EP1129336A1 - Vorrichtung und verfahren zur schnellen auswertung von bindungsreaktionen in strukturierten interferometrischen mikrotiterplatten - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur schnellen auswertung von bindungsreaktionen in strukturierten interferometrischen mikrotiterplatten

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Publication number
EP1129336A1
EP1129336A1 EP98966390A EP98966390A EP1129336A1 EP 1129336 A1 EP1129336 A1 EP 1129336A1 EP 98966390 A EP98966390 A EP 98966390A EP 98966390 A EP98966390 A EP 98966390A EP 1129336 A1 EP1129336 A1 EP 1129336A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
layer
substrate
thickness
change
interference
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98966390A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gunnar Brink
Joachim RÄDLER
Erich Sackmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jandratek GmbH
Original Assignee
Jandratek GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jandratek GmbH filed Critical Jandratek GmbH
Publication of EP1129336A1 publication Critical patent/EP1129336A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a device and a method for rapidly evaluating binding reactions in structured interferometric microtiter plates, in particular a device and a method for determining the change in the optical thickness of a layer by means of light interference.
  • microtiter plates are plastic trays made of transparent plastics (polystyrene, polypropylene etc.) with a number (typically 96) of small reaction pots. Proteins, such as antibodies, can be bound in the hydrophobic containers by physisorption. The addition of the solutions to be tested and the subsequent washing cycles are often carried out by automated pipetting machines.
  • the reading of the plates can also be automated.
  • the color reaction is measured based on the optical absorption of the solution, in radiological tests the amount of radioactive substances.
  • radiological tests the amount of radioactive substances.
  • firstly fluorescence or radioactive labels are necessary and secondly, in particular ELISA tests are not always quantitative, ie only detect the presence but not the exact amount of a substance.
  • Biosensors In contrast to this are biosensors, which deliver exact values, for example the optical layer thickness of an adsorbate or the mass coverage of a surface.
  • Biosensors are reversible and continuously working sensors for the detection of proteins, nucleic acids or poly sugars. Such highly sensitive transducers play a major role if, in addition to the presence of a ligand, its concentration is also to be determined.
  • Quantitative sensors can be used in particular to determine the binding constant of a ligand. In addition to the development of suitable substrates and chemical coupling processes, the automation of the quantitative determination of the receptor-ligand binding must still be optimized.
  • optical layer thicknesses include surface plasmon resonance (Liedberg, et al. 1983; Surface Plasmon Resonance for Gas Detection and Biosensing, Sensors and Actuators, 4: 299-304), which reflecto Electric interference spectroscopy (Brecht et al. 1993; Interferometric immunoasay in a FIA system: a sensitive and rapid approach in label-free immunosensing. Biosensors & Bioelectronics. 8: 387-392), as well as quartz scales.
  • the first two techniques measure optical layer thicknesses with a resolution in the Angstrom range, while the Quartz scale measures mass loadings with a detection limit in the ⁇ g range.
  • an interference layer of constant thickness D in this case 48 nm
  • D in this case 48 nm
  • a planar interference layer only provides a signal which is subject to numerous interferences.
  • the object of the invention is to provide a device, a method and a method for producing the device which allow (s) to determine the change in the optical thickness of a layer, preferably an adsorbate layer in microtiter plates. This object is achieved with the features of the claims.
  • the invention is based on the basic idea that due to variations in the spacing between the top and bottom of a layer, for example an adsorbate layer, there are varying interference patterns when irradiated with light if the optical thickness of the layer changes.
  • a biofunctionalized microtiter plate microstructured interference layers introduced or applied.
  • the optical reflection interference of the plate is imaged and evaluated with the help of image processing.
  • the mean square difference of the nominal intensities of the interference patterns before and after adsorption is used to determine the change in the optical layer thickness of the adsorbate.
  • the device / method according to the invention is based on optical interference, the thickness of the interference-capable coating varying. This is resolved by optical imaging and evaluated by a simple image processing method.
  • the ligands to be detected do not have to be pretreated or labeled.
  • the determination of the change in the optical layer thickness of the adsorbate from the mean square difference of the nominated intensities has a high sensitivity with a layer thickness resolution of one angstrom (1 ⁇ ).
  • the method is robust against external fluctuations in the lighting intensity, as well as against irregularities in the exact microstructuring of the plate.
  • microtitre test is based on an imaging process, obvious malfunctions such as the Precipitation of reagents or the accumulation of a speck of dust can easily be noticed. 6.
  • the imaging process can be easily combined with fluorescence techniques.
  • the method should therefore be used as an interferometric immunoassay, the advantages being particularly evident in automated systems with a high throughput of microtiter plates. It is therefore also explained below how structured microtiter plates can be produced inexpensively on a plastic basis.
  • La shows a representation of an integrated interference layer with a laterally varying layer thickness D, the adsorbate layer ⁇ carrying receptors and an optical layer thickness change ⁇ being measured;
  • FIG. 1c shows the mean square difference of the normalized intensities S as a function of the optical layer thickness change ⁇ ;
  • 2a shows a representation of a microtiter plate with 12 reaction droplets
  • 2b shows an interfering recess integrated in each potty (and filled with the plastic 2); 2c shows a representation of an interference pattern. Of a depression, as can be seen in the imaging reflection interference microscopy;
  • FIG. 3 shows a structure for the optical imaging of the reflectivity of the microtiter plate by means of reflection-interference-contrast microscopy
  • FIG. 4 shows a structure for the optical imaging of the reflectivity of the microtiter plate by means of laser scanning.
  • the basis of the method according to the invention is to apply a biofunctionalized layer directly to an interference-capable substrate.
  • This first layer is provided with a biocompatible adsorbate layer 3 with calculation index n3, preferably a polymer layer, which contains antibodies or receptors.
  • Layer thickness ⁇ of this biocompatible layer 3 increases when ligands 4 are bound from an aqueous solution 17 with a calculation index /.
  • the substrate is illuminated from below, ie from the side facing away from the biofunctionalized layer 3, with preferably monochromatic light, and the resulting interference pattern is imaged on a camera.
  • the intensity of the reflected light is determined by the superposition of all reflected partial beams (see: Azza, R. et al. 1975; Ellipsometry and polarized light, Amsterdam, North Holland).
  • For the exact determination of a change in layer thickness ⁇ use is now made of the fact that the thickness D of the interference layer 2 varies laterally, so that a large number of interference maxima and minima are produced.
  • Fig. La shows a first embodiment. This shows, for example, a triangular depression and thus a linear change in the thickness D corresponding to the oblique course of the triangular surfaces from the location.
  • the interference images are now processed in such a way that the change in layer thickness ⁇ is determined only from the mean square phase shift. This corresponds to the shift in the reflectivity curves shown in FIG. 1b. This processing makes the determination of the change in thickness of the adsorbate layer 3 independent both of fluctuations in the incident light and of the precise shape and quality of the microstructured interference layer.
  • a number of maxima and the same number of minima are preferably used for the evaluation.
  • only the first layer 2 is applied to the carrier 1, so that an attachment to the layer 2 takes place.
  • the first layer 2 or second layer 3 does not have the receptors to which ligands bind, but conversely the ligands to which the receptors bind.
  • the mutual binding effect of receptors and ligands is used here.
  • a flat or smooth carrier is used, on which the layer 2 is applied in such a way that the distance between the top and bottom varies. In this way it is achieved in this embodiment that the thickness D of the layer 2 varies.
  • Layer 2 is preferably applied in the form of drops or droplets (for example sprayed on or applied with a pipette). These are allowed to dry or polymerize.
  • a flat layer 2 is applied, to which a structure is then printed.
  • a swellable material is preferably used for the second layer 3, which in the dry state has a thickness of approximately 5 to 200 ⁇ , preferably approximately 10 to 20 ⁇ , while in the swollen state it has thicknesses between 10 and 100,000 ⁇ , preferably 10,000 ⁇ . In this swollen state, this layer preferably has a refractive index n3 of 1.31.
  • the change in the optical thickness of the layer to be determined can take place, for example, in the following ways.
  • the physical thickness and thus also the optical thickness of the layer change due to deposits on the other hand, a change in the optical thickness can be based on a change in the refractive index, which results from deposits in the layer.
  • An interference image is recorded before and after (or during) the addition of the ligand and the following operations are carried out over the surface of the interference pattern. (In the case of a multiple test, such as the microtiter plate shown below, these operations are of course carried out separately for each binding surface.)
  • the intensities are standardized:
  • the ⁇ > means the averaging over all NxM pixels. Then the difference between the normalized intensities I ⁇ , N of the images before and after the binding is formed and divided into squares:
  • averaging is carried out over all NxM pixels of an image section which is preferably the same size or smaller than the interference pattern at the bottom of a microtiter potty. Averaging is preferably carried out over a square area.
  • S is referred to as the "mean square difference of the normalized intensities" of two interference patterns (I v , I j j) before and after the adsorption. The following applies to the value S obtained in this way:
  • Equation (3) is used in many practical cases where NEN the adsorbate layer is small compared to ⁇ / 4 is sufficient to directly determine the optical layer thickness increase ⁇ from the measured value for S.
  • the respective accuracy of equation (3) can be determined by comparison with the numerical values for given refractive indices and layer thicknesses ⁇ .
  • S is proportional to the change in layer thickness ⁇ .
  • the exact relationship can be determined numerically and stored in a table. For the borderline case that the adsorbate layer is exactly zero before adsorption, the above relationship (3) can be derived by neglecting multiple reflection.
  • Fig. Lc shows the size S of a simulated sample, which was calculated according to equations (1) and (2) as a function of
  • Optically high-quality, laterally structured interference layers can be produced by standard vapor deposition of dielectric layers on glass.
  • the structuring would take the form of masks which are either shifted or exchanged between the individual vapor deposition cycles.
  • plastic plate or the carrier substance is structured.
  • An optically low or non-birefringent polymer (polycarbonate, cyclic olefir-e) can, for example, be injection molded onto a microtiter plate mold (FIG. 2a).
  • This consists of an arrangement of small plastic pots with a flat bottom.
  • a depression 5 of a few micrometers depth is pressed in each potty with the aid of a stamp (FIG. 2b).
  • the recess is between 5 and 2000 nanometers deep.
  • a second polymer (layer 2) with a different refractive index is applied from the solution to the depression 5 in the casting process, but can - as shown in Fig. La - extend beyond the recess 5. Since the diameter of the stamp is constant, the layer thickness D can be produced very reproducibly by applying a defined amount of solvent.
  • the second plastic 2 should be soluble in a solvent that does not attack the plastic 1. By drying the layer 2, a meniscus can form on the surface.
  • the reflectivity of the microtiter plate can be imaged with the aid of reflection microscopy under reflected light (see FIG. 3). If monochromatic light is generated with the aid of a narrow-band interference filter, the interference becomes visible in the laterally structured depressions 5 described above. In practice, further the ratio of interference signal to background brightness verbes ⁇ lets fibers by the anti-Flex technology for Pluta (Pluta, M; Advanced Light Microscopy, Elsevier, Amsterdam 1989) uses be ⁇ . 3 shows the beam path of such a reflection-interference-contrast microscope according to Pluta. If the sample chamber is placed directly on the immersion oil ⁇ / 4 plate 7 applied, so the first reflective interface is the glass-magnesium fluoride 2 interface (Fig. La).
  • the carrier 1 with the introduced interference layer 2 is arranged over a ⁇ / 4 plate 7 (optional). In between is a medium 6 with the same refractive index as the support
  • This medium is preferably an immersion oil or silicone.
  • the light emitted by a mercury vapor lamp 14 is directed onto the layer to be measured via a bandpass filter 13, which generates monochromatic light, a polarizer 12 (optional), a semi-transparent mirror 9 and an objective 8.
  • the reflected light penetrates the semitransparent mirror 9 and reaches an camera 11 via an analyzer 10 (optional). This can be a CCD camera.
  • a second possible readout method consists of scanning the microtiter plate with a laser or a laser diode. The reflected light is recorded with a one-dimensional detector. If the plate is scanned, an interference signal again arises, as shown in FIG. 1b, and the evaluation is carried out analogously to the imaging reflection interference.
  • Fig. 4 shows an embodiment with laser scanning. Scanning the microtiter plate with a laser 19 is advantageous in applications in which the speed of the reading process is critical.
  • imaging optics are dispensed with and the microtiter plate is scanned by a laser beam, the intensity of the reflected beam being measured.
  • the laser beam is deflected by a rotatable mirror 20 so that it sweeps over the sample and is reflected on a one-dimensional detector 21 (preferably CCD).
  • the depressions of the microtiter plate in this embodiment of the scanning are preferably roof-shaped or wedge-shaped depressions, that is to say only varied in a direction corresponding to the scanning direction.
  • the averages according to formulas (1) and (2) correspond to the averaging along a line.
  • Reference numeral 18 denotes a glass block with an anti-reflective coating.

Abstract

Es wird ein interferometrisches Verfahren beschrieben, welches erlaubt, die Änderung der optischen Dicke einer Adsorbatschicht in Mikrotiterplatten zu bestimmen. Das Verfahren beruht auf der Integration von lateral strukturierten Interferenzschichten in den Boden einer biofunktionalisierten Mikrotiterplatte. Die optische Reflexions-Interferenz der Platte wird abgebildet und mit Hilfe von Bildverarbeitung ausgewertet. Dabei wird die mittlere quadratische Differenz der normierten Intensitäten zur Bestimmung der Änderung der optischen Dicke des Adsorbats genutzt. Das Verfahren ist hochempfindlich, quantitativ, kostengünstig und robust gegen äussere Störungen. Einer der wesentlichen Vorteile ist, dass die Liganden nicht markiert werden müssen.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur schnellen Auswertung von Bindungsreaktionen in strukturierten interferometrisehen
Mikrσtiterplatten
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur schnellen Auswertung von Bindungsreaktionen in strukturierten interferometrischen Mikrotiter- platten, insbesondere eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Bestimmen der Änderung der optischen Dicke einer Schicht mittels Lichtinterferenz.
Eine Reihe von immunologischen Tests setzt voraus, daß entweder das Antigen oder der Antikörper an eine Festkörperoberfläche gekoppelt werden. Dazu werden Festkörperträger wie Latexkugeln, Plastikröhrchen etc. verwendet. Der bei weitem erfolgreichste und am weitesten verbreitete Träger ist allerdings die Mikrotiterplatte. Techniken wie der ELISA- (enzyme-linked i munosorbent assay) Test oder radiologische Immun-Tests werden standardmäßig in wegwerfbaren Mikrotiterplatten durchgeführt. Mikrotiterplatten sind Plastiktabletts aus transparenten Kunststoffen (Polystyrol, Polypropylene etc.) mit einer Anzahl (typischerweise 96) kleiner Reak- tionstöpfchen. Proteine, wie beispielsweise Antikörper, können in den hydrophoben Behältern durch Physisorption gebundenen werden. Die Zugabe der zu testenden Lösungen und die folgenden Waschzyklen werden häufig durch automatisierte Pippettierautomaten ausgeführt. Auch das Auslesen der Platten kann automatisiert werden. Für ELISA-Tests wird dabei die Farbreaktion anhand der optischen Absorption der Lösung gemessen, bei radiologischen Tests die Menge radioaktiv markierter Substanzen. Allerdings sind für diese Art Tests erstens Fluoreszenzoder radioaktive Markierungen notwendig und zweitens insbesondere ELISA-Tests nicht immer quantitativ, d.h. weisen lediglich das Vorhandensein, nicht aber die exakte Menge einer Substanz nach.
Im Gegensatz dazu stehen Biosensoren, welche exakte Werte, beispielsweise der optischen Schichtdicke eines Ad- sorbates oder der Massenbelegung einer Oberfläche liefern. Biosensoren sind reversibel und kontinuierlich arbeitende Meßaufnehmer zum Nachweis von Proteinen, Nukleinsäuren oder Polyzuckern. Solche hochempfindlichen Meßwandler spielen dann eine große Rolle, wenn außer dem Vorhandensein eines Liganden auch noch dessen Konzentration bestimmt werden soll. Quantitative Meßaufnehmer können insbesondere dazu dienen, die Bindungskonstante eines Liganden zu bestimmen. Neben der Entwicklung geeigneter Substrate und chemischer Ankopplungsverfahren ist die Automatisierung der quantitativen Bestimmung der Rezeptor-Ligand Bindung nach wie vor zu optimieren.
Zu den bekanntesten quantitativen Oberflächentechniken, welche optische Schichtdicken bestimmen, gehören die Oberflächen-Plasmonen-Resonanz (Liedberg, et al . 1983; Surface Plasmon Resonance for Gas Detection and Biosen- sing, Sensors and Actuators , 4:299-304), die reflekto e- trische Interferenz-Spektroskopie (Brecht et al. 1993; Interferometric immunoasay in a FIA-system: a sensitive and rapid approach in lable-free immunosensing. Biosensors & Bi oelectronics . 8:387-392), sowie Quarzwaagen. Die ersten beiden Techniken messen optische Schichtdik- ken mit einer Auflösung im Ängström-Bereich, während die Quarzwaage Massenbelegungen mit einer Nachweisgrenze im μg-Bereich mißt.
In R dler, et al . 1993, Imaging optical thicknesses and Separation distances of phospholipid vesicles at solid surfaces, J. Physics II France 3:727-748, wird gezeigt, daß die Reflexions-Interferenz-Contrast-Mikroskopie (RICM) für einfache Schichtsysteme quantitativ auswertbare Interferenzintensitäten abbildet. Es werden insbesondere planare Systeme von aufgedampften Magnesiumfluorit mit adhärierenden Vesikeln, gespreiteten Membranen oder durch Langmuir-Blodgett Technik übertragenen Lipid- Monolagen abgebildet. Es wird gezeigt, daß die (beispielsweise in Fig. lb dargestellte) Intensitätsänderung bei Proteinadsoprtion an eine Interferenzschicht von konstanter Dicke D (in diesem Fall 48nm) meßbar bzw. mit RICM auf eine CCD Kamera abbildbar ist. Bei der Messung von Schichtdickenänderungen liefert eine planare Interferenzschicht jedoch lediglich ein Signal, welches zahlreichen Störungen unterworfen ist.
Demgegenüber liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung, ein Verfahren und ein Verfahren zum Herstellen der Vorrichtung bereitzustellen, welche (s) erlaubt, die Änderung der optischen Dicke einer Schicht, vorzugsweise einer Adsorbatschicht in Mikrotiterplatten zu bestimmen. Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen der Ansprüche gelöst.
Bei der Lösung geht die Erfindung von dem Grundgedanken aus, daß sich aufgrund von Variationen im Abstand von Oberseite und Unterseite einer Schicht, beispielsweise einer Adsorbatschicht, bei einer Bestrahlung mit Licht variierende Ir-terferenzmuster ergeben, wenn sich die optische Dicke der Schicht ändert. Dazu werden in oder auf einen Träger einer biofunktionalisierten Mikrotiterplat- te mikrostrukturierte Interferenzschichten ein- bzw. aufgebracht .
Die optische Reflexions-Interferenz der Platte wird abgebildet und mit Hilfe von Bildverarbeitung ausgewertet. Dabei wird die mittlere quadratische Differenz der no- mierten Intensitäten der Interferenzmuster vor und nach Adsorption zum Bestimmen der Änderung der optischen Schichtdicke des Adsorbats genutzt. Die erfindungsgemäße Vorrichtung/das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf optischer Interferenz, wobei die Dicke der interferenzfähigen Beschichtung variiert. Diese wird durch optische Abbildung aufgelöst und durch ein einfaches Bildverarbeitungsverfahren ausgewertet .
Die Vorteile der Erfindung sind vielfältig:
1. Die nachzuweisenden Liganden müssen nicht vorbehandelt oder markiert werden.
2. Die Auswertung einer Platte mit einer großen Anzahl Tests ist in einem Schritt möglich und mit Hilfe eines schnellen Rechners in Sekunden zu bewerkstelligen.
3. Die Bestimmung der Änderung der optischen Schichtdicke des Adsorbats aus der mittleren quadratischen Differenz der nomierten Intensitäten hat eine hohe Empfindlichkeit mit einer Schichtdickenauflösung von einem Ängström (1 Ä) .
4. Das Verfahren ist robust gegen äußere Schwankungen der Beleuchtungsintensität, als auch gegen Unregelmäßigkeiten in der genauen Mikrostrukturierung der Platte.
5. Da der beschriebene Mikrotitertest auf einem bildgebendem Verfahren beruht, können durch weitere intelligente Bildverarbeitung oder durch visuelle Kontrolle offensichtliche Störungen, wie das Aus- fällen von Reagenzien oder die Anlagerung eines Staubkorns, leicht bemerkt werden. 6. Das bildgebende Verfahren läßt sich leicht mit Fluoreszenztechniken kombinieren.
Das Verfahren sollte daher Anwendung als interferometri- scher Immunoassay finden, wobei die Vorteile insbesondere in automatisierten Anlagen mit hohem Durchsatz von Mikrotiterplatten zum Tragen kommen. Es wird daher im folgenden auch erläutert, wie strukturierte Mikrotiterplatten kostengünstig auf Kunststoffbasis hergestellt werden können.
Die Erfindung wird nachstehend mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. la eine Darstellung einer integrierten Interferenzschicht mit lateral variierender Schichtdicke D, wobei die Adsorbatschicht δ Rezeptoren trägt und eine optische Schichtdickenänderung Δδ gemessen wird;
Fig. lb eine Simulation der Reflektivität als Funktion der ortsabhängigen Schichtdicke D der Interferenzschicht; die Kurven entsprechen Adsorbatschichtdik- ken von δ = 10, 20 und 30 Ä;
Fig. lc eine Darstellung der mittleren quadratischen Differenz der normierten Intensitäten S als Funktion der optischen Schichtdickenänderung Δδ;
Fig. 2a eine Darstellung einer Mikrotiterplatte mit 12 Reaktionstöpfchen;
Fig. 2b eine in jedes Töpfchen integrierte (und mit dem Kunststoff 2 aufgefüllte) interferierende Vertiefung; Fig. 2c eine Darstellung eines Interferenzmusters .einer Vertiefung, wie es in der abbildenden Reflexions- Interferenz-Mikroskopie sichtbar wird;
Fig. 3 einen Aufbau zur optischen Abbildung der Reflek- tivität der Mikrotiterplatte mittels Reflexions- Interferenz-Kontrast-Mikroskopie; und
Fig. 4 einen Aufbau zur optischen Abbildung der Reflek- tivität der Mikrotiterplatte mittels Laser- Abtastung.
Die Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, eine biofunktionalisierte Schicht unmittelbar auf ein interferenzfähiges Substrat aufzutragen. Im einfachsten Fall wird auf einen Abschnitt eines Trägers 1 (z.B. Glas oder Kunststoff) mit Brechungsindex nl (beispielsweise nl=l,5) eine erste dünne (vorzugsweise heterogene) Schicht 2 mit einem zu nl unterschiedlichem Brechungsindex n2 aufgetragen (siehe Fig. la) , mit n2 vorzugsweise im Bereich von 1,3 bis 1,4. Diese erste Schicht ist mit einer biokompatiblen Adsorbatschicht 3 mit Berechnungsindex n3, vorzugsweise einer Polymerschicht versehen, welche Antikörper oder Rezeptoren enthält. Die optische
Schichtdicke δ dieser biokompatiblen Schicht 3 nimmt bei der Bindung von Liganden 4 aus einer wäßrigen Lösung 17 mit Berechnungsindex / zu. Zur Detektion der Schichtdickenzunahme wird das Substrat von unten, d.h. von der der biofunktionalisierten Schicht 3 abgewandten Seite, mit vorzugsweise monochromatischem Licht beleuchtet und das entstehende Interferenzmuster auf eine Kamera abgebildet. Die Intensität des reflektierten Lichts bestimmt sich aus der Überlagerung aller reflektierter Teilstrahlen (siehe: Azza , R. et al . 1975; Ellipsome- trie and polarized light, Amsterdam, North Holland) . Dabei geht sowohl die Dicke D der Interferenzschicht 2, als auch die Dicke δ des Adsorbatfilms 3 ein. Zur genauen Bestimmung einer Schichtdickenänderung Δδ wird nun ausgenutzt, daß die Dicke D der Interferenzschicht 2 lateral variiert, so daß eine Vielzahl von Interferenz- Maxima und -Minima entsteht.
Fig. la zeigt eine erste Ausführungsform. Darin ist beispielsweise eine dreiecksförmige Vertiefung und damit eine lineare Veränderung der Dicke D entsprechend dem schrägen Verlauf der Dreiecksflächen vom Ort dargestellt. Das Verhältnis der entsprechenden Interferenzintensitäten Irefl^O ist in Fig. lb gezeigt. Hier ist zu erkennen, daß sich die Lage der Maxima mit einer Zunahme der Dicke δ der Adsorbatschicht verschiebt. Die Interferenzbilder werden nun auf eine Weise verarbeitet, daß die Schichtdickenänderung Δδ lediglich aus der mittleren quadratischen Phasenverschiebung bestimmt wird. Dies entspricht der Verschiebung der in Fig. lb dargestellten Reflektivitätskurven. Durch diese Verarbeitung wird die Bestimmung der Dickenänderung der Adsorbatschicht 3 unabhängig sowohl von Schwankungen des einfallenden Lichts, als auch von der genauen Form und Güte der mikrostrukturierten Interferenzschicht. Zur Auswertung werden vorzugsweise eine Anzahl von Maxima und gleich vielen Minima verwendet.
Der Darstellung in Fig. lb liegen folgende Brechungsindizes zugrunde: Träger 1 = Glas, n^ = 1,51; erste Schicht 2 = Interferenzschicht, n2 = 1,38; zweite Schicht 3 = Adsorbat (Protein), n3 = 1,55; wässrige Lösung 17, n4 = 1,33.
In einer weiteren Ausführungsform wird auf dem Träger 1 nur die erste Schicht 2 aufgebracht, so daß eine Anlagerung an die Schicht 2 stattfindet. o
Als weitere Ausführungsform weist die erste Schicht 2 bzw. zweite Schicht 3 nicht die Rezeptoren auf, an die sich Liganden binden, sondern umgekehrt die Liganden, an die sich die Rezeptoren binden. Es wird hierbei die wechselseitige Bindungswirkung von Rezeptoren und Liganden genutzt.
In einer weiteren Ausführungsform wird anstelle eines Trägers mit Ausnehmungen ein ebener bzw. glatter Träger verwendet, auf den die Schicht 2 derart aufgebracht wird, daß der Abstand zwischen Ober- und Unterseite variiert. Auf diese Weise wird in dieser Ausführungsform erreicht, daß die Dicke D der Schicht 2 variiert. Vorzugsweise wird die Schicht 2 in Form von Tropfen oder Tröpfchen aufgebracht (beispielsweise aufgespritzt oder mit einer Pipette aufgetragen) . Diese läßt man eintrocknen oder polymerisieren. Alternativ wird eine ebene Schicht 2 aufgetragen, der anschließend eine Struktur aufgedruckt wird.
Für die zweite Schicht 3 wird vorzugsweise ein quellfähiges Material verwendet, das im trockenen Zustand eine Dicke von etwa 5 bis 200 Ä, vorzugsweise etwa 10 bis 20 Ä hat, während sie im gequollenen Zustand Dicken zwischen 10 und 100000 Ä, vorzugsweise 10000 Ä aufweist. In diesem gequollenen Zustand weist diese Schicht vorzugsweise einen Brechungsindex n3 von 1,31 auf.
Die zu bestimmende Änderung der optischen Dicke der Schicht kann beispielsweise auf folgende Arten erfolgen. Zum einen ändert sich aufgrund von Anlagerungen die physikalische Dicke und somit auch die optische Dicke der Schicht, zum anderen kann eine Änderung der optischen Dicke auf einer Änderung des Brechungsindexes beruhen, die sich aufgrund von Einlagerungen in die Schicht ergibt. Es wird jeweils ein Interferenzbild vor und nach (bzw. während) der Zugabe des Liganden aufgenommen und folgende Operationen über der Fläche des Interferenzmusters ausgeführt. (Im Falle eines Vielfachtest, wie der weiter unten gezeigten Mikrotiterplatte, werden diese Operationen natürlich für jede Bindungsfläche getrennt durchgeführt.) Zunächst werden die Intensitäten normiert :
Wobei die <> die Mittelung über alle NxM Bildpunkte bedeutet. Dann wird die Differenz der normierten Intensitäten Iγ, N der Bilder vor und nach der Bindung gebildet und quadratisch ge ittelt :
wobei die Mittelung über alle NxM Bildpunkte eines Bildausschnitts durchgeführt wird, welcher vorzugsweise gleich groß oder aber kleiner als das Interferenzmuster am Boden eines Mikrotiter-Töpfchens ist. Vorzugsweise wird über eine quadratische Fläche gemittelt. S wird bezeichnet als die "mittlere quadratische Differenz der normierten Intensitäten" zweier Interferenzmuster (Iv, Ijj) vor bzw. nach der Adsorption. Für den auf diese Weise erhaltenen Wert S gilt:
wobei λ die verwendete Lichtwellenlänge bezeichnet und n-j_ die jeweiligen Brechungsindizes, wie oben definiert. Gleichung (3) wird in vielen praktischen Fällen, in de- nen die Adsorbatschicht klein gegenüber λ/4 ist genügen, um die optische Schichtdickenzunahme Δδ aus dem gemessenen Wert für S direkt zu bestimmen. Die jeweilige Genauigkeit der Gleichung (3) läßt sich durch Vergleich mit den numerischen Werten für gegebene Brechungsindizes und Schichtdicken δ bestimmen. Somit ist für kleine Schichtdickenänderungen S proportional zur Schichtdik- kenänderung Δδ. Die exakte Beziehung kann numerisch bestimmt und tabellarisch abgelegt werden. Für den Grenzfall, daß die Adsorbatschicht vor der Adsorption exakt Null ist, läßt sich obige Beziehung (3) unter Vernachlässigung von Vielfachreflexion herleiten. Fig. lc zeigt die Größe S einer simulierten Probe, welche nach Gleichung (1) und (2) berechnet wurde als Funktion der
Schichtdickenänderung Δδ. Dabei wurde angenommen, daß die Adsorbatschicht δ homogen, also nicht vom Ort abhängig ist.
Herstellung interferometrischer Mikrotiterplatten
Optisch hochwertige, lateral strukturierte Interferenzschichten können durch standardmäßiges Aufdampfen dielektrischer Schichten auf Glas hergestellt werden. Die Strukturierung würde in diesem Fall durch Masken, welche zwischen den einzelnen Aufdampfzyklen entweder verschoben oder ausgetauscht werden, erfolgen.
Erfindungsgemäß werden gemäß der ersten Ausführungsform Plastikplatter- bzw. die Trägersubstanz strukturiert. Dies ist einfach und kostengünstig. Ein optisch niedrig oder nicht-dcppelbrechendes Polymer (Polycarbonat, zyklische Olefir-e) kann beispielsweise im Spritzgußverfahren auf eine Mikrotiterplattenform gebracht werden (Fig. 2a) . Diese besteht aus einer Anordnung kleiner Plastiktöpfchen mit flachem Boden. In einem zweiten Schritt wird mit Hilfe eines Stempels in jedem Töpfchen eine Vertiefung 5 von einigen wenigen Mikrometern Tiefe gepreßt (Fig. 2b) . Beispielsweise ist die Vertiefung zwischen 5 und 2000 Nanometer tief. Für die exakte Form der Vertiefung 5 sind mehrere Möglichkeiten denkbar. Beispielsweise monoton ansteigende, vorzugsweise stetige Formen, wie konkave, konvexe, konische oder dachförmige Vertiefungen stellen einfache Lösungen dar. Im letzten Schritt wird ein zweites Polymer (Schicht 2) mit unterschiedlichem Brechungsindex im Gießverfahren aus der Lösung auf die Vertiefung 5 aufgetragen, kann aber - wie in Fig. la gezeigt - über die Vertiefung 5 hinaus verlaufen. Da der Durchmesser des Stempels konstant ist, läßt sieh durch Auftragen einer definierten Menge Lösungsmittel die Schichtdicke D sehr reproduzierbar herstellen. Der zweite Kunststoff 2 soll in einem Lösungsmittel lösbar sein, welches den Kunststoff 1 nicht angreift. Durch Eintrocknen der Schicht 2 kann sich an der Oberfläche ein Meniskus ausbilden.
Auslesen des Reflexions-Interferenz-Signals
Die Reflektivität der Mikrotiterplatte kann mit Hilfe von Reflexions-Mikroskopie unter Auflichtbeleuchtung abgebildet werden (siehe Fig. 3) . Wird mit Hilfe eines schmalbandigen Interferenzfilters monochromatisches Licht erzeugt, werden die Interferenzen in den oben beschriebenen lateral strukturierten Vertiefungen 5 sichtbar. In der Praxis läßt sich weiterhin das Verhältnis von Interferenzsignal zu Hintergrundhelligkeit verbes¬ sern, indem die Antiflex-Technik nach Pluta (Pluta, M; Advanced Light Microscopy, Elsevier, Amsterdam 1989) be¬ nutzt wird. Fig. 3 zeigt den Strahlengang eines solchen Reflexions-Interferenz-Kontrast-Mikroskops nach Pluta. Wird die Probenkammer durch Immersionsöl direkt auf die λ/4-Platte 7 aufgebracht, so ist die erste reflektierende Grenzfläche die Glas-Magnesiumfluorid 2 Grenzschicht (Fig. la) .
Fig. 3 zeigt einen Aufbau zur optischen Abbildung der Reflektivität der Mikrotiterplatte mittels Reflexions- Interferenz-Kontrast-Mikroskopie. Der Träger 1 mit der eingebrachten Interferenzschicht 2 wird über einer λ/4- Platte 7 (optional) angeordnet. Dazwischen befindet sich ein Medium 6 mit gleichem Brechungsindex wie der Träger
1 und die λ/4-Platte 7 zur reflexionsfreien Ankopplung. Dieses Medium ist vorzugsweise ein Immersionsöl oder Silikon. Das von einer Quecksilberdampflampe 14 ausgestrahlte Licht wird über ein Bandpass-Filter 13, das monochromatisches Licht erzeugt, über einen Polarisator 12 (optional) , einen halbdurchlässigen Spiegel 9 und ein Objektiv 8 auf die zu messende Schicht gerichtet. Das reflektierte Licht durchdringt den halbdurchlässigen Spiegel 9 und gelangt über einen Analysator 10 (optional) zu einer Kamera 11. Diese kann eine CCD-Kamera sein.
Ein zweites mögliches Ausleseverfahren (Auslesevorrichtung) besteht in der Abtastung der Mikrotiterplatte mit einem Laser bzw. einer Laserdiode. Das reflektierte Licht wird mit einem eindimensionalen Detektor aufgenommen. Wird die Platte abgerastert, entsteht wiederum ein Interferenzsignal, wie in Fig. lb dargestellt, und die Auswertung erfolgt analog zur abbildenden Reflexions- Interferenz.
Fig. 4 zeigt eine Ausführungsform mit Laserabtastung. Eine Abtastung der Mikrotiterplatte mit einem Laser 19 ist vorteilhaft in Anwendungen, bei denen die Geschwindigkeit des A sleseprozeßes kritisch ist. In dieser Aus- führungsform wird auf abbildende Optik verzichtet und die Mikrotiterplatte von einem Laserstrahl abgetastet, wobei die Intensität des reflektierten Strahls gemessen wird. In Fig. 4 wird der Laserstrahl durch einen drehbaren Spiegel 20 so umgelenkt, daß er die Probe überstreicht und auf einen eindimensionalen Detektor 21 (vorzugsweise CCD) reflektiert wird. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte in dieser Ausführung der Abtastung sind vorzugsweise dach- oder keilförmige Vertiefungen, also lediglich in einer, der Abtastrichtung entsprechenden, Richtung variiert. Die Mittelungen nach Formel (1) und (2) entsprechen in diesem Fall der Mittelung entlang einer Linie. Bezugszeichen 18 bezeichnet einen Glasblock mit Antireflexbeschichtung.

Claims

Patentansprüche :
Substrat mit einem Träger (1) und mit einer auf mindestens einem Abschnitt des Trägers (1) angeordneten Schicht (2) oder mit zwei übereinander liegenden Schichten (2, 3), wobei die am Träger (1) aufliegende Schicht (2) in mindestens einem Abschnitt eine sich ortsabhängig ändernde Dicke aufweist, die erste oder die zweite Schicht an ihrer freien Oberfläche Stoffe binden kann und dadurch ihre optische Dicke ändert und die Schichten so bemessen sind, daß an ihnen Lichtinterferenz beobachtbar ist.
Substrat nach Anspruch 1, wobei die Variation der Dicke monoton ist.
Substrat nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Dicke linear oder nicht-linear variiert.
Substrat nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Oberseite und/oder Unterseite eines Abschnitts der ersten Schicht (2) eine konvexe oder konkave oder konische oder dachförmige Form aufweist.
Substrat nach Anspruch 1, wobei der Träger (1) mindestens eine Ausnehmung (16) aufweist.
Substrat nach Anspruch 1 oder 5, wobei der Träger, vorzugsweise im Bereich der Ausnehmung (16) mindestens eine Vertiefung (5) aufweist.
Substrat nach Anspruch 6, wobei die erste Schicht (2) die Vertiefung (5) mindestens teilweise ausfüllt.
Substrat nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Vertiefung (5) eine monotone Wandung aufweist.
9. Substrat nach Anspruch 8, wobei die Wandung eine lineare oder nicht-lineare Form aufweist.
10. Substrat nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Wandung eine konvexe oder konkave oder konische oder dachförmige Form aufweist.
11. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die erste Schicht (1) heterogen ist.
12. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die erste Schicht (2) einen Brechungsindex n2 aufweist, der von dem Brechungsindex nl des Trägers (1) verschieden ist.
13. Substrat nach Anspruch 12, wobei n2 kleiner als nl ist.
14. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die zweite Schicht (3) auf der von dem Träger (1) abgewandten Seite der ersten Schicht (2) angeordnet ist.
15. Substrat nach Anspruch 14, wobei die zweite Schicht (3) eine bindende Eigenschaft für einen Stoff aufweist.
16. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die erste Schicht (2) eine bindende Eigenschaft für einen Stoff aufweist.
17. Substrat nach Anspruch 15 oder 16, wobei die bindende Eigenschaft eine Bindungswirkung zwischen Rezeptor und Ligand ist.
18. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Änderung der optischen Dicke durch eine Änderung der physikalischen Dicke der zweiten Schicht
.erfolgt. lo
19. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Änderung der optischen Dicke durch eine Änderung des Brechungsindexes der zweiten Schicht erfolgt.
20. Substrat nach einem der Ansprüche 14 bis 19, wobei die zweite Schicht (3) einen zu n2 unterschiedlichen Brechungsindex n3 aufweist, wobei vorzugsweise n2 kleiner als n3 ist.
21. Substrat nach einem der Ansprüche 14 bis 20, wobei die zweite Schicht (3) eine quellfähige Schicht ist.
22. Substrat nach einem der Ansprüche 14 bis 21, wobei die zweite Schicht (3) im trockenen Zustand eine Dicke von 5 bis 200 Ä aufweist.
23. Substrat nach einem der Ansprüche 14 bis 22, wobei die zweite Schicht (3) im gequollenen Zustand eine Dicke von 10 bis 100000 Ä aufweist.
24. Substrat nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei die Vertiefung (5) zwischen 1 und 10000 Nanometer tief ist.
25. Substrat nach Anspruch 24, wobei die Vertiefung (5) zwischen 5 und 2000 Nanometer tief ist.
26. Substrat nach Anspruch 25, wobei die Vertiefung (5) 600 Nanometer tief ist.
27. Substrat nach einem der Ansprüche 5 bis 10, wobei die Vertiefung (5) eine Tiefe entsprechend einem ganzzahligen Vielfachen der halben Lichtwellenlänge in der ersten Schicht (2) aufweist.
28. Sensor zum Bestimmen der Änderung der optischen Dicke einer Schicht mittels Lichtinterferenz mit einem Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 27.
29. Vorrichtung zum Bestimmen der Änderung der optischen Dicke einer Schicht mittels Lichtinterferenz mit einem Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 27 und einer Lichtquelle (14), einem halbdurchlässigen Spiegel (9), einem Objektiv (8) und einer Kamera.
30. Vorrichtung nach Anspruch 29, ferner mit einem Polarisator (12) .
31. Vorrichtung nach Anspruch 29 oder 30, ferner mit einem Analysator (10) .
32. Vorrichtung nach Anspruch 29, 30 oder 31, ferner mit einer λ/4-Platte (7) .
33. Verfahren zur Bestimmung der Änderung der optischen Dicke einer Schicht, die ihre optische Dicke infolge der Bindung eines Stoffes ändert, mittels Lichtinterferenz, bei dem a) die Schicht (2) auf einem Träger (1) aufgebracht ist und in mindestens einem Abschnitt eine sich ortsabhängig ändernde Dicke aufweist, b) ein Reflexions-Interferenzbild der Schicht vor der Bindung des Stoffes zur Ermittlung von Referenzwerten und nach der Bindung des Stoffes zur Ermittlung von Meßwerten erfaßt wird, c) die ermittelten Intensitäten I gemäß
normiert werden, d) die mittlere quadratische Intensitätsdifferenz
bestimmt wird, und e) die optische Schichtdickenänderung Δδ gemäß
bestimmt wird.
34. Verfahren zur Bestimmung der Änderung der optischen Dicke einer Schicht, die ihre optische Dicke infolge der Bindung eines Stoffes ändert, mittels Lichtinterferenz, bei dem a) die Schicht als zweite Schicht (3) über einer ersten Schicht (2) liegt, die ihrerseits auf einem Träger (1) aufgebracht ist und in mindestens einem Abschnitt eine sich ortsabhängig ändernde Dicke aufweist, b) ein Reflexions-Interferenzbild der Schicht vor der Bindung des Stoffes zur Ermittlung von Referenzwerten und nach der Bindung des Stoffes zur Ermittlung von Meßwerten erfaßt wird, c) die ermittelten Intensitäten I gemäß
normiert werden, d) die mittlere quadratische Intensitätsdifferenz
bestimmt wird, und e) die optische Schichtdickenänderung Δδ gemäß
bestimmt wird.
35. Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, wobei die Phasenverschiebung aus der mittleren quadratischen Differenz der no ierten Intensitäten der Interferenzbilder vor und nach der Zugabe der Schicht bestimmt wird.
36. Verfahren nach Anspruch 33, 34 oder 35, wobei die Oberseite und/oder Oberseite eines Abschnitts der ersten Schicht (2) eine konvexe oder konkave oder konische oder dachförmige Form aufweist.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 36, wobei die zweite Schicht (3) biofunktional ist.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 37, wobei monochromatisches Licht verwendet wird.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 38, wobei die Interferenzmuster vor, während und nach der Zugabe des Stoffes bestimmt werden.
40. Verfahren zum Bestimmen der Änderung der optischen Dicke einer Schicht mittels Lichtinterferenz, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung durch Veränderung der Lichtinterferenz in einem Substrat mit Träger der Schicht nach einem der Ansprüche 1 bis 27 erfolgt.
41. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 40, wobei die Bestimmung in einem Trägersubstrat erfolgt, das aus zwei optisch transparenten Kunststoffen mit unterschiedlichem Brechungsindex hergestellt und mit gedruckten, aufgespritzten, gepreßten oder gegossenen interferenzfähigen Strukturen versehen ist.
42. Verfahren nach einem der Anspruch 33 bis 41, wobei der strukturierte Träger der sensitiven Oberfläche mittels Reflexions-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie abgebildet wird.
43. Verfahren nach einem der Anspräche 33 bis 41, wobei der strukturierte Träger der sensitiven Oberfläche mittels Laserlicht und Photodetektoren abgerastert wird.
44. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 43, wobei zur Bestimmung der Änderung der optischen Dicke der Schicht eine Bindungswirkung zwischen Rezeptor und Ligand verwendet wird.
45. Verwendung des Substrates nach einem der Ansprüche 1 bis 27 in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 44.
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