CN109030445B - 一种测定壳寡糖含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种测定壳寡糖含量的方法，属于大分子检测技术领域。本发明采用苯酚‑荧光分光光度法，利用壳寡糖与苯酚溶液混合后，壳寡糖的氨基和苯酚的羟基结合，使混合水溶液的pH值改变，苯酚发生荧光淬灭，导致荧光强度呈指数下降，使壳寡糖的浓度与荧光对数值在一定范围内呈线性关系，用于壳寡糖的含量测定。此方法费用低，灵敏度高，稳定性强，重现性好，检测浓度范围为0～2.4mg/ml，使用广泛，可用于不同剂型壳寡糖的含量测定，解决了现有技术中操作繁琐、成本高、准确性低、测定范围窄的问题。

Description

一种测定壳寡糖含量的方法
技术领域
本发明属于大分子检测领域，涉及一种测定壳寡糖含量的方法。
背景技术
壳寡糖(又称寡聚氨基葡糖、甲壳低聚糖、Chitosan Oligosaccharide，Chito-oligosaccharide，Oligochitosan)由甲壳质(几丁质)脱乙酰化的产物壳聚糖降解获得，是由2-10个氨基葡糖通过β－1，4糖苷键连接而成的低聚糖，也是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基多糖，水溶性好，易被动物体吸收。壳寡糖原材料来源广泛，安全无毒，其具有的抗炎、增强免疫力、抗肿瘤、抑菌、清除自由基、抗氧化等生理活性已引起国内外医药研究者的广泛关注。在作物栽培领域，壳寡糖具有调控植物生长和防治植物病害等生物活性，被作为抗病毒制剂，广泛用于黄瓜、番茄等多种蔬菜生产中。在医药领域，壳寡糖具有调节免疫力、抗氧化、抑制肿瘤生长及抗炎反应、增强骨强度、抗菌、抗疟疾等作用。因此在农业、食品、医药等领域具有广阔的应用前景。但是在壳寡糖产品的质量控制中，除了要测定壳寡糖的脱乙酰度、聚合度和相对分子量，还需要确定产品中壳寡糖的实际含量，现有方法对产品中壳寡糖的含量测定准确性低，致使产品中壳寡糖含量的测定方法的不成熟和馈乏。
当前，壳寡糖的含量分析方法主要有三大类：高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法(TLC)和分光光度法。HPLC法采用示差检测器检测或紫外检测器检测，该方法灵敏度高、准确可靠，但操作过程繁琐，样品处理和分析时间长。TLC法稳定性差，测定误差大，准确性低，无法保证测得产品质量优劣。分光光度法是较为传统的壳寡糖检测的方法，得到多次改进，但依然存在水解不彻底、含量测定范围低窄问题，增加测定结果的误差。另外，如中国专利申请号201711493051.2公开了一种以水溶性苯胺蓝为探针的紫外可见分光光度法测定壳寡糖，水解壳寡糖也可利用紫外分光光度法精确测得壳寡糖含量，但是该方法中苯胺蓝-壳寡糖体系受温度、pH值影响，操作步骤多，稳定性差。综上，壳寡糖含量的测定方法依然需要不断的改进和更新。因此，建立一种简单易行而又准确的测定产品中壳寡糖含量的方法极为迫切。
发明内容
为改进现有技术中对壳寡糖的含量测定方法误差大、稳定性低，耗时费力，尤其是不能广泛应用于壳寡糖不同制剂含量测定等缺点，本发明旨在提供一种测定不同剂型壳寡糖含量的方法。本发明采用苯酚-荧光分光光度法，利用壳寡糖与苯酚溶液混合后，壳寡糖的氨基和苯酚的羟基结合，使混合水溶液的pH值改变，苯酚发生荧光淬灭，导致荧光强度呈指数下降，使壳寡糖的浓度与荧光对数值在一定范围内呈线性关系，可用于壳寡糖的含量测定。此方法费用低，灵敏度高，稳定性强，重复性好，检测浓度范围为0～2.4mg/ml，使用广泛，可用于壳寡糖片剂、颗粒剂和滴丸等不同制剂中壳寡糖的含量测定。
一种测定壳寡糖含量的方法，包括如下步骤：
1)绘制壳寡糖的标准曲线：向比色管中分别加入0、0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml充分溶解于蒸馏水的4.00mg/ml的壳寡糖标准品储备液，后加入100μl苯酚水溶液，蒸馏水定容，摇匀，制备得到浓度梯度为0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40mg/ml的壳寡糖标准溶液，于荧光分光光度仪上测定荧光强度值F，建立lnF与壳寡糖浓度X之间的线性关系；
2)样品工作液的配备：取壳寡糖待测样品，加入蒸馏水，混合均匀，配制成浓度为3～5mg/ml的壳寡糖溶液；
3)样品中壳寡糖含量测定：取样品工作液2-6ml，按步骤1)检测方法进行测定，测定波长为λex/λem＝285/300nm，狭缝5nm，记录荧光强度F值，计算lnF值，并带入线性回归方程中求得样品浓度，即得。
优选地，所述步骤2)中的待测样品为壳寡糖片剂、壳寡糖颗粒剂、壳寡糖胶囊或壳寡糖滴丸。
优选地，所述步骤1)中的苯酚质量浓度为5％。
优选地，所述步骤3)中测定波长为λex/λem＝285/300nm，狭缝5nm。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
1)本发明的壳寡糖含量的测定方法线性好，检测范围广，利用加入壳寡糖后使苯酚荧光猝灭原理，随着壳寡糖浓度的增加，苯酚的荧光强度值F呈指数下降，并发现其lgF值与壳寡糖的加入量存在线性关系，绘制lgF与壳寡糖浓度关系曲线图，结果显示壳寡糖浓度在0～2.4mg/ml范围内呈良好线性关系，最高检测限达2.4mg/ml。
2)本发明的壳寡糖含量的测定方法简单快速，不受制剂辅料干扰，结果准确可靠，可检测多种壳寡糖剂型。
3)本发明的壳寡糖含量的测定方法灵敏度高，重现性好，稳定性强，成本低。
附图说明
图1为苯酚、壳寡糖、苯酚-壳寡糖的荧光发射波长扫描图，其中：1为苯酚，2为苯酚和小分子量壳寡糖(分子量<1000)混合溶液，3为苯酚和大分子量壳寡糖(分子量<3000)，4为小分子量壳寡糖(分子量<1000)，5为大分子量壳寡糖(分子量<3000)。
图2为苯酚、壳寡糖、苯酚-壳寡糖的荧光激发波长扫描图，其中：1为苯酚，2为苯酚和小分子量壳寡糖(分子量<1000)混合溶液，3为苯酚和大分子量壳寡糖(分子量<3000)，4为小分子量壳寡糖(分子量<1000)，5为大分子量壳寡糖(分子量<3000)。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述发明并不以任何方式限定本发明专利的保护范围。
实施例1
一种测定壳寡糖含量的方法，测定壳寡糖片剂中壳寡糖的含量，其包括如下步骤：
1)绘制壳寡糖(COS)的标准曲线：向10ml比色管中加入一定量充分溶解于蒸馏水的4.00mg/ml的壳寡糖标准品溶液，后用移液枪吸取100μl，浓度为5％的苯酚水溶液加入比色管中，蒸馏水定容至刻度线，摇匀，制备得到浓度梯度分别为0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40mg/ml的COS标准品溶液，于荧光分光光度仪上测定荧光强度F值，检测条件为λex/λem＝285/300nm，狭缝5nm，并建立lnF与壳寡糖浓度X之间的标准曲线lnF＝9.022-2.272X，r＝0.997。
2)4.00mg/ml壳寡糖片剂工作液的配制：取10片壳寡糖片剂于研钵中研磨成粉末，烘干冷却，其中，壳寡糖片剂成分组成和重量百分比为壳寡糖87.5％、交联聚维酮(PPVP)4％、磷酸氢钙(CaHPO4)4％、微晶纤维(MCC)4％和硬脂酸镁0.5％，称取0.4000g粉末，加适量蒸馏水溶解，转移至50ml离心管中，摇匀，在转速为10000r/min条件下离心10min，取全部上清液转移至100mL容量瓶中，蒸馏水定容摇匀，即得浓度为4mg/ml壳寡糖片剂待溶液，其中壳寡糖的浓度为3.5mg/ml。
3)样品中壳寡糖含量测定：分别取4.00mg/ml壳寡糖片剂样品工作液(壳寡糖浓度3.5mg/ml)2.00、4.00、5.00、6.00ml于10ml比色管中，重复4组，吸取100μl质量浓度为5％的苯酚溶液加入比色管中，定容，摇匀，于波长为λex/λem＝285/300nm，狭缝5nm条件下测定荧光强度值F，并计算相对应的lgF值，将lgF带入线性回归方程，求得壳寡糖片剂中壳寡糖的含量如表1。
表1片剂中壳寡糖含量测定(％)
Figure GDA0002391097940000041
实施例2
一种测定壳寡糖含量的方法，测定壳寡糖颗粒剂中壳寡糖的含量，其包括如下步骤：
1)绘制壳寡糖(COS)的标准曲线：向10ml比色管中加入一定量充分溶解于蒸馏水的4.00mg/ml的壳寡糖标准品溶液，后用移液枪吸取100μl，浓度为5％的苯酚水溶液加入比色管中，蒸馏水定容至刻度线，摇匀，制备得到浓度梯度分别为0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40mg/ml的COS标准品溶液，于荧光分光光度仪上测定荧光强度F值，检测条件为λex/λem＝285/300nm，狭缝5nm，并建立lnF与壳寡糖浓度X之间的标准曲线lnF＝9.008-2.248X，r＝0.997。
2)4.00mg/ml壳寡糖颗粒剂工作液的配制：称取0.2000g壳寡糖的颗粒剂，其中，壳寡糖颗粒剂的成分组成和重量百分比分别为壳寡糖96.4％、PVP 3％和阿司巴坦0.6％，用蒸馏水溶解，移于50ml的容量瓶中，蒸馏水定容至刻度线，充分摇匀得4.00mg/ml壳寡糖颗粒剂待测液,其中壳寡糖的浓度为3.86mg/ml。
3)样品中壳寡糖含量测定：分别取4.00mg/ml壳寡糖样品工作液(壳寡糖浓度3.86mg/ml)2.00、4.00、5.00、6.00ml于10ml比色管中，重复3组，吸取100μl质量浓度为5％的苯酚溶液加入比色管中，定容，摇匀，于波长为λex/λem＝285/300nm，狭缝5nm条件下测定荧光强度值F，并计算相对应的lgF值，将lgF带入线性回归方程，求得壳寡糖片剂中壳寡糖的含量如表2。
表2颗粒集中壳寡糖含量测定
Figure GDA0002391097940000051
实施例3
一种测定壳寡糖含量的方法，测定壳寡糖滴丸中壳寡糖的含量，其包括如下步骤：
1)绘制壳寡糖(COS)的标准曲线：向10ml比色管中加入一定量充分溶解于蒸馏水的4.00mg/ml的壳寡糖标准品溶液，后用移液枪吸取100μl，浓度为5％的苯酚水溶液加入比色管中，蒸馏水定容至刻度线，摇匀，制备得到浓度梯度分别为0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40mg/ml的COS标准品溶液，于荧光分光光度仪上测定荧光强度F值，检测条件为λex/λem＝285/300nm，狭缝5nm，并建立lnF与壳寡糖浓度X之间的标准曲线lnF＝8.998-2.269X，r＝0.9996。
2)16.00mg/ml壳寡糖滴丸工作液的配制：称取0.8000g壳寡糖的滴丸，滴丸的成分组成和重量百分比分别为壳寡糖25％和PEG600075％，加适量蒸馏水用玻璃棒搅拌溶解，并移入50mL容量瓶中，定容摇匀，得浓度为16.00mg/ml壳寡糖滴丸待测液，其中壳寡糖的浓度为4.00mg/ml。。
3)样品中壳寡糖含量测定：分别取16.00mg/ml壳寡糖滴丸待测液2.00、3.00和4.00ml于10ml比色管中，重复3组，吸取100μl质量浓度为5％的苯酚溶液加入比色管中，定容，摇匀，于波长为λex/λem＝285/300nm，狭缝5nm条件下测定荧光强度值F，并计算相对应的lnF值，将lnF带入线性回归方程，求得壳寡糖片剂中壳寡糖的含量如表3。
表3丸剂中壳寡糖含量测定
Figure GDA0002391097940000061
实施例4：
一种测定壳寡糖含量的方法，测定壳寡糖胶囊中壳寡糖的含量，其包括如下步骤：
1)绘制壳寡糖(COS)的标准曲线
向10ml比色管中加入一定量充分溶解于蒸馏水的4.00mg/ml的壳寡糖标准品溶液，后用移液枪吸取100μl，浓度为5％的苯酚水溶液加入比色管中，蒸馏水定容至刻度线，摇匀，制备得到浓度梯度分别为0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40mg/ml的COS标准品溶液，于荧光分光光度仪上测定荧光强度F值，检测条件为λex/λem＝285/300nm，狭缝5nm，并建立lnF与壳寡糖浓度X之间的标准曲线lnF＝8.93-2.337x，r＝0.9991。
2)4.0mg/ml壳寡糖胶囊工作液的配制：胶囊去壳，称取0.4000g，胶囊内容物的成分组成和重量百分比分别为壳寡糖92％、微晶纤维素(MCC)2％、5％(w/v)的聚维酮(PVP)溶液2％、硬脂酸钙1％、无水乙醇2％和微粉硅胶1％；加适量蒸馏水用玻璃棒搅拌溶解，转移至50ml离心管中，摇匀，在转速为10000r/min条件下离心10min，取全部上清液转移至100ml容量瓶中，蒸馏水定容摇匀，即得浓度为4.0mg/ml的壳寡糖胶囊剂待测液，其中壳寡糖的浓度为3.68mg/ml。。
3)样品中壳寡糖含量测定：分别取4.00mg/ml壳寡糖滴丸待测液2.00、3.00和4.00ml于10ml比色管中，重复3组，吸取100μl质量浓度为5％的苯酚溶液加入比色管中，定容，摇匀，于波长为λex/λem＝285/300nm，狭缝5nm条件下测定荧光强度值F，并计算相对应的lnF值，将lnF带入线性回归方程，求得壳寡糖片剂中壳寡糖的含量如表4。
表4胶囊剂中壳寡糖含量测定
Figure GDA0002391097940000071
试验例1：苯酚的荧光光谱扫描
用荧光检测仪对苯酚，壳寡糖以及苯酚和壳寡糖的混合溶液，对荧光发射光和激发光进行扫描。如图1和2所示，苯酚的荧光最大发射波长和激发波长分别为285nm和300nm，不同分子量(<1000，<3000)的壳寡糖无荧光，但其与苯酚结合后，使苯酚发生明显的荧光猝灭，浓度相同的不同分子量壳寡糖不影响苯酚荧光淬灭的结果。
试验例2：线性范围
在最佳实验条件下，按照实验方法在10ml比色管中分别加入0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00、6.00ml的5mg/ml壳寡糖溶液，后加入100μl的5％苯酚溶液，定容摇匀后，测定荧光强度F值，绘制F与加入壳寡糖浓度X的曲线图，结果表明，在壳寡糖在0～3mg/ml浓度范围内，F值随浓度呈指数下降，y＝8975e-2.557x，r＝0.992，最高检测限为2.5mg/ml，壳寡糖浓度≧2.75mg/ml时，检测不到荧光，随即缩小壳寡糖浓度范围，在10ml比色管中分别加入0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml的4mg/ml壳寡糖溶液使其在0-2.4mg/ml之间，此时，F值随浓度的关系为Y＝7743e-2.261x，r＝0.9997，即得线性方程lnF＝8.955-2.261X，r＝0.9997。
试验例3：稳定性考察
1)时间对苯酚荧光影响
在λex/λem＝285/300nm下，探究苯酚-壳寡糖溶液随着时间变化，其荧光强度值F的变化，每间隔10min测定样品的荧光强度值，结果如表5，在60min内，加入各浓度壳寡糖溶液，其RSD值均<5％，说明在60min内，苯酚的荧光强度值稳定。
表5不同浓度壳寡糖在不同时间点的苯酚-壳寡糖荧光强度值
Figure GDA0002391097940000081
2)不同剂型壳寡糖辅料对苯酚荧光的影响
用荧光检测仪分别检测壳寡糖颗粒剂中辅料PVP和阿司帕坦；壳寡糖片剂中可溶于水的辅料PPVP和CaHPO4；壳寡糖滴丸中辅料PEG6000；壳寡糖胶囊中可溶于水的PVP和无水乙醇对苯酚荧光强度值的影响。
如表6-11结果为不同浓度辅料PPVP、CaHPO4、PVP、阿司帕坦和PEG600对苯酚荧光值F的影响，检测条件为λex/λem＝285/300nm，狭缝5nm，表中RSD1(％)为加入不同浓度辅料后测定的F值与不加辅料测定的F值的相对标准偏差，RSD2(％)为同一浓度重复测定4次的相对标准偏差，其值均<2％，说明辅料的加入对苯酚的荧光值无影响，该检测方法稳定可靠。
表6 CaHPO4对苯酚荧光值的影响(n＝4)
Figure GDA0002391097940000091
表7PPVP对苯酚荧光值的影响(n＝4)
Figure GDA0002391097940000092
表8 PVP对苯酚荧光值的影响(n＝4)
Figure GDA0002391097940000093
表9阿司巴坦对苯酚荧光值的影响(n＝4)
Figure GDA0002391097940000101
表10 PEG6000对苯酚荧光值的影响(n＝3)
Figure GDA0002391097940000102
表11无水乙醇对苯酚荧光值的影响(n＝3)
Figure GDA0002391097940000103
其中壳寡糖颗粒剂和胶囊中都含有PVP，因此PVP对苯酚荧光强度的影响只检测一次。
试验例4：壳寡糖的检测
1.试验对象：苯酚-荧光分光光度法、1-萘酚-荧光分光光度法。
2.检测方法：
向比色管中分别加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0ml的浓度为4.00mg/ml的壳寡糖标准品储备液，对照组加入100μl蒸馏水，试验组1加入100μl质量百分数为5％的苯酚水溶液，试验组2加入100μl质量百分数为7.6％1-萘酚(与苯酚的摩尔数相同)水溶液，蒸馏水定容，摇匀，制备得到浓度梯度为0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00和2.40mg/ml的壳寡糖标准溶液，于荧光分光光度仪上测定荧光强度F值，苯酚的λex/λem＝285/300nm，1-萘酚的λex/λem＝308nm/477nm计算各浓度与lnF值是否存在线性关系。
3.试验结果：
苯酚的lnF值与壳寡糖浓度存在线性关系，线性方程为：lnF＝8.9-2.2X，r＝0.9997。
1-萘酚的lnF值与壳寡糖浓度无限性关系，通过数据分析还发现，1-萘酚的F值、logF值等与壳寡糖浓度均没有线性函数关系，说明苯酚-荧光分光光度法可有效、准确地检测壳寡糖的浓度，而其他酚类化合物无此效果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护。

Claims (4)

1.一种测定壳寡糖含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)绘制壳寡糖的标准曲线：向比色管中分别加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0ml的浓度为4.00mg/ml的壳寡糖标准品储备液，后加入100μl苯酚水溶液，蒸馏水定容，摇匀，制备得到浓度梯度为0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00和2.40mg/ml的壳寡糖标准溶液，于荧光分光光度仪上测定荧光强度F值，并建立lnF与壳寡糖浓度X之间的线性关系曲线；
2)样品工作液的配备：取壳寡糖待测样品，加入蒸馏水，混合均匀，配制成浓度为3～5mg/ml的壳寡糖溶液；
3)样品中壳寡糖含量测定：取样品工作液2-6ml，按步骤1)检测方法进行测定，记录荧光强度F值，计算lnF值，并带入线性回归方程中求得样品浓度，即得。
2.根据权利要求1所述的一种测定壳寡糖含量的方法，其特征在于，所述步骤2)中的待测样品为壳寡糖片剂、壳寡糖颗粒剂、壳寡糖胶囊或壳寡糖滴丸。
3.根据权利要求1所述的一种测定壳寡糖含量的方法，其特征在于，所述步骤1)中的苯酚浓度为5％，w/v。
4.根据权利要求1所述的一种测定壳寡糖含量的方法，其特征在于，所述步骤3)中测定波长为λex/λem＝285/300nm，狭缝5nm。
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