CN109342398A

CN109342398A - 一种鱼肉中痕量环丙沙星的sers检测方法

Info

Publication number: CN109342398A
Application number: CN201811427595.3A
Authority: CN
Inventors: 腾渊洁; 章裕超; 任泽宇
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2019-02-15

Abstract

本发明公开了一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，检测方法为：首先制备Au纳米溶胶，Au纳米溶胶中加入正己烷，漩涡混合，静置，形成清晰的水、正己烷两相，除去上层的正己烷相，得Au纳米膜浮于水面的测试体系，以Au纳米膜为SERS基底可有效对环丙沙星进行分析检测。对鱼肉中痕量环丙沙星进行检测时，用提取溶剂对鱼肉泥中的环丙沙星进行提取，提取后的上清液进行柱层析净化，收集洗脱液并用氮气吹干，然后用超纯水复溶后，即得待测样品，待测样品与Au纳米溶胶、正己烷混合，经过一系列步骤制备得到Au纳米膜后，即可进行检测。本发明利用界面自组装技术制备二维Au纳米膜，检测鱼肉中痕量环丙沙星时具有快速、简单、增强效果好的优点。

Description

一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法

技术领域

本发明涉及一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法。

背景技术

环丙沙星作为喹诺酮类抗生素广泛用于家畜养殖和水产养殖的疾病预防和治疗。然而，近年来不法分子对抗生素的滥用，导致在家畜、水产中产生残留，最终对人体产生危害。

迄今，已提出许多检测鱼肉环丙沙星残留的方法，其中被广为应用的分析检测技术是高效液相色谱（HPLC）与紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器的联用，其他还包括电位滴定法、微生物法、分子印迹聚合物法等。

表面增强拉曼光谱（SERS）法作为一种新型的光谱检测分析技术，具有灵敏度高、操作简单、可以对待测物进行现场、快速、无损、在线分析检测。但是现有技术的SERS检测方法的处理过程较为繁琐复杂，亟需开发更为简便的适合SERS检测的前处理方法。

发明内容

针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法。

一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）制备Au纳米溶胶：取HAuCl₄水溶液置于烧瓶中，剧烈搅拌下加热至沸腾后，迅速加入柠檬酸盐水溶液，混合溶液颜色由浅黄色逐渐变为酒红色，冷凝回流，然后搅拌冷却至室温，得Au纳米溶胶，冷藏保存备用；

2）制备标准工作液：取步骤1）所得Au纳米溶胶，加入环丙沙星，配制不同环丙沙星浓度的6种标准工作液，冷藏保存；

3）制作标准曲线：步骤2）所得6种标准工作液分别置于离心管中，离心管中加入正己烷后漩涡混合，离心管中形成乳浊液，然后静置，乳浊液分离成清晰的水、正己烷两相，并在水、正己烷相界面处形成有金属光泽的Au纳米膜，且环丙沙星吸附在所述Au纳米膜上，除去正己烷相后，将吸附有环丙沙星的Au纳米膜置于测试平台上进行SERS测试，以标准工作液中环丙沙星的浓度为横坐标和测试得到的拉曼光谱强度为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程；

4）测定鱼肉中环丙沙星的含量：鱼肉泥和提取溶剂置于离心管中，混合均匀，然后超声提取，取上清液过滤，滤液进行柱层析净化，收集洗脱液并用氮气吹干，然后用超纯水复溶得到基质液；取步骤1）Au纳米溶胶置于离心管中，离心管中加入所述基质液和正己烷后漩涡混合，离心管中形成乳浊液，然后静置，乳浊液分离成清晰的水、正己烷两相，并在水、正己烷相界面处形成有金属光泽的Au纳米膜，除去正己烷相后，将Au纳米膜置于测试平台上进行SERS测试，检测到的拉曼光谱强度代入回归方程，即可推断出鱼肉中环丙沙星的含量。

所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤1）中，柠檬酸盐水溶液的质量分数为2~6%；HAuCl₄水溶液的质量分数为0.02~0.06%，HAuCl₄水溶液与柠檬酸盐水溶液的体积比为40~60:1。

所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于所述柠檬酸盐为柠檬酸钠或柠檬酸钾。

所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤3）中，正己烷与标准工作液的体积比为0.25~2:1。

所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤4）中，正己烷与Au纳米溶胶的体积比为0.25~2:1；基质液与Au纳米溶胶的体积比为1 : 8~10。

所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤3）或步骤4）中，进行漩涡混合的转速为2400~2600r/min，进行漩涡混合的时间为0~60s。

所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤4）中，提取溶剂为EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，EDTA-Mcllvaine缓冲溶液的浓度为0.05~0.15mol/L，优选为0.1mol/L。

所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤4）中，采用HLB固相萃取柱进行柱层析净化，进行柱层析净化的洗脱剂为甲醇。

所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤2）的6种标准工作液中，环丙沙星的浓度分别为100μg/mL、75μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL和5μg/mL。

相对于现有技术，本发明取得的有益效果是：

本发明利用界面自组装技术制备二维Au纳米膜（Au MLF），具有快速、简单、增强效果好的优点。二维Au纳米膜相较于Au，Ag溶胶，具有更好的均匀性和一致性。且较化学吸附的自组装法需要先对衬底材料进行一定的表面处理，然后通过含有两亲性官能团的分子将纳米粒子吸附到衬底上自组装成SERS基底，操作更为省时节能，且SERS基底均匀性很大程度上取决于表面处理技术，由于制备过程没有任何添加，可以尽可能小的降低SERS基底背景干扰信号，降低检测限。

附图说明

图1为环丙沙星水溶液的NRS光谱、环丙沙星水溶液的Au纳米溶胶的SERS光谱和环丙沙星水溶液的Au MLF基底的SERS光谱的对比图；

图2A为不同漩涡时间的环丙沙星的SERS信号谱图；

图2B为环丙沙星1380 cm^-1处特征峰强度随涡旋时间的变化曲线；

图3A为不同正己烷体积的环丙沙星的SERS信号图谱；

图3B为环丙沙星1380 cm^-1处特征峰强度随正己烷体积的变化曲线；

图4A为不同浓度的环丙沙星的SERS信号图谱；

图4B为环丙沙星650 cm^-1处特征峰强度随其浓度的变化曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

本发明使用的仪器与试剂如下：

仪器：LabRAM HR UV 800激光共聚焦显微拉曼光谱仪（法国JOBIN YVON公司），激光器是He-Ne激光器，激光发射波长为632.18nm，共焦孔径和光栅刻线数分别是300 um和600lines.mm-1，物镜为50倍长焦镜头；CARY100紫外-可见分光光谱仪（美国VARIAN公司）；美国Scilogex MX-F固定式漩涡混匀仪。

试剂：环丙沙星（99.0%）、氯金酸(99.9%)、柠檬酸三钠(99.9%)、正己烷(99.9%)均从阿拉丁（上海，中国）购买。含环丙沙星阴性鱼肉样品由浙江省湖州市长兴县疾病预防控制中心提供。实验用水为18.3 MΩ cm超纯水（HUMAN UP 900型超纯水仪）。

以下实施例中：

NRS光谱的测试方法是：使用 632 nm 的光源作为激发光，光能量变化范围为 30 到60 m W，积分时间为 10 s，拉曼测试扫描范围均为200~2000 cm^-1。SERS光谱的测试方法是：使用 632 nm 的光源作为激发光，光能量变化范围为 30 到 60 m W，积分时间为 10 s，拉曼测试扫描范围均为200~2000 cm^-1。

实施例1：

传统方法制备纳米金溶胶表面增强拉曼基底的方法，步骤如下：

取100mL质量浓度为0.04%的HAuCl₄水溶液置于烧瓶中，剧烈搅拌下加热至沸腾后，迅速加入2mL质量浓度为4%的柠檬酸钠水溶液，混合溶液颜色由浅黄色逐渐变为酒红色，待混合溶液颜色变化稳定后，冷凝回流15min，停止加热，搅拌冷却至室温，得Au纳米溶胶，放于4℃冰箱冷藏保存备用。

实施例2：

Au MLF基底的制备方法，步骤如下：

取实施例1所得Au纳米溶胶400μL置于离心管中，加入600μL正己烷后，将离心管转移至Scilogex MX-F固定式漩涡混匀仪中，于2500r/min下漩涡混合5s，离心管中形成乳浊液，然后静置，乳浊液分离成清晰的水、正己烷两相，并在水、正己烷相界面处形成有金属光泽的Au纳米膜，倒置并打开离心管除去上层正己烷相，得Au纳米膜浮于水相表面，Au纳米膜即为Au MLF基底。

实施例3：

测定1×10^-1 mol/L环丙沙星水溶液的NRS光谱，取1×10-1 mol/L环丙沙星水溶液滴于洁净的载玻片上，进行NRS光谱测试，测试结果见图1中的曲线a所示；

测定Au纳米溶胶作为活性基底对环丙沙星的SERS增强效果：40μL的10μg/mL环丙沙星水溶液与360μL实施例1所得Au纳米溶胶混合后，滴于测试平台上进行SERS光谱测试，测试结果见图1中的曲线b所示；

Au MLF作为活性基底对环丙沙星的SERS增强效果：取实施例1所得Au纳米溶胶360μL置于4 mL的聚丙烯离心管中，加入40μL的10μg/mL环丙沙星水溶液，再加入600μL正己烷后，将离心管转移至Scilogex MX-F固定式漩涡混匀仪中，于2500r/min下漩涡混合5s，离心管中形成乳浊液，然后静置，乳浊液分离成清晰的水、正己烷两相，并在水、正己烷相界面处形成有金属光泽的Au纳米膜，环丙沙星吸附在Au纳米膜上，倒置并打开离心管除去上层正己烷相，得Au纳米膜浮于水面的测试体系，将吸附有环丙沙星的Au纳米膜置于测试平台上进行SERS测试，测试结果见图1中的曲线c所示；

从图1曲线a中可以看出，环丙沙星的主要特征拉曼峰:650 cm^-1为萘啶环呼吸振动；755 cm^-1为萘啶环上环丙烷骨架的面内变形振动；1380 cm^-1为O-C-O 对称伸缩振动。10^-1mol/L环丙沙星溶液的NRS中特征拉曼峰信号很弱，说明不使用任何增强基底，直接对环丙沙星溶液进行拉曼测试不能得到很强的信号。在使用了Au纳米溶胶作为SERS活性基底后(图1曲线b)，环丙沙星溶液SERS中的特征拉曼峰强度明显增加。在使用Au MLF作为SERS活性基底后(图1曲线c)，环丙沙星SERS中的特征拉曼峰强度进一步增强。这个现象说明AuMLF具有比普通的Au纳米溶胶更强的SERS增强性能。

实施例4：

考察漩涡混合时间对SERS信号的影响：

重复实施例3中的Au MLF作为活性基底的测试过程，但是漩涡混合替换为0s、5s、10s、20s、30s和60s，对最终制得的Au纳米膜进行SERS测试，测试结果分别见图2A中的曲线a、曲线b、曲线c、曲线d、曲线e和曲线f所示。从图2A可以看出涡旋时间较短时，其SERS信号较弱，增加涡旋时间后，其SERS信号显著增强，且呈现先增强后减弱的趋势。

其中环丙沙星在1380 cm^-1处特征峰强度随涡旋时间的变化曲线见图2B所示，从图2B可以看出，涡旋时间在0~5 s范围内时，随着涡旋时间的增加，其SERS信号增加。当涡旋时间为5 s时，环丙沙星的SERS信号最强，而涡旋时间进一步增加后，环丙沙星的SERS信号反而下降，并在涡旋时间30 s后，下降趋势变缓。这可能是因为随着涡旋时间的增加，Au MLF基底的单位面积内的Au纳米粒子数目逐渐增多，相邻的Au纳米粒子有机会互相接近产生“热点”，因此环丙沙星的SERS信号逐渐增强并达到最大。进一步增加涡旋时间后，由于单位面积内的Au纳米粒子数目持续增加，Au纳米粒子被迫拥挤在一起，“热点”减少，甚至失去准单层结构，故涡旋时间过长后环丙沙星的SERS信号会减弱。

实施例5：

考察正己烷加入量对SERS信号的影响：

重复实施例3中的Au MLF作为活性基底的测试过程，但是正己烷的加入量替换为50μL、100μL、200μL、400μL、600μL和800μL，对最终制得的Au纳米膜进行SERS测试，测试结果分别见图3A中的曲线a、曲线b、曲线c、曲线d、曲线e和曲线f所示。从图3A可以看出，相较于涡旋时间对环丙沙星SERS信号的影响，正己烷的体积对环丙沙星SERS信号影响不明显。在正己烷体积较少时，环丙沙星的SERS信号很弱，且随着正己烷的体积增大，SERS信号出现了先增强后缓慢减弱的趋势。

其中环丙沙星在1380 cm^-1处特征峰强度随正己烷加入量的变化曲线见图3B所示，从图3B可以看出，在正己烷体积为50~800μL范围内，随着正己烷体积的增加，其SERS信号先增强后自200μL后缓慢减弱，因此，综合从节约溶剂和信号强度角度考虑，选择200μL作为最佳体积。

实施例6：

绘制环丙沙星的标准曲线：

取0.05g环丙沙星固体于烧杯中，加入适量的pH=6的HCl水溶液溶解，然后转移至100mL的容量瓶内，用PH=6的HCl水溶液定容，即得到500μg/mL的环丙沙星的标准储备液，然后用超纯水逐级稀释得到环丙沙星浓度为100.0μg/mL、75μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL和5μg/mL的6种标准工作液。

上述配制的6种标准工作液，分别取40μL与360μL的实施例1所得Au纳米溶胶置于离心管中，加入200μL的正己烷，使用Scilogex MX-F固定式漩涡混匀仪于2500r/min下漩涡混合5s，离心管中形成乳浊液，然后静置，乳浊液分离成清晰的水、正己烷两相，并在水、正己烷相界面处形成有金属光泽的Au纳米膜，环丙沙星吸附在Au纳米膜上，倒置并打开离心管除去上层正己烷相，得Au纳米膜浮于水面的测试体系，在Au纳米膜浮于水面的测试体系中，环丙沙星浓度分别为10μg/mL、7.5μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1μg/mL和0.5μg/mL，将吸附有环丙沙星的Au纳米膜分别置于测试平台上进行SERS测试，测试结果分别见图4A中的曲线f、曲线e、曲线d、曲线c、曲线b和曲线a所示，从图4A看以看出，随着环丙沙星浓度的增加，拉曼光谱峰强度逐渐增强。

从图4A可以看出，环丙沙星浓度低至0.5μg/mL时，环丙沙星在650cm⁻¹处拉曼特征峰依然能被观察到。

其中，环丙沙星在650cm^-1处特征峰强度随环丙沙星浓度的变化曲线见图4B所示，从图4B看以看出，标准工作液中的环丙沙星浓度在5~100μg/mL（即测试体系内环丙沙星浓度在0.5~10μg/mL）时，环丙沙星浓度与拉曼光谱峰强度之间具备良好的线性关系。以标准工作液中环丙沙星的浓度为横坐标，以图4A中检测到的环丙沙星在650cm^-1处特征峰强度为纵坐标绘制标准曲线，绘制的标准曲线见图4B，计算回归方程I =1.144C +0.423，线性相关系数r = 0.956，I为环丙沙星在650 cm^-1处特征峰强度，C为标准工作液中的环丙沙星浓度。

按照14次空白试验所对应的响应值I_SERS（拉曼光谱强度）的3倍标准偏差，求得AuMLF作为活性基底时，环丙沙星的检出限为0.34μg/mL。

实施例7 鱼肉样品中痕量环丙沙星的实际检测，步骤过程如下：

1）样品提取：称取阴性鱼肉泥0.4 g（精确到 0.01 g）置于4 mL聚丙烯离心管中，加入1.6 mL 的0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，使用Scilogex MX-F固定式漩涡混匀仪于1000 r/min下旋涡混合1 min，超声提取10 min，在10000 r/min转速下离心5 min（离心温度低于2~4℃），收集上清液，沉淀物按照上述方法重复操作提取1次，合并2次上清液，用快速滤纸过滤，得待净化提取溶液；

2）样品净化：HLB 固相萃取柱（200 mg，3 mL），使用时先向HLB 固相萃取柱通入3.0 mL甲醇进行活化，随后通入3.0 mL水进行平衡，将步骤1）所得待净化提取溶液以2~3 mL/min的速度过柱，弃去从HLB 固相萃取柱内流出的滤液，用2.0 mL的5%甲醇水溶液过柱淋洗，弃去从HLB 固相萃取柱内流出的淋洗液，将小柱抽干，再用3.0 mL甲醇过柱洗脱并收集洗脱液，洗脱液用氮气吹干，用超纯水定容得到3.0 mL的基质液。

3）样品检测：取40μL步骤2）所得基质液与360μL的实施例1所得Au纳米溶胶置于离心管中，加入200μL的正己烷，使用Scilogex MX-F固定式漩涡混匀仪于2500r/min下漩涡混合5s，离心管中形成乳浊液，然后静置，乳浊液分离成清晰的水、正己烷两相，并在水、正己烷相界面处形成有金属光泽的Au纳米膜，环丙沙星吸附在Au纳米膜上，倒置并打开离心管除去上层正己烷相，得Au纳米膜浮于水面的测试体系，将吸附有环丙沙星的Au纳米膜分别置于测试平台上进行SERS测试，测试结果代入实施例6所得回归方程，即可推断出阴性鱼肉泥中的环丙沙星含量。

为了验证上述测试方法在复杂基质的环境下的检测效果，对阴性鱼肉泥进行加标实验。采集了三种加标浓度(0.5、5.0和10.0μg/mL)的阴性鱼肉泥的SERS信号，进行回收率的分析，分析结果如表1所示，从表1可以看出，目标分析物环丙沙星在3个加标浓度下的回收率为84.6~103.8%，测定结果RSD在2.34~7.30%之间，说明该方法的精密度和准确度较好。

表1 方法的精密度和准确度分析

本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。

Claims

1.一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤1）中，柠檬酸盐水溶液的质量分数为2~6%；HAuCl₄水溶液的质量分数为0.02~0.06%，HAuCl₄水溶液与柠檬酸盐水溶液的体积比为40~60:1。

3.根据权利要求2所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于所述柠檬酸盐为柠檬酸钠或柠檬酸钾。

4.根据权利要求1所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤3）中，正己烷与标准工作液的体积比为0.25~2:1。

5. 根据权利要求1所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤4）中，正己烷与Au纳米溶胶的体积比为0.25~2:1；基质液与Au纳米溶胶的体积比为1 : 8~10。

6.根据权利要求1所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤3）或步骤4）中，进行漩涡混合的转速为2400~2600r/min，进行漩涡混合的时间为0~60s。

7.根据权利要求1所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤4）中，提取溶剂为EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，EDTA-Mcllvaine缓冲溶液的浓度为0.05~0.15mol/L，优选为0.1mol/L。

8. 根据权利要求1所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤4）中，采用HLB 固相萃取柱进行柱层析净化，进行柱层析净化的洗脱剂为甲醇。

9.根据权利要求1所述的一种鱼肉中痕量环丙沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤2）的6种标准工作液中，环丙沙星的浓度分别为100μg/mL、75μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL和5μg/mL。