CN102809656B - 一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量的测定方法，属于生物技术领域。该方法在检品供试品的制备中进行蛋白酶K处理，加入的蛋白酶K量为酶解反应体系中蛋白的含量的2～8倍，还用冷酚处理即用乙酸钠饱和冷酚溶液分离结合物中结合多糖与游离多糖，与免疫电泳检测技术联合使用测得结合疫苗成品各群游离多糖的含量。本发明方法消除了各群结合物载体蛋白在免疫电泳中对电泳迁移率等相关因素的影响，有效地分离了结合物中结合多糖与游离多糖，建立了检测4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖的适宜检测体系，具有耐用性强、准确性及精密度高的特点，建立了评价4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品质量的方法。

Description

一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量的测定方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量的测定方法。 

背景技术

奈瑟氏脑膜炎球菌（n.meningitidis），简称脑膜炎球菌，脑膜炎球菌感染是引起儿童细菌性脑膜炎的常见病因，病死率较高。由于脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗的使用，有效地控制了发病率。但是，荚膜多糖属T细胞非依赖性抗原，再次免疫不能被加强，且不能诱导2岁以下儿童产生免疫应答，有一定的局限性。以化学方法将蛋白载体共价结合到荚膜多糖上，可以使之成为T细胞依赖型抗原，从而具有免疫记忆反应，因此对5岁以下婴幼儿提供免疫保护。

研究表明，A群脑膜炎球菌多糖—白喉毒素无毒变异蛋白结合物、C群脑膜炎球菌多糖—白喉毒素无毒变异蛋白结合物、Y群脑膜炎球菌多糖—白喉毒素无毒变异蛋白结合物、W135群脑膜炎球菌多糖—白喉毒素无毒变异蛋白结合物在小鼠中具有很强的免疫原性，可刺激小鼠产生高水平的IgG，而单独的荚膜多糖不能刺激小鼠产生抗体或仅有低水平抗体产生。可见结合物中真正起作用的是与白喉毒素无毒变异蛋白结合的多糖，多糖结合疫苗中的游离多糖含量超过规定的限度会对疫苗临床使用的效果产生不利的影响，因此多糖蛋白结合物中游离多糖含量测定是多糖结合疫苗质量控制中的关键指标之一，也是反映结合疫苗质量的优劣的主要指标之一。

因为不同细菌荚膜多糖以及不同多糖结合物性质差异较大，对于单独结合物原液中游离多糖含量，A群可采用冷酚处理后通过测定磷含量获得，C、Y或W135群也可采用冷酚处理后通过测定唾液酸含量获得；A+C结合疫苗各群游离多糖含量也可分别通过前述测A群的磷含量和C群的唾液酸含量而获得，而在A、C、Y、W135群结合疫苗成品中A、C、Y、W135群结合物混合在一起，且C、Y、W135群均含有唾液酸，故无法通过测唾液酸含量获得C、Y、W135各群游离多糖含量，由于在生产3个群以上的多糖结合疫苗成品过程中存在诸多影响因素，且A、C、Y或W135群游离多糖的稳定性各不相同，而各群游离多糖含量的高低与结合疫苗成品中对应群抗原对机体免疫原性的好坏密切相关，从而影响最终产品的免疫保护效果，故需要对A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量进行分别测定，以保证最终产品的质量。

《火箭免疫电泳法定量检测4价脑膜炎球菌多糖疫苗中C群脑膜炎球菌多糖含量的方法学验证》（林云等，发表国际生物制品学杂志2008年12月第31卷第6期）中介绍了一种检测4价脑膜炎球菌多糖疫苗中C群脑膜炎球菌多糖含量的方法，解决了测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗成品各群多糖含量的技术问题，但该方法不适用于测定结合疫苗成品中各群多糖含量，因为实验证明，结合疫苗中各群结合物的载体蛋白会对火箭免疫电泳产生影响，导致结果不能真实准确地反映多糖含量，故3个群以上的多糖结合疫苗成品包括A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量的测定是一个技术难点，目前尚无该类多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量测定的通用方法，需建立一种方法准确测定该类多糖结合疫苗成品中A、C、Y、W135等各群的游离多糖含量。

抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。 这种反应即可在机体内进行，也可以在机体外进行。抗原抗体反应的特点主要有三性：即特异性、比例性、可逆性。 特异性，是抗原抗体反应的最主要特征，这种特异性是由抗原决定簇和抗体分子的超变区之间空间结构的互补性确定的。这种高度的特异性在传染病的诊断与防治方面得到有效的应用。随着免疫学技术的发展进步，还将在医学和生物学领域得到更加深入和广泛的应用，比如肿瘤的诊断和特异性治疗等。 比例性，是指抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应，在抗原抗体比例相当或抗原过剩或抗体过剩的情况下，反应最彻底，形成的免疫复合物沉淀最多、最大。而当抗原抗体比例超过此范围时，反应速度和沉淀物量都会迅速降低甚至不出现抗原抗体反应。 可逆性，是指抗原抗体结合形成复合物后，在一定条件下又可解离恢复为抗原与抗体的特性。由于抗原抗体反应是分子表面的非共价键结合，所形成的复合物并不牢固，可以随时解离，解离后的抗原抗体仍保持原来的理化特征和生物学活性。

火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起来的一项定量技术，实质上是加速度地单向扩散。在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；加入待测标本后，将抗原置阴极端，用横距2—3mA／cm的电流强度进行电泳。抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量成正比，用已知量标准抗原作对照，可以方便地测定未知标本中的抗原含量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术还没有能对3个群以上多糖结合疫苗成品中各群的游离多糖含量进行测定的方法，导致该多糖结合疫苗成品质量难以控制的缺陷和不足，其目的是提供一种可以准确并简便、快捷地测定脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量的方法。

为解决上述技术问题和达到本发明目的，本发明是通过以下技术方案实现的。本发明所提供的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量的测定方法，包括以下步骤：

（1）检品供试品的制备

①预处理：取待测的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品用注射用水按标示量复溶，取5.0ml于超滤杯中，5000～10000×g离心超滤20～40min，收集浓缩液，补注射用水至总体积为1.0ml，得超滤浓缩液；用Lowry法测定该超滤浓缩液中蛋白的浓度；

②蛋白酶K处理：酶解反应体系总体积为420μl，以所述的酶解反应体系总体积为基准，取1/6体积的超滤浓缩液，加入1/10体积的蛋白酶K缓冲液、加入蛋白酶K，加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的2～8倍，并补加注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育6小时±2小时，即得检品供试品原液JY；

③冷酚处理：另取超滤浓缩液0.6ml，按超滤浓缩液与乙酸钠饱和冷酚溶液的体积比为1：2～3，加入乙酸钠饱和冷酚溶液，振荡混匀10～30 min，置冰浴5～20 min，8000～10000rpm，8℃离心10～30分钟，收取上清液，即得检品供试品上清液JS；

（2）对照供试品的制备

①预处理：取所述的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品预测定群对应的多糖，用注射用水将该多糖稀释至多糖浓度为60μg/ml；

②蛋白酶K处理：取步骤（2）①中60μg/ml的多糖溶液，按步骤（1）中②相同的方法处理，得对照供试品原液DY；

③冷酚处理：将步骤（2）①中60μg/ml的多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，再按步骤（1）中③相同的方法处理，得对照供试品上清液DS；

（3）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖，加入pH8.6的巴比妥电泳缓冲液使胶浓度为1.5%，加热溶胀完全，放56℃水浴10～30min，加入预测定群对应的效价为1：640的特异性抗血清，该抗血清的量为琼脂糖溶液体积的3%（V/V），混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔；

（4）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂，然后在其余各孔依次分别加入预测定群对应的4个以上已知不同浓度的多糖标准品、JY、 DY、JS、DS ，加入量均为7μl/孔；

（5）电泳及胶片处理

按常规方法进行电泳、干胶制备、染色和脱色处理；

（6）结果计算

①用游标卡尺量取预测定群对应的各多糖标准品、JY、 DY、JS、DS的峰高值，以各浓度多糖标准品浓度对数为横坐标，对应峰高值为纵坐标作回归曲线，将JY、 DY、JS、DS的峰高值代入回归曲线分别计算JY、 DY、JS、DS的多糖含量；

 ②根据如下公式计算有效性P：

；

③根据如下公式计算预测定群中游离多糖含量H：

。

步骤（4）所述的预测定群对应的4个以上已知不同浓度的多糖标准品是预测定群对应的浓度分别为2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的5个多糖标准品。

步骤（1）和步骤（2）所述的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品为A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品。

本发明所述的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品是指4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗的最终生产产品，所述的A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品是指A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的最终生产产品。

本发明的有益效果是：

本发明方法采用蛋白酶K降解多糖结合物供试品中的载体蛋白，消除了各群结合物载体蛋白在免疫电泳中对电泳迁移率等相关因素的影响，采用乙酸钠饱和冷酚溶液分离结合物中结合多糖与游离多糖，再联合使用免疫特异性结合电泳检测技术，建立了检测4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖的适宜检测体系，其操作简便、快捷，免疫检测特异性强，提供了一种准确、快速测定4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量的方法，该方法从准确性、精密度及耐用性验证的结果来看，具有耐用性强、准确性及精密度高的特点，建立了评价4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品质量的方法。

实施例1—实施例12对A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中各群游离多糖含量的测定，每一群作了3个处理，每个处理3次重复，每个群9次实验，A、C、Y、W135群各群游离多糖含量测定：①A、C、Y、W135群各群的试验有效性P均能达到96%以上，其标准偏差SD分别为2.70%、1.52%、2.03%、2.16%，相对标准偏差CV分别为2.74%、1.54%、2.05%、2.15%，相对标准偏差CV在5%以内；②A、C、Y、W135群各群的游离多糖重复性测定结果的标准偏差SD分别为1.13%、0.39%、1.18%、0.48%，相对标准偏差CV分别为6.98%、4.26%、6.085%、2.07%，相对标准偏差CV在7%以内，表明本发明方法的耐用性强。

实施例还对多糖含量的准确性进行了比较试验，采用了用已知多糖浓度的单群脑膜炎球菌多糖结合物直接进行免疫电泳检测其多糖浓度，与用相同结合物采用本发明方法检测其多糖浓度的比较实验，实验表明：

直接进行免疫电泳检测单群脑膜炎球菌多糖结合物中多糖含量，检测重复性较差，且检测值与实际值偏差较大，回收率低（69.08%—75.92%），不能准确反映多糖结合物中的多糖浓度，故直接进行免疫电泳检测的方法不适于检测结合疫苗成品中多糖含量（检测结果见表5)。

而本发明方法对已知多糖浓度的单群脑膜炎球菌多糖结合物中多糖含量的检测，通过使用蛋白酶K对多糖结合物供试品进行处理，消除了载体蛋白在免疫电泳中对电泳迁移率等相关因素的影响，其检测重复性好，检测值与实际值偏差较小，从A群、C群、Y群到W135群的标准偏差SD分别为3.22%、2.98%、3.21%、2.60%，相对标准偏差CV分别为3.25%、3.00%、3.22%、2.61%, 标准偏差SD及相对标准偏差CV值均在5%以内，酶处理后的各群结合物多糖含量重复性检测结果平均回收率X均在99%以上，验证了本发明方法的准确性和精密度均高，表明本发明方法可以准确测定结合疫苗成品中各群多糖含量（检测结果见表5)。

  实施例还对游离多糖含量的准确性进行了比较试验，采用了用乙酸钠饱和冷酚溶液分离结合物中结合多糖与游离多糖，与免疫电泳检测技术联合使用，即通过模拟结合疫苗成品的制备及检测处理方法，即将已知多糖浓度和游离多糖含量的4个群多糖结合物混合在一起制备各群多糖均为60μg/ml的混合物，用冷酚处理后再进行免疫电泳检测游离多糖含量，比较检测值与实际值之间的接近程度，通过计算回收率来进行验证。实际值为各单群结合疫苗采用授权的中国专利号为ZL200610048876.9发明名称为“一种A、C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法”（公开号：CN1971266，公开日：2007年5月30日）的发明方法进行检测的结果。实验结果表明：其游离多糖含量采用本发明方法检测重复性好，检测值与实际值偏差较小，从A群、C群、Y群到W135群的标准偏差SD分别为0.39%、0.26%、0.42%、0.56%，相对标准偏差CV分别为0.39%、0.26%、0.42%、0.56%, 标准偏差SD及相对标准偏差CV值均在5%以内，其游离多糖含量重复性检测结果平均回收率X均在99%以上，验证了本发明方法测定结合疫苗中游离多糖的准确性和精密度均高，表明本发明方法可以准确测定结合疫苗成品中各群游离多糖含量（检测结果见表6）。

本发明方法采用的低浓度的标准品即2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml来制作的标准曲线，既曲线线性好，也增强了检测灵敏度。在4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中，每1剂量各群多糖含量都较低，且为确保多糖结合疫苗的质量，需要将游离多糖含量控制在较低的范围内，大约为总多糖的30%或更低，故多糖结合疫苗的游离多糖含量测定相对于总多糖含量测定更为困难，本发明采用降低标准品浓度，通过5个不同低浓度的标准品即2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml来制作标准曲线，各群标准曲线相关系数r的数据可以看出，各群标准曲线相关系数r平均值均在0.985以上，且精密度高，即标准偏差SD在0.0009～0.0013之间，相对标准偏差CV值均低于1%，曲线的重复性和稳定性都非常好，检测灵敏度高。(详见表7)。

具体实施方式

以下各实施例无特殊说明均为常规方法，A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品，多糖标准品，各特异性抗血清以及所用其它试剂均为市售产品。 

所用仪器设备：①电泳仪：DYY-6C型    厂家：北京市六一仪器厂

              ②电泳槽：DYCP-31DN   厂家：北京市六一仪器厂

              ③制胶板：宽式水平电泳槽BG-subMAX 配套制胶板

实施例1   A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中A群游离多糖含量的测定

A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中A群游离多糖含量的测定，作3次重复，分别为重复1、重复2、重复3，各重复均按以下步骤进行：

（1）检品供试品制备

①预处理：取待测的A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品12瓶（标示量是每瓶0.5ml），用注射用水6ml复溶后（即用注射用水按标示量复溶），取复溶后的溶液5.0ml于超滤杯中，5000×g 4℃离心超滤40min，收集浓缩液，补注射用水至1.0ml，得超滤浓缩液；用Lowry法测定该超滤浓缩液中蛋白的浓度,测得其蛋白浓度为285.7μg/ml；

②蛋白酶K处理：酶解反应体系总体积为420μl，以所述的酶解反应体系总体积420μl为基准，取1/6体积的超滤浓缩液70μl，加入1/10体积的蛋白酶K缓冲液42μl，2μl蛋白酶K，并补加注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育4小时，即得检品供试品原液JY；加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的2倍；蛋白酶K的量的计算：

③冷酚处理：另取超滤浓缩液 0.6ml，按超滤浓缩液与乙酸钠饱和冷酚溶液的体积比为1：2，加入 1.2ml乙酸钠饱和冷酚溶液，振荡混匀 10min，置冰浴 10min，8000rpm ，8℃ 离心 30min，收集上清液，即得检品供试品上清液JS。

（2）对照供试品制备

①预处理：取A群脑膜炎球菌多糖（即步骤（1）所述的待测的A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品预测定群对应的多糖），用注射用水将该多糖稀释至60μg/ml；

②蛋白酶K处理：取步骤（2）①所述的60μg/ml的多糖溶液，按步骤（1）中②相同的方法进行蛋白酶K处理，得对照供试品原液DY；具体是：

取步骤（2）①60μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖溶液70μl（酶解反应体系总体积420μl的），加入2μl蛋白酶K和42μl蛋白酶K缓冲液（酶解反应体系总体积420μl的），并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育4小时，即得对照供试品原液DY；

③冷酚处理：将步骤（2）①中60μg/ml的多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，再按步骤（1）中③相同的方法处理，得对照供试品上清液DS；具体是：

另将步骤（2）①中60μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml ，取0.6ml，加入 1.2ml乙酸钠饱和冷酚溶液，振荡混匀10min，置冰浴 10min，8000rpm， 8℃离心30min，收集上清液，即得对照供试品上清液DS。

（3）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1504g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入效价为1：640的A群脑膜炎球菌多糖抗血清，该抗血清的量为琼脂糖溶液体积的3%（V/V，即体积分数）即为0.3ml，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（4）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个A群脑膜炎球菌多糖标准品、DS 、DY、JS 、JY、加入量均为7μl/孔；5个A群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。

（5）电泳及胶片处理

稳压40V电泳5小时，然后将琼脂糖胶片于生理盐水中浸泡、振摇2小时，再置于两层干净滤纸之间，放37℃过夜制成干胶；将干胶于考马斯亮蓝染色液中浸泡10分钟，脱色液脱色至胶片火箭峰清晰、背景无色。

（6）结果计算

①用游标卡尺量取各多糖标准品（2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）、DS 、DY、JS 、JY的峰高值，以多糖标准品浓度对数为横坐标，对应峰高值为纵坐标作回归曲线，计算DS 、DY、JS 、JY的多糖含量；

 

结果见表1。

实施例2  A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中A群游离多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入4μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育6小时，即得检品供试品原液JY；加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的4倍。

③冷酚处理：另取超滤浓缩液0.6ml，加入1.8ml乙酸钠饱和冷酚溶液，超滤浓缩液与乙酸钠饱和冷酚溶液的体积比为1：3，振荡混匀20min，置冰浴5min，9000rpm，8℃离心20min，收集上清液，即得检品供试品上清液JS。

（2）对照供试品制备

②蛋白酶K处理：取60μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖溶液70μl，按本实施例步骤（1）中②相同的方法进行蛋白酶K处理，得对照供试品原液DY；

③冷酚处理：取60μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，按本实施例步骤（1）中③相同的方法进行冷酚处理，得对照供试品上清液DS。

（3）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1538g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入0.3ml 效价为1：640的A群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

结果见表1。

实施例3  A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中A群游离多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入8μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育8小时，即得检品供试品原液JY；加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的8倍；

③冷酚处理：另取超滤浓缩液0.6ml，加入1.2ml乙酸钠饱和冷酚溶液，振荡混匀30min，置冰浴20min，10000rpm，8℃离心10min，收取上清液，即得检品供试品上清液JS。

（2）对照供试品制备

②蛋白酶K处理：取60μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖溶液70μl，按本实施例步骤（1）中②相同的方法进行蛋白酶K处理，得对照供试品原液DY；

③冷酚处理： 将60μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，，按本实施例步骤（1）中③相同的方法进行冷酚处理，得对照供试品上清液DS。

（3）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1526g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入0.3ml 效价为1：640的A群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

结果见表1。

  分析：本发明的技术方案中有检品供试品预处理时离心条件5000～10000×g 离心超虑20～40min，蛋白酶K处理时37℃孵育6小时±2小时、加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的2～8倍以及冷酚处理时，按超滤浓缩液与乙酸钠饱和冷酚溶液的体积比为1：2～3，加入乙酸钠饱和冷酚溶液，振荡混匀10～30 min，置冰浴5～20 min，8000～10000rpm，8℃离心10～30分钟，在实施例1-实施例3中分别对以上技术参数进行了范围两端及中间参数运用的实验，每一运用重复进行了3次实验，共计9次，通过对检测结果的统计分析，试验有效性P均能达到95%以上，相对标准偏差CV在5%以内，游离多糖重复性测定结果相对标准偏差CV在7%以内，表明本方法的耐用性强，且测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中A群游离多糖含量的精密度高。

实施例4  A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中C群游离多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（2）对照供试品制备

①预处理：取C群脑膜炎球菌多糖，用注射用水将该多糖稀释至60μg/ml；

②蛋白酶K处理：取60μg/ml的C群脑膜炎球菌多糖溶液70μl，按实施例1步骤（1）中②相同的方法进行蛋白酶K处理，得对照供试品原液DY；

③冷酚处理： 将60μg/ml的C群脑膜炎球菌多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，按实施例1步骤（1）中③相同的方法进行冷酚处理，得对照供试品上清液DS。

（3）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1531g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入0.3ml效价为1：640的C群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（4）上样

多糖标准品为5个已知不同浓度的C群脑膜炎球菌多糖标准品，该5个C群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。

结果见表2。

实施例5  A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中C群游离多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入4μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育6小时，即得检品供试品原液JY；加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的4倍。

③冷酚处理：另取超滤浓缩液0.6ml，加入1.8ml乙酸钠饱和冷酚溶液，超滤浓缩液与乙酸钠饱和冷酚溶液的体积比为1：3，振荡混匀20min，置冰浴5min，9000rpm，8℃离心20min，收集上清液，即得检品供试品上清液JS。

（2）对照供试品制备

①预处理：取C群脑膜炎球菌多糖，用注射用水将该多糖稀释至60μg/ml；

②蛋白酶K处理：取60μg/ml的C群脑膜炎球菌多糖溶液70μl，按本实施例步骤（1）中②相同的方法进行蛋白酶K处理，得对照供试品原液DY；

③冷酚处理： 将60μg/ml的C群脑膜炎球菌多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，按本实施例步骤（1）中③相同的方法进行冷酚处理，得对照供试品上清液DS。

（3）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1511g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入0.3ml效价为1：640的C群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（4）上样

多糖标准品为5个已知不同浓度的C群脑膜炎球菌多糖标准品，该5个C群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。

结果见表2。

实施例6  A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中C群游离多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入8μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育8小时，即得检品供试品原液JY；加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的8倍；

③冷酚处理：另取超滤浓缩液0.6ml，加入1.2ml乙酸钠饱和冷酚溶液，振荡混匀30min，置冰浴20min，10000rpm，8℃离心10min，收取上清液，即得检品供试品上清液JS。

（2）对照供试品制备

①预处理：取C群脑膜炎球菌多糖，用注射用水将该多糖稀释至60μg/ml；

②蛋白酶K处理：取60μg/ml的C群脑膜炎球菌多糖溶液70μl，按本实施例步骤（1）中②相同的方法进行蛋白酶K处理，得对照供试品原液DY；

③冷酚处理： 将60μg/ml的C群脑膜炎球菌多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，按本实施例步骤（1）中③相同的方法进行冷酚处理，得对照供试品上清液DS。

（3）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1523g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入0.3ml效价为1：640的C群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（4）上样

多糖标准品为5个已知不同浓度的C群脑膜炎球菌多糖标准品，该5个C群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。

结果见表2。

 

分析：同实施例1-实施例3，在实施例4-实施例6中分别对本发明技术方案中提到的相关技术参数进行了范围两端及中间参数运用的实验，每一运用重复进行了3次实验，共计9次，通过对检测结果的统计分析，试验有效性P均能达到95%以上，相对标准偏差CV在5%以内，游离多糖重复性测定结果相对标准偏差CV在5%以内，表明本方法的耐用性强，且测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中C群游离多糖含量的精密度高。

实施例7  A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中Y群游离多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（2）对照供试品制备

①预处理：取Y群脑膜炎球菌多糖，用注射用水将该多糖稀释至60μg/ml，得Y群脑膜炎球菌多糖溶液；

②蛋白酶K处理：取本实施例步骤（2）①所述的60μg/ml Y群脑膜炎球菌多糖溶液70μl，按实施例1步骤（1）中②相同的方法进行蛋白酶K处理，得对照供试品原液DY；

③冷酚处理：将步骤（2）①中60μg/ml的Y群脑膜炎球菌多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，按实施例1步骤（1）中③相同的方法进行冷酚处理，得对照供试品上清液DS。

（3）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1505g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入0.3ml 效价为1：640的Y群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（4）上样

多糖标准品为5个已知不同浓度的Y群脑膜炎球菌多糖标准品，该5个Y群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。

结果见表3。

实施例8  A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中Y群游离多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入4μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育6小时，即得检品供试品原液JY；加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的4倍；

③冷酚处理：另取超滤浓缩液0.6ml，加入1.8ml乙酸钠饱和冷酚溶液，超滤浓缩液与乙酸钠饱和冷酚溶液的体积比为1：3，振荡混匀20min，置冰浴5min，9000rpm，8℃离心20min，收集上清液，即得检品供试品上清液JS。

（2）对照供试品制备

①预处理：取Y群脑膜炎球菌多糖，用注射用水将该多糖稀释至60μg/ml，得Y群脑膜炎球菌多糖溶液；

②蛋白酶K处理：取本实施例步骤（2）①所述的60μg/ml Y群脑膜炎球菌多糖溶液70μl，按本实施例步骤（1）中②相同的方法进行蛋白酶K处理，得对照供试品原液DY；

③冷酚处理：将本实施例步骤（2）①所述的60μg/ml Y群脑膜炎球菌多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，按本实施例步骤（1）中③相同的方法进行冷酚处理，得对照供试品上清液DS。

（3）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1498g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入0.3ml 效价为1：640的Y群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（4）上样

多糖标准品为5个已知不同浓度的Y群脑膜炎球菌多糖标准品，该5个Y群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。

结果见表3。

实施例9  A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中Y群游离多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入8μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育8小时，即得检品供试品原液JY；加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的8倍；

③冷酚处理：另取超滤浓缩液0.6ml，加入1.2ml乙酸钠饱和冷酚溶液，振荡混匀30min，置冰浴20min，10000rpm，8℃离心10min，收取上清液，即得检品供试品上清液JS。

（2）对照供试品制备

①预处理：取Y群脑膜炎球菌多糖，用注射用水将该多糖稀释至60μg/ml，得Y群脑膜炎球菌多糖溶液；

②蛋白酶K处理：取本实施例步骤（2）①所述的60μg/mlY群脑膜炎球菌多糖溶液70μl，按本实施例步骤（1）中②相同的方法进行蛋白酶K处理，得对照供试品原液DY；

③冷酚处理：将本实施例步骤（2）①所述的60μg/mlY群脑膜炎球菌多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，按本实施例步骤（1）中③相同的方法进行冷酚处理，得对照供试品上清液DS。

（3）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1504g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入0.3ml 效价为1：640的Y群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（4）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个Y群脑膜炎球菌多糖标准品、DS 、DY、JS 、JY、加入量均为7μl/孔；5个Y群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。

结果见表3。

 

分析：同实施例1-实施例3，在实施例7-实施例9中分别对本发明技术方案中提到的相关技术参数进行了范围两端及中间参数运用的实验，每一运用重复进行了3次实验，共计9次，通过对检测结果的统计分析，试验有效性P均能达到95%以上，相对标准偏差CV在5%以内，游离多糖重复性测定结果相对标准偏差CV在7%以内，表明本方法的耐用性强，且测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中Y群游离多糖含量的精密度高。

实施例10  A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中W135群游离多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（2）对照供试品制备

①预处理：取W135群脑膜炎球菌多糖，用注射用水将该多糖稀释至60μg/ml，得W135群脑膜炎球菌多糖溶液；

②蛋白酶K处理：取本实施例10步骤（2）①所述的60μg/mlW135群脑膜炎球菌多糖溶液70μl，按实施例1步骤（1）中②相同的方法进行蛋白酶K处理，得对照供试品原液DY；

③冷酚处理：取本实施例10步骤（2）①所述的60μg/mlW135群脑膜炎球菌多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，按实施例1步骤（1）中③相同的方法进行冷酚处理，得对照供试品上清液DS。

（3）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1505g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入0.3ml 效价为1：640的W135群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（4）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个W135群脑膜炎球菌多糖标准品、DS 、DY、JS 、JY、加入量均为7μl/孔；该5个W135群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。结果见表4。

实施例11  A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中W135群游离多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入4μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育6小时，即得检品供试品原液JY；加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的4倍；

③冷酚处理：另取超滤浓缩液0.6ml，加入1.8ml乙酸钠饱和冷酚溶液，超滤浓缩液与乙酸钠饱和冷酚溶液的体积比为1：3，振荡混匀20min，置冰浴5min，9000rpm，8℃离心20min，收集上清液，即得检品供试品上清液JS。

（2）对照供试品制备

①预处理：取W135群脑膜炎球菌多糖，用注射用水将该多糖稀释至60μg/ml，得W135群脑膜炎球菌多糖溶液；

②蛋白酶K处理：取本实施例步骤（2）①所述的60μg/ml W135群脑膜炎球菌多糖溶液70μl，按本实施例步骤（1）中②相同的方法进行蛋白酶K处理，得对照供试品原液DY；

③冷酚处理：取本实施例步骤（2）①所述的60μg/ml W135群脑膜炎球菌多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，按本实施例步骤（1）中③相同的方法进行冷酚处理，得对照供试品上清液DS。

（3）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1511g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入0.3ml效价为1：640的 W135群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（4）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个W135群脑膜炎球菌多糖标准品、DS 、DY、JS 、JY、加入量均为7μl/孔；5个W135群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。

结果见表4。

实施例12  A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中W135群游离多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入8μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育8小时，即得检品供试品原液JY；加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的8倍；

③冷酚处理：另取超滤浓缩液0.6ml，加入1.2ml乙酸钠饱和冷酚溶液，振荡混匀30min，置冰浴20min，10000rpm，8℃离心10min，收取上清液，即得检品供试品上清液JS。

（2）对照供试品制备

①预处理：取W135群脑膜炎球菌多糖，用注射用水将该多糖稀释至60μg/ml，得W135群脑膜炎球菌多糖溶液；

②蛋白酶K处理：取本实施例12步骤（2）①所述的60μg/ml W135群脑膜炎球菌多糖溶液70μl，按本实施例步骤（1）中②相同的方法进行蛋白酶K处理，得对照供试品原液DY；

③冷酚处理：取本实施例12步骤（2）①所述的60μg/ml W135群脑膜炎球菌多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，按本实施例步骤（1）中③相同的方法进行冷酚处理，得对照供试品上清液DS。

（3）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1508g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入0.3ml 效价为1：640的W135群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（4）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个W135群脑膜炎球菌多糖标准品、DS 、DY、JS 、JY、加入量均为7μl/孔；5个W135群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。

结果见表4。

 

分析：同实施例1-实施例3，在实施例10-实施例12中分别对本发明技术方案中提到的相关技术参数进行了范围两端及中间参数运用的实验，每一运用重复进行了3次实验，共计9次，通过对检测结果的统计分析，试验有效性P均能达到95%以上，相对标准偏差CV在5%以内，游离多糖重复性测定结果相对标准偏差CV在5%以内，表明本方法的耐用性强，且测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中W135群游离多糖含量的精密度高。

实施例13  本发明方法测定多糖含量的准确性比较试验

本实施例是用已知多糖浓度为40μg/ml的单群脑膜炎球菌多糖结合物直接进行免疫电泳检测其多糖浓度，与用相同结合物采用本发明方法检测其多糖浓度的比较实验，比较其准确性。

（1）    已知多糖浓度为40μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖结合物直接进行免疫电泳检测A群多糖含量，步骤如下：

①抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1504g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入效价为1：640的A群脑膜炎球菌多糖抗血清，该抗血清的量为琼脂糖溶液体积的3%（V/V，即体积分数）即为0.3ml，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

②上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个A群脑膜炎球菌多糖标准品、已知多糖浓度为40μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖结合物、加入量均为7μl/孔；5个A群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。

③电泳及胶片处理

稳压40V电泳5小时，然后将琼脂糖胶片于生理盐水中浸泡、振摇2小时，再置于两层干净滤纸之间，放37℃过夜制成干胶；将干胶于考马斯亮蓝染色液中浸泡10分钟，脱色液脱色至胶片火箭峰清晰、背景无色。

④检测结果计算

用游标卡尺量取各多糖标准品（2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）、所述的已知多糖浓度为40μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖结合物的峰高值，以多糖标准品浓度对数为横坐标，对应峰高值为纵坐标作回归曲线，计算已知多糖浓度为40μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖结合物的所检测的多糖含量。

用直接进行免疫电泳检测已知多糖浓度为40μg/ml的其它三个群的脑膜炎球菌多糖结合物中多糖的含量，除检测样品分别为多糖浓度为40μg/ml的C群脑膜炎球菌多糖结合物、多糖浓度为40μg/ml的Y群脑膜炎球菌多糖结合物、多糖浓度为40μg/ml的W135群脑膜炎球菌多糖结合物，以及特异性抗血清分别为对应的效价为1:640的C群脑膜炎球菌多糖抗血清、效价为1:640的Y群脑膜炎球菌多糖抗血清、效价为1:640的W135群脑膜炎球菌多糖抗血清外，其余步骤与已知多糖浓度为40μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖结合物直接进行免疫电泳检测A群多糖含量相同，不再赘述。

（2）采用本发明方法检测已知多糖浓度为40μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖结合物中A群多糖含量，步骤如下：

1）检品供试品制备

①检品原液即为供试品，其蛋白浓度为64.3μg/ml（用Lowry法测得蛋白的浓度）；

②蛋白酶K处理：酶解反应体系总体积为420μl，以所述的酶解反应体系总体积420μl为基准，取1/6体积的供试品70μl，加入1/10体积的蛋白酶K缓冲液42μl，0.5μl蛋白酶K，并补加注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育4小时，即得供试品原液JY；加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的2倍；蛋白酶K的量的计算：

2）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1504g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入效价为1：640的A群脑膜炎球菌多糖抗血清，该抗血清的量为琼脂糖溶液体积的3%（V/V，即体积分数）即为0.3ml，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

3）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个A群脑膜炎球菌多糖标准品、JY、加入量均为7μl/孔；5个A群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。

4）电泳及胶片处理

稳压40V电泳5小时，然后将琼脂糖胶片于生理盐水中浸泡、振摇2小时，再置于两层干净滤纸之间，放37℃过夜制成干胶；将干胶于考马斯亮蓝染色液中浸泡10分钟，脱色液脱色至胶片火箭峰清晰、背景无色。

5）结果计算

用游标卡尺量取各多糖标准品（2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）、JY的峰高值，以多糖标准品浓度对数为横坐标，对应峰高值为纵坐标作回归曲线，计算JY的多糖含量。

采用本发明方法检测已知多糖浓度为40μg/ml的其它三个群的脑膜炎球菌多糖结合物中多糖含量，除待测的供试品分别为多糖浓度为40μg/ml的C群脑膜炎球菌多糖结合物、多糖浓度为40μg/ml的Y群脑膜炎球菌多糖结合物、多糖浓度为40μg/ml的W135群脑膜炎球菌多糖结合物，以及特异性抗血清分别为对应的效价为1:640的C群脑膜炎球菌多糖抗血清、效价为1:640的Y群脑膜炎球菌多糖抗血清、效价为1:640的W135群脑膜炎球菌多糖抗血清外，其余步骤与本实施例（2）所述的采用本发明方法检测已知多糖浓度为40μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖结合物中A群多糖含量相同，不再赘述。

各单群脑膜炎球菌多糖结合物酶处理前和酶处理后的多糖含量免疫电泳检测结果对比见表5。实验结果显示：

直接进行免疫电泳检测单群脑膜炎球菌多糖结合物中多糖含量，检测重复性较差，且检测值与实际值偏差较大，回收率低（69.08%—75.92%），不能准确反映多糖结合物中的多糖浓度，故直接进行免疫电泳检测的方法不适于检测结合疫苗成品中多糖含量（检测结果见表5）。

而本发明方法对已知多糖浓度的单群脑膜炎球菌多糖结合物中多糖含量的检测，通过使用蛋白酶K对多糖结合物供试品进行处理，消除了载体蛋白在免疫电泳中对电泳迁移率等相关因素的影响，其检测重复性好，检测值与实际值偏差较小，从A群、C群、Y群到W135群的标准偏差SD分别为3.22%、2.98%、3.21%、2.60%，相对标准偏差CV分别为3.25%、3.00%、3.22%、2.61%, 标准偏差SD及相对标准偏差CV值均在5%以内，酶处理后的各群结合物多糖含量重复性检测结果平均回收率X均在99%以上，验证了本发明方法的准确性和精密度均高，表明本发明方法可以准确测定结合疫苗成品中各群多糖含量（检测结果见表5）。

 

实施例14  本发明方法测定游离多糖含量的准确性比较试验

  本实施例采用本发明方法中用乙酸钠饱和冷酚溶液分离结合物中结合多糖与游离多糖，与免疫电泳检测技术联合使用，即通过模拟结合疫苗成品的制备及检测处理方法，将已知多糖浓度和游离多糖含量的A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、Y群脑膜炎球菌多糖结合疫苗和W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗混合在一起，使各群多糖终浓度为60μg/ml，即得已知各群多糖浓度分别为60μg/ml的A、C、Y、W135群结合疫苗混合物，用冷酚处理后再进行免疫电泳检测游离多糖的含量，比较检测值与游离多糖的实际值之间的接近程度，通过计算回收率来进行验证。游离多糖的实际值为各单群结合疫苗采用授权的中国专利号为ZL200610048876.9发明名称为“一种A、C群脑膜炎球菌多糖结合物中游离多糖含量的测定方法”（公开号：CN1971266，公开日：2007年5月30日）的发明方法进行检测的结果。

所述的已知各群多糖浓度分别为60μg/ml的A、C、Y、W135群结合疫苗混合物中A群游离多糖的测定：分别为重复1、重复2、重复3、……重复9，各重复均按以下步骤进行：

（1）检测供试品上清液的制备

冷酚处理：取已知各群多糖浓度分别为60μg/ml的A、C、Y、W135群结合疫苗混合物 0.6ml，按样品与乙酸钠饱和冷酚溶液的体积比为1：2，加入 1.2ml乙酸钠饱和冷酚溶液，振荡混匀 10min，置冰浴 10min，8000rpm ，8℃ 离心 30min，收集上清液，即得检品供试品上清液JS。

（2）对照供试品制备

①预处理：取A群脑膜炎球菌多糖，用注射用水将该多糖稀释至60μg/ml；

③冷酚处理：取步骤（2）①中60μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，加入 1.2ml乙酸钠饱和冷酚溶液，振荡混匀10min，置冰浴 10min，8000rpm，8℃离心30min，收集上清液，即得对照供试品上清液DS；

（3）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1504g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入效价为1：640的A群脑膜炎球菌多糖抗血清，该抗血清的量为琼脂糖溶液体积的3%（V/V，即体积分数）即为0.3ml，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（4）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个A群脑膜炎球菌多糖标准品、DS、DY、JS，加入量均为7μl/孔；5个A群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。

（5）电泳及胶片处理

稳压40V电泳5小时，然后将琼脂糖胶片于生理盐水中浸泡、振摇2小时，再置于两层干净滤纸之间，放37℃过夜制成干胶；将干胶于考马斯亮蓝染色液中浸泡10分钟，脱色液脱色至胶片火箭峰清晰、背景无色。

（6）结果计算

①用游标卡尺量取各多糖标准品（2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）、DS 、DY、JS 的峰高值，以多糖标准品浓度对数为横坐标，对应峰高值为纵坐标作回归曲线，计算DS、DY、JS 的多糖含量；

②根据如下公式计算有效性P：

；

③根据如下公式计算预测定的群中游离多糖含量H：

。

检测结果见表6。

已知各群多糖浓度分别为60μg/ml的A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗混合物中C群游离多糖、Y群游离多糖、W135群游离多糖含量的测定，除步骤（2）所用的脑膜炎球菌多糖分别为C群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖、W135群脑膜炎球菌多糖；步骤（3）加入的抗血清分别为效价为1：640的C群脑膜炎球菌多糖抗血清、效价为1：640的Y群脑膜炎球菌多糖抗血清、效价为1：640的W135群脑膜炎球菌多糖抗血清；步骤（4）所述的已知不同浓度的5个脑膜炎球菌多糖标准品分别为C群脑膜炎球菌多糖标准品、Y群脑膜炎球菌多糖标准品、W135群脑膜炎球菌多糖标准品外（各群脑膜炎球菌多糖标准品的5个浓度均分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml；），其余步骤与本实施例14中所述的已知各群多糖浓度分别为60μg/ml的A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗混合物中A群游离多糖的测定相同，不再赘述（检测结果见表6）。

  实验结果表明：已知各群多糖浓度分别为60μg/ml的A、C、Y、W135群结合疫苗混合物中各单群游离多糖含量检测重复性好，检测值与实际值偏差较小，从A群、C群、Y群到W135群的标准偏差SD分别为0.39%、0.26%、0.42%、0.56%，相对标准偏差CV分别为0.39%、0.26%、0.42%、0.56%，标准偏差SD及相对标准偏差CV值均在5%以内，其游离多糖含量重复性检测结果平均回收率X均在99%以上，验证了本发明方法测定结合疫苗中游离多糖的准确性和精密度均高，表明本发明方法可以准确测定结合疫苗成品中各群游离多糖含量（检测结果见表6）。

 

在4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中，每1剂量各群多糖含量都较低，且为确保多糖结合疫苗的质量，需要将游离多糖含量控制在较低的范围内，大约为总多糖的30%或更低，故多糖结合疫苗的游离多糖含量测定相对于总多糖含量测定更为困难，本发明采用降低标准品浓度，通过5个不同低浓度的标准品即2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml来制作标准曲线，增强了检测灵敏度，且曲线线性较好。结果见表7。

由表3的数据可以看出，各群标准曲线相关系数r平均值均在0.985以上，且精密度较高，即标准偏差SD在0.0009～0.0013之间，相对标准偏差CV值均低于1%，曲线的重复性和稳定性都非常好，检测灵敏度高。

所用试剂的配制方法：

1、蛋白酶K缓冲液（pH8.0）：

    量取1mol/L Tris溶液1.0ml（pH8.0）、5mol/L氯化钠溶液2.0ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2.0ml、20%SDS溶液2.5ml，加注射用水至100ml。

2、巴比妥电泳缓冲液（pH8.6）

称取巴比妥4.14g、巴比妥钠23.18g，加水适量，加热使之溶解，放冷至室温，再加叠氮钠0.15g，溶解后，加水稀释至1500ml。

3、乙酸钠饱和冷酚溶液：

取500克分析纯无水醋酸钠在加热下溶于800ml注射用水，趁热用0.45微孔滤膜过滤，过滤后的醋酸钠溶液冷却后出现大量结晶，此时上清即为饱和醋酸钠溶液。取此饱和醋酸钠溶液100ml，加注射用水稀释至1000ml，调pH至6.9~7.1，即为1/10饱和中性醋酸钠溶液。取500克分析纯苯酚（一瓶），在60℃水浴下加热使融化，趁热将已融化的苯酚倒入装有1000ml 1/10饱和中性醋酸钠溶液的容器中，置磁力搅拌器上避光混匀平衡1小时，静置过夜，弃上层水相后，转入棕色瓶置4℃冰箱保存即可，每次使用均取下层。

4、考马斯亮蓝R250脱色液： 

   准确量取无水乙醇225ml，冰醋酸50ml，注射用水225ml混匀即得。

5、考马斯亮蓝染色液： 

   准确称取考马斯亮蓝R250 1.0g，加入考马斯亮蓝R250脱色液200ml溶解混匀即得。

Claims (3)

1.一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量的测定方法，包括以下步骤：

（1）检品供试品的制备

①预处理：取待测的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品用注射用水按标示量复溶，取5.0ml于超滤杯中，5000～10000×g离心超滤20～40min，收集浓缩液，补注射用水至总体积为1.0ml，得超滤浓缩液；用Lowry法测定该超滤浓缩液中蛋白的浓度；

②蛋白酶K处理：酶解反应体系总体积为420μl，以所述的酶解反应体系总体积为基准，取1/6体积的超滤浓缩液，加入蛋白酶K和1/10体积的蛋白酶K缓冲液，其中加入的蛋白酶K的质量为酶解反应体系中蛋白的质量的2～8倍，并补加注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育6小时±2小时，即得检品供试品原液JY；

③冷酚处理：另取超滤浓缩液0.6ml，按超滤浓缩液与乙酸钠饱和冷酚溶液的体积比为1：2～3，加入乙酸钠饱和冷酚溶液，振荡混匀10～30 min，置冰浴5～20 min，8000～10000rpm，8℃离心10～30分钟，收取上清液，即得检品供试品上清液JS；所述的乙酸钠饱和冷酚溶液按如下方法配制而得：取500克分析纯无水醋酸钠在加热下溶于800ml注射用水，趁热用0.45微孔滤膜过滤，过滤后的醋酸钠溶液冷却后出现大量结晶，此时上清即为饱和醋酸钠溶液；取此饱和醋酸钠溶液100ml，加注射用水稀释至1000ml，调pH至6.9~7.1，即为1/10饱和中性醋酸钠溶液；取500克分析纯苯酚，在60℃水浴下加热使融化，趁热将已融化的苯酚倒入装有1000ml 1/10饱和中性醋酸钠溶液的容器中，置磁力搅拌器上避光混匀平衡1小时，静置过夜，弃上层水相后，转入棕色瓶置4℃冰箱保存即可，每次使用均取下层；

（2）对照供试品的制备

①预处理：取所述的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品预测定群对应的多糖，用注射用水将该多糖稀释至多糖浓度为60μg/ml；

②蛋白酶K处理：取步骤（2）①中60μg/ml的多糖溶液，按步骤（1）中②相同的方法处理，得对照供试品原液DY；

③冷酚处理：将步骤（2）①中60μg/ml的多糖溶液用注射用水稀释至10μg/ml，取0.6ml，再按步骤（1）中③相同的方法处理，得对照供试品上清液DS；

（3）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖，加入pH8.6的巴比妥电泳缓冲液使胶浓度为1.5%，加热溶胀完全，放56℃水浴10～30min，加入预测定群对应的效价为1：640的特异性抗血清，该抗血清的量为琼脂糖溶液体积的3%，混匀后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔；

（4）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂，然后在其余各孔依次分别加入预测定群对应的4个以上已知不同浓度的多糖标准品、JY、 DY、JS、DS ，加入量均为7μl/孔；

（5）电泳及胶片处理

按常规方法进行电泳、干胶制备、染色和脱色处理；

（6）结果计算

①用游标卡尺量取预测定群对应的各多糖标准品、JY、 DY、JS、DS的峰高值，以各浓度多糖标准品浓度对数为横坐标，对应峰高值为纵坐标作回归曲线，将JY、 DY、JS、DS的峰高值代入回归曲线分别计算JY、 DY、JS、DS的多糖含量；

②根据如下公式计算有效性P：

；

③根据如下公式计算预测定群中游离多糖含量H：

。

2. 根据权利要求1所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量的测定方法，其特征在于：步骤（4）所述的预测定群对应的4个以上已知不同浓度的多糖标准品是预测定群对应的浓度分别为2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的5个多糖标准品。

3.根据权利要求1或2所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群游离多糖含量的测定方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（2）所述的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品为A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品。