CN108088830B - 一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，属于大分子检测领域。本发明利用一定条件下，壳寡糖能与宝石红结合形成离子缔合物，使共振散射强度显著增强，加入十二烷基硫酸钠作为增敏剂提高其灵敏度。通过共振散射强度与壳寡糖在一定的浓度范围内呈线性关系，以此作为壳寡糖的定量基础，建立了测定壳寡糖的共振瑞利散射法。本方法测定受离子浓度和干扰物的影响，在实际样品测定中，需控制离子浓度在0.05mol/L‑0.20mol/L的标准品做定量标准，具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作简便等优点。

Description

一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法
技术领域
本发明涉及一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，属于大分子检测领域。
背景技术
壳寡糖(chitosan oligosaccharide/chitooligosaccharide，COS)，又称低寡葡萄糖、低寡氨基葡萄糖等，是一种碱性氨基寡糖，由2-氨基葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成，其中含有部分的乙酰氨基葡萄糖残基。壳寡糖来源广泛，安全无毒，水溶性好，有抗氧化、抑菌、抗肿瘤、增强免疫力等多种生物活性，已引起国内外医药研究者的广泛关注。因此，壳寡糖的准确定量显得十分重要，建立简便高效的方法测定壳寡糖含量有着重要的意义，这将进一步推进壳寡糖在各个领域的应用。
目前测定壳寡糖的常用方法依然存在一些不足，如比色法：此方法经凝胶渗透色谱验证，能较为准确地判断壳寡糖的平均寡合度。虽然比色法技术简单，对设备要求不高，成本较低，但由于其准确性不高，因此有必要开发一种新的可准确测定壳寡糖的分析方法；色谱法：薄层层析法虽然可以分析壳寡糖，价格低廉，但此方法操作时间长，只能进行微量生产，无法定量，薄层-比色法可用于壳寡糖常规检验。但是，要大规模地对壳寡糖分离分析还需要不断地寻求新的技术。而目前国内外，利用简便、快速、灵敏度高的共振瑞利散射方法直接测定壳寡糖含量的相关研究较少，因此，共振瑞利散射法测定壳寡糖有着很大的研究空间及重要意义。
基于此，本发明提供一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法。
发明内容
为了克服现有技术中对于成品中壳寡糖的含量难以定量，操作技术繁琐的技术不足，本发明提供一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，本发明利用一定条件下，壳寡糖能与宝石红结合形成离子缔合物，使共振散射强度显著增强，加入十二烷基硫酸钠作为增敏剂提高其灵敏度。通过共振散射强度与壳寡糖在一定的浓度范围内呈线性关系，以此作为壳寡糖的定量基础，建立了测定壳寡糖的共振瑞利散射法。本方法测定受离子浓度和干扰物的影响，在实际样品测定中，需控制离子浓度在0.05mol/L-0.20mol/L的标准品做定量标准，具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作简便等优点。
一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，其包括下述步骤：
1)绘制△I和不同浓度的壳寡糖的标准曲线
向10mL比色管中加入1.0mL的B-R缓冲溶液，一定浓度梯度的壳寡糖标准溶液，1.0mL浓度为0.086mol/L的增敏剂，以及1.0mL浓度为1.0×10-4mol/L的宝石红溶液，使用蒸馏水定容后充分摇匀，将其置于室温10min后于F-2500型荧光分光光度计上，以λex＝λem进行同步扫描，分别记录含壳寡糖的各检测体系在λ＝470nm处体系的共振散射强度I，其中试剂空白在λ＝470nm处体系的共振散射强度I0，并计算△I＝I-I0，建立△I与壳寡糖浓度的标准曲线C；
2)10μg/mL的样品工作液的制备：将壳寡糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液。
3)样品中壳寡糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)检测方法进行测定，在470nm处测定其散射值I，并计算△I＝I–I0，将△I代入线性回归方程求得样品中壳寡糖的含量，同时做加标回收试验。
如上所述的通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，所述的B-R缓冲溶液由0.04mol/L混合酸与0.2mol/LNaOH溶液按不同比例配制而成。
如上所述的通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，所述的混合酸由正磷酸、冰乙酸和硼酸按不同比例配制而成。
如上所述的通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，所述的B-R缓冲溶液的pH为4.9。
如上所述的通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，所述增敏剂为吐温20，吐温80，OP乳化剂,十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠中的一种
如上所述的通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，所述增敏剂为十二烷基硫酸钠。
如上所述的通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，步骤1中溶液的加入顺序为首先加入宝石红溶液，其次加入十二烷基硫酸钠溶液，再次加入RB缓冲溶液，最后加入壳寡糖溶液。
如上所述的通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，壳寡糖的浓度范围0.5μg/mL-2.5μg/mL。
样品前处理：将壳寡糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液。
取样品工作液1mL，按实验方法进行测定，在470nm处测定其吸光度值I，并计算△I＝I-I0，将△I代入线性回归方程求得样品中壳寡糖的含量，同时做加标回收试验。
试验例：
1.壳寡糖-宝石红-十二烷基硫酸钠体系的共振瑞利散射光谱
图1为体系的共振散射光谱图。由图1可知，COS，SDS和宝石红本身的散射值较低，但当COS与宝石红及SDS三者结合后散射值明显增大，并在470nm处有散射峰。实验的空白组散射值较低，且实验组随着COS的浓度的增大，体系的散射值增大，存在较好的线性关系。
2.BR缓冲溶液的pH对体系散射值的影响
于10mL的比色管中，各依次加入2.0mLpH＝3，4，5，6的B-R缓冲液，1.0mL浓度为10μg/mL的壳寡糖溶液，以及2.0mL浓度为1.0×10-4mol/L的宝石红溶液，用三次蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀振荡90s，置于常温静置30min。于F-2500型荧光分光光度计上以λex＝λem进行同步扫描，得到共振瑞利散射光谱。
结果见图2和图3，缓冲溶液的酸度对该反应体系有着显著的影响，在pH＝5.0附近时散射值较大，通过酸度的细化实验，最终最佳酸度条件确定在pH＝4.9处。
3.不同缓冲液对于体系散射值的影响
分别考察了B-R缓冲溶液，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液和甘氨酸-盐酸缓冲溶液3种缓冲溶液对体系散射值的影响。按照实验方法，改变加入的缓冲溶液，得到各个缓冲溶液的散射值。
结果见图2、图4、图5，体系在B-R缓冲溶液中灵敏度最高，散射值最大，故最佳缓冲溶液选择为B-R缓冲溶液。
4.缓冲液的加入量对散射值的影响
缓冲溶液为实验体系提供合适的酸度结合环境，其加入量对离子缔合物的形成有着一定的影响，不改变其他实验条件，改变pH＝4.9的B-R缓冲溶液的加入量为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3mL，测定其散射值。
结果见图6，B-R缓冲溶液加入量为1.5mL和2.5mL时均出现峰值，且加入量为1.5mL时ΔI较大，故选择加入B-R缓冲液加入量为1.5mL。
5.宝石红加入量对散射值的影响
宝石红作为染料探针与目标物质壳寡糖结合，其加入量直接影响着离子缔合物的形成，不改变其他实验条件，改变浓度为1.0×10-4mol/L的宝石红的加入量为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3mL，测定其散射值。
结果见图7，宝石红的加入量对该反应体系有显著影响，可以看出，随着宝石红染液的加入，ΔI先升后降，且在加入量为2mL处达到峰值。故选择宝石红加入量为2mL。
6.增敏剂加入量对散射值的影响
分别考察吐温20，吐温80，OP乳化剂,十二烷基硫酸钠(SDS),十二烷基磺酸钠(SLS)5种表面活性剂对体系散射值的影响。按照实验方法，不改变其他实验条件，最后加入1mL表面活性剂，一组于常温静置，另一组于80℃水浴加热10min后静置至常温，测定其散射值。
结果见图8，当加入十二烷基硫酸钠时，体系散射值明显增强，结果表明十二烷基硫酸钠的加入量对该体系存在一定的影响，故选择十二烷基硫酸钠(SDS)冲溶液作为实验的增敏剂。
7.十二烷基硫酸钠加入量对散射值的影响
十二烷基硫酸钠是一种阴离子表面活性剂，其临界胶束浓度为0.0086mol/L，当达到临界胶束浓度(CMC)后，表面活性剂分子自身通过范德华力相互聚集，形成亲油基向内，亲水基向外的胶束，使离子缔合物在胶束溶液中的溶解度显著增加，产生的胶束增溶作用使共振散射强度显著增加。不改变其他实验条件，改变浓度为0.086mol/L的十二烷基硫酸钠的加入量为0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3mL，测定其散射值。
结果见图9，结果表明十二烷基硫酸钠的加入量对该体系存在一定的影响，整体趋势先升后降，当加入量为1mL时散射值最大，后略有下降，当加入量为1.0mL时散射值较大且体系稳定性好，故0.086mol/L的十二烷基硫酸钠最佳加入量为1.0mL，即对应十二烷基硫酸钠浓度为0.0086mol/L。
8.试剂加入顺序对于体系散射值的影响
在实验条件下，考察了阴离子染料宝石红，B-R缓冲液，COS及SDS的12种不同的加入顺序对体系灵敏度的影响。结果见表1，图10，最佳加入顺序为“宝石红+SDS+RB缓冲溶液+COS”，此时体系的散射值最大，灵敏度最高且重现性最好。
表1加入顺序的影响
Figure BDA0001535482560000051
9.反应温度对于体系散射值的影响
在实验条件下，考察了20～100℃不同温度对体系灵敏度的影响，结果见图11，结果表明，温度对体系的散射值存在着影响。散射值随着温度的升高呈先上升再下降再上升的趋势，20℃达到最大散射值且在该反应温度下，重现性较好，故体系最佳温度为20℃。
10.稳定时间对于体系散射值的影响
在较优条件下，考察体系的稳定时间，考察3h，每隔一段时间测其散射值。结果表明，体系在10min内即可达到稳定并且散射值达到最大，2h内可保持稳定的散射值不变。故选择稳定时间为2h。
11.离子强度对于体系散射值的影响
以NaCl(0.005～0.3mol/L)考察离子强度对体系散射值的影响。结果见图12，离子浓度在0.05mol/L-0.2mol/L时散射值趋于平稳，体系相对稳定。
12.共存物质对于体系散射值的影响
考察了6种共存物质对该体系的干扰，体系中壳寡糖的浓度为1μg/mL。在相对误差在±5％范围内，各种共存物质的允许量见表2。常见的铜，钙，锰等的干扰小，允许量大。
表2共存物质的影响
Figure BDA0001535482560000061
本发明与现有技术相比具有如下技术优势：
1)线性好、检出限低：在最佳实验条件下，按照实验方法测定不同浓度的壳寡糖对应的△I，绘制标准曲线，结果表明，壳寡糖在浓度0.5μg/mL-2.5μg/mL范围内与△I存在良好的线性关系，线性范围宽，检出限为0.4708μg/mL。
2)本方法测定受离子浓度和干扰物的影响，在实际样品测定中，需控制离子浓度在0.05mol/L-0.20mol/L的标准品做定量标准，具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作简便等优点。
附图说明
图1壳寡糖-宝石红-十二烷基硫酸钠体系的共振瑞利散射光谱。
图2BR缓冲溶液的pH对体系散射值的影响图。
图3BR缓冲液pH细化图。
图4甘氨酸-盐酸缓冲液pH对体系散射值影响图。
图5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH对体系散射值影响图。
图6BR缓冲液加入量对体系散射值影响图。
图7宝石红加入量对体系散射值影响图。
图8不同增敏剂对体系散射值影响图。
图9SDS加入量对体系散射值影响图。
图10不同试剂加入顺序对体系散射值影响图。
图11温度对体系散射值影响图。
图12离子强度对于体系散射值影响图
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述发明并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。
实施例
一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，其包括下述步骤：
1)绘制△I和不同浓度的壳寡糖的标准曲线
向10mL比色管中加入1.0mLpH为4.9的B-R缓冲溶液，一定浓度梯度的壳寡糖标准溶液，1.0mL浓度为0.086mol/L的十二烷基硫酸钠溶液，以及1.0mL浓度为1.0×10-4mol/L的宝石红溶液，使用蒸馏水定容后充分摇匀，将其置于室温10min后于F-2500型荧光分光光度计上，以λex＝λem进行同步扫描，分别记录含壳寡糖的各检测体系在λ＝470nm处体系的共振散射强度I，其中试剂空白在λ＝470nm处体系的共振散射强度I0，并计算△I＝I-I0，建立△I与壳寡糖浓度的标准曲线C。
2)10μg/mL的样品工作液的制备：将壳寡糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液。
用样品工作液按实验方法绘制样品曲线，与壳寡糖标准曲线比较，结果为样品的线性回归方程是线性回归方程为ΔI＝33.31c+151.41，相关系数0.9901。
3)样品中壳寡糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)检测方法进行测定，在470nm处测定其散射值I，并计算△I＝I–I0，将△I代入线性回归方程求得样品中壳寡糖的含量，同时做加标回收试验。
取样品工作液1mL，按实验方法进行测定，在470nm处测定其散射值I，并计算△I＝I–I0，将△I代入线性回归方程求得样品中壳寡糖的含量,同时做加标回收试验。结果为：奥利奇善壳寡糖胶囊中壳寡糖的含量为1174mg/g，RSD为2.081％。加标回收率见表3。
表3样品分析结果
Figure BDA0001535482560000081
在实验中，于10mL的比色管依次加入2.0mL浓度为1.0×10-4mol/L的宝石红，1.0mL浓度为0.086mol/L的十二烷基硫酸钠，1.5mL pH＝4.9的B-R缓冲溶液和3.0mL浓度为10μg/mL壳寡糖溶液，用蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀后室温静置10min。于F-2500型荧光分光光度计上，以λex＝λem进行同步扫描，于2h内测定完成。记录含壳寡糖的体系在λ＝470nm处体系的共振散射强度I，其中试剂空白在λ＝470nm处体系的共振散射强度I0，并计算△I＝I-I0。壳寡糖在浓度0.5μg/mL-2.5μg/mL范围内与△I存在良好的线性关系，线性范围宽，检出限为0.4708μg/mL。本方法测定受离子浓度和干扰物的影响，在实际样品测定中，需控制离子浓度在0.05mol/L-0.20mol/L的标准品做定量标准，具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作简便等优点。
线性范围与检出限
在最佳实验条件下，按照实验方法测定不同浓度的壳寡糖对应的△I，绘制标准曲线，结果表明，壳寡糖在浓度0.5μg/mL-2.5μg/mL范围内与△I存在良好的线性关系，线性回归方程为ΔI＝33.31c+151.41，相关系数0.9901，方法线性范围宽，检出限0.4708μg/mL。

Claims (1)

1.一种通过共振瑞利散射法准确测定壳寡糖含量的方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)绘制△I和不同浓度的壳寡糖的标准曲线向10mL比色管中加入1.0mL的B-R缓冲溶液，一定浓度梯度的壳寡糖标准溶液，1.0mL浓度为0.086mol/L的增敏剂，以及1.0mL浓度为1.0×10-4mol/L的宝石红溶液，使用蒸馏水定容后充分摇匀，将其置于室温10min后于F-2500型荧光分光光度计上，以λex＝λem进行同步扫描，分别记录含壳寡糖的各检测体系在λ＝470nm处体系的共振散射强度I，其中试剂空白在λ＝470nm处体系的共振散射强度I0，并计算△I＝I-I0，建立△I与壳寡糖浓度的标准曲线C；
2)10μg/mL的样品工作液的制备：将壳寡糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液， 用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液；
3)样品中壳寡糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)检测方法进行测定，在470nm处测定其散射值I，并计算△I＝I–I0，将△I代入线性回归方程求得样品中壳寡糖的含量，同时做加标回收试验；
所述B-R缓冲溶液由0.04mol/L混合酸与0.2mol/LNaOH溶液按不同比例配制而成；所述混合酸由正磷酸、冰乙酸和硼酸按不同比例配制而成；所述的B-R缓冲溶液的pH为4.9；所述增敏剂为十二烷基硫酸钠；步骤1中溶液的加入顺序为首先加入宝石红溶液，其次加入十二烷基硫酸钠溶液，再次加入RB缓冲溶液，最后加入壳寡糖溶液；所述壳寡糖的浓度范围0.5μg/mL-2.5μg/mL。
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