DE4200088C2 - Verfahren und Vorrichtung zum optischen Nachweis einer An- oder Einlagerung mindestens einer stofflichen Spezies in oder an mindestens einer dünnen Schicht - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum optischen Nachweis einer An- oder Einlagerung mindestens einer stofflichen Spe­ zies in oder an mindestens einer dünnen Schicht aufgrund physikalischer oder chemischer Wechselwirkung sowie eine Vorrichtung zu seiner Durchführung.

Im Laufe der Zeit ist bereits eine Vielzahl optischer Meß­ methoden zum Nachweis verschiedenster Vorgänge aus dem physi­ kalisch-chemischen und auch biochemischen Bereich entwickelt worden. Diese Methoden haben sich teilweise auch Interferenz­ erscheinungen, d. h. die Überlagerungen zweier oder mehrerer Lichtstrahlen, zunutze gemacht.

Bei bekannten Ausführungen wie sie beispielsweise in der WO 91/04483 oder in der US-PS 48 20 649 beschrieben sind, ist eine Messung jedoch nur nach Abschluß der Reaktion (in Luft) möglich. Dementsprechend ist eine zeitaufgelöste (on-line) Detektion eines in oder an dünnen Schichten ablaufenden Vor­ gangs nicht vorgesehen. Außerdem müssen teilweise weitere Aufarbeitungsschritte durchgeführt werden, bevor die eigent­ liche Nachweisreaktion stattfinden kann (s. beispielsweise US-PS 48 20 649).

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, der Messung von Inter­ ferenzerscheinungen neue Einsatzgebiete zu erschließen. Dabei sollen physikalisch-chemische, biochemische und biologische Vorgänge auf möglichst einfache Weise nachweisbar sein.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Dabei befindet sich die dünne Schicht auf einer Unterlage und dünne Schicht und Unterlage sind ausrei­ chend transparent. Licht geeigneter Wellenlängen oder eines geeigneten Spektralbereiches wird von der der mindestens einen dünnen Schicht abgewandten Seite der Unterlage einge­ strahlt. Interferenzerscheinungen führen an der mindestens einen dünnen Schicht zu einer Modulation des Reflexions- oder Transmissionsspektrums. Änderungen des Reflexions- oder Transmissionsspektrums werden aufgrund der Wechselwirkung spektral erfaßt, und aus dem erfaßten Spektrum wird eine optische Schichtdicke bestimmt.

Einer der Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt sich darin, daß in Abweichung vom Stand der Technik eine Mes­ sung auch dann möglich ist, wenn sich die dünne Schicht in Kontakt mit einer flüssigen Probe befindet. Dies ist unter anderem darauf zurückzuführen, daß ein transparentes Schicht­ system gewählt wird und die Einstrahlung des Lichts auf der der dünnen Schicht abgewandten Seite erfolgt.

Durch die beanspruchte Kombination der Verfahrensmerkmale, insbesondere durch die spektrale Detektion und die damit mögliche analytische Kurvenanpassung zur Schichtdickenermitt­ lung kann bei der Erfindung die Empfindlichkeit ellipsometri­ scher Verfahren in der Meßgenauigkeit erreicht und sogar übertroffen werden. Dabei ist die zur Durchführung des Ver­ fahrens vorgesehene Apparatur vergleichsweise einfach zu re­ alisieren und mit einem geringeren Kostenaufwand verbunden als dies normalerweise bei ellipsometrischen Verfahren der Fall ist. Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist darin zu sehen, daß die eigentliche Meßgröße (optische Schichtdicke) durch die gewählte spektrale Erfassung weitgehend unempfind­ lich gegen Intensitätsfluktuationen der Lichtquelle oder ge­ gen ein Driften des Detektionssystems ist. Auch Intensitäts­ schwankungen, die sich aus anderen Teilen des Meßaufbaus (Einkopplung, Strahlführung) ergeben können, lassen sich auf diese Weise vermeiden.

An einer dünnen Schicht, wie beispielsweise einer Membran, einer Folie oder einem Film, die mindestens teilweise optisch transparent ist, treten durch Überlagerung zweier oder mehre­ rer Teilstrahlen Interferenzerscheinungen auf, wenn die fol­ genden Bedingungen erfüllt sind:

• 1. Im betrachteten Spektralbereich muß ein Teil des Lichts an den Phasengrenzen der dünnen Schicht reflektiert wer­ den. Dies wird beispielsweise durch einen ausreichenden Unterschied in der Brechzahl im Vergleich zum Nachbarme­ dium oder durch eine Teilverspiegelung erreicht.
• 2. Die Grenzflächen müssen ausreichend eben und parallel angeordnet sein.
• 3. Der Gangunterschied der Teilstrahlen muß kleiner als die Kohärenzlänge des verwendeten Lichts sein.

Durch das Verfahren nach der Erfindung wird der Nachweis einer Vielzahl von physikalischen, chemischen, biochemischen und biologischen Vorgängen möglich. Die nachgewiesenen Inter­ ferenzerscheinungen können beispielsweise auf einen Volumen­ effekt in der dünnen Schicht, der durch Sorption eines Stof­ fes hervorgerufen wird, zurückzuführen sein. Weiter ist es möglich, Interferenzen zu messen, die durch Adsorption von stofflichen Spezies an der Oberfläche der dünnen Schicht her­ vorgerufen werden. Bei den Ausführungsformen der Erfindung ist eine Linearität der Meßergebnisse über einen großen Be­ reich gegeben. Die Erfindung bietet weiterhin den Vorteil, daß die erhaltenen Daten on-line erfaßt und ausgewertet wer­ den können.

Die Interferenzerscheinungen können sowohl an den transmit­ tierten als auch an den reflektierten Teilstrahlen beobachtet werden. Es ist vorteilhaft, wenn die Interferenz in Refle­ xion gemessen wird. Auf diese Weise kann der nachzuweisende Vorgang an einer Seite oder innerhalb der dünnen Schicht ab­ laufen, während von der anderen Seite das Licht eingestrahlt und die reflektierten Teilstrahlen detektiert werden. Dies ermöglicht eine einfache Durchführung des Verfahrens, da die zur Durchführung des Verfahrens nötigen Geräte auf gegenüber­ liegenden Seiten der Probe angeordnet werden können.

Der Einfall des eingestrahlten Lichts auf die dünne Schicht erfolgt im wesentlichen senkrecht. Dadurch sind durch Bre­ chung oder Polarisation hervorgerufene Effekte auszuschließen oder vernachlässigbar. Als eingestrahltes Licht wird insbe­ sondere Weißlicht, wie beispielsweise das Licht einer Xenon­ hochdrucklampe, verwendet. Nach der Erfindung sind aber alle möglichen Lichtquellen, wie polychromatische Lichtquellen, eine Kombination aus mehreren schmalbandigen Lichtquellen (Linienstrahlern), und andere Kontinuumstrahler einsetzbar. Dabei können die Lichtquellen kontinuierlich oder gepulst betrieben werden.

Die durch die Interferenzerscheinungen hervorgerufenen Modu­ lationen des Reflexions- oder Transmissionsspektrums werden als Änderung des Spektrums spektral erfaßt und aus dem erfaß­ ten Spektrum eine optische Schichtdicke bestimmt. Dabei läßt sich die absolute optische Schichtdicke beispielsweise aus der spektralen Lage der Interferenzextrema und deren Abstän­ den voneinander berechnen. Auch aus der Intensitätsänderung bei mehreren Wellenlängen läßt sich die optische Schichtdicke bestimmen.

Unter "dünnen Schichten" nach der Erfindung sind solche zu verstehen, deren Schichtdicke in der Größenordnung der Wel­ lenlänge des eingestrahlten Lichts liegt. Dabei sollte die doppelte Schichtdicke kleiner als die Kohärenzlänge des Lichts sein. Dies hat zur Folge, daß mit Licht hoher Kohärenz dickere Schichten vermessen werden können als mit Licht ge­ ringerer Kohärenz. Typische Schichtdicken der dünnen Schich­ ten liegen im Bereich zwischen 0,3 µm und 10 µm, wobei eine Obergrenze von 5 µm, insbesondere 2 µm, bevorzugt ist.

Als Detektoren sind bei der Erfindung alle üblichen Systeme zur spektralen Messung von Lichtintensitäten geeignet, wie beispielsweise Photohalbleiter, Photomultiplier u. a. Die Spektrometersysteme sind beispielsweise Systeme aus Polychro­ matoren, Diodenarraydetektoren und dergleichen.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform nach der Erfindung wird der nachzuweisende Vorgang durch eine Wechselwirkung zwischen mindestens zwei stofflichen Spezies hervorgerufen. Dabei soll der Begriff "Spezies" umfassend zu verstehen sein. Im Bereich der Biologie kann es sich um Organismen, im Bereich der Bio­ chemie um beliebige Stoffe, wie beispielsweise Enzyme, Anti­ körper und dergleichen sowie im Bereich der Chemie und Physik um Atome oder Moleküle handeln. Voraussetzung ist, daß die Wechselwirkungen zu Änderungen von Interferenzerscheinungen bei eingestrahlten Lichtstrahlen geeigneter Wellenlängen oder eines geeigneten Spektralbereiches führen. Besonders geeignet ist das Verfahren zum insbesondere direkten Nachweis von Vor­ gängen, die auf die Wechselwirkung zwischen mindestens zwei biochemischen Spezies zurückzuführen sind.

Besonders vorteilhaft ist das Verfahren nach der Erfindung bei der Verfolgung von Immunreaktionen und den zugrundelie­ genden Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen. Bekanntlich die­ nen Antikörper im Organismus höherer Tiere zur Unterscheidung und Erkennung von Fremdsubstanzen. Eine erworbene Immunität gegen Infektionskrankheiten beruht unter anderem auf der Bil­ dung spezifischer Antikörper gegen den jeweiligen Erreger. Antikörper sind größere Proteine und treten in verschiedenen Untertypen auf. Jeder Antikörper erkennt mit hoher Selektivi­ tät eine spezifische Struktur, nämlich das zugehörige Antigen oder einen spezifischen Teil eines größeren Antigens. Unter geeigneten Bedingungen bilden Antigen und Antikörper einen stabilen Antigen-Antikörper-Komplex. Aufgrund dieser Tatsache bilden Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen schon seit gerau­ mer Zeit die Grundlage für eine große Zahl analytischer Ver­ fahren, die unter dem Oberbegriff "Immunoassays" zusammenge­ faßt werden.

Von den Immunoassays existiert eine Vielzahl von Varianten. Im Normalfall wird das Antigen durch Adsorption an ein Sub­ strat gebunden und nicht gebundene Substanzen in einem Wasch­ schritt entfernt. Anschließend wird im Überschuß ein Antikör­ per zugegeben, der das gesuchte Antigen spezifisch erkennt. Nicht gebundener Antikörper wird ebenfalls abgewaschen. Die Menge an gebundenem Antikörper ist daher ein Maß für die Menge an Antigen in der Probe. Zum Nachweis der gebundenen Antikörpermenge muß der Antikörper bisher mit einer geeigne­ ten Markierung versehen werden. Eine solche Markierung er­ folgt mit radioaktiven Substanzen (Radio-Immunoassay), mit Fluoreszenzfarbstoffen (Fluoreszenz-Immunoassay) oder mit Enzymen (Enzym-Immunoassay).

Wird das Verfahren nach der Erfindung zum Nachweis von Anti­ gen-Antikörper-Wechselwirkungen eingesetzt, ist keine Markie­ rung erforderlich. Dadurch wird es möglich, die eigentliche Antigen-Antikörperreaktion kontinuierlich und ggf. on-line zu verfolgen. Dies ist bei den bisherigen Methoden nicht mög­ lich, da das gemessene Signal erst in einer Sekundär- oder Tertiärreaktion gebildet wird. Weiterhin ist das erfindungs­ gemäße Verfahren im Vergleich zu herkömmlichen Immunoassays wesentlich schneller durchzuführen und durch Verzicht auf speziell markierte Komponenten sinken die Kosten zur Durch­ führung des Verfahrens.

Die dünne Schicht bei der Erfindung wird insbesondere minde­ stens teilweise von einer Trägerschicht gebildet, wobei der nachzuweisende Vorgang vorzugsweise an und/oder in der Trä­ gerschicht abläuft. Die Trägerschicht kann zur Erzeugung der Interferenzerscheinungen durch Überlagerung zweier oder meh­ rerer Teilstrahlen in Transmission und/oder in Reflexion dienen. Sie kann auch das Substrat zur weiteren Beschichtung mit sensoraktivem Material oder zur Ankopplung einer geeigne­ ten Spezies, die an dem nachzuweisenden Vorgang beteiligt ist, sein. Bei der Trägerschicht handelt es sich vorzugsweise um eine Polymerschicht oder um eine Schicht oder einen Film, der aus organischem oder anorganischem Material bestehen kann. Bei Verwendung von organischen Polymerschichten ist beispielsweise eine Schicht aus Polystyrol zum Nachweis von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen besonders geeignet. Bei Verwendung von anorganischen Schichten können vorzugsweise Substanzen verwendet werden, die sich in ihrer Brechzahl hin­ reichend von der Brechzahl der angrenzenden Medien unter­ scheiden. Insbesondere können abgeschiedene Schichten aus anorganischen Oxiden oder Nitriden, wie beispielsweise SiO₂, Si-nitrid, Aluminiumoxid, Titanoxid, verwendet werden. Die Abscheidung kann beispielsweise durch CVD (chemical vapour deposition) erfolgen.

Es ist vorteilhaft, wenn die Trägerschicht auf die Unterlage aufgebracht ist. Die Unterlage dient dabei der mechanischen Stabilisierung sowie der Weiterleitung des Lichts und kann auch die Funktion einer Reflexionsgrenzschicht übernehmen. Geeignete Unterlagen sind beispielsweise Plättchen aus Glas, Quarz, Saphir usw . . Als Unterlage kann jedoch auch das Ende eines Lichtleiters, die Oberfläche einer Lichtquelle sowie die Oberfläche von Detektoren oder anderen optischen Bauele­ menten, wie beispielsweise Spiegeln, Halbleiteroberflächen u. a. dienen.

Zwischen der Trägerschicht und der Unterlage können weitere Schichten, insbesondere reflexionsverstärkenden Eigenschaf­ ten, vorgesehen sein. Reflexionsverstärkende Schichten dienen der Verringerung der spektralen Bandbreite der Trans­ mission oder Reflexion der interferenzerzeugenden Schicht durch Erhöhung des Reflexionsgrades an den Phasengrenzen. Solche Schichten werden beispielsweise durch Aufdampfung von Metallen oder durch Verspiegelung mit Dielektrika herge­ stellt.

Es ist nach der Erfindung bevorzugt, wenn eine der Spezies, deren Wechselwirkung mit mindestens einer anderen Spezies beobachtet wird, in und/oder an der Trägerschicht chemisch oder physikalisch gebunden ist. Eine solche Bindung besteht vorzugsweise in einer Adsorption der Spezies an der Oberflä­ che der Trägerschicht. Dadurch ist eine der wechselwirkenden Spezies definiert an der Oberfläche gebunden, so daß eine Wechselwirkung mit weiteren Spezies und damit der Nachweis des zu untersuchenden Vorgangs wesentlich vereinfacht wird. So kann beim Nachweis einer Antigen-Antikörper-Wechselwirkung beispielsweise das Antigen auf der Oberfläche einer Polysty­ rolschicht adsorbiert sein und definiert mit einem spezifi­ schen Antikörper reagieren.

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung weist im wesentlichen eine Lichtquelle, insbesondere eine Xenonhochdrucklampe, eine Probeneinrichtung, an der der zu untersuchende Vorgang durch­ geführt werden kann, sowie einen Detektor und eine Auswerte­ einrichtung, die vorzugsweise einen Computer enthält, auf. Weitere Merkmale ergeben sich aus Anspruch 14.

Die genannte Vorrichtung zeigt vorzugsweise zusätzlich einen Y-Lichtleiter. Dabei dient der erste Arm des Lichtleiters zum Einstrahlen des Lichts auf die Probeneinrichtung und der zweite Arm des Lichtleiters führt den, insbesondere reflek­ tierten Anteil des Lichts zum Detektor. Durch die Verwendung eines Y-Lichtleiters kann auch auf einfache Weise eine im wesentlichen senkrechte Einstrahlung und Detektion des Lichts erfolgen.

Die Probeneinrichtung besteht aus einer Unterlage, insbeson­ dere aus Glas, sowie vorzugsweise einer Trägerschicht, an der der nachzuweisende Vorgang abläuft. Bei der Trägerschicht handelt es sich vorzugsweise um eine Polymerschicht oder eine anorganische Schicht. Die Schichten sind beispielsweise so ausgebildet, daß sie zum Nachweis einer Antigen-Antikörper- Wechselwirkung das Antigen adsorbieren können.

Die Vorrichtung nach der Erfindung benötigt keine aufwendigen mechanischen Bauteile, wie sie bei vielen optischen Nachweis­ geräten erforderlich sind. So ist beispielsweise im Normal­ fall keine Winkelverstellung einfallender und/oder ausfal­ lender Lichtstrahlen nötig.

Die beschriebenen Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 den schematischen Aufbau einer Nachweisvor­ richtung nach der Erfindung, und

Fig. 2 den Verlauf eines Immunoassays durch Bestim­ mung der optischen Schichtdicke mittels Mes­ sung der Interferenz.

In Fig. 1 ist ein Meßaufbau zur Interferenzmessung nach der Erfindung schematisch dargestellt. Die Vorrichtung 1 besteht im wesentlichen aus einer Lichtquelle 2, wie beispielsweise einer Xenonhochdrucklampe, einer Probeneinrichtung 3, einem Detektor 4 und einer Auswerteeinrichtung 5. Die Auswerteein­ richtung 5 enthält einen Computer 6 zur Erfassung und Auswer­ tung der gemessenen Daten. Die Lichtquelle 2 und der Detektor 4 stehen über einen Y-Lichtleiter 7 mit der Probeneinrichtung 3 in Verbindung. Über den ersten Arm 8 des Y-Lichtleiters 7 wird das Licht auf die Probeneinrichtung 3 geschickt und der reflektierte Anteil des Lichts über den zweiten Arm 9 des Lichtleiters 7 zum Detektor 4 geführt. Der Detektor 4 kann beispielsweise ein sog. Diodenarray mit 512 Dioden sein. In diesem Fall wird die Änderung der Transmission oder Refle­ xion über die spektrale Verschiebung des gesamten Transmis­ sions- bzw. Reflexionsspektrums detektiert. In dem in Fig. 1 dargestellten Fall werden die Interferenzerscheinungen in Re­ flexion gemessen. Nach der Erfindung ist es aber in gleicher Weise möglich, die Interferenzerscheinungen in Transmission zu detektieren. Weiterhin können die Interferenzerscheinungen über Intensitätsänderungen mehreren Wellenlängen detektiert werden.

Die in Fig. 1 dargestellte Probeneinrichtung 3 zeigt eine Unterlage 10 sowie eine Trägerschicht 11. Bei der Unterlage kann es sich beispielsweise um ein Glasplättchen mit einer Dicke von ca. 1 mm, ein handelsübliches Interferenzfilter, das Ende des Lichtleiters 7 oder um andere geeignete Substra­ te handeln, wie sie in der Beschreibung aufgeführt sind. Die Trägerschicht 11 ist beispielsweise ein Polymerfilm mit einer Stärke von 1 µm, an dem der nachzuweisende Vorgang stattfin­ det. Das auf die Probeneinrichtung 3 gerichtete Ende des Lichtleiters 7 ist so angeordnet, daß es einen im wesentli­ chen senkrechten Einfall des Lichts auf die einzelnen Schich­ ten der Probeneinrichtung 3 ermöglicht. Damit können störende Effekte, die auf Brechungen und Polarisationen zurückzuführen sind, weitgehend vernachlässigt oder ausgeschlossen werden. Der in Fig. 1 ebenfalls dargestellte Pfeil deutet den nachzu­ weisenden Vorgang an, der sich in der Probeneinrichtung 3 ab­ spielt.

Das aus der Lichtquelle 2 über den ersten Arm 8 des Lichtlei­ ters 7 auf die Probeneinrichtung 3 einfallende Licht wird an den einzelnen Grenzflächen der Schichten der Probeneinrich­ tung 3 reflektiert. Wenn die Kohärenzbedingung erfüllt ist, kommt es zur Überlagerung der Teilstrahlen, die entweder konstruktiv oder destruktiv sind. Die Lage der Maxima und Minima hängt von der Wellenlänge sowie von der Schichtdicke und der Brechzahl der Substanzen auf der Unterlage bzw. dem Polymerfilm ab. Ändert sich nun die optische Schichtdicke durch den zu untersuchenden Vorgang, wird eine Verschiebung der Interferenzmuster beobachtet. Mit den unter Zuhilfenahme des Computers 6 durchgeführten Auswerteverfahren kann aus dieser Verschiebung der Interferenzmuster die Änderung der optischen Schichtdicke bestimmt werden. Solche Auswertungen können sowohl auf der Bestimmung der Änderung der Transmis­ sion oder Reflexion bei mehreren Wellenlängen oder der Verschiebung der Transmissions- oder Reflexionsspektrums beruhen.

Beispiel 1

Mit der in Fig. 1 dargestellten Meßvorrichtung wird die Im­ munreaktion zwischen Rinder-Serum-Albumin-(RSA) und Anti- RSA auf einer Trägerschicht von Polysiloxan untersucht. Dabei wird auf einem Quarzglasplättchen mit einer Dicke von 1 mm ein Polysiloxanfilm (Silgel 604 von Wacker-Chemie, Burghau­ sen) in einer Dicke von 1 µm aufgebracht. Diese Trägerschicht wird mit Anti-RSA beschichtet. Dann wird RSA in 0,1 µg/ml Pufferlösung zugegeben. Das Interferenzspektrum wird vor und nach der Zugabe des RSA bestimmt. Es zeigt sich eine deutli­ che Veränderung in der Lage des Maximums und in der Amplitude der Interferenz.

Aus der Intensitätsänderung eines ausgewählten Interferenzma­ ximums wird eine Änderung der optischen Schichtdicke be­ stimmt. Der erhaltene Wert für die Schichtdickenänderung liegt innerhalb des Bereichs, wie sie für Antigen-Antikörper- Wechselwirkungen erwartet werden. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, daß die Schichtdicke bereits nach einem Zeitraum von 20 Minuten im wesentlichen konstant ist. Damit kann die Untersuchung der Immunreaktion wesentlich schneller durchge­ führt werden als dies bei üblichen Immunoassays der Fall ist.

Die Genauigkeit und die Reproduzierbarkeit der Messungen ist besonders hoch, wenn die Schichtdicke von Polymerschicht plus Antigen-Antikörper-Schichten nach durchgeführter Immunreak­ tion zwischen 1 und 2 µm liegt. Eine Gesamtschichtdicke von ca. 1,5 µm ist besonders vorteilhaft. Durch Variation der Dicke der Polymerschicht kann die Gesamtschichtdicke in den optimalen Bereich gebracht werden.

Beispiel 2

Mit der in Fig. 1 dargestellten Meßvorrichtung wurde ein weiteres Immunoassay durchgeführt. Als Antigen wurde ein synthetisches Fragment aus dem Hüllprotein des Maul- und Klauenseuche-Virus eingesetzt. Zum Blockieren freigebliebener Bindungsstellen wurde Kollagenlösung eingesetzt. Als Antikör­ per wurde zunächst ein unspezifischer und anschließend ein spezifischer monoklonaler Antikörper untersucht. Das Antigen wurde auf einem Polystyrolfilm adsorbiert. Die Schichtdicke bzw. die Änderung der Schichtdicke wurde in festen Zeitab­ ständen untersucht.

Die Messung aller Reaktionsschritte wurde so durchgeführt, daß die Messung jeweils so lange fortgesetzt wurde bis ein stabiles Signal und damit eine gleichbleibende optische Schichtdicke vorhanden war. Nach jeder Zugabe wurde bis zum Einstellen einer konstanten Schichtdicke gewartet. Der Ver­ lauf der Reaktion ist aus Fig. 2 zu ersehen.

Auf eine Unterlage aus Quarzglas mit einer Dicke von 1 mm wurde eine Polystyrolschicht aufgebracht. Diese Polystyrol­ schicht wurde mit Antigen belegt und die noch freien Stellen auf der Oberfläche anschließend mit Kollagen blockiert. Dann wurde zuerst ein unspezifischer und in einem zweiten Versuch ein spezifischer Antikörper zugegeben. Wie bereits ausge­ führt, wurden alle Reaktionsschritte bis zur gleichbleibenden Schichtdicke verfolgt und nach jeder Proteinzugabe bis zum Einstellen einer konstanten Schichtdicke abgewartet. An­ schließend wurde in jedem Fall mit Pufferlösung gespült, bis sich wiederum eine konstante Schichtdicke ergab. Nach jeder Proteinzugabe zeigte sich eine Schichtdickenzunahme von einigen Nanometer (nm) über einen Zeitraum von ca. 20 Minu­ ten. Bei den nachfolgenden Waschschritten nahm die gemessene Schichtdicke regelmäßig binnen weniger Minuten wieder ab. Nach der Adsorption des Antigens und nach der Zugabe eines Blockierungsproteins (Kollagen) verblieb auch nach dem Wasch­ schritt eine Nettozunahme der Schichtdicke. Wie Fig. 2 zeigt, liegt die Zunahme der optischen Schichtdicke von ca. 4 nm gut innerhalb des Erwartungsbereichs für eine weitgehend ge­ schlossene Protein-Monolayer. Bei der Zugabe der Antikörper ergab sich sowohl für den unspezifischen als auch für den spezifischen Antikörper eine Zunahme der optischen Schicht­ dicke. Für den spezifischen Antikörper war jedoch die Ände­ rung der optischen Schichtdicke deutlich größer. Zudem war die Schichtdicke bei dem unspezifischen Antikörper bei Puf­ ferzugabe vollständig reversibel, während beim spezifischen Antikörper eine unter den gewählten Bedingungen stabile Ände­ rung der optischen Schichtdicke von ca. 1,8 nm erhalten wur­ de. Die bei Beispiel 2 gemessenen Reaktionszeiten für die Antigen-Antikörper-Reaktion liegen mit ca. 20 Minuten deut­ lich unterhalb der Inkubationszeiten im Stundenbereich wie sie bei üblichen Immunassays, wie beispielsweise ELISA erhal­ ten werden. Es zeigt sich auch der Vorteil des Blockierungs­ schrittes bei Festphasen-Adsorptionsassays durch die Netto- Schichtdickenänderung bei Zugabe eines Blockierungsproteins. Die Erfindung liefert somit ein relativ einfaches Verfahren, das eine kontinuierliche Verfolgung der Antigen-Antikörper- Wechselwirkung bei niedrigen Kosten ermöglicht. Außerdem han­ delt es sich bei dem Verfahren nach der Erfindung um ein on­ line-Verfahren.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wurde die Einsatzmöglichkeit der Erfindung zum Nachweis von Kohlenwasserstoffen in einer dünnen Polymer­ schicht untersucht. Dazu wurde auf eine handelsübliche Inter­ ferenzfilter ein Polysiloxanfilm aufgebracht. Die so erhalte­ ne Probeneinrichtung wurde in die in Fig. 1 dargestellte Meß­ vorrichtung eingebracht. Um die Einsatzfähigkeit der Proben­ einrichtung als Sensor für Kohlenwasserstoffe aufzuzeigen, wurde die Probeneinrichtung mit verschiedenen Kohlenwasser­ stoffen, wie beispielsweise Ether, n-Pentan, n-Hexan, n-Hep­ tan in Berührung gebracht. Bei allen Stoffen zeigte sich eine deutliche Verschiebung des Interferenzspektrums unter Einfluß der genannten Kohlenwasserstoffe. Nach Kalibrierung des Sy­ stems bestand sich über einen weiten Bereich ein guter linea­ rer Zusammenhang zwischen der relativen Änderung der opti­ schen Schichtdicke und der Menge der verwendeten Substanzen.

Ein Nachweis der Kohlenwasserstoffe ist sowohl aus der Gas­ phase als auch aus flüssigen Systemen, wie beispielsweise aus wäßriger Phase, möglich.

Claims (16)

1. Verfahren zum optischen Nachweis einer An- oder Einlage­ rung mindestens einer stofflichen Spezies in oder an mindestens einer dünnen Schicht aufgrund physikalischer oder chemischer Wechselwirkung, wobei

• - sich die mindestens eine dünne Schicht auf einer Unterlage befindet und dünne Schicht und Unterlage ausreichend transparent sind,
• - Licht geeigneter Wellenlängen oder eines geeigneten Spektralbereiches von der der mindestens einen dünnen Schicht abgewandten Seite der Unterlage eingestrahlt wird,
• - Interferenzerscheinungen an der mindestens einen dünnen Schicht zu einer Modulation des Reflexions- oder Transmissionsspektrums führen,
• - Änderungen des Reflexions- oder Transmissionsspek­ trums aufgrund der Wechselwirkung spektral erfaßt, und
• - aus dem erfaßten Spektrum eine optische Schichtdicke bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die spektrale Erfassung mit Hilfe eines Spektrometersy­ stems, insbesondere eines Array-Spektrometers, erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Licht relativ zur Oberfläche der dünnen Schicht im wesentlichen senkrecht eingestrahlt wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß Weißlicht, insbesondere Licht einer Xenonhochdrucklampe, eingestrahlt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß die Wechselwirkung von minde­ stens zwei stofflichen Spezies in oder an der dünnen Schicht nachgewiesen wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß die Wechselwirkung von minde­ stens zwei biochemischen Spezies in oder an der dünnen Schicht nachgewiesen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Antigen-Antikörper-Wechselwirkung nachgewiesen wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß die dünne Schicht mindestens teilweise von einer Trägerschicht gebildet wird, wobei vorzugsweise der nachzuweisende Vorgang an und/oder in der Trägerschicht abläuft.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Trägerschicht um eine anorganische Schicht, insbesondere aus einem anorganischen Oxid oder Nitrid, handelt.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Trägerschicht um eine organische Poly­ merschicht, insbesondere eine Polystyrolschicht, han­ delt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Trägerschicht auf der Unterlage, insbesondere einer Glasunterlage, befindet.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sich zwischen Trägerschicht und Unterlage mindestens eine weitere, insbesondere reflex­ ionsverstärkende Schicht befindet.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Spezies in und/oder an der Trägerschicht chemisch oder physikalisch gebunden, insbesondere adsorbiert wird oder ist.

14. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit

• - einer Lichtquelle (2), die Licht geeigneter Wellen­ längen oder eines geeigneten Spektralbereiches aus­ sendet, insbesondere eine Xenonhochdrucklampe,
• - einer Probeneinrichtung (3), bestehend aus einer Unterlage und mindestens einer darauf befindlichen dünnen Schicht, wobei in oder an der mindestens einen dünnen Schicht eine zu untersuchende An- oder Ein­ lagerung mindestens einer stofflichen Spezies ab­ läuft, dünne Schicht und Unterlage ausreichend trans­ parent sind und die Lichtquelle auf der der minde­ stens einen dünnen Schicht abgewandten Seite der Unterlage angeordnet ist,
• - einem Detektor (4) zur spektralen Erfassung von Änderungen des Reflexions- oder Transmissionsspek­ trums, insbesondere einem Diodenarray, und
• - einer Auswerteeinrichtung (5), die insbesondere einen Computer (6) aufweist, zur Bestimmung einer optischen Schichtdicke.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Y-Lichtleiter (7) aufweist, wobei der erste Arm (8) des Lichtleiters (7) zur Einstrahlung des Lichts auf die Probeneinrichtung (3) und der zweite Arm (9) des Lichtleiters (7) zur Führung eines reflektierten Anteils des eingestrahlten Lichts auf den Detektor (4) vorgesehen ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Unterlage (10) insbesondere aus Glas besteht, und auf die Unterlage (10) eine Trägerschicht (11), insbesondere anorganische Schicht, aufgebracht ist.