CN112179859A - 一种定量检测肺炎球菌多糖含量的免疫学检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测肺炎球菌多糖含量的免疫学检测方法。包括如下步骤：(1)配置双光径免疫浊度分析仪的冲洗液；双光径免疫浊度分析仪的冲洗液由包括3‑环己胺‑2‑羟基丙磺酸配置而成；(2)采用冲洗液冲洗双光径免疫浊度分析仪，然后用其测定至少4个不同浓度的肺炎球菌多糖标准品溶液的吸光度；以肺炎球菌多糖标准品溶液的吸光度、浓度，建立肺炎球菌多糖标准品溶液的标准曲线；(3)在步骤(2)相同的条件下，测定待测样品溶液的吸光度；采用步骤(2)中标准曲线计算，得到待测样品溶液中肺炎球菌多糖的浓度，以得到待测样品中肺炎球菌多糖的含量。本发明克服了普通化学检测方法无法准确区分各型肺炎球菌多糖的困难，同时降低试验成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种定量检测肺炎球菌多糖含量的免疫学检测方法，属于药物分析领域。
背景技术
肺炎链球菌在呼吸道的感染可引起支气管炎、肺炎、中耳炎、鼻窦炎等疾病，如果肺炎链球菌侵入血液则会引起脑膜炎、败血症等更为严重的疾病。肺炎链球菌始终是导致儿童脑膜炎、菌血症、肺炎等严重疾病的首位病原菌，是引起鼻窦炎和急性中耳炎的最常见病因。迄今为止，23个血清型的肺炎链球菌多糖疫苗已经研制成功，在23价肺炎球菌多糖疫苗成品指控项目中，23价肺炎球菌多糖含量是疫苗的重要检测指标。
速率散射浊度法(LSR)则是测定各型肺炎多糖含量的主要方法。因为利用了抗原抗体的特异性反应，所以可以准确地检測23价肺炎多精疫苗中各型多糖的含量。不同于普通化学检测方法无法准确区分各型肺炎球菌多糖，该方法更为精确，并有较高的灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提供一种定量检测肺炎球菌多糖含量的免疫学检测方法。
本发明提供的一种定量检测肺炎球菌多糖含量的免疫学检测方法，包括如下步骤：
(1)配置双光径免疫浊度分析仪的冲洗液；
所述双光径免疫浊度分析仪的冲洗液由包括3-环己胺-2-羟基丙磺酸(CAPSO)配置而成；
(2)采用所述冲洗液冲洗双光径免疫浊度分析仪，然后用其测定至少4个不同浓度的所述肺炎球菌多糖标准品溶液的吸光度，检测时所述肺炎球菌多糖标准品溶液放置在样本区、血清加入UDR试剂盒后放在试剂区；以所述吸光度为纵坐标，以所述肺炎球菌多糖标准品溶液的浓度为横坐标，建立所述肺炎球菌多糖标准品溶液的标准曲线；
(3)在步骤(2)相同的条件下，测定待测样品溶液的吸光度，检测时所述待测样品溶液放置在样本区、血清加入UDR试剂盒后放在试剂区；采用步骤(2)中所述标准曲线计算，得到所述待测样品溶液中肺炎球菌多糖的浓度，以得到待测样品中肺炎球菌多糖的含量。
本发明中，所用肺炎球菌多糖标准品可购自丹麦国立血清研究所。
上述的方法中，所述双光径免疫浊度分析仪的型号为IMMAGE 800；
所述冲洗液由包括NaCl、所述3-环己胺-2-羟基丙磺酸(CAPSO)和NaoH配置而成。进一步的，根据所述冲洗液使用限期，还可以加入防腐剂。具体的，所述实验所用洗液为现用现配，无需加防腐剂。
上述的方法中，配制的1000ml所述冲洗液中，所述NaCl的用量为4～5g；所述3-环己胺-2-羟基丙磺酸的用量为2～3g，所述NaoH的含量调pH值为8.0～10.5，具体可为10.2。
上述的方法中，步骤(2)和(3)中测定吸光度采用的波长为530～670nm，具体可为670nm，90度检测角。
上述的方法中，步骤(2)和(3)中测定吸光度采用的检测模式为速率散射模式。
上述的方法中，步骤(2)和(3)中测定吸光度采用的光源为激光光源。
所述肺炎球菌多糖标准品溶液的浓度范围是1.25～25μg/ml。具体的，所述肺炎球菌多糖标准品溶液的最高浓度为25μg/ml，建立标准曲线时2倍梯度稀释，根据不同型别标准曲线建立情况，浓度范围会有所不同。
上述的方法中，采用所述双光径免疫浊度分析仪检测吸光度的方法，包括如下步骤：1)打开所述双光径免疫浊度分析仪，采用所述冲洗液冲洗反应杯；
2)装载贝克曼自带缓冲液和载贝克曼自带稀释液；
3)在所述双光径免疫浊度分析仪的自定义主界面选择所述检测模式，设定所述肺炎球菌多糖标准品、血清、所述贝克曼自带缓冲液进样体积，增益系数以及反应时间；
4)装载不同浓度的所述肺炎球菌多糖标准品溶液与其相应的血清试剂，请求定标；
5)以不同浓度的肺炎球菌多糖标准品与其相应的吸光度在所述双光径免疫浊度分析仪上建立标准曲线；
6)在所述双光径免疫浊度分析仪上手动编辑所述待测样品的架子号、位置号、样品标号、进行检测；
7)在主屏幕下，选择结果<Results>，输入相关查询的架子号、样品标号，按F1显示结果(Display Results)，即得到所述待测样品中肺炎球菌多糖的含量。
上述的方法中，步骤3)中，设定的所述肺炎球菌多糖标准品进样体积为10～25μl，具体可为20μl；
所述血清进样体积为10～25μl，具体可为20μl；
所述缓冲液进样体积为200～300μl，具体可为200μl；
所述增益系数值为1～4；所述肺炎球菌多糖为14型多糖时，选用增益系数为4，其余其它型别多糖可以是1，更具体的，所述肺炎球菌多糖为1型多糖时，选用增益系数为1进行设定，所述肺炎球菌多糖为14型多糖时，选用增益系数为4(或者1)进行设定，需根据当批次的兔抗血清质量以及具体的仪器响应值来选择；
所述反应时间为1～5min，具体可为2.5min。
上述的方法中，步骤5)中，所述标准曲线R≥0.98～0.99。
上述的方法中，所述方法适用所述待测样品包括23个血清型的肺炎链球菌多糖疫苗里每型别多糖的定量检测。
本发明具有以下优点：
本发明克服了普通化学检测方法无法准确区分各型肺炎球菌多糖的困难，同时降低试验成本，采用IMMAGE 800仪器用户自定义模式，开发了肺炎链球菌多糖的定量检测方法。该方法分别以便宜易得的NACL、CAPSO和Na0H为主要原料，配制冲洗液和贝克曼自带冲洗液上机，按照摸索出的方法进行定标，对同一批待检测多糖样品含量进行检测，两批检测结果偏差很小，不大于10％。该方法克服了外购市售洗液以及试剂盒昂贵的问题，大大降低了实验成本，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为PN1型用自制冲洗液体系肺炎球菌多糖浓度与其相应响应值的线性关系。
图2为PN1型用市售冲洗液体系肺炎球菌多糖浓度与其相应响应值的线性关系。
图3为PN14型用自制冲洗液体系肺炎球菌多糖浓度与其相应响应值的线性关系。
图4为PN14型用市售冲洗液体系肺炎球菌多糖浓度与其相应响应值的线性关系。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
1.试剂与标准物质
洗液：称取NaCl 4.5g，CAPSO 2.5g，加入纯化水1000mL，混匀溶解后，加入NaOH调PH值为10.0～10.4，于0.22μm滤膜过滤后备用，现配现用。
市售洗液：贝克曼公司
肺炎多糖标准品：PN 1型多糖标准品来源于丹麦国家血清研究所。
PN 1型多糖待测样品：SH-P201110001(1)，各项检测指标均合格。
2.仪器
(1)双光径免疫浊度分析仪(IMMAGE 800)；
(2)涡旋混匀器(HYQ-2121A)；
(3)电子天平(BT224S)。
3.实验步骤
(2)装载试剂：打开仪器，冲洗反应杯，按标准操作规程，装载缓冲液、稀释液；
(3)编程设置：自定义设置界面中，设定标准品进样体积为20μl；血清进样体积为20μl；缓冲液进样体积为200μl；增益系数值为4；
(4)装载血清试剂及标准多糖梯度样品，请求定标；
(5)以一系列不同浓度的肺炎球菌多糖标准品与其相应的吸光度在IAMMAGE800仪器上建立标准曲线；标准曲线R值＞0.99；
(6)在仪器上手动编辑待测样品的架子号、位置号、样品标号、进行检测；
(7)在主屏幕下，选择结果<Results>，输入相关查询条件(架子号、样品编号)，按F1显示结果(Display Results)。
4.实验结果
4.1自制冲洗液系统
4.1.1定标结果
4.1.2待测样品结果
4.2市售冲洗液系统
4.2.1定标结果
4.2.2待测样品结果
4.3结果分析
由以上结果可知：用自制冲洗液体系检测待测糖含量均值、变异系数以及回收率与贝克曼自带冲洗液体系检测结果一致。表明，使用自制冲洗液体系进行自定义模式多糖含量定量检测方法可行，可信。
实施例2：
1.试剂与标准物质
洗液：称取NaCl 4.5g，CAPSO 2.5g，加入纯化水1000mL，混匀溶解后，加入NaoH调PH值为10.0～10.4，于0.22μm滤膜过滤后备用，现配现用。
市售洗液：贝克曼公司
肺炎多糖标准品：PN 14型多糖标准品来源于丹麦国家血清研究所。
PN 14型多糖待测样品：JK012S14-02-20120223，各项检测指标均合格。
2.仪器
(1)双光径免疫浊度分析仪(IMMAGE 800)；
(2)涡旋混匀器(HYQ-2121A)；
(3)电子天平(BT224S)。
3.实验步骤
(2)装载试剂：打开仪器，冲洗反应杯，按标准操作规程，装载缓冲液、稀释液；
(3)编程设置：自定义设置界面中，设定标准品进样体积为20μl；血清进样体积为20μl；缓冲液进样体积为200μl；增益系数值为4(或1)；
(4)装载血清试剂及标准多糖梯度样品，请求定标；
(5)以一系列不同浓度的肺炎球菌多糖标准品与其相应的吸光度在IAMMAGE800仪器上建立标准曲线；标准曲线R值＞0.99；
(6)在仪器上手动编辑待测样品的架子号、位置号、样品标号、进行检测；
(7)在主屏幕下，选择结果<Results>，输入相关查询条件(架子号、样品编号)，按F1显示结果(Display Results)。
4.实验结果
4.1自制冲洗液系统
4.1.1定标结果
4.1.2待测样品结果
4.2市售冲洗液系统
4.2.1定标结果
4.2.2待测样品结果
4.3结果分析
由以上结果可知：用自制冲洗液体系检测待测糖含量均值、变异系数以及回收率与贝克曼自带冲洗液体系检测结果一致。表明，使用自制冲洗液体系进行自定义模式多糖含量定量检测方法可行，可信。
Claims (10)
1.一种定量检测肺炎球菌多糖含量的免疫学检测方法，包括如下步骤：
(1)配置双光径免疫浊度分析仪的冲洗液；
所述双光径免疫浊度分析仪的冲洗液由包括3-环己胺-2-羟基丙磺酸(CAPSO)配置而成；
(2)采用所述冲洗液冲洗双光径免疫浊度分析仪，然后用其测定至少4个不同浓度的所述肺炎球菌多糖标准品溶液的吸光度，检测时所述肺炎球菌多糖标准品溶液放置在样本区、血清加入UDR试剂盒后放在试剂区；以所述吸光度为纵坐标，以所述肺炎球菌多糖标准品溶液的浓度为横坐标，建立所述肺炎球菌多糖标准品溶液的标准曲线；
(3)在步骤(2)相同的条件下，测定待测样品溶液的吸光度，检测时所述待测样品溶液放置在样本区、血清加入UDR试剂盒后放在试剂区；采用步骤(2)中所述标准曲线计算，得到所述待测样品溶液中肺炎球菌多糖的浓度，以得到待测样品中肺炎球菌多糖的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述双光径免疫浊度分析仪的型号为IMMAGE 800；
所述冲洗液由包括NaCl、所述3-环己胺-2-羟基丙磺酸(CAPSO)和NaoH配置而成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：配制的1000ml所述冲洗液中，所述NaCl的用量为4～5g；所述3-环己胺-2-羟基丙磺酸的用量为2～3g，所述NaoH的含量调pH值为8.0～10.5。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中测定吸光度采用的波长为530～670nm。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中测定吸光度采用的检测模式为速率散射模式。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中测定吸光度采用的光源为激光光源。
所述肺炎球菌多糖标准品溶液的浓度范围是1.25～25μg/ml。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：采用所述双光径免疫浊度分析仪检测吸光度的方法，包括如下步骤：1)打开所述双光径免疫浊度分析仪，采用所述冲洗液冲洗反应杯；
2)装载贝克曼自带缓冲液和载贝克曼自带稀释液；
3)在所述双光径免疫浊度分析仪的自定义主界面选择所述检测模式，设定所述肺炎球菌多糖标准品、血清、所述贝克曼自带缓冲液进样体积，增益系数以及反应时间；
4)装载不同浓度的所述肺炎球菌多糖标准品溶液与其相应的血清试剂，请求定标；
5)以不同浓度的肺炎球菌多糖标准品与其相应的吸光度在所述双光径免疫浊度分析仪上建立标准曲线；
6)在所述双光径免疫浊度分析仪上手动编辑所述待测样品的架子号、位置号、样品标号、进行检测；
7)在主屏幕下，选择结果<Results>，输入相关查询的架子号、样品标号，按F1显示结果(Display Results)，即得到所述待测样品中肺炎球菌多糖的含量。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤3)中，设定的所述肺炎球菌多糖标准品进样体积为10～25μl；
所述血清进样体积为10～25μl；
所述缓冲液进样体积为200～300μl；
所述增益系数值为1～4；
所述反应时间为1～5min。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：步骤5)中，所述标准曲线R≥0.98～0.99。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法适用所述待测样品包括23个血清型的肺炎链球菌多糖疫苗里每型别多糖的定量检测。
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