DE4200088A1 - Verfahren und vorrichtung zum nachweis physikalisch-chemischer oder biochemischer wechselwirkungen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis physikalischer, chemischer, biochemischer und biolo­ gischer Vorgänge.

Im Laufe der Zeit ist bereits eine Vielzahl optischer Meßme­ thoden zum Nachweis verschiedenster Vorgänge aus dem physika­ lisch-chemischen und auch biochemischen Bereich entwickelt worden. Diese Methoden haben sich teilweise auch Interferenz­ erscheinungen, d. h. die Überlagerung zweier oder mehrerer Lichtstrahlen, zunutze gemacht.

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, der Messung von Inter­ ferenzerscheinungen neue Einsatzgebiete zu erschließen. Dabei sollen physikalisch-chemische, biochemische und biologische Vorgänge auf möglichst einfache Weise nachweisbar sein.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, bei dem Licht geeigneter Wellenlänge oder eines geeigneten Spektralbereichs auf eine Probe eingestrahlt wird, an der der nachzuweisende Vorgang an und/oder in mindestens einer dünnen Schicht aus mindestens teilweise optisch transparentem Material abläuft, und dabei die durch den genannten Vorgang hervorgerufenen Interferenzerscheinungen gemessen werden.

An einer dünnen Schicht, wie beispielsweise einer Membran, einer Folie oder einem Film, die mindestens teilweise optisch transparent ist, treten durch Überlagerung zweier oder mehre­ rer Teilstrahlen Interferenzerscheinungen auf, wenn die folgenden Bedingungen erfüllt sind:

• 1. Im betrachteten Spektralbereich muß ein Teil des Lichts an den Phasengrenzen der dünnen Schicht reflektiert wer­ den. Dies wird beispielsweise durch einen ausreichenden Unterschied in der Brechzahl im Vergleich zum Nachbarme­ dium oder durch eine Teilverspiegelung erreicht.
• 2. Die Grenzflächen müssen ausreichend eben und parallel angeordnet sein.
• 3. Der Gangunterschied der Teil strahlen muß kleiner als die Kohärenzlänge des verwendeten Lichts sein.

Durch das Verfahren nach der Erfindung wird der Nachweis einer Vielzahl von physikalischen, chemischen, biochemischen und biologischen Vorgängen möglich. Die nachgewiesenen Inter­ ferenzerscheinungen können beispielsweise auf einen Volumen­ effekt in der dünnen Schicht, der durch Sorption eines Stof­ fes hervorgerufen wird, zurückzuführen sein. Weiter ist es möglich, Interferenzen zu messen, die durch Adsorption von Stoffen oder Spezies an der Oberfläche der dünnen Schicht hervorgerufen werden. Bei den Ausführungsformen der Erfindung ist eine Linearität der Meßergebnisse über einen großen Be­ reich gegeben. Die Erfindung bietet weiterhin den Vorteil, daß die erhaltenen Daten on-line erfaßt und ausgewertet wer­ den können.

Die Interferenzerscheinungen können sowohl an den transmit­ tierten als auch an den reflektierten Teilstrahlen beobachtet werden. Es ist vorteilhaft, wenn die Interferenz in Reflexion gemessen wird. Auf diese Weise kann der nachzuweisende Vor­ gang an einer Seite oder innerhalb der dünnen Schicht ablau­ fen, während von der anderen Seite das Licht eingestrahlt und die reflektierten Teilstrahlen detektiert werden. Dies ermög­ licht eine einfache Durchführung des Verfahrens, da die zur Durchführung des Verfahrens nötigen Geräte auf gegenüberlie­ genden Seiten der Probe angeordnet werden können.

Der Einfall des eingestrahlten Lichts auf die dünne Schicht erfolgt im wesentlichen senkrecht. Dadurch sind durch Bre­ chung oder Polarisation hervorgerufene Effekte auszuschließen oder vernachlässigbar. Als eingestrahltes Licht wird insbe­ sondere Weißlicht, wie beispielsweise das Licht einer Xenon­ hochdrucklampe verwendet. Nach der Erfindung sind aber alle möglichen Lichtquellen, wie monochromatische Lichtquellen, Linienstrahler und andere Kontinuumsstrahler einsetzbar. Da­ bei können die Lichtquellen kontinuierlich oder gepulst be­ trieben werden. Die gemessenen Interferenzerscheinungen kön­ nen als sog. optische Schichtdicke(nänderung) interpretiert und vorzugsweise auch dargestellt werden. Dabei läßt sich die absolute optische Schichtdicke beispielsweise aus der spek­ tralen Lage der Interferenzextrema und deren Abständen von­ einander berechnen. Auch aus der Intensitätsänderung bei einer oder mehreren Wellenlängen läßt sich die optische Schichtdicke bestimmen.

Unter "dünnen Schichten" nach der Erfindung sind solche zu verstehen, deren Schichtdicke in der Größenordnung der Wel­ lenlänge des eingestrahlten Lichts liegt. Dabei sollte die doppelte Schichtdicke kleiner als die Kohärenzlänge des Lichts sein. Dies hat zur Folge, daß mit Licht hoher Kohärenz dickere Schichten vermessen werden können als mit Licht ge­ ringerer Kohärenz. Typische Schichtdicken der dünnen Schich­ ten liegen im Bereich zwischen 0,3 µm und 10 µm, wobei eine Obergrenze von 5 µm, insbesondere 2 µm bevorzugt ist.

Als Detektoren sind bei der Erfindung alle üblichen Systeme zur spektralen und/oder monochromatischen Messung von Licht­ intensitäten geeignet, wie beispielsweise Photohalbleiter, Photomultiplier u. a. Die Spektrometersysteme sind beispiels­ weise Systeme aus Monochromator und Detektor, Polychromato­ ren, Diodenarraydetektoren und dergleichen.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform nach der Erfindung wird der nachzuweisende Vorgang durch eine Wechselwirkung zwischen mindestens zwei Spezies hervorgerufen. Dabei soll der Begriff "Spezies" umfassend zu verstehen sein. Im Bereich der Biolo­ gie kann es sich um Organismen, im Bereich der Biochemie um beliebige Stoffe, wie beispielsweise Enzyme, Antikörper und dergleichen sowie im Bereich der Chemie und Physik um Atome oder Moleküle handeln. Voraussetzung ist, daß die Wechsel­ wirkungen zu Änderungen von Interferenzerscheinungen bei ein­ gestrahlten Lichtstrahlen geeigneter Wellenlänge oder eines geeigneten Spektralbereiches fuhren. Besonders geeignet ist das Verfahren zum insbesondere direkten Nachweis von Vorgän­ gen, die auf die Wechselwirkung zwischen mindestens zwei biochemischen Spezies zurückzuführen sind.

Besonders vorteilhaft ist das Verfahren nach der Erfindung bei der Verfolgung von Immunreaktionen und den zugrundelie­ genden Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen. Bekanntlich die­ nen Antikörper im Organismus höherer Tiere zur Unterschei­ dung und Erkennung von Fremdsubstanzen. Eine erworbene Immu­ nität gegen Infektionskrankheiten beruht unter anderem auf der Bildung spezifischer Antikörper gegen den jeweiligen Erreger. Antikörper sind größere Proteine und treten in ver­ schiedenen Untertypen auf. Jeder Antikörper erkennt mit hoher Selektivität eine spezifische Struktur, nämlich das zugehöri­ ge Antigen oder einen spezifischen Teil eines größeren Anti­ gens. Unter geeigneten Bedingungen bilden Antigen und Anti­ körper einen stabilen Antigen-Antikörper-Komplex. Aufgrund dieser Tatsache bilden Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen schon seit geraumer Zeit die Grundlage für eine große Zahl analytischer Verfahren, die unter dem Oberbegriff "Immuno­ assays" zusammengefaßt werden.

Von den Immunoassays existiert eine Vielzahl von Varianten. Im Normalfall wird das Antigen durch Adsorption an ein Sub­ strat gebunden und nicht gebundene Substanzen in einem Wasch­ schritt entfernt. Anschließend wird im Überschuß ein Antikör­ per zugegeben, der das gesuchte Antigen spezifisch erkennt. Nicht gebundener Antikörper wird ebenfalls abgewaschen. Die Menge an gebundenem Antikörper ist daher ein Maß für die Menge an Antigen in der Probe. Zum Nachweis der gebundenen Antikörpermenge muß der Antikörper bisher mit einer geeigne­ ten Markierung versehen werden. Eine solche Markierung er­ folgt mit radioaktiven Substanzen (Radio-Immunoassay), mit Fluoreszenzfarbstoffen (Fluoreszenz-Immunoassay) oder mit Enzymen (Enzym-Immunoassay).

Wird das Verfahren nach der Erfindung zum Nachweis von Anti­ gen-Antikörper-Wechselwirkungen eingesetzt, ist keine Markie­ rung erforderlich. Dadurch wird es möglich, die eigentliche Antigen-Antikörperreaktion kontinuierlich und ggf. on-line zu verfolgen. Dies ist bei den bisherigen Methoden nicht mög­ lich, da das gemessene Signal erst in einer Sekundär- oder Tertiärreaktion gebildet wird. Weiterhin ist das erfindungs­ gemäße Verfahren im Vergleich zu herkömmlichen Immunoassays wesentlich schneller durchzuführen und durch Verzicht auf speziell markierte Komponenten sinken die Kosten zur Durch­ führung des Verfahrens.

Die dünne Schicht bei der Erfindung wird insbesondere minde­ stens teilweise von einer Trägerschicht gebildet, wobei der nachzuweisende Vorgang vorzugsweise an und/oder in der Trä­ gerschicht abläuft. Die Trägerschicht kann zur Erzeugung der Interferenzerscheinungen durch Überlagerung zweier oder meh­ rerer Teilstrahlen in Transmission und/oder in Reflexion dienen. Sie kann auch das Substrat zur weiteren Beschichtung mit sensoraktivem Material oder zur Ankopplung einer geeigne­ ten Spezies, die an dem nachzuweisenden Vorgang beteiligt ist, sein. Bei der Trägerschicht handelt es sich vorzugs­ weise um eine Polymerschicht oder um eine Schicht oder einen Film, der aus organischem oder anorganischem Material beste­ hen kann. Bei Verwendung von organischen Polymerschichten ist beispielsweise eine Schicht aus Polystyrol zum Nachweis von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen besonders geeignet. Bei Verwendung von anorganischen Schichten können vorzugsweise Substanzen verwendet werden, die sich in ihrer Brechzahl hinreichend von der Brechzahl der angrenzenden Medien unter­ scheidet. Insbesondere können abgeschiedene Schichten aus anorganischen Oxiden oder Nitriden, wie beispielsweise SiO₂, Si-nitrid, Aluminiumoxid, Titanoxid, verwendet werden. Die Abscheidung kann beispielsweise durch CVD (chemical vapour deposition) erfolgen.

Es ist vorteilhaft, wenn die Trägerschicht auf eine Unterla­ ge, insbesondere aus mindestens teilweise optisch transparen­ tem Material, aufgebracht ist. Die Unterlage dient dabei der mechanischen Stabilisierung sowie der Weiterleitung des Lichts und kann auch die Funktion einer Reflexionsgrenz­ schicht übernehmen. Geeignete Unterlagen sind beispielsweise Plättchen aus Glas, Quarz, Saphir usw. Als Unterlage kann jedoch auch das Ende eines Lichtleiters, die Oberfläche einer Lichtquelle sowie die Oberfläche von Detektoren oder anderen optischen Bauelementen, wie beispielsweise Spiegeln, Halblei­ teroberflächen u. a. dienen.

Zwischen der Trägerschicht und der Unterlage können weitere Schichten, insbesondere mit reflexionsverstärkenden Eigen­ schaften, vorgesehen sein. Reflexionsverstärkende Schichten dienen der Verringerung der spektralen Bandbreite der Trans­ mission oder Reflexion der interferenzerzeugenden Schicht durch Erhöhung des Reflexionsgrades an den Phasengrenzen. Solche Schichten werden beispielsweise durch Aufdampfung von Metallen oder durch Verspiegelung mit Dielektrika herge­ stellt.

Es ist nach der Erfindung bevorzugt, wenn eine der Spezies, deren Wechselwirkung mit mindestens einer anderen Spezies beobachtet wird, in und/oder an der Trägerschicht chemisch oder physikalisch gebunden ist. Eine solche Bindung besteht vorzugsweise in einer Adsorption der Spezies an der Oberflä­ che der Trägerschicht. Dadurch ist eine der wechselwirkenden Spezies definiert an der Oberfläche gebunden, so daß eine Wechselwirkung mit weiteren Spezies und damit der Nachweis des zu untersuchenden Vorgangs wesentlich vereinfacht wird. So kann beim Nachweis einer Antigen-Antikörper-Wechselwirkung beispielsweise das Antigen auf der Oberfläche einer Polysty­ rolschicht absorbiert sein und definiert mit einem spezifi­ schen Antikörper reagieren.

In besonderen Fällen kann das Verfahren nach der Erfindung direkt auf der Unterlage durchgeführt werden. In diesen Fällen kann auf eine besondere Trägerschicht verzichtet werden. Die Unterlage selbst übernimmt die Funktion der Trägerschicht.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung liegt vor, wenn als Unterlage ein handelsübliches oder ein gering­ fügig modifiziertes Interferenzfilter eingesetzt wird. Solche Interferenzfilter sind käuflich zu erwerben und haben die Eigenschaft, nur bestimmte Wellenlängen oder Wellenlängenbe­ reiche durchzulassen. Normalerweise sind diese Interferenz­ filter aus mehreren Schichten aufgebaut, wobei entweder meh­ rere Metallschichten (Metallinterferenzfilter) oder dünne Schichten von abwechselnd hoher und niedriger Brechzahl vor­ handen sind. An ihren Oberflächen besitzen die Interferenz­ filter meist Glasschichten und/oder Farbgläser (sog. Kanten­ filter), die unerwünschte Wellenlängenbereiche ausblenden. Diese Schichten können ggf. entfernt und damit das Interfe­ renzfilter für den Einsatz nach der Erfindung (geringfügig) modifiziert werden. Mit solchen handelsüblichen Interferenz­ filtern kann das Verfahren nach der Erfindung besonders ein­ fach und kostengünstig durchgeführt werden.

Eine Vorrichtung zum Nachweis physikalischer, chemischer, biochemischer und biologischer Vorgänge weist eine Lichtquel­ le, insbesondere eine Xenonhochdrucklampe, eine Probenein­ richtung, an der der zu untersuchende Vorgang durchgeführt werden kann, sowie einen Detektor und eine Auswerteeinrich­ tung, die vorzugsweise einen Computer enthält, auf. Eine solche Vorrichtung ist insbesondere zur Durchführung des be­ reits beschriebenen Verfahrens geeignet.

Die genannte Vorrichtung zeigt vorzugsweise zusätzlich einen Y-Lichtleiter. Dabei dient der erste Arm des Lichtleiters zum Einstrahlen des Lichts auf die Probeneinrichtung und der zweite Arm des Lichtleiters führt den, insbesondere reflek­ tierten Anteil des Lichts zum Detektor. Durch die Verwendung eines Y-Lichtleiters kann auch auf einfache Weise eine im wesentlichen senkrechte Einstrahlung und Detektion des Lichts erfolgen.

Die Probeneinrichtung besteht zweckmäßig aus einer Unterlage, insbesondere aus Glas, sowie einer Trägerschicht, an der der nachzuwelsende Vorgang abläuft. Bei der Trägerschicht handelt es sich vorzugsweise um eine Polymerschicht oder eine anorga­ nische Schicht. Die Schichten sind beispielsweise so ausge­ bildet, daß sie zum Nachweis einer Antigen-Antikörper-Wech­ selwirkung das Antigen adsorbieren können. Es ist bevorzugt, wenn als Unterlage ein handelsübliches Interferenzfilter vorgesehen ist.

Die Vorrichtung nach der Erfindung benötigt keine aufwendigen mechanischen Bauteile, wie sie bei vielen optischen Nachweis­ geräten erforderlich sind. So ist beispielsweise im Normal­ fall keine Winkelverstellung einfallender und/oder ausfallen­ der Lichtstrahlen nötig.

Die Erfindung betrifft weiterhin einen optischen Sensor oder Meßkopf, der aus einer Unterlage, insbesondere einer Glasun­ terlage, sowie einer Trägerschicht, insbesondere einer Poly­ merschicht oder einer anorganischen Schicht, besteht. An der Trägerschicht des optischen Sensors läuft der Vorgang ab, der nachgewiesen werden soll. Als Unterlage kann vorzugsweise ein handelsübliches Interferenzfilter vorgesehen sein. Dabei kann in besonderen Fällen auf die Trägerschicht verzichtet werden, so daß sich der nachzuweisende Vorgang an dem Interferenzfil­ ter, d. h. an der Unterlage selbst, abspielt.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung eines handelsüblichen Interferenzfilters zur Herstellung eines optischen Sensors. Dabei wird das Interferenzfilter insbeson­ dere als Unterlage für eine Schicht benutzt, in und/oder an der ein nachzuweisender physikalisch-chemischer, biochemi­ scher und/oder biologischer Vorgang abläuft. In besonderen Fällen ist es vorteilhaft, wenn der Vorgang an der Oberfläche des Interferenzfilters selbst abläuft. In diesen Fällen kann ein optischer Sensor auf besonders einfache Weise hergestellt und zum Nachweis und zur Untersuchung der genannten Vorgänge verwendet werden.

Die beschriebenen Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzug­ ten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 den schematischen Aufbau einer Nachweisvor­ richtung nach der Erfindung, und

Fig. 2 den Verlauf eines Immunoassays durch Bestim­ mung der optischen Schichtdicke mittels Mes­ sung der Interferenz.

In Fig. 1 ist ein Meßaufbau zur Interferenzmessung nach der Erfindung schematisch dargestellt. Die Vorrichtung 1 besteht im wesentlichen aus einer Lichtquelle 2, wie beispielsweise einer Xenonhochdrucklampe, einer Probeneinrichtung 3, einem Detektor 4 und einer Auswerteeinrichtung 5. Die Auswerteein­ richtung 5 enthält einen Computer 6 zur Erfassung und Auswer­ tung der gemessenen Daten. Die Lichtquelle 2 und der Detektor 4 stehen über einen Y-Lichtleiter 7 mit der Probeneinrichtung 3 in Verbindung. Über den ersten Arm 8 des Y-Lichtleiters 7 wird das Licht auf die Probeneinrichtung 3 geschickt und der reflektierte Anteil des Lichts über den zweiten Arm 9 des Lichtleiters 7 zum Detektor 4 geführt. Der Detektor 4 kann beispielsweise ein sog. Diodenarray mit 512 Dioden sein. In diesem Fall wird die Änderung der Transmission oder Reflexion über die spektrale Verschiebung des gesamten Transmissions­ bzw. Reflexionsspektrums detektiert. In dem in Fig. 1 darge­ stellten Fall werden die Interferenzerscheinungen in Refle­ xion gemessen. Nach der Erfindung ist es aber in gleicher Weise möglich, die Interferenzerscheinungen in Transmission zu detektieren. Weiterhin können die Interferenzerscheinungen über Intensitätsänderungen bei einer oder mehreren Wellenlän­ gen (monochromatisch) detektiert werden.

Die in Fig. 1 dargestellte Probeneinrichtung 3 zeigt eine Unterlage 10 sowie eine Trägerschicht 11. Bei der Unterlage kann es sich beispielsweise um ein Glasplättchen mit einer Dicke von ca. 1 mm, ein handelsübliches Interferenzfilter, das Ende des Lichtleiters 7 oder um andere geeignete Substra­ te handeln, wie sie in der Beschreibung aufgeführt sind. Die Trägerschicht 11 ist beispielsweise ein Polymerfilm mit einer Stärke von 1 µm, an dem der nachzuweisende Vorgang stattfin­ det. Das auf die Probeneinrichtung 3 gerichtete Ende des Lichtleiters 7 ist so angeordnet, daß es einen im wesentli­ chen senkrechten Einfall des Lichts auf die einzelnen Schich­ ten der Probeneinrichtung 3 ermöglicht. Damit können störende Effekte, die auf Brechungen und Polarisationen zurückzuführen sind, weitgehend vernachlässigt oder ausgeschlossen werden. Der in Fig. 1 ebenfalls dargestellte Pfeil deutet den nachzu­ weisenden Vorgang an, der sich in der Probeneinrichtung 3 ab­ spielt.

Das aus der Lichtquelle 2 über den ersten Arm 8 des Lichtlei­ ters 7 auf die Probeneinrichtung 3 einfallende Licht wird an den einzelnen Grenzflächen der Schichten der Probeneinrich­ tung 3 reflektiert. Wenn die Kohärenzbedingung erfüllt ist, kommt es zur Überlagerung der Teilstrahlen, die entweder konstruktiv oder destruktiv sind. Die Lage der Maxima und Minima hängt von der Wellenlänge sowie von der Schichtdicke und der Brechzahl der Substanzen auf der Unterlage bzw. dem Polymerfilm ab. Ändert sich nun die optische Schichtdicke durch den zu untersuchenden Vorgang, wird eine Verschiebung der Interferenzmuster beobachtet. Mit den unter Zuhilfenahme des Computers 6 durchgeführten Auswerteverfahren kann aus dieser Verschiebung der Interferenzmuster die Änderung der optischen Schichtdicke bestimmt werden. Solche Auswertungen können sowohl auf der Bestimmung der Änderung der Transmis­ sion oder Reflexion bei einzelnen Wellenlängen oder der Verschiebung des Transmissions- oder Reflexionsspektrums beruhen.

Beispiel 1

Mit der in Fig. 1 dargestellten Meßvorrichtung wird die Im­ munreaktion zwischen Rinder-Serum-Albumin-(RSA) und Anti- RSA auf einer Trägerschicht von Polysiloxan untersucht. Dabei wird auf einem Quarzglasplättchen mit einer Dicke von 1 mm ein Polysiloxanfilm (Silgel 604 von Wacker-Chemie, Burghau­ sen) in einer Dicke von 1 µm aufgebracht. Diese Trägerschicht wird mit Anti-RSA beschichtet. Dann wird RSA in 0,1 µg/ml Pufferlösung zugegeben. Das Interferenzspektrum wird vor und nach der Zugabe des RSA bestimmt. Es zeigt sich eine deutli­ che Veränderung in der Lage des Maximums und in der Amplitude der Interferenz.

Aus der Intensitätsänderung eines ausgewählten Interferenzma­ ximums wird eine Änderung der optischen Schichtdicke be­ stimmt. Der erhaltene Wert für die Schichtdickenänderung liegt innerhalb des Bereichs, wie sie für Antigen-Antikörper- Wechselwirkungen erwartet werden. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, daß die Schichtdicke bereits nach einem Zeitraum von 20 Minuten im wesentlichen konstant ist. Damit kann die Untersuchung der Immunreaktion wesentlich schneller durchge­ führt werden als dies bei üblichen Immunoassays der Fall ist.

Die Genauigkeit und die Reproduzierbarkeit der Messungen ist besonders hoch, wenn die Schichtdicke von Polymerschicht plus Antigen-Antikörper-Schichten nach durchgeführter Immunreak­ tion zwischen 1 und 2 µm liegt. Eine Gesamtschichtdicke von ca. 1,5 µm ist besonders vorteilhaft. Durch Variation der Dicke der Polymerschicht kann die Gesamtschichtdicke in den optimalen Bereich gebracht werden.

Beispiel 2

Mit der in Fig. 1 dargestellten Meßvorrichtung wurde ein weiteres Immunoassay durchgeführt. Als Antigen wurde ein synthetisches Fragment aus dem Hüllprotein des Maul- und Klauenseuche-Virus eingesetzt. Zum Blockieren freigebliebener Bindungsstellen wurde Kollagenlösung eingesetzt. Als Antikör­ per wurde zunächst ein unspezifischer und anschließend ein spezifischer monoklonaler Antikörper untersucht. Das Antigen wurde auf einem Polystyrolfilm adsorbiert. Die Schichtdicke bzw. die Änderung der Schichtdicke wurde in festen Zeitab­ ständen untersucht.

Die Messung aller Reaktionsschritte wurde so durchgeführt, daß die Messung jeweils so lange fortgesetzt wurde bis ein stabiles Signal und damit eine gleichbleibende optische Schichtdicke vorhanden war. Nach jeder Zugabe wurde bis zum Einstellen einer konstanten Schichtdicke gewartet. Der Ver­ lauf der Reaktion ist aus Fig. 2 zu ersehen.

Auf eine Unterlage aus Quarzglas mit einer Dicke von 1 mm wurde eine Polystyrolschicht aufgebracht. Diese Polystyrol­ schicht wurde mit Antigen belegt und die noch freien Stellen auf der Oberfläche anschließend mit Kollagen blockiert. Dann wurde zuerst ein unspezifischer und in einem zweiten Versuch ein spezifischer Antikörper zugegeben. Wie bereits ausge­ führt, wurden alle Reaktionsschritte bis zur gleichbleibenden Schichtdicke verfolgt und nach jeder Proteinzugabe bis zum Einstellen einer konstanten Schichtdicke abgewartet. An­ schließend wurde in jedem Fall mit Pufferlösung gespült, bis sich wiederum eine konstante Schichtdicke ergab. Nach jeder Proteinzugabe zeigte sich eine Schichtdickenzunahme von einigen Nanometer (nm) über einen Zeitraum von ca. 20 Minu­ ten. Bei den nachfolgenden Waschschritten nahm die gemessene Schichtdicke regelmäßig binnen weniger Minuten wieder ab. Nach der Adsorption des Antigens und nach der Zugabe eines Blockierungsproteins (Kollagen) verblieb auch nach dem Wasch­ schritt eine Nettozunahme der Schichtdicke. Wie Fig. 2 zeigt, liegt die Zunahme der optischen Schichtdicke von ca. 4 nm gut innerhalb des Erwartungsbereichs für eine weitgehend ge­ schlossene Protein-Monolayer. Bei der Zugabe der Antikörper ergab sich sowohl für den unspezifischen als auch für den spezifischen Antikörper eine Zunahme der optischen Schicht­ dicke. Für den spezifischen Antikörper war jedoch die Ände­ rung der optischen Schichtdicke deutlich größer. Zudem war die Schichtdicke bei dem unspezifischen Antikörper bei Puf­ ferzugabe vollständig reversibel, während beim spezifischen Antikörper eine unter den gewählten Bedingungen stabile Änderung der optischen Schichtdicke von ca. 1,8 nm erhalten wurde. Die bei Beispiel 2 gemessenen Reaktionszeiten für die Antigen-Antikörper-Reaktion liegen mit ca. 20 Minuten deut­ lich unterhalb der Inkubationszeiten im Stundenbereich wie sie bei üblichen Immunoassays, wie beispielsweise ELISA erhalten werden. Es zeigt sich auch der Vorteil des Blockie­ rungsschrittes bei Festphasen-Adsorptionsassays durch die Netto-Schichtdickenänderung bei Zugabe eines Blockierungs­ proteins. Die Erfindung liefert somit ein relativ einfaches Verfahren, das eine kontinuierliche Verfolgung der Antigen- Antikörper-Wechselwirkung bei niedrigen Kosten ermöglicht. Außerdem handelt es sich bei dem Verfahren nach der Erfindung um ein on-line-Verfahren.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wurde die Einsatzmöglichkeit der Erfindung zum Nachweis von Kohlenwasserstoffen in einer dünnen Polymer­ schicht untersucht. Dazu wurde auf ein handelsübliches Inter­ ferenzfilter ein Polysiloxanfilm aufgebracht. Die so erhalte­ ne Probeneinrichtung wurde in die in Fig. 1 dargestellte Meß­ vorrichtung eingebracht. Um die Einsatzfähigkeit der Proben­ einrichtung als Sensor für Kohlenwasserstoffe aufzuzeigen, wurde die Probeneinrichtung mit verschiedenen Kohlenwasser­ stoffen, wie beispielsweise Ether, n-Pentan, n-Hexan, n-Hep­ tan in Berührung gebracht. Bei allen Stoffen zeigte sich eine deutliche Verschiebung des Interferenzspektrums unter Einfluß der genannten Kohlenwasserstoffe. Nach Kalibrierung des Sy­ stems bestand sich über einen weiten Bereich ein guter linea­ rer Zusammenhang zwischen der relativen Änderung der opti­ schen Schichtdicke und der Menge der verwendeten Substanzen. Ein Nachweis der Kohlenwasserstoffe ist sowohl aus der Gas­ phase als auch aus flüssigen Systemen, wie beispielsweise aus wäßriger Phase, möglich.

Claims (26)

1. Verfahren zum Nachweis physikalischer, chemischer, bio­ chemischer und biologischer Vorgänge, bei dem Licht ge­ eigneter Wellenlänge oder eines geeigneten Spektralbe­ reiches auf eine Probe, an der der Vorgang an und/oder in mindestens einer dünnen Schicht aus mindestens teil­ weise optisch transparentem Material abläuft, einge­ strahlt wird und dabei die durch den genannten Vorgang hervorgerufenen Interferenzerscheinungen gemessen wer­ den.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Interferenzerscheinungen an den reflektierten Teil­ strahlen gemessen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß das Licht relativ zur Oberfläche der dünnen Schicht im wesentlichen senkrecht eingestrahlt wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Weißlicht, insbesondere Licht einer Xenonhochdrucklampe, eingestrahlt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß erhaltene Meßwerte als Änderung der optischen Schichtdicke der dünnen Schicht Interpretiert und ggf. dargestellt werden.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Phasenverschiebung des Interferenzspektrums und/oder Intensitätsänderungen bei einer oder mehreren Wellenlängen gemessen werden.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der nachzuweisende Vorgang auf der Wechselwirkung von mindestens zwei Spezies beruht.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Vorgang auf der Wechsel­ wirkung von mindestens zwei biochemischen Spezies be­ ruht.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Vorgang um eine Antigen-Antikörper-Wechselwirkung handelt.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die dünne Schicht mindestens teilweise von einer Trägerschicht gebildet wird, wobei vorzugsweise der nachzuweisende Vorgang an und/oder in der Trägerschicht abläuft.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Trägerschicht um eine anorganische Schicht, insbesondere aus einem anorganischen Oxid oder Nitrid, handelt.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Trägerschicht um eine organische Poly­ merschicht, insbesondere eine Polystyrolschicht, han­ delt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Trägerschicht auf minde­ stens einer Unterlage, insbesondere einer Glasunterlage, befindet.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß sich zwischen Trägerschicht und Unterlage mindestens eine weitere, insbesondere reflek­ tionsverstärkende Schicht befindet.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Spezies in und/oder an der Trägerschicht chemisch oder physikalisch gebunden, insbesondere adsorbiert wird oder ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterlage die Trägerschicht bildet.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Unterlage um ein handelsübliches Interferenzfilter handelt.

18. Vorrichtung zum Nachweis physikalischer, chemischer, biochemischer und biologischer Vorgänge, insbesondere nach einem der vorhergehenden Anspruche, mit

• - einer Lichtquelle (2), insbesondere einer Xenon­ hochdrucklampe,
• - einer Probeneinrichtung (3), an der der zu unter­ suchende Vorgang durchgeführt werden kann,
• - einem Detektor (4), und
• - einer Auswerteeinrichtung (5), die insbesondere einen Computer (6) aufweist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Y-Lichtleiter (7) aufweist, wobei der erste Arm (8) des Lichtleiters (7) zur Einstrahlung des Lichts auf die Probeneinrichtung (3) und der zweite Arm (9) des Lichtleiters (7) zur Führung eines reflektierten Anteils des eingestrahlten Lichts auf den Detektor (4) vorgesehen ist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Probeneinrichtung (3) eine Unterlage (10), insbesondere aus Glas, und eine auf die eine Seite der Unterlage (10) aufgebrachte Trägerschicht (11), insbesondere anorganische Schicht, aufweist, an der der zu untersuchende Vorgang abläuft.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Unterlage (10) um ein handelsübli­ ches Interferenzfilter handelt.

22. Optischer Sensor mit einer Unterlage, insbesondere aus Glas, und einer auf der einen Seite der Unterlage aufge­ brachten Trägerschicht, insbesondere anorganische Schicht, an der physikalische, chemische, biochemische und/oder biologische Vorgänge ablaufen können.

23. Sensor nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Unterlage um ein handelsübliches Interfe­ renzfilter handelt.

24. Optischer Sensor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein handelsübliches Interferenzfilter aufweist, an dessen Oberfläche ein physikalischer, chemischer, biochemischer und/oder biologischer Vorgang ablaufen kann.

25. Verwendung eines handelsüblichen Interferenzfilters zur Herstellung eines optischen Sensors, insbesondere als Unterlage für eine Schicht, in und/oder an der physika­ lische, chemische, biochemische und/oder biologische Vorgänge nachgewiesen werden sollen.

26. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der nachzuweisende Vorgang an der Oberfläche des Inter­ ferenzfilters selbst abläuft.