CN110927139A

CN110927139A - 一种鱼肉中痕量恩诺沙星的sers检测方法

Info

Publication number: CN110927139A
Application number: CN201911181674.5A
Authority: CN
Inventors: 滕渊洁; 王珍妮; 任泽宇
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2020-03-27

Abstract

本发明公开了一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，方法为：首先制备Ag纳米溶胶，Ag纳米溶胶中加入油相溶剂和相转移催化剂，漩涡混合，静置，形成清晰的水、油两相，除去油相，得Ag纳米膜浮于水面的测试体系，以Ag纳米膜为SERS基底可有效对恩诺沙星进行分析检测。对鱼肉中痕量恩诺沙星进行检测时，用提取溶剂对鱼肉匀浆中的恩诺沙星进行提取，提取后的上清液进行柱层析净化，收集洗脱液并蒸干，然后用甲醇复溶后，即得待测样品，待测样品与Ag纳米溶胶、油相溶剂和相转移催化剂混合，经过一系列步骤制备得到Ag纳米膜后，即可进行检测。本发明利用界面自组装技术制备Ag纳米单层膜，检测鱼肉中痕量恩诺沙星时具有快速、简单、增强效果好的优点。

Description

一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法

技术领域

本发明涉及一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法。

背景技术

恩诺沙星也称为乙基环丙沙星，是一种合成的第三代氟喹诺酮类抗菌药物，仅用于牲畜和家禽。但是，滥用抗生素已经引起了耐药性，甚至出现了多药耐药的病原体，这些残留的药物可能会通过食物链积聚在人体中，引起一系列的副作用。

目前，对鱼肉中的抗生素常用检测方法主要包括高效液相色谱、液相色谱串联质谱法、毛细管电泳、气相色谱结合质谱、液相色谱-电喷雾-串联质谱分析和高效液相色谱-串联质谱法。这些方法是用于在各种环境中定性/定量测定抗生素的最传统的方法，具有灵敏度和准确度较高、应用范围广的优点。然而，昂贵的设施、复杂的前处理和繁琐的操作限制了这种方法分析应用。与上述几种检测方法相比，SERS操作简单直接，具有指纹识别特征和单分子水平灵敏度的优异性，已被广泛应用于分析分子与金属纳米材料之间的相互作用，使用SERS活性基底进行抗生素检测，检测灵敏度大幅提高，并可以达到痕量检测。

发明内容

针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法。

所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备Ag纳米溶胶：取AgNO₃水溶液和PVA水溶液超声混合后，加入到冰冷的NaBH₄水溶液中，剧烈搅拌下观察到溶液颜色由无色立即变为棕黄色，然后将混合物煮沸0.5～1.5h以分解过量的NaBH₄，停止加热，搅拌冷却至室温，得Ag纳米溶胶，冷藏保存备用；

2)制备标准工作液：取恩诺沙星用甲醇溶解，得到恩诺沙星的标准储备液备用；取阴性鱼肉匀浆和水相提取溶剂置于离心管中，混合均匀，然后超声提取，取上清液过滤，滤液进行柱层析净化，收集洗脱液并用旋转蒸发仪蒸干，然后用甲醇复溶得到阴性基质液；用所得阴性基质液稀释上述配制的标准储备液，配制不同浓度恩诺沙星的9种标准工作液，冷藏保存；

3)制作标准曲线：步骤2)所得9种标准工作液分别置于离心管中，离心管中加入油相溶剂、相转移催化剂和步骤1)所得Ag纳米溶胶后漩涡混合，离心管中形成乳浊液，然后静置，乳浊液分离成清晰的水、油两相，并在水、油相界面处形成有银属光泽的Ag纳米膜，且恩诺沙星吸附在所述Ag纳米膜上，除去油相后，将吸附有恩诺沙星的Ag纳米膜置于测试平台上进行SERS测试，以标准工作液中恩诺沙星的浓度为横坐标和测试得到的拉曼光谱强度为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程；

4)测定鱼肉中恩诺沙星的含量：鱼肉匀浆和水相提取溶剂置于离心管中，混合均匀，然后超声提取，取上清液过滤，滤液进行柱层析净化，收集洗脱液并用旋转蒸发仪蒸干，然后用甲醇复溶得到阳性基质液；取步骤1)Ag纳米溶胶置于离心管中，离心管中加入所述阳性基质液、油相溶剂和相转移催化剂后漩涡混合，离心管中形成乳浊液，然后静置，乳浊液分离成清晰的水、油两相，并在水、油相界面处形成有银属光泽的Ag纳米膜，除去油相后，将Ag纳米膜置于测试平台上进行SERS测试，检测到的拉曼光谱强度代入回归方程，即可推断出鱼肉中恩诺沙星的含量。

所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤1)中，PVA水溶液的质量分数为0.08～0.12％；AgNO₃水溶液的质量分数为0.06～0.10％，NaBH₄水溶液的质量分数为0.006～0.010％，NaBH₄水溶液、AgNO₃水溶液与PVA水溶液的体积比为8～12:1～3:1。

所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤3)和步骤4)中，油相溶剂均为二氯甲烷、三氯甲烷、苯、甲苯、环己烷或正己烷，优选为正己烷。

所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤3)和步骤4)中，相转移催化剂均为十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵或四丁基溴化铵，优选为十六烷基三甲基溴化铵。

所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤3)或步骤4)中，相转移催化剂与油相溶剂的体积比在1:16～23，优选为1:20。

所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤3)中，每种标准工作液与油相溶剂的体积比均为1:0.25～6，优选为1:1；步骤4)中，水相提取溶剂与油相溶剂的体积比为1:0.25～6，优选为1:1。

所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤3)或步骤4)中，进行漩涡混合的转速为2400～2600r/min，优选为2500r/min；进行漩涡混合的时间为5～60s，优选为40s。

所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤2)或步骤4)中，水相提取溶剂为EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，EDTA-Mcllvaine缓冲溶液的浓度为0.05～0.15mol/L，优选为0.1mol/L。

所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤2)或步骤4)中，采用HLB固相萃取柱进行柱层析净化，进行柱层析净化的洗脱剂为甲醇。

所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤2)配制的9种标准工作液中，恩诺沙星的浓度分别为700、600、500L、100、80、60、40、20、10μg/mL。

相对于现有技术，本发明取得的有益效果是：

1)本发明制备的Ag纳米单层膜致密均匀且稳定，且对SERS信号增强效果在痕量分析时较为理想，在Ag纳米单层膜的制备过程中，PVA的添加可有效阻止Ag纳米颗粒团聚，且本发明通过实验发现使用十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵或四丁基溴化铵等作为相转移催化剂的情况下，Ag的成膜状态及成膜效率均较好，且形成的Ag纳米单层膜具有很好的SERS信号增强效果。

2)本发明利用液液界面自组装技术结合相转移催化剂制备Ag纳米单层膜(AgMLF)，具有快速、简单、增强效果好的优点。Ag MLF相较于Ag溶胶，具有更好的均匀性和一致性。待测分子在形成Ag MLF之前直接加入且不影响膜的性能，同时待测分子被诱导至界面的银纳米颗粒携带至界面处，对其进行SERS检测操作更为省时高效，整个检测过程不到1分钟。由于制备过程操作简单方便，相转移催化剂分子结构简单可以尽可能小的降低SERS基底背景干扰信号，降低检测限。本发明的方法可进一步应用于其他氟喹诺酮类抗生素的检测。

附图说明

图1为恩诺沙星溶液的Au纳米溶胶的SERS光谱、恩诺沙星溶液的Au单层膜的SERS光谱、恩诺沙星溶液的Ag纳米溶胶的SERS光谱和恩诺沙星溶液的Ag MLF基底的SERS光谱的对比图；

图2A为实施例4中油相溶剂种类的恩诺沙星的SERS信号谱图；

图2B为实施例4中恩诺沙星在1390cm^-1处特征峰强度随油相溶剂种类变化的曲线图；

图3A为实施例5中正己烷体积对SERS信号的影响图；

图3B为实施例5中恩诺沙星在1390cm^-1处特征峰强度随正己烷加入体积变化的曲线图；

图4A为实施例6中十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对SERS信号的影响图；

图4B为实施例6中十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)对SERS信号的影响图；

图4C为实施例6中四丁基溴化铵(TBAB)对SERS信号的影响图；

图4D为实施例6中恩诺沙星在1390cm^-1处特征峰强度随相转移催化剂种类变化的曲线图；

图5A为实施例7中十六烷基三甲基溴化铵加入体积对SERS信号的影响图；

图5B为实施例7中恩诺沙星在1390cm^-1处特征峰强度随十六烷基三甲基溴化铵体积变化的曲线图；

图6A为实施例8中不同漩涡时间的恩诺沙星的SERS信号谱图；

图6B为实施例8中恩诺沙星1390cm^-1处特征峰强度随涡旋时间变化的曲线图；

图7A为实施例9中不同浓度的恩诺沙星的SERS信号图谱；

图7B为实施例9中恩诺沙星1390cm^-1处特征峰强度随其浓度变化的曲线；

图8为实际阳性鱼肉样品的恩诺沙星含量检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

本发明使用的仪器与试剂如下：

仪器：LabRAM HR UV 800激光共聚焦显微拉曼光谱仪(法国JOBIN YVON公司)，激光器是He-Ne激光器，激光发射波长为632.18nm，共焦孔径和光栅刻线数分别是300μm和600lines.mm^-1，物镜为50倍长焦镜头；CARY100紫外-可见分光光谱仪(美国VARIAN公司)；美国Scilogex MX-F固定式漩涡混匀仪。

试剂：恩诺沙星(99.0％)，硝酸银(99.9％)，硼氢化钠(99.9％)，PVA(99.0～99.4％)，甲醇(99.9％)，正己烷(99.9％)，环己烷(99.9％)，甲苯(99.9％)，苯(99.9％)，二氯甲烷(99.9％)，氯仿(99.9％)，柠檬酸(99.9％)，磷酸氢二钠(99.9％)，EDTA(99.9％)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，99.9％)，十二烷基三甲基溴化铵(DTAB，99.9％)，四丁基溴化铵(TBAB，99.9％)均从阿拉丁(上海，中国)购买。含恩诺沙星阴性鱼肉样品由浙江省湖州市长兴县疾病预防控制中心提供。实验用水为18.25MΩcm超纯水(由HUMAN UP 900型超纯水仪制得)。

以下实施例中，SERS光谱的测试方法是：使用632nm的光源作为激发光，光能量变化范围为30到60m W，积分时间为40s，拉曼测试扫描范围均为400～2000cm^-1。

实施例1：

制备Ag纳米溶胶的方法，步骤如下：取50mL质量浓度为0.08％AgNO₃水溶液和25mL质量分数为0.1％的PVA水溶液混合超声5min，将混合溶液平均分为三批加入到有150mL质量浓度为0.008％冰冷NaBH₄水溶液的250ml烧瓶中，剧烈搅拌下，可观察到溶液颜色由无色马上变为棕黄色，最后在冷凝回流条件下将混合物煮沸约1h以分解过量的NaBH₄，停止加热，搅拌冷却至室温，得Ag纳米溶胶，放于4℃冰箱冷藏保存备用。

制备Au纳米溶胶的方法，步骤如下：取100mL质量浓度为0.04％的HAuCl₄水溶液置于烧瓶中，剧烈搅拌下加热至沸腾后，迅速加入2mL质量浓度为4％的柠檬酸钠水溶液，混合溶液颜色由浅黄色逐渐变为酒红色，待混合溶液颜色变化稳定后，冷凝回流15min，停止加热，搅拌冷却至室温，得Au纳米溶胶，放于4℃冰箱冷藏保存备用。

实施例2：

Ag MLF基底的制备方法，步骤如下：

取实施例1所得Ag纳米溶胶380μL置于离心管中，加入380μL正己烷，19μL十六烷基三甲基溴化铵后，将离心管转移至Scilogex MX-F固定式漩涡混匀仪中，于2500r/min下漩涡混合40s，离心管中形成乳浊液，然后静置，乳浊液分离成清晰的水、正己烷两相，并在水、正己烷相界面处形成有金属光泽的Ag纳米膜，倒置并打开离心管除去上层正己烷相，得Ag纳米膜浮于水相表面，Ag纳米膜即为Ag MLF基底。

实施例3：

Ag纳米溶胶对恩诺沙星的SERS增强效果：取20μL的500μg/mL恩诺沙星溶液与380μL实施例1制备的Ag纳米溶胶混合后，滴于测试平台上进行SERS光谱测试，500μg/mL恩诺沙星溶液的Ag纳米溶胶的SERS光谱，测试结果如图1中的曲线c所示。

Au纳米溶胶对恩诺沙星的SERS增强效果：取20μL的500μg/mL恩诺沙星溶液与380μL实施例1制备的Au纳米溶胶混合后，滴于测试平台上进行SERS光谱测试，500μg/mL恩诺沙星溶液的Au纳米溶胶的SERS光谱，测试结果如图1中的曲线a所示。

Ag MLF活性基底对恩诺沙星的SERS增强效果：取380μL实施例1制备的Ag纳米溶胶置于4mL的聚丙烯离心管中，加入20μL的500μg/mL恩诺沙星溶液，再加入19μL十六烷基三甲基溴化铵和380μL正己烷(正己烷即油相溶剂)后，将离心管转移至Scilogex MX-F固定式漩涡混匀仪中，于2500r/min下漩涡混合40s，离心管中形成乳浊液，然后静置，乳浊液分离成清晰的水、正己烷两相，并在水、正己烷相界面处形成有金属光泽的Ag纳米膜，恩诺沙星吸附在Ag纳米膜上，倒置并打开离心管除去上层正己烷相，得Ag纳米膜浮于水面的测试体系，将吸附有恩诺沙星的Ag纳米膜置于测试平台上进行SERS测试，500μg/mL恩诺沙星溶液的Ag单层膜的SERS光谱，测试结果如图1的曲线d所示。

Au MLF活性基底对恩诺沙星的SERS增强效果：重复实施例3中上述Ag MLF活性基底对恩诺沙星的SERS增强效果的测试过程，不同之处在于：将380μL实施例1制备的Ag纳米溶胶替换为380μL实施例1制备的Au纳米溶胶，其他操作条件不变。最终将吸附有恩诺沙星的Au纳米膜置于测试平台上进行SERS测试，500μg/mL恩诺沙星溶液的Au单层膜的SERS光谱，测试结果如图1的曲线b所示。

从图1中可以看出，上述四个SERS底物上的恩诺沙星特征峰基本相同。Au纳米溶胶作为SERS活性基底后SERS信号非常弱，几乎检测不到。Ag纳米溶胶作为SERS基底SERS信号稍强于Au纳米溶胶。而金属纳米膜的SESR信号均强于金属溶胶，且Ag MLF的SERS信号最强。这个现象说明金属纳米膜具有比普通的金属纳米颗粒的胶体更强的SERS性能。对于纳米粒子聚集体或阵列，每个粒子中的等离子体共振可能被耦合，导致等离子体激元波长的变化或强度的变化。因此Ag MLF比普通的Ag溶胶具有更强的局域电磁场耦合共振。此外，由于恩诺沙星溶液时是在形成Ag MLF之前加入的，在形成Ag MLF的过程中，恩诺沙星被诱导至界面的Ag NPs携带至界面处，类似于一种浓缩的过程，导致界面处恩诺沙星的浓度高于体相中恩诺沙星的浓度。

实施例4：

考察油相溶剂种类对SERS信号的影响：

重复实施例3中的Ag MLF作为活性基底的测试过程，但是油相溶剂替换为同等体积量的二氯甲烷、三氯甲烷、苯、甲苯、环己烷或正己烷，对最终制得的Ag纳米膜分别进行SERS测试，测试结果分别见图2A中的曲线a、曲线b、曲线c、曲线d、曲线e和曲线f所示。其中恩诺沙星在1390cm-¹处特征峰强度随油相溶剂种类变化的曲线见图2B所示。

对于不互溶的两相液体的界面张力γ_o/w可以有公式(1)进行估算：

其中γo是油相的表面张力，γ_w是水的表面张力，

是水的色散力。表1是通过查阅各溶剂表面张力后，通过公式(1)估算所得不同油相对水的界面张力。颗粒在界面吸附能力的强弱可用颗粒的界面脱附能的大小ΔE来表征，有公式

ΔE＝-πr²γ_o/w(1±cosθ)² (2)

其中r是纳米粒子的半径，γ_o/w是界面张力，θ是纳米粒子在界面的接触角，可以看出，无论θ如何变化，始终有ΔE＜0，因此，界面能的降低是金属纳米粒子进行界面自组装的主要驱动力。通过公式(2)计算可知，界面张力越大，界面能降低得越多，越容易在液液两相界面自组装，被诱导至界面的Ag纳米粒子携带至界面处的恩诺沙星的量就越多，SERS信号越强。此外，由于二氯甲烷和三氯甲烷密度比水大，并且细针筒无法抽取出下层全部的油相，倒置离心管并打开过程中会使一部分恩诺沙星流失(当以二氯甲烷或三氯甲烷这类密度比水大的非极性有机溶剂作为油相时，使用细针筒抽取以去除下层油相；当以苯、甲苯、环己烷或正己烷这类密度比水小的非极性有机溶剂作为油相时，倒置离心管并打开去除上层油相)，所以SERS信号较弱。

表1不同油相对水的界面张力

可以看出，表1中的计算结果与图3中测试结果相对应，可以通过计算非极性有机溶剂与水之间的界面张力，能推测哪种类型的非极性有机溶剂作为油相，可能具有较好的Ag纳米膜制备效果。

实施例5：

考察Ag纳米溶胶与正己烷的体积比对SERS信号的影响：

重复实施例3中的Ag MLF作为活性基底的测试过程，但是正己烷加入量以Ag溶胶(380μL)与正己烷体积比为1:0.25，1:0.5，1:1，1:2，1:3，1:4，1:5和1:6的量进行替换，即正己烷的添加体积分别是95,190,380,760,1140,1520,1900,2280μL，对最终制得的Ag纳米膜分别进行SERS测试，测试结果分别见图3A中的曲线a、曲线b、曲线c、曲线d、曲线e、曲线f、曲线g和曲线h所示。恩诺沙星在1390cm^-1处特征峰强度随随正己烷加入体积变化的曲线见图3B所示。从图3A和图3B可以看出，随着正己烷的量的增加恩诺沙星的SERS信号逐渐增强，在正己烷的加入量为380μL时，也就是Ag溶胶与正己烷的体积为1:1时SERS信号达到最强，但在正己烷体积大于Ag溶胶后，恩诺沙星的SERS信号明显开始减弱。综合从节约溶剂和信号强度角度，正己烷的体积为380μL时，效果最佳。

实施例6：

考察相转移催化剂种类对SERS信号的影响：

重复实施例3中的Ag MLF作为活性基底的测试过程，但是相转移催化剂替换为同等体积量的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)或四丁基溴化铵(TBAB)，对最终制得的Ag纳米膜分别进行SERS测试，测试结果分别见图4A、4B、4C所示。恩诺沙星在1390cm^-1处特征峰强度随相转移催化剂种类变化的曲线见图4D所示。

分子结构不同的相转移催化剂其表面活性效率不同，由于用NaBH₄还原制得的Ag胶体中的Ag纳米颗粒带有负电荷，因此选择了与金属Ag纳米粒子电荷相反的具有不同分子结构的疏水性阳离子的相转移催化剂。该方法的优点是疏水阳离子更倾向于留在油相中，并且不直接吸附在金属Ag纳米颗粒上，从而便于进行SERS测量。

从图4A、4B、4C可以明显看出，使用这三种相转移催化剂的SERS增强信号几乎无异。但在实验过程中发现，在加入CTAB时涡旋混合20s后所形成的银膜的状态最好，银膜致密且均匀，完整的平铺在样品盖里。这是因为随着烷基碳链长度的增加，其水溶性呈下降趋势，CTAB相比于DTAB水溶性低得多，通过涡旋后会更快的转移到油相中去，因此被阳离子基团吸引的Ag纳米颗粒聚集到界面上的速率更快。相比于CTAB和DTAB，TBAB具有较大的空间位阻，带有负电荷的Ag纳米颗粒与TBA⁺结合相对困难。不过，相信随着涡旋时间的增加，这三种相转移催化剂都会使Ag纳米颗粒在水油两相界面上完整的成膜。从成膜效率上考虑，CTAB为最佳。

实施例7：

考察十六烷基三甲基溴化铵加入量对SERS信号的影响：

重复实施例3中的Ag MLF作为活性基底的测试过程，但是十六烷基三甲基溴化铵加入量分别替换为17，18，19，20，21，22，23μL，对最终制得的Ag纳米膜分别进行SERS测试，测试结果分别见图5A中的曲线a、曲线b、曲线c、曲线d、曲线e、曲线f和曲线g所示。恩诺沙星在1390cm^-1处特征峰强度随十六烷基三甲基溴化铵体积变化的曲线见图5B所示。

界面处高质量膜的形成很大程度上取决于所用相转移催化剂的量。相转移催化剂用量太少的话不能破坏界面平衡，这会通过界面有序效应阻碍排列，而如果相转移催化剂用量所用量太多则难以在液液界面获得均匀的薄膜。从图5A和图5B中可以看出，加入的十六烷基三甲基溴化铵体积对SERS信号增强整体影响不大，在十六烷基三甲基溴化铵体积为19μL时SERS信号相对稳定，表示银膜较为均匀，因此，综合从成膜状态和信号强度角度考虑，十六烷基三甲基溴化铵的最佳体积为19μL。

实施例8：

考察漩涡混合时间对SERS信号的影响：

重复实施例3中的Ag MLF作为活性基底的测试过程，但是漩涡混合时间分别替换为5，10，20，30，40，50，60s，对最终制得的Ag纳米膜分别进行SERS测试，测试结果分别见图6A中的曲线a、曲线b、曲线c、曲线d、曲线e、曲线f和曲线g所示。恩诺沙星在1390cm^-1处特征峰强度随涡旋时间变化的曲线见图6B所示。

十六烷基三甲基溴化铵的阳离子基团水解可自发在油界面形成正电荷，然后它们可以通过静电吸引去吸引带负电荷的Ag纳米颗粒。涡旋这种机械冲击既增加了水相和油相的接触表面，又提高了粒子动能，以加速颗粒运动和界面形成。涡旋时间越长，单位面积内Ag纳米粒子数的增多，会使Ag纳米膜变得越致密。因此控制涡旋时间可以调控Ag纳米膜中相邻Ag纳米粒子的间距，进而控制“热点”数量，可以激发热点附近的分子并显示出显著的SERS增强。

从图6A和图6B可以看出，涡旋时间较短时，SERS信号较弱，增加涡旋时间后，SERS信号显著增强，且呈现先增强后减弱的趋势。当涡旋时间为40s时，SERS信号最强，而涡旋时间进一步增加后，SERS信号反而下降，并在涡旋时间40s后，下降趋势变缓。这是因为随着涡旋时间的增加，单位面积内的Ag纳米粒子数目逐渐增多，相邻的Ag纳米粒子互相接近产生“热点”，实现局部表面等离子体共振，因此SERS信号逐渐增强并达到最大。进一步增加涡旋时间后，由于单位面积内的Ag纳米粒子数目持续增加，Ag纳米粒子被迫拥挤在一起，银膜加厚，有可能失去了单层结构，使得待测分子无法进入到银膜的缝隙里，故涡旋时间过长后SERS信号会减弱。

实施例9：

绘制恩诺沙星的标准曲线：

称取0.10g恩诺沙星固体于烧杯中，加入适量甲醇溶解，然后转移至于100mL的棕色容量瓶中用甲醇定容，得到浓度为1000μg/mL的恩诺沙星的标准储备液。

1)样品提取：称取阴性鱼肉匀浆0.40g置于4mL聚丙烯离心管中，加入1.6mL的0.1mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，使用Scilogex MX-F固定式漩涡混匀仪于1000r/min下旋涡混合1min，超声提取10min，在10000r/min转速下离心5min，收集上清液，按照上述方法重复操作提取2次，合并3次上清液，得待净化提取溶液；

2)样品净化：HLB固相萃取柱(200mg，3mL)，使用时先向HLB固相萃取柱通入3.0mL甲醇进行活化，随后通入3.0mL水进行平衡，将步骤1)所得待净化提取溶液以2～3mL/min的速度过柱，弃去从HLB固相萃取柱内流出的滤液，用2.0mL的5％甲醇水溶液过柱淋洗，弃去从HLB固相萃取柱内流出的淋洗液，将小柱抽干，再用3.0mL甲醇过柱洗脱并收集洗脱液，洗脱液用旋转蒸发仪蒸干，用甲醇定容得到3.0mL阴性鱼肉基质液。多次重复以上操作合并阴性鱼肉基质液待使用。

3)制备标准工作液：取步骤2)得到的阴性鱼肉基质液，逐级稀释上述配制的1000μg/mL恩诺沙星的标准储备液，得到恩诺沙星浓度依次为700μg/mL、600μg/mL、500μg/mL、100μg/mL、80μg/mL、60μg/mL、40μg/mL、20μg/mL和10μg/mL的9种标准工作液。

4)样品检测：步骤3)所得9种标准工作液，分别量取20μL与380μL的实施例1所得Ag纳米溶胶置于离心管中，加入380μL的正己烷和19μL十六烷基三甲基溴化铵，使用ScilogexMX-F固定式漩涡混匀仪于2500r/min下漩涡混合40s，离心管中形成乳浊液，然后静置，乳浊液分离成清晰的水、正己烷两相，并在水、正己烷相界面处形成有银属光泽的Ag纳米膜，恩诺沙星吸附在Ag纳米膜上，倒置并打开离心管除去上层正己烷相，得Ag纳米膜浮于水面的测试体系，将吸附有恩诺沙星的Ag纳米膜分别置于测试平台上进行SERS测试，测试结果分别见图7A中的曲线i、曲线h、曲线g、曲线f、曲线e、曲线d、曲线c、曲线b和曲线a所示。恩诺沙星在1390cm^-1处特征峰强度随其浓度的变化曲线见图7B所示。

从图7A看以看出，随着恩诺沙星浓度的增加，拉曼光谱峰强度逐渐增强。从图7B可以看出，在10～500μg/mL范围内具有良好的线性关系线性方程为I＝0.0036C+0.1074，线性相关系数r＝0.9976。恩诺沙星浓度低至10μg/mL时，恩诺沙星在1390cm^-1处拉曼特征峰依然能被观察到。按照14次空白试验所对应的响应值I_SERS(拉曼光谱强度)的3倍标准偏差，求得Ag MLF作为活性基底时，恩诺沙星的检出限为0.71μg/mL。

为了验证上述测试方法在复杂基质的环境下的检测效果，对阴性鱼肉匀浆进行加标实验。采集了三种加标浓度(10、100和500μg/mL)的阴性鱼肉匀浆的SERS信号，进行回收率的分析，分析结果如表2所示，从表2可以看出，目标分析物恩诺沙星在3个加标浓度下的回收率为82.5％～110.3％，相对标准偏差(RSD)为3.90％～8.58％，说明该方法的精密度和准确度较好。

表2方法的精密度和准确度分析

实施例10：

阳性鱼肉样品中痕量恩诺沙星的检测，步骤过程如下：

样品提取、样品净化过程重复实施9，但是不同之处在于：实施例9的步骤2)中，洗脱液用旋转蒸发仪蒸干后，操作步骤替换为“用甲醇定容得到30μL阳性鱼肉基质液”。

将实施例10定容得到的30μL阳性鱼肉基质液进行检测，检测过程为：量取20μL阳性鱼肉基质液与380μL的实施例1所得Ag纳米溶胶置于离心管中，加入380μL的正己烷和19μL十六烷基三甲基溴化铵，使用Scilogex MX-F固定式漩涡混匀仪于2500r/min下漩涡混合40s，离心管中形成乳浊液，然后静置，乳浊液分离成清晰的水、正己烷两相，并在水、正己烷相界面处形成有银属光泽的Ag纳米膜，恩诺沙星吸附在Ag纳米膜上，倒置并打开离心管除去上层正己烷相，得Ag纳米膜浮于水面的测试体系，将吸附有恩诺沙星的Ag纳米膜分别置于测试平台上进行SERS测试，测试结果代入实施例9所得回归方程，即可推断出鱼肉匀浆中的恩诺沙星含量，鱼肉样品中恩诺沙星的SERS光谱如图8所示。

将实施例10的检测结果代入实施例9通过标准曲线得到的回归方程，计算得到阳性鱼肉中的恩诺沙星含量为18.81μg/mL(23756μg/kg)。

由于相较于实施例9定容得到的3.0mL阴性鱼肉基质液，实施例10定容得到的30μL阳性鱼肉基质液达到了“恩诺沙星成分的浓度浓缩100倍的效果”，因此阳性鱼肉中恩诺沙星的实际含量为0.1881μg/mL(237.56μg/kg)。通过LC-MS/MS方法测定相同鱼的恩诺沙星含量为0.1718μg/mL(217μg/kg)。与LC-MS/MS方法的结果相比，SERS方法显示出较少的误差。

本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。

Claims

1.一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1）制备Ag纳米溶胶：取AgNO₃水溶液和PVA水溶液超声混合后，加入到冰冷的NaBH₄水溶液中，剧烈搅拌下观察到溶液颜色由无色立即变为棕黄色，然后将混合物煮沸0.5~1.5h以分解过量的NaBH₄，停止加热，搅拌冷却至室温，得Ag纳米溶胶，冷藏保存备用；

2）制备标准工作液：取恩诺沙星用甲醇溶解，得到恩诺沙星的标准储备液备用；取阴性鱼肉匀浆和水相提取溶剂置于离心管中，混合均匀，然后超声提取，取上清液过滤，滤液进行柱层析净化，收集洗脱液并用旋转蒸发仪蒸干，然后用甲醇复溶得到阴性基质液；用所得阴性基质液稀释上述配制的标准储备液，配制不同浓度恩诺沙星的9种标准工作液，冷藏保存；

3）制作标准曲线：步骤2）所得9种标准工作液分别置于离心管中，离心管中加入油相溶剂、相转移催化剂和步骤1）所得Ag纳米溶胶后漩涡混合，离心管中形成乳浊液，然后静置，乳浊液分离成清晰的水、油两相，并在水、油相界面处形成有银属光泽的Ag纳米膜，且恩诺沙星吸附在所述Ag纳米膜上，除去油相后，将吸附有恩诺沙星的Ag纳米膜置于测试平台上进行SERS测试，以标准工作液中恩诺沙星的浓度为横坐标和测试得到的拉曼光谱强度为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程；

4）测定鱼肉中恩诺沙星的含量：鱼肉匀浆和水相提取溶剂置于离心管中，混合均匀，然后超声提取，取上清液过滤，滤液进行柱层析净化，收集洗脱液并用旋转蒸发仪蒸干，然后用甲醇复溶得到阳性基质液；取步骤1）Ag纳米溶胶置于离心管中，离心管中加入所述阳性基质液、油相溶剂和相转移催化剂后漩涡混合，离心管中形成乳浊液，然后静置，乳浊液分离成清晰的水、油两相，并在水、油相界面处形成有银属光泽的Ag纳米膜，除去油相后，将Ag纳米膜置于测试平台上进行SERS测试，检测到的拉曼光谱强度代入回归方程，即可推断出鱼肉中恩诺沙星的含量。

2. 根据权利要求1所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤1）中，PVA水溶液的质量分数为0.08~0.12%；AgNO₃水溶液的质量分数为0.06~0.10%，NaBH₄水溶液的质量分数为0.006~0.010%，NaBH₄水溶液、AgNO₃水溶液与PVA水溶液的体积比为8~12 :1~3 : 1。

3.根据权利要求1所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤3）或步骤4）中，油相溶剂均为二氯甲烷、三氯甲烷、苯、甲苯、环己烷或正己烷，优选为正己烷。

4.根据权利要求1所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤3）或步骤4）中，相转移催化剂均为十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵或四丁基溴化铵，优选为十六烷基三甲基溴化铵。

5. 根据权利要求4所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤3）或步骤4）中，相转移催化剂与油相溶剂的体积比在1 : 16~23，优选为1 : 20。

6. 根据权利要求1所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤3）中，每种标准工作液与油相溶剂的体积比均为1 : 0.25~6，优选为1 : 1；步骤4）中，水相提取溶剂与油相溶剂的体积比为1 : 0.25~6，优选为1 : 1。

7.根据权利要求1所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤3）或步骤4）中，进行漩涡混合的转速为2400~2600r/min，优选为2500r/min；进行漩涡混合的时间为5~60s，优选为40s。

8.根据权利要求1所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤2）或步骤4）中，水相提取溶剂为EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，EDTA-Mcllvaine缓冲溶液的浓度为0.05~0.15mol/L，优选为0.1mol/L。

9. 根据权利要求1所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤2）或步骤4）中，采用HLB 固相萃取柱进行柱层析净化，进行柱层析净化的洗脱剂为甲醇。

10. 根据权利要求1所述的一种鱼肉中痕量恩诺沙星的SERS检测方法，其特征在于步骤2）配制的9种标准工作液中，恩诺沙星的浓度分别为700、600、500 L、100、80、60、40、20、10μg/mL。