DE69932289T2

DE69932289T2 - Sensor und Messgerät mit dessen Nutzung

Info

Publication number: DE69932289T2
Application number: DE1999632289
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Hiki-gun Takei; Takeshi Asaka-shi Sakamoto
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1998-05-19
Filing date: 1999-05-18
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2019-05-19
Also published as: US6331276B1; EP0965835A3; JP3380744B2; EP0965835A2; EP0965835B1; JPH11326193A; DE69932289D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Sensoren wie zum Beispiel Immunsensoren, Gassensoren oder Ionensensoren, die sich des Prinzips der Oberflächenplasmonresonanz bedienen, und eine Vorrichtung unter Verwendung dieser Sensoren.
Das Oberflächenplasmon ist eine sich ausbreitende Welle kollektiv schwingender freier Elektronen an einer Grenzfläche zwischen einem dünnen metallischen Film und einem dielektrischen Material. Da die Ausbreitung der Welle sensitiv durch die Dielektrizitätskonstante an der Grenzfläche beeinflusst wird, bildet sie die Grundlage für ein Detektionsprinzip in Immunsensoren und Gassensoren. Ein typischer Aufbau eines solchen Sensors ist in 2A gezeigt. Ein dünner metallischer Film 21 aus einem freie Elektronen aufweisenden Metall wie zum Beispiel Gold oder Silber mit einer Dicke von ca. 50 nm ist auf der Oberfläche eines Prismas mit einem hohen Brechungsindex ausgebildet, die zusätzlich zu dem dünnen metallischen Film 21 eine Molekülerkennungslage 29 aufweist. Zum Erzeugen des Oberflächenplasmons an der Oberfläche des dünnen metallischen Films 21 muss der Film 21 von der Prismenseite mit p-polarisiertem, kollimiertem monochromatischem Licht 22 von einer Lichtquelle 23 unter einem bestimmten Winkel bestrahlt werden, der als Resonanzwinkel bezeichnet wird. Die Erzeugung des Oberflächenplasmons wird durch Erfassen von spiegelnd reflektiertem Licht 25 mit einem Detektor 26 überwacht. Mit anderen Worten, wie in 2B gezeigt, wenn der Einfallswinkel dem Resonanzwinkel 27 entspricht, mit dem das Oberflächenplasmon angeregt wird, wird die Intensität 28 des reflektierten Lichts sehr gering, weil ein großer Teil der Energie in dem einfallenden Licht auf das Oberflächenplasmon übertragen wird. Der Resonanzwinkel ist abhängig von der Dielektrizitätskonstante an der Oberfläche; wird eine Änderung der Dielektrizitätskonstante an der Oberfläche des dünnen metallischen Films 21 induziert, nimmt die Intensität 31 des reflektierten Lichts jetzt mit einem neuen Resonanzwinkel 30 ab. Weil der Resonanzwinkel nur von der Dielektrizitätskonstante in einem Bereich von mehreren Hundert Mikrometer von der Oberfläche abhängt, reicht die Adsorption einer kleinen Menge einer Probe aus, um den Resonanzwinkel zu verschieben. Wenn eine Vorrichtung mit einer Molekülerkennungslage 29 konstruiert wird, die ein bestimmtes Molekül erkennen und binden kann, und wenn man eine Probenflüssigkeit über die Oberfläche strömen lässt, verändert sich die Dielektrizitätskonstante, wenn ein bestimmtes Molekül in der Probenflüssigkeit gebunden wird. Daher kann durch Beobachten des um den Resonanzwinkel herum reflektierten Lichts sofort festgestellt werden, ob das bestimmte Molekül von der Molekülerkennungslage 29 erfasst worden ist.
Um das mit einem dünnen metallischen Film verbundene Phänomen des Oberflächenplasmons zu nutzen, ist neben dem vorstehend beschriebenen kollimierten monochromatischen Licht ein Verfahren (1) bekannt, bei dem der Film mit divergentem monochromatischen Licht bestrahlt und das reflektierte Licht mit einer Lichtsensoranordnung gemessen wird, und ein Verfahren (2), bei dem der Film mit kollimiertem weißen Licht bestrahlt und das reflektierte Licht mit einem Spektrometer gemessen wird. Bei beiden Verfahren bedient man sich der Abhängigkeit des Resonanzwinkels für Licht einer bestimmten Wellenlänge von der Dielektrizitätskonstante der Grenzfläche.
In dem Beitrag „Surface-enhanced Raman scattering from silver particles on polymer-replica substrates", Optics Letters, Vol. 7, Nr. 3, März 1982, Seiten 105 bis 107, beschreiben Hart et al. die optischen Eigenschaften einer mit Silber beschichteten Polymer-Mikrostruktur und vergleichen Messungen der Raman-Streuung mit dem Modell der Partikelplasmonresonanz.
WO 98 09153 beschreibt die Erzielung einer starken nicht strahlenden Kopplung von Plasmonresonanzen dicht gepackter Metallpartikel, indem diese in halbregelmäßigen zweidimensionalen Anordnungen in einem kolloidalen metallischen Film angeordnet werden. Die kolloidalen Filme werden auf einem Substrat mit funktionellen Gruppen mit hoher Affinität für ein geeignetes Metall wie zum Beispiel Silber ausgebildet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Bei der Messvorrichtung unter Nutzung des Phänomens der Oberflächenplasmonresonanz nach dem Stand der Technik muss die relative Position der Lichtquelle, des dünnen metallischen Films und des Lichtdetektors präzise eingehalten sowie bei Bedarf stufenlos mechanisch verstellt werden. Zur Verbesserung der Messgenauigkeit ist es wünschenswert, den Abstand zwischen dem dünnen metallischen Film und dem Lichtdetektor zu erhöhen, aber dies schließt eine kompakte Bauweise der Vorrichtung aus. Weil das Oberflächenplasmonresonanzverfahren temperaturempfindlich ist, ist außerdem eine Temperaturregelung oder Korrektur von Temperaturabweichungen erforderlich, was ebenfalls eine kompakte Ausführung der Vorrichtung verhindert. Ein weiteres optisches Phänomen, das in Verbindung mit einem freie Elektronen aufweisenden Metall auftritt, ist das lokalisierte Oberflächenplasmon. Wenn Partikel aus einem freie Elektronen aufweisenden Metall wie zum Beispiel Goldpartikel mit weißem Licht bestrahlt werden, werden freie Elektronen in den Partikeln angeregt, innerhalb der Grenzen der Partikel mit einer bestimmten Frequenz kollektiv zu schwingen. Diese Art von kollektiven Schwingungen pflanzt sich nicht fort; daher die Bezeichnung lokalisiertes Oberflächenplasmon.
Die Plasmonresonanzwellenlänge hängt bekanntlich von der Dielektrizitätskonstante im optischen Nahfeldbereich innerhalb mehrerer Fraktionen eines Teilchendurchmessers entfernt von der Teilchenoberfläche ab, und ein Verfahren zum Nachweis biologischer Moleküle unter Verwendung dieser Technik ist ebenfalls bekannt (Science, 277, 1078, 1997).
Im Prinzip ist es möglich, die Nahfeldintensität zu verstärken, indem man die Form der Goldpartikel zu einem Ellipsoid ändert (Surface Science, 156, 678, 1985). Es ist auch bekannt, dass die starke Nahfeldintensität am Ende einer scharfen Metallspitze erzeugt wird, wenn sie in die Nähe eines Metallsubstrats gebracht und bestrahlt wird (J. Vac. Sci. Technol., 9, 510, 1991).
Ausgehend von dem Gedanken, dass scharfe Spitzen und längere Partikel dieselbe Wirkung haben, hat der Erfinder festgestellt, dass eine viel stärkere Färbung als in Verbindung mit den Goldpartikeln nach dem bisherigen Stand der Technik beobachtet wurde, wenn kappenförmige Goldpartikel nahe eines Metallsubstrats gebildet wurden. Eine stärkere Färbung impliziert, dass die Nahfeldintensität um die auf der Oberfläche adsorbierten kappenförmigen Goldpartikel ebenfalls verstärkt ist. Daher kann ein Gerät auf der Grundlage des Prinzips der einfachen Messung der durch Adsorption der Moleküle auf der Teilchenoberfläche im Nahfeld bewirkten Veränderung im Absorptionsspektrum einfacher und kompakter sein als ein herkömmlicher Oberflächenplasmonsensor. Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Sensors und einer Messvorrichtung, die kompakt und einfach zu handhaben ist und auf der Farbänderung der neuen Partikel basiert.
Daher werden ein Sensor nach Anspruch 1 und Vorrichtungen nach Anspruch 4 und 5 bereitgestellt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Querschnittsansicht einer Ausführungsform der Messvorrichtung nach der vorliegenden Erfindung.
2A zeigt eine Vorrichtung nach dem Stand der Technik, und 2B zeigt ein Diagramm zur Beschreibung des Messprinzips.
3A bis 3D zeigen ein Verfahren zum Ausbilden von Metallpartikeln auf einem dünnen metallischen Film mit einem Sensor nach der vorliegenden Erfindung.
4 zeigt ein Reflexionsspektrum eines Sensors nach der vorliegenden Erfindung mit Polymerpartikeln verschiedener Größe.
5 zeigt die Abhängigkeit eines Reflexionsspektrums von der Immersionsflüssigkeit entsprechend der Dielektrizitätskonstante von Goldpartikeln in einer Ausführungsform eines Sensors nach der vorliegenden Erfindung.
6 zeigt die Änderung der maximalen Absorptionswellenlänge in Abhängigkeit von Oberflächenmodifikationen von Goldpartikeloberflächen in einer Ausführungsform eines Sensors nach der vorliegenden Erfindung.
7 zeigt die zeitliche Änderung der maximalen Absorptionswellenlänge aufgrund der Adsorption von Octadecanthiol auf Goldpartikeloberflächen in einer Ausführungsform eines Sensors nach der vorliegenden Erfindung.
8A bis 8E zeigen Oberflächenmodifikationen von Goldpartikeln in einer Ausführungsform eines Sensors nach der vorliegenden Erfindung.
9 zeigt eine Querschnittsansicht einer weiteren Ausführungsform der Messvorrichtung nach der vorliegenden Erfindung.
10A bis 10C zeigen Schemazeichnungen einer weiteren Ausführungsform der Messvorrichtung nach der vorliegenden Erfindung.
11A bis 11D zeigen Zeichnungen zur Beschreibung einer weiteren Ausführungsform der Messvorrichtung nach der vorliegenden Erfindung.
12A bis 12E zeigen ein Verfahren zur biomolekularen Modifikation von Goldoberflächen unter Nutzung der Bindung von Thiolmolekülen an Gold.
13A und 13B zeigen eine Querschnittsansicht und eine Gesamtansicht einer weiteren Ausführungsform der Messvorrichtung nach der vorliegenden Erfindung.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
3A bis 3D zeigen ein Verfahren zum Bilden von kappenförmigen Metallpartikeln auf einem dünnen metallischen Film 41, der einen Sensor nach der vorliegenden Erfindung umfasst. Wie in 3A gezeigt, wird der dünne metallische Film 41 mit einer Dicke von 5 nm bis 1.000 nm durch Aufdampfen eines freie Elektronen aufweisenden Metalls wie zum Beispiel Gold, Silber, Kupfer oder Aluminium auf ein transparentes Substrat 40 gebildet. Als Nächstes wird, wie in 3B gezeigt, dieser dünne metallische Film 41 mit einem 10 mM-Lösung eines Thiolmoleküls wie zum Beispiel 2-Aminoethanthiol oder Thioglycolat behandelt, um eine modifizierte Lage 42 auf der Oberfläche zu bilden. Danach werden, wie in 3C gezeigt, Polystyrolkügelchen 43 mit einem Teilchendurchmesser von 5 nm bis 100 μm, suspendiert in einer 1 bis 50 mM-Carbodiimidlösung, zu dem dünnen metallischen Filmüberzug zugegeben, so dass eine Kügelchenlage 44 auf der Oberfläche des dünnen Goldfilms 41 gebildet wird, auf dessen Oberfläche sich die modifizierte Lage 42 befindet. Als Nächstes werden, wie in 3D gezeigt, nach Trocknen und Aufbringen von Gold in einer Dicke von 5 nm bis 500 nm kappenförmige Goldpartikel 45 auf der Oberfläche der Polystyrolkügelchen gebildet (japanische Patent-Offenlegungsschrift Hei 11-1703).
Nach der vorliegenden Erfindung werden keine massiven kugelförmigen Goldpartikel gebildet, sondern vielmehr Poly merpartikel, die mit elektrisch isolierten kappenförmigen Goldpartikeln bedeckt sind. Nachstehend werden sie jedoch der Einfachheit halber als Goldpartikel bezeichnet. Wie aus der Beschreibung der folgenden Ausführungsform ersichtlich wird, verstärkt das Vorhandensein des darunter liegenden Goldsubstrats die bei dem Substrat 40 beobachtete Färbung (japanische Patent-Offenlegungsschrift 10339808A).
Diese Färbung ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass Licht in einem bestimmten Wellenlängenband von den Partikeln selektiv absorbiert wird, wenn das Substrat 40 in einem bestimmten Winkel mit weißem Licht bestrahlt wird, und das nicht absorbierte Licht wird größtenteils spiegelnd auf der Substratoberfläche reflektiert. Weil keine Wellenlängenabhängigkeit für durchgelassenes Licht gegeben ist, wird andererseits der Färbungseffekt in diesem Fall nicht beobachtet.
Dieses Phänomen kann auf die Wechselwirkung des Goldfilms und der Goldpartikel zurückgeführt werden, wie nachstehend beschrieben. Durch Bilden von Goldpartikeln in der Nähe des dünnen Goldfilms kommt es anscheinend zu einer Wechselwirkung zwischen dem sich ausbreitenden Oberflächenplasmon des dünnen Films und dem lokalisierten Plasmon der Partikel, wodurch neue Absorptionseigenschaften entstehen. Die durch Bestrahlen mit kollimiertem weißen Licht in einem bestimmten Winkel und Messen des spiegelnd reflektierten Lichts erhaltenen Reflexionsspektren weisen scharfe Peaks in den ultravioletten, sichtbaren und infraroten Lichtbereichen auf, und die Wellenlängen dieser Absorptionspeaks richten sich nach der Art und Dicke des Metalls auf dem Substrat, dem Durchmesser und der Adsorptionsdichte der Polystyrolkügelchen, sowie der Art der Dicke des Metalls, das thermisch auf die Polystyrolkügelchen aufgedampft ist. Zu beachten ist, dass die Form der Partikel besonders wichtig ist, wie aus der Tatsache ersichtlich ist, dass auf einem dünnen Goldfilm adsorbierte kugelförmige Goldpartikel eine deutlich geringere Färbung zeigen.
4 zeigt ein Reflexionsspektrum für eine Ausführungsform des Sensors nach der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Polymerkügelchen verschiedener Größe. Wird ein Sensor mit Polystyrolkügelchen mit einer Teilchengröße von 55, 110, 152 und 209 nm, auf die 20 nm Gold aufgebracht sind, mit weißem Licht in einem bestimmten Winkel bestrahlt, wird ein Verbundstoff aus den Metallpartikeln und dem metallischen Film erhalten, der je nach Teilchengröße unterschiedliche Reflexionsspektren aufweist.
5 zeigt das Reflexionsspektrum, das abhängig ist von der Dielektrizitätskonstante des die Metallpartikel umgebenden Materials in der Ausführungsform des Sensors nach der vorliegenden Erfindung. Diese Abbildung zeigt als Beispiel die Messergebnisse für das Reflexionsspektrum, wenn ein Sensor mit einer Goldschicht von 20 nm Dicke auf Polystyrolkügelchen von 209 nm Durchmesser an der Luft verbleibt, und für das Reflexionsspektrum, wenn die Goldpartikeloberfläche des Sensors in Wasser eingetaucht wird. Aus dieser Abbildung ist ersichtlich, dass die maximale Absorption von einer Wellenlänge von 800 nm auf 870 nm verschoben wird, wenn die Goldpartikeloberfläche mit Wasser in Berührung kommt, das eine andere Dielektrizitätskonstante als Luft aufweist. Der geringe Unterschied in dem Spektrum für den Sensor mit Partikeln mit einem Durchmesser von 209 nm in 4 im Vergleich zu dem in 5 ist auf unterschiedliche Messbedingungen zurückzuführen; letzteres wurde mit einer Integrationskugel erhalten.
Die Änderung in dem Spektrum richtet sich nach der Änderung der Dielektrizitätskonstante in einem Bereich von mehreren Nanometern bis zu mehreren Hundert Nanometern von der Oberfläche des dünnen metallischen Films und ist sowohl schnell als auch umkehrbar. Dies wird nachstehend anhand von 6 und 7 beschrieben.
6 zeigt eine maximale Absorptionswellenlänge, die abhängig ist von der Oberflächenmodifikation der Goldpartikeloberflächen. In der Abbildung zeigt die horizontale Ach se die Art der auf den Goldpartikeloberflächen adsorbierten Moleküle und die vertikale Achse den Umfang der Gesamtverschiebung der maximalen Absorptionswellenlänge (Umfang der Änderung des Spektrums). Diese Daten gelten für den Fall, bei dem die Größe der Goldpartikel 110 nm beträgt und das Licht mit einem Winkel von 0 Grad abgestrahlt wird. Für diese Abbildung wurde zunächst die Wellenlänge ohne Oberflächenmodifikation (Spülen) gemessen, danach die nach Adsorption von Thiol (+THIOL), nach Adsorption von Biotin am Ende von Thiol (+BIOTIN) und nach Adsorption von Avidin am Ende von Biotin (+AVIDIN).
7 zeigt ein Beispiel für die zeitliche Änderung der maximalen Absorptionswellenlänge aufgrund der Adsorption von Octadecanthiol auf der Goldpartikeloberfläche bei einem Sensor nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Bei Eintauchen in reines Ethanol bleibt die maximale Absorptionswellenlänge der Goldpartikel konstant; wird aber Octadecanthiol (Konzentration 30 μm in Ethanol) zum Zeitpunkt 0 zugegeben, beginnt die Absorptionspeak-Wellenlänge sich zu ändern. Nach 2.500 Sekunden zeigt die maximale Absorptionswellenlänge eine Gesamtverschiebung von 6 nm. Es ist bekannt, dass Octadecanthiol eine dichte, aus einzelnen Molekülen bestehende Lage, als selbst assemblierte Monolage bezeichnet, auf Goldoberflächen bildet. Daher zeigen die vorstehenden Daten, dass der Sensor nach der vorliegenden Erfindung eine ausreichende Empfindlichkeit besitzt, um die Bildung einer aus einzelnen Molekülen bestehenden Lage zu registrieren, und dass die gewünschte Reaktion innerhalb von 100 Sekunden erhalten wird.
Weiter weist die Sensoroberfläche nach der vorliegenden Erfindung eine Monolage von auf einer Goldoberfläche adsorbierten Polymerkügelchen auf, wobei jedes Polymerkügelchen mit einem kappenförmigen Goldpartikel überzogen ist. Aufgrund der Wechselwirkung des lokalisierten Oberflächenplasmons der Goldpartikel und des sich ausbreitenden Oberflächenplasmons des dünnen Goldfilms kann ein empfindlicher Sensor realisiert werden, bei dem das Absorptionsspektrum größtenteils aufgrund der Änderung der Dielektrizitätskonstante in einem stärkeren elektrischen Feld variiert, wie durch die Berechnung in der vorstehend genannten Arbeit gezeigt (J. Vac. Sci. Technol., 2, 510, 1991).
ERSTE AUSFÜHRUNGSFORM
Ein Beispiel für die Messvorrichtung nach der vorliegenden Erfindung ist in 1 gezeigt. Die Vorrichtung weist einen Flüssigkeitskanal mit einer Metallplatte 1 und einem transparenten Substrat 2 auf beiden Seiten auf, und ein Verbundstoff 3 aus einem dünnen metallischen Film 41 und Mikrogoldpartikeln 5 ist auf die Metallplatte 1 aufgedampft. In der Abbildung ist ein Modifikationsfilm 42 nicht gezeigt. Der Verbundstoff 3 weist einen Aufbau auf, bei dem Gold 5 in einer Dicke von 5 nm bis 1.000 nm auf Polystyrolkügelchen mit einer Größe von 5 nm bis 100 μm aufgedampft ist, die nach dem in 3 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Das Substrat 40 des Verbundstoffs 3 kann die Metalloberfläche 1 bilden, ist aber vorzugsweise transparent, wie in 3 beschrieben. Es ist praktisch, wenn sich das Substrat 40 ohne weiteres von dem transparenten Substrat 2 abnehmen bzw. daran anbringen lässt, um einen schnellen Austausch entsprechend dem jeweils gemessenen Objekt zu ermöglichen.
Verschiedene Modifikationen können an den Goldpartikeloberflächen des Verbundstoffs 3 vorgenommen werden, und typische Modifikationen sind in 8 gezeigt. In 8A bis 8E, wie für 3 beschrieben, bezeichnet 40 das transparente Substrat, 41 den dünnen metallischen Film, der auf das Substrat aufgedampft ist, und 92 die Modifikationslage, die auf dem dünnen metallischen Film 41 gebildet ist. 8A zeigt den Fall, bei dem die Oberfläche der Mikrogoldpartikel des Verbundstoffs 3 durch einen Antikörper 60 modifiziert ist, 8B zeigt den Fall, bei dem die Oberfläche der Mikrogoldpartikel des Verbundstoffs 3 durch eine Nukleinsäure 61 modifiziert ist, 8C zeigt den Fall, bei dem die Oberfläche der Mikrogoldpartikel des Verbundstoffs 3 durch Zeolit 62 modifiziert ist, 8D zeigt den Fall, bei dem die Oberfläche der Mikrogoldpartikel des Verbundstoffs 3 durch einen Kationenaustauscher 63 modifiziert ist, und 8E zeigt den Fall, bei dem die Oberfläche der Mikrogoldpartikel des Verbundstoffs 3 durch einen Anionenaustauscher 64 modifiziert ist.
Nach dieser Ausführungsform wird monochromatisches Licht 7 von einer Lichtquelle 6 über das transparente Substrat 2 in einem optischen System 8A in den Flüssigkeitskanal eingeleitet, an den Oberflächen der Mikrogoldpartikel des Verbundstoffs 3 reflektiert und von einem Detektor 9 in einem optischen System 8B detektiert. Enthält eine Probenflüssigkeit 10, die in den Flüssigkeitskanal eingeleitet wird, ein Zielmolekül, für dessen Detektion die Oberfläche der Mikrogoldpartikel modifiziert ist, wird dieses selektiv adsorbiert. Da Änderungen im Reflexionsgrad des reflektierten monochromatischen Lichts 7 sehr empfindlich für den Zustand der Oberflächen der Mikrogoldpartikel des Verbundstoffs 3 sind, kann das Vorhandensein des Zielmoleküls nachgewiesen werden.
ZWEITE AUSFÜHRUNGSFORM
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist in 9 gezeigt. Hier ist ein Flüssigkeitskanal 71 mit oberen und unteren Metallplatten 70 versehen. Ein Verbundstoff 72 aus dem dünnen metallischen Film 41 und Mikrogoldpartikeln ist auf der Oberfläche der Metallplatte 70 über und unter dem Flüssigkeitskanal 71 ausgebildet. Auch bei diesem Beispiel ist die Modifikationslage 42 nicht gezeigt. Das Substrat des Verbundstoffs 72 kann die Metallplatte 70 sein, aber vorzugsweise handelt es sich um das transparente Substrat 40, wie in 3 gezeigt. Wie bei der Ausführungsform in 1 ist es insbesondere praktisch, wenn dieses als Standard für den Sensor vorgesehen ist und entsprechend der Än derung des zu messenden Objekts gewechselt wird. An der Oberfläche des Verbundstoffs 72 können verschiedene Modifikationen vorgenommen werden, wie bei den in 8A bis 8E gezeigten Beispielen.
Nach dieser Ausführungsform wird monochromatisches Licht 74 von einer Lichtquelle 73 von einem optischen System 75 durch ein transparentes Fenster 76 zu dem Verbundstoff 72 auf der Metallplatte geleitet und passiert nach mehrfachem Reflektieren an den oberen und unteren Verbundstoffen 72 ein transparentes Fenster 77, wo es von dem optischen System 75 einem Detektor 78 zugeführt und detektiert wird. Enthält eine Probenflüssigkeit 79, die in den Flüssigkeitskanal 71 eingeleitet wird, ein Zielmolekül entsprechend einer Oberflächenmodifikation der Mikrogoldpartikel des Verbundstoffs 3, wird dieses selektiv adsorbiert. Da Änderungen im Reflexionsgrad des reflektierten monochromatischen Lichts 7 sehr empfindlich für den Zustand der Oberflächen der Mikrogoldpartikel des Verbundstoffs 3 sind, kann so das Vorhandensein der Probe nachgewiesen werden.
Bei dieser Ausführungsform wird das monochromatische Licht 74 dem Detektor 78 zugeführt, nachdem es mehrfach an dem oberen und unteren Verbundstoff 72 reflektiert worden ist, so dass das Vorhandensein des Zielmoleküls mit einer höheren Genauigkeit nachgewiesen werden kann.
DRITTE AUSFÜHRUNGSFORM
Eine weitere Ausführungsform nach der Erfindung ist in 10A gezeigt. Die Vorrichtung umfasst eine Lichtquelle 80, eine mit der Lichtquelle 80 verbundene optische Faser 84, einen mit der optischen Faser 84 verbundenen Sensorkopf 81, eine über einen Koppler 82 mit der optischen Faser 84 verbundene optische Faser 84 und einen mit dieser verbundenen Detektor 83.
Der detaillierte Aufbau des Sensorkopfes 81 ist in 10B gezeigt. Der Sensorkopf 81 ist eine Kammer mit einem hohlen Teil, der auf die Spitze der optischen Faser 84 passt, und ein Verbundstoff 85 aus dem dünnen metallischen Film 41 und Mikrogoldpartikeln ist auf einer Innenfläche 86 des hohlen Teils der Kammer gebildet. Das von der Lichtquelle 80 über die optische Faser 84 weitergeleitete Licht wird auf den Verbundstoff 85 gestrahlt und teilweise als reflektiertes Licht 88 von dem Verbundstoff 85 reflektiert. Das reflektierte Licht 88 wird von dem Koppler 82 dem Detektor 83 zugeführt und detektiert. Eine Öffnung 89 zum Einbringen der Probenflüssigkeit ist in der Kammer 81 vorgesehen. Eine Probenflüssigkeit 90 wird über die Öffnung 89 eingebracht, wie durch die gestrichelte Linie angedeutet. An der Oberfläche des Verbundstoffs 85 können wie bei den vorherigen Ausführungsformen verschiedene Modifikationen vorgenommen werden, und ein in der durch die Öffnung 89 eingebrachten Probenflüssigkeit enthaltenes Zielmolekül kann auf der Oberfläche entsprechend der Modifikation des Verbundstoffs 85 adsorbiert werden. Erfolgt die Adsorption an der Oberfläche des Verbundstoffs 85, variiert das Reflexionsvermögen des monochromatischen Lichts 88 mit hoher Empfindlichkeit, so dass das Vorhandensein des Zielmoleküls in der Probenflüssigkeit 90 nachgewiesen werden kann.
Bei dieser Ausführungsform wird eine Faser verwendet, und weil eine Faser in einen engen Detektionsraum eingeführt werden kann, sind verschiedene Anwendungen möglich. Wird der Sensorkopf 81 für jedes zu messende Objekt ausgetauscht, kann eine Verunreinigung verhindert werden.
Außerdem können die Faser 84 und der Sensorkopf 81, von dem in 10C nur die Spitze gezeigt ist, einstückig mit einem Endoskop 91 zur Untersuchung lebender Organismen ausgebildet sein. Mit dieser Vorrichtung können eine bestimmte Position in einem Objekt mit dem Endoskop und eine bestimmte Probe an dieser Position untersucht werden. In diesem Fall können, auch wenn in der Abbildung nicht gezeigt, die normalerweise von einem Endoskop ausgeführten Steuerfunktionen zum Öffnen und Schließen der Öffnung 89 verwendet werden, über die die Probenflüssigkeit eingebracht wird.
VIERTE AUSFÜHRUNGSFORM
Eine weitere Ausführungsform nach der der vorliegenden Erfindung wird unter Bezugnahme auf 11A bis 11D und 12A bis 12D beschrieben.
Zunächst wurde ein dünner Goldfilm 100A von 5 nm bis 1.000 nm Dicke auf ein flaches Siliziumsubstrat 100 aufgedampft. Um die Oberfläche des dünnen Goldfilms hydrophil zu machen, wurde der Film mit einer Thiolmoleküllage 42 chemisch modifiziert, indem er mit einer Thiollösung mit einer Carboxyl- oder Aminoendgruppe wie zum Beispiel Thioglycolat oder 2-Aminoethanthiol behandelt wurde. Danach wurden in einer Carbodiimidlösung mit einer Konzentration von 0,01 bis 1 M suspendierte Polystyrolkügelchen mit einem Teilchendurchmesser von 5 nm bis 100 μm mit der dünnen metallischen Filmoberfläche 100A des Substrats 100 in Kontakt gebracht, um auf der dünnen metallischen Filmoberfläche eine Monolage von Polystyrolkügelchen zu bilden. Polystyrolkügelchen verschiedener Größen wurden in verschiedenen Bereichen 101, 102, 103 und 104 adsorbiert. Danach wurde Gold in einer Dicke von 5 nm bis 100 nm auf die adsorbierten Polystyrolkügelchen aufgedampft. Auf diese Weise wurde eine Sensoroberfläche mit Goldpartikeln verschiedener Größe in vier Regionen gebildet, wie in 11A gezeigt.
Die Oberfläche der Mikrogoldpartikel bei dieser Ausführungsform wurde mit Gold-Thiol-Chemie chemisch modifiziert. Eine Oberfläche 93 der Mikrogoldpartikel wurde in eine 10 mM wässrige Lösung von Thiolmolekülen 94 mit einer Aminogruppe wie zum Beispiel Aminoethanthiol eingetaucht, um die Oberfläche 93 der Partikel mit einer Aminogruppe zu modifizieren, wie in 12A gezeigt. Als Nächstes wurde mit N-Hydroxysuccinimid modifiziertes Biotin 95, suspendiert in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7 bis 9, mit Carbodiimid aktiviert und zu den zuvor mit einer Aminogruppe modifizierten Mikrogoldpartikeln zugegeben, wie in 12B gezeigt. Als Ergebnis wird eine Peptidbindung zwischen dem Carbonylkohlenstoff und der Aminogruppe gebildet, um die Oberfläche der Mikrogoldpartikel mit Biotin zu modifizieren. Als Nächstes wurde Avidin oder Streptoavidin 96 mit vier Bindungsstellen an das Biotin gebunden, wie in 12D gezeigt. Danach kann ein beliebiges biotinyliertes biologisches Molekül 97 wie zum Beispiel ein Protein, Ligand oder DNS an die Oberfläche der mit Avidin modifizierten Mikrogoldpartikel gebunden werden, wie in 12E gezeigt.
Als ein Beispiel für diese Oberflächenmodifikation sind in 11B mit einem Antikörper 107 chemisch modifizierte Mikrogoldpartikel 108 in einer Region 101 gebildet, während mit einem Liganden 105 chemisch modifizierte Mikrogoldpartikel 106 in einer Region 102 gebildet sind.
Wie in 11C gezeigt, wird das Siliziumsubstrat 100 mit den modifizierten Mikrogoldpartikeln in einem bestimmten Winkel von einer Lichtquelle 109 bestrahlt. Kollimiertes weißes Licht 111 von einem Kollimator 110 wird spiegelnd reflektiert, von einem optischen System 112 gebündelt, mit einem Beugungsgitter 113 spektral aufgeteilt und mit einem Detektor 114 detektiert.
Eine eine Probe 115 enthaltende Flüssigkeit wird auf das Siliziumsubstrat 100 geleitet, und wenn die Probe 115 selektiv zum Beispiel nur von dem Antikörper 107 in der Region 101 gebunden wird, ändert sich nur die Wellenlänge des für die Region 101 spezifischen Absorptionspeaks 116, und so kann die Probe 115 durch Beobachtung der Spektraländerung identifiziert werden.
11D zeigt schematisch ein Beispiel dieser Spektraländerung. Hier ist zu sehen, dass sich von den von den Regionen 101 bis 104 erfassten Spektralpeaks 116 bis 119 nur das Spektralpeak 116 in der Region 101, an die die Probe 115 gebunden ist, ändert, wie durch die gestrichelte Linie gezeigt.
Nach dieser Ausführungsform können, wenn mehrere Regionen auf einem Substrat ausgebildet sind und jede davon in geeigneter Weise modifiziert ist, mehrere Proben in einer Probenlösung gleichzeitig detektiert werden, so dass die in
7 beschriebene zeitabhängige Änderung auf 1/Anzahl der Regionen für jede Probe verringert werden kann.
FÜNFTE AUSFÜHRUNGSFORM
Eine weitere Ausführungsform nach der vorliegenden Erfindung ist in 13A und 13B gezeigt. Der Grundaufbau dieser Ausführungsform ist identisch mit der Beschreibung in Zusammenhang mit 9, aber um eine Verunreinigung der Proben auszuschließen, wenn eine große Anzahl von Proben gemessen wird, wird ein Aufbau verwendet, bei dem ein Sensorteil und ein optischer Detektionsteil voneinander getrennt werden können und der Sensorteil frei angebracht oder abgenommen werden kann, wie in 13A gezeigt, um so einen einfachen Austausch zu ermöglichen.
In dem Sensorteil ist ein Verbundstoff 130 aus Mikrogoldpartikeln und einem dünnen metallischen Film in einem Mikroflüssigkeitskanal 131 ausgebildet, in den eine Mikrokapillare 132 eingesteckt ist. Zusätzlich zu einer Lichtquelle 133, einem optischen System 135A und 135B und einem optischen Detektor 134 weist der optische Detektionsteil Bauteile zum Verbinden des Sensorteils mit dem optischen System auf. Wenn der Sensorteil in eine Verbindungsöffnung 136 des optischen Detektionsteils eingesteckt ist, gelangt Licht von der Lichtquelle 133 durch ein optisches Fenster 137A des Sensorteils, um den Verbundstoff 130 zu bestrahlen. Das reflektierte Licht gelangt durch ein optisches Fenster 137B und wird mit einem optischen Detektor 134 detektiert. Eine Dichtung 140 verhindert ein Auslaufen der Probenflüssigkeit.
Der optische Detektionsteil umfasst einen Mechanismus zum Aufnehmen der Probenflüssigkeit, das heißt die Verbindungsöffnung 136 ist mit einer Kammer 138 verbunden. Eine Piezoeinrichtung 139 ist an der Kammer 138 angebracht. Durch Anlegen einer Impulsspannung an die Piezoeinrichtung wird das Volumen der Kammer 138 plötzlich verringert und dann wiederhergestellt, so dass der Druck in der Kammer 138 impulsartig verringert wird, wodurch die Probenlösung von außen in den Sensorteil eingesaugt wird.
In dem Sensorteil 143 und dem optischen Detektionsteil 144 sind mehrere Kanäle ausgebildet, wie in 13B gezeigt, so dass mehrere Probenlösungen 142 in Probenlösungsöffnungen 141 gleichzeitig angesaugt und gemessen werden können. Wenn der Sensorteil 143 für jede Probenlösung ausgewechselt wird, können nach diesem Aufbau Fehler aufgrund einer Verunreinigung zwischen Probenlösungen ohne weiteres verhindert werden.

Claims

Sensor mit einem flachen Substrat (40), einer Lage (44) isolierender Elemente (43) aus einem Polymer oder einem Nichtmetall, die im wesentlichen gleichförmig auf dem Substrat angeordnet sind, eine dünne Mikropartikel-Metallage, die freie Elektronen aufweist und im wesentlichen über der Hälfte der äußeren Oberfläche der isolierenden Elemente (43) auf der dem Substrat gegenüberliegenden Seite ausgebildet ist, und ein dünner metallischer Film (41) auf dem Substrat (40), dadurch gekennzeichnet, daß die isolierenden Elemente (43) die Form von Kügelchen aufweisen, und der dünne metallische Film (41) zwischen dem Substrat (40) und der Lage (44) isolierender Kügelchen ausgebildet ist.
Sensor nach Anspruch 1, wobei die Lage (44) aus isolierenden Kügelchen (43) aus Polymer oder einem Nichtmetall ferner umfaßt: ein Isoliermaterial, das ein Polymer einschließlich Polystyrol, Styrol/Butadien, Polyvinyltoluol, Styrol/Divinylbenzol oder Vinyltoluol/T-Butylstyrol mit im wesentlichen einem monodispersen Durchmesser von 5 nm bis 100 μm, oder ein Nichtmetall einschließlich Silizium, Siliziumoxid, Galliumarsenid oder Glas darstellt, und die freie Elektronen aufweisende dünne Mikropartikel-Metallage aus Gold, Silber, Kupfer oder Aluminium von 1 nm bis 100 μm Dicke besteht.
Sensor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Oberfläche des dünnen metallischen Films (41) durch Thiol, Disulfid oder Sulfid modifiziert ist, um eine freie Elektronen aufweisende dünne Mikropartikel-Metallage (42) auf seiner oberen Fläche zu bilden, und die isolierenden Kügelchen (43) auf der Oberfläche des dünnen metallischen Films adsorbiert sind.
Messvorrichtung mit dem Sensor eines der vorhergehenden Ansprüche, einem optischen System (6, 8A, 8B, 9) zur Bestrahlung der freie Elektronen aufweisenden dünnen Mikropartikel-Metallage mit Licht unter einem festgelegten Winkel, und zum Detektieren des von der freie Elektronen aufweisenden dünnen Mikropartikel-Metallage reflektierten Lichts, und Mittel zur Zuführung einer Probenlösung (10) zu der freie Elektronen aufweisenden dünnen Mikropartikel-Metallage.
Messvorrichtung mit einer Mehrzahl unabhängiger Sensoren, jeweils nach einem der Ansprüche 1 bis 3, einer Mehrzahl optischer Systeme (6, 8A, 8B, 9) zur Bestrahlung der freie Elektronen aufweisenden dünnen Mikropartikel-Metallagen der Mehrzahl unabhängiger Sensoren mit Licht unter einem festgelegten Winkel, und zum Detektieren des von den freie Elektronen aufweisenden dünnen Mikropartikel-Metallagen reflektierten Lichts, und eine Mehrzahl von unabhängigen Mitteln zur Zuführung von Probenlösungen (10) zu den freie Elektronen aufweisenden dünnen Mikropartikel-Metallagen der Mehrzahl unabhängiger Sensoren.
Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei das Mittel zur Bereitstellung der Probenlösungen ein mit den Sensoren verbundenes Lösungsaufnahmemittel (138) ist, das eine Volumenänderung eines Raums durch den piezoelektrischen Effekt einer Piezoeinrichtung (139) benutzt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das optische System (134) zum Detektieren des reflektierten Lichts dazu eingerichtet ist, eine spektrale Änderung des Lichts oder eine Änderung der Reflexion des Lichts zu detektieren.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei die freie Elektronen aufweisende Mikropartikel-Metallage durch ein Molekül modifiziert ist, das zur selektiven Kombination mit einem bestimmten Bestandteil in der Probenlösung ausgelegt ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei die Modifikation der freie Elektronen aufweisenden Mikropartikel-Metallage durch einen Antikörper, ein Protein einschließlich einem Rezeptor, oder eine Nukleinsäure einschließlich einer DNS ausgeführt ist, die die Fähigkeit zur selektiven Verbindung mit dem spezifischen Bestandteil aufweisen.