決めマークを検出することができる。例えば、この部材は、検光子とすることができる。
【０２０９】
有利には、検光子が中性化されたときまたは除去されたときには、位置決めマークが、『見えないもの』となる。
【０２１０】
上記の例と同様に、基板には、機能層（２１０）がコーティングされる。上記と同様に、中間層を設けることもできる。
【０２１１】
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（９）国際特許出願明細書第９８ ０１５３３号
（１０）米国特許明細書第５ ７２１ ４３５号
（１１）国際特許出願明細書第９８／２８６２３号
（１２）国際特許出願明細書第９８／３８４９０号
（１３）欧州特許出願明細書第０ ６４０ ８２６号
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明による読取デバイスを簡略化して示す図である。
【図２】 図１の細部を示す図である。
【図３】 図１のデバイスによって読取可能な、本発明によるバイオチップを簡略化して示す平面図である。
【図４】 本発明によるバイオチップを簡略化して示す平面図であって、このようなバイオチップの読取シークエンスの一例を示している。
【図５】 本発明におけるバイオチップの一部を簡略化して示す断面図であって、他の可能な実施形態を示している。
【図６】 本発明におけるバイオチップの一部を簡略化して示す断面図であって、他の可能な実施形態を示している。
【図７】 本発明におけるバイオチップの一部を簡略化して示す断面図であって、他の可能な実施形態を示している。
【図８】 本発明におけるバイオチップの一部を簡略化して示す断面図であって、他の可能な実施形態を示している。
【図９】 本発明におけるバイオチップの一部を簡略化して示す断面図であって、他の可能な実施形態を示している。
【符号の説明】
１０ バイオチップ
１４ アクチュエータ（相対変位手段）
２０ 光学ヘッド
２２ 焦点合わせ用レンズ
２４ アクチュエータ（相対変位手段）
３２ 二色性ミラー（二色性スライド）
４０ 光学分析システム、第１光学システム
４２ 第１電気光学的センサ
４７ 光ファイバ
６０ 位置決めシステム、第２光学システム
６２ 第２電気光学的センサ
７０ サーボ制御ユニット（サーボ制御手段）
８０ 焦点合わせシステム、第３光学システム
８２ 第３電気光学的センサ
１１０ 認識領域
１２２ ガイドトラック（光学的位置決めマーク）
１２４ エンコーダ（光学的位置決めマーク）
１２４ａ エンコーダ（光学的位置決めマーク）
２１１ 接着層
２２１ 領域（光学的位置決めマーク）
２２２ 領域（光学的位置決めマーク）
２２３ ドーピング領域（光学的位置決めマーク）
２２５ 凹所（光学的位置決めマーク）
２２６ 中間層
２２７ 複屈折材料領域（光学的位置決めマーク）
Claims (29)
- 複数の認識領域（１１０）と複数の光学的位置決めマーク（１２２，１２４，１２４ａ，２２１，２２２，２２３，２２５，２２７）とを具備しているバイオチップを、リアルタイムで読み取るためのデバイスであって、
前記認識領域が、ＤＮＡまたはＲＮＡのフラグメントを備えているとともに、前記認識領域が、前記位置決めマークの全部またはいくつかをカバーし得るよう、全体的にまたは部分的に、前記位置決めマークに重ね合わされており、
前記デバイスが、
−前記バイオチップ上に入射光を投影し得る光学ヘッド（２０）と、
−前記バイオチップ上にわたっての走査を可能とし得るよう、前記光学ヘッドと前記バイオチップとの間の相対変位を引き起こすための相対変位手段（１４、および、２４）と、
−前記光学ヘッドと協働することによって、前記認識領域からの光を、少なくとも１つの第１電気光学的センサ（４２）上に投影する、光学的分析システムと称される第１光学システム（４０）と、
−前記光学ヘッドと協働することによって、少なくとも１つの位置決めマークからの光を、少なくとも１つの第２電気光学的センサ（６２）上に投影する、位置決めシステムと称される第２光学システム（６０）と、
−該光学的位置決めシステム内の前記電気光学的センサ（６２）からの電気出力信号の関数として前記相対変位手段を制御し得るよう、前記光学ヘッドの前記相対変位手段をサーボ制御するためのサーボ制御手段（７０）と、
を具備し、
−前記相対変位手段が、巨視的変位手段（１４）と微視的変位手段（２４）とを備え、
−前記サーボ制御手段（７０）が、前記微視的変位手段（２４）に対して接続されており、
前記デバイスが、さらに、前記光学ヘッドと協働することによって、入射光の前記バイオチップ上における反射によって生成された光を、第３電気光学的センサ（８２）上に投影する、焦点合わせシステムと称される第３光学システム（８０）を具備し、
この第３光学システムにおけるアクチュエータが、前記第２光学システムにおける前記微視的変位手段（２４）とされ、
この第３光学システムにおける制御手段が、前記第２光学システムにおける前記サーボ制御手段（７０）とされていることを特徴とするデバイス。 - 請求項１記載のデバイスにおいて、
前記光学的分析システム（４０）が、共焦光学システムであることを特徴とするデバイス。 - 請求項１または２記載のデバイスにおいて、
前記認識領域上に存在するターゲット分子によって放出された光を受領するための前記第１電気光学的センサが、光熱効果の代理としての質量や厚さや屈折率や光の変化による蛍光や反射光やハイブリッド化検出光を検出するものとされていることを特徴とするデバイス。 - 請求項１〜３のいずれかに記載のデバイスにおいて、
前記第１電気光学的センサ（４２）が、光ファイバ（４７）を介して前記第１光学システムに対して光学的に接続されていることを特徴とするデバイス。 - 請求項１〜４のいずれかに記載のデバイスにおいて、
前記第１および第２光学システムが、二色性スライド（３２）を介して前記光学ヘッドに対して接続されていることを特徴とするデバイス。 - 請求項１〜５のいずれかに記載のデバイスにおいて、
前記光学ヘッド（２０）が、入射光の前記バイオチップ上における反射によって生成された光を、前記第３電気光学的センサ上に投影するためのものであることを特徴とするデバイス。 - 請求項１〜４のいずれかに記載のデバイスにおいて、
前記第１および前記第２光学システムと、前記第１および前記第２光学システムに共通した少なくとも１つの電気光学的センサと、を備えてなる単一の光学システムを具備し、
前記共通の光学センサが、前記分子認識領域からの光を収集するとともに、少なくとも１つの位置決めマークからの光を収集し、かつ、前記光学ヘッドの走査のための前記サーボ制御手段に対して接続されていることを特徴とするデバイス。 - 複数の認識領域（１１０）と、複数の光学的位置決めマーク（１２２，１２４，１２４ａ，２２１，２２２，２２３，２２５，２２７）と、を具備しているバイオチップであって、
前記認識領域が、前記位置決めマークの全部またはいくつかをカバーし得るよう、全体的にまたは部分的に、前記位置決めマークに重ね合わされていることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８記載のバイオチップにおいて、
前記位置決めマークが、少なくとも１つの読取用入射光に応答して前記認識領域から放出される少なくとも１つの蛍光に対して、透明であることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８または９記載のバイオチップにおいて、
前記分子認識領域が、前記位置決めマークに対して所定位置に配置されていることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８〜１０のいずれかに記載のバイオチップにおいて、
光学的マーク（１２４，１２４ａ）が、各分子認識領域に関連して設けられていることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８〜１１のいずれかに記載のバイオチップにおいて、
前記分子認識領域（１１０）が、行列配置され、
少なくとも１つの光学的マーク（１２４）が、前記分子認識領域の各列および／または各行に関連して設けられていることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８〜１２のいずれかに記載のバイオチップにおいて、
前記光学的マークが、反射光の比率が５０％未満である好ましくは５％未満であるといったような反射性を有したストリップとされることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８〜１３のいずれかに記載のバイオチップにおいて、
前記光学的マークが、入射光に位相シフトを与え得るような生地表面を有したストリップとされることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８〜１４のいずれかに記載のバイオチップにおいて、
前記光学的マークが、前記認識領域がなす列に沿って延在した分散性材料または蛍光性材料から形成された位置決めトラックを備え、
該位置決めトラック上に、反射性ストリップが配置されていることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８〜１４のいずれかに記載のバイオチップにおいて、
前記光学的マークが、前記認識領域（１１０）がなす列に沿って延在した、反射率が５０％未満であるような好ましくは５％未満であるようなわずかに反射性のトラックを備え、
該トラックが、局所的非反射性領域（１２４）を備えていることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８〜１６のいずれかに記載のバイオチップにおいて、
前記位置決めマークがなす領域とその隣接領域とには、入射光に対しての異なる光学経路がもたらされることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８〜１７のいずれかに記載のバイオチップにおいて、
前記位置決めマーク（２２１）とその隣接領域（２２２）とは、いずれもが反射率が５０％未満であるような好ましくは５％未満であるような低反射率の材料から形成されているものの、反射率が互いに異なる材料から形成されていることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項１８記載のバイオチップにおいて、
前記位置決めマークとその隣接領域とは、物理的厚さが互いに異なるものとして形成されていることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項１８記載のバイオチップにおいて、
前記位置決めマークとその隣接領域とは、互いに異なるドーピング特性を有したものとして形成されていることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８〜２０のいずれかに記載のバイオチップにおいて、
前記位置決めマークと、前記認識領域上のコーティング層と、の間に、中間層（２２６）が設けられ、
該中間層の屈折率および反射率が、二色性ミラーを形成し得るように、選択されていることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８〜２１のいずれかに記載のバイオチップにおいて、
認識分子が配置される面とは反対側に位置していて背面と称される面を通して前記バイオチップに到達する光ビームに対しての、前記位置決めマークの反射率、および／または、前記認識領域と前記位置決めマークとの間の境界部の反射率が、１〜１０％のものとされていることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８〜２１のいずれかに記載のバイオチップにおいて、
前記バイオチップのうちの、コーティング材料によってコーティングされている方の面（前面）に到達する光ビームに対しての、前記位置決めマークの反射率、および／または、前記認識領域上のコーティング材料と前記位置決めマークとの間の境界部の反射率が、１〜１００％のものとされていることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８〜２３のいずれかに記載のバイオチップにおいて、
前記位置決めマークが、偏光されている読取用入射光の偏光方向を変換し得る複屈折性材料からなる領域（２２７）を備えていることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８〜２４のいずれかに記載のバイオチップにおいて、
前記分子認識領域が、透明な接着層（２１１）を有していることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８〜２５のいずれかに記載のバイオチップにおいて、
前記認識領域が、ＤＮＡプローブや抗体や抗原といったような化学的または生物学的反応剤の中から選択された反応剤によってコーティングされていることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項８〜２６のいずれかに記載されたバイオチップを読み取るための方法であって、
請求項１〜７のいずれかに従って構成されたデバイスを使用することを特徴とする方法。 - 複数の認識領域と該認識領域に関連して設置された複数の光学的位置決めマークとを具備しているバイオチップを、請求項１〜７のいずれかに記載されたデバイスを使用して、読み取るための方法であって、
測定領域にわたって順次的に走査を行うことによって、前記光学的分析システム内のセンサから出力される読取信号を、連続的に獲得し、
走査される認識領域に関連している互いに近接する２つの位置決めマークの間を前記光学ヘッドが通過する通過時間の関数として、前記獲得信号を規格化することを特徴とする方法。 - 複数の認識領域と該認識領域に関連して設置された複数の光学的位置決めマークとを具備しているバイオチップを、請求項１〜７のいずれかに記載されたデバイスを使用して、読み取るための方法であって、
測定領域にわたって順次的に走査を行うことによって、前記光学的分析システム内のセンサから出力される読取信号を、連続的に獲得し、
走査される認識領域に関連している互いに近接する２つの位置決めマークの間を前記光学ヘッドが通過する間に測定された通過時間に対して、前記光学ヘッドと前記バイオチップとの間の相対変位速度をサーボ制御することを特徴とする方法。
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